CN113521306B - 具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有透皮增强作用的传递体‑外泌体膜融合制剂及其制备方法和应用，该制剂的制备包括：间充质干细胞外泌体的提取分离；载有小分子肽的传递体制备；透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体‑外泌体膜融合载体的构建；植物精油凝胶的制备；具有透皮增强作用的传递体‑外泌体膜融合制剂。本发明制备的传递体‑外泌体膜融合制剂能显著改善小分子肽的载药量，与传统脂质体相比具有更高的变形性、更优异的透皮效果，与具有透皮作用的植物精油协同起效，以更好地促进功效美容成分向皮肤深层的渗透，通过简单涂抹即有望实现紧致肌肤，恢复皮肤活力等多重美容功效，使用方便安全无痛感，对皮肤无刺激，在医疗市场具有巨大的应用市场和开发前景。

Description

具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，其中角质层负责抵御外来侵害，也因此阻挡了许多护肤功效成分的吸收。真皮层成纤维细胞胶原蛋白合成减少、流失增加会导致皮肤出现松弛、细纹等衰老现象，基底层黑素细胞合成的黑色素增加导致暗黄、生斑等问题，但是市面上的护肤品大多成分单一，且以化学成分为主，由于皮肤角质层的限制而只停留在皮肤表层，难以渗透进入皮肤深层针对特定细胞发挥作用，造成浪费，影响使用者的实际使用效果。
就护肤品而言，其中的活性成分若只是单独存在，易受pH、氧化、与其他成分的相互作用的影响导致自身效用降低。CN202010292807.2提供了一种具有美白祛斑功能的精华液，其中含有多种中西结合的美白组合物：密蒙花提取物(0.1-10％)、黄精提取物(0.1-10％)、辛夷提取物(0.1-10％)、牡丹皮提取物(0.1-10％)、根皮素(0.05-2％)、4-n-丁基间苯二酚(0.01-0.3％)、维生素C或其衍生物(0.05-2％)、烟酰胺(0.05-2％)、维生素E(0.03-1％)等，另外含有5-20％的保湿剂、1-5％的皮肤调理剂、0.1-5％的增溶剂、0.1-1％的增稠剂、0.02-2％的防腐剂，但是载体优势不够明显，难以保证多重美白成分的稳定性及有效性。CN104083318A提供了一种美白护肤品及其制备方法，其中美白成分仅占0.5-1.5％，且存在渗透效果有限等问题，其美白效果还有较大提升空间。
新兴医美手段如微针、水光针等物理方法可以在一定程度上将有效成分递送至较深层皮肤，但会造成出血、刺激等皮肤损伤，使用后修复周期长，注意事项多，不宜长期、反复使用，给爱美人士造成诸多不便。脐带来源的间充质干细胞外泌体可以通过多种细胞因子恢复皮肤成纤维细胞的活性、促进胶原再生，具有强大的美容功效，但由于提取率低、载药效果差限制了其在美容护肤领域的应用。因此，有必要发明一种高效、无创、快速、稳定的新型美容技术，将护肤成分高效递送至皮肤深层以发挥多重美容功效。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂，本发明中的制剂是一种透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体与外泌体膜融合载体以及与具有透皮作用植物精油联用的复合制剂，本发明制备的制剂有效克服了外泌体或者传递体作为单一载体使用，存在载药量小，渗透量有限等缺陷，为解决传统制备方法中存在的问题，本发明将外泌体和传递体进行膜融合构建一种仿生载体负载小分子肽，在表面用透皮肽修饰，并与具有透皮作用的植物精油联用，促进小分子肽的高效透皮吸收，增强美容效果的同时改善小分子肽的载药量和稳定性。
本发明还提供所述具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞外泌体的提取分离：培养间充质干细胞，超速离心法提取外泌体，-80℃储存备用；
(2)载有小分子肽的传递体制备：称取磷脂，胆固醇，边缘活性剂于茄形瓶，加入小分子肽溶液，采用薄膜分散法制备含有小分子肽的传递体混悬液；具体可以采用薄膜分散法，于不同水浴温度下水合制备含有肽的传递体混悬液，透析袋除去未被包封的游离肽，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的构建：将步骤(1)的外泌体和步骤(2)的传递体混悬液混合，采用挤出法使得载有小分子肽的传递体与外泌体的膜融合，加入透皮肽，混合后离心弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；其中，外泌体和传递体混悬液混合后，用挤出器分别过不同孔径的滤膜挤出，介导载有肽的传递体与外泌体膜融合载体的构建；其中，混合后离心为摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清；
(4)植物精油凝胶的制备：称取植物精油、增溶剂、纯化水混合均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆粉末，均匀分散于植物精油均相溶液表面，溶胀过夜，形成植物精油凝胶；溶胀为室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.0-6.5(皮肤表面pH)；
(5)具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶混合，搅拌均匀，即得。
作为优选，步骤(1)所述干细胞为人脐带间充质干细胞；超速离心法提取分离外泌体的方法为：依次4℃，2000g离心10min去除细胞碎片，取上清过0.22μm滤膜，于100000g，离心70min，得到外泌体。
其中，步骤(2)所述磷脂为大豆磷脂(SPC)，蛋黄卵磷脂(EPC)，氢化大豆磷脂(HSPC)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)中的一种或几种；所述边缘活性剂为吐温80、胆酸钠、去氧胆酸钠等中的一种或几种的组合物。本发明制备的传递体是在脂质体的基础上添加一定的边缘活性剂如胆酸盐等，使磷脂双分子层的流动性更强，能够通过挤压变形穿过小于其自身粒径数倍的皮肤角质细胞间隙，具有优异的透皮效果，不仅能有效改善难溶性成分的溶解度，还可提高有效成分的稳定性，具有两亲性、生物相容性等优点。
其中，步骤(2)所述磷脂与胆固醇的质量比为9-5:1，边缘活性剂与总脂质(磷脂及胆固醇)的质量比为1:5-7，小分子肽与总脂质的质量比例(药脂比)为1:10-80，作为优选，薄膜分散法中成膜及水合温度为25或55℃。
其中，步骤(3)所述小分子美容肽为具有美白、抗衰等多重美容功效的寡肽-1、三肽-1和六肽-12中的一种或几种的组合物。本发明中使用的寡肽-1，六肽-1，三肽-12已被证明具有很好的美白、抗衰功效，常作为功效成分被添加至多种护肤品中，以期发挥恢复皮肤细胞活力、改善细纹、对抗肌肤松弛、暗哑，使肌肤重现立体与饱满等功效。
其中，步骤(3)所述外泌体与传递体的质量比为5:1-1:5，所述透皮肽由十一个氨基酸组成，序列为ACTGSTQHQCG，透皮肽与膜融合载体的质量比为0.1-0.6:1。本发明使用的透皮肽通常是由十几个氨基酸组成的短肽，作用于皮肤后可短暂打开皮肤孔道，促进有效成分的透皮吸收且不损伤皮肤。本发明中将透皮肽修饰在纳米载体表面，可以在不增加载体纳米尺寸的前提下，使有效成分高效透过角质层，进入真皮层，并增加真皮层成纤维细胞对有效成分的摄取，刺激细胞再生、胶原合成、组织修复，进而从细胞层面发挥美容护肤功效。
其中，步骤(3)所述挤出法使用滤膜为聚碳酸酯膜，滤膜孔径包括5μm、1μm、400nm和200nm，每种滤膜反复挤出10-20次。
其中，步骤(4)所述植物精油为桉叶油，荷荷巴油，乳木果油，鳄梨油，杏仁油中的一种或几种；所述增溶剂为丙二醇、甘油、乙醇、丁二醇中的一种或几种。本发明使用的植物中提取的植物精油具有透皮吸收效果好、来源天然、安全性高等优点，同时，植物精油具有赋香、抗炎、抑菌、抗氧化等作用，将其应用至护肤品中可以避免防腐剂、香精等其他化学物质的添加。
其中，步骤(4)中植物精油、增溶剂、卡波姆的质量比为0.25-2.5：2-10：0.25-2。
其中，步骤(5)中膜融合载体与植物精油凝胶的质量比为2:1-1:2。
本发明所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂制备方法所制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂。
本发明所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂制备方法所制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂在皮肤深层美白中的应用。
本发明的设计原理为：皮肤由于角质层的存在，普通护肤品难以透过角质层进入皮肤深层发挥功效，克服角质屏障限制的方法主要有两种，一种是使用经皮渗透促进剂如化学合成的透皮剂如氮酮等，但存在刺激性高、对皮肤产生不可逆损伤等风险，植物精油是一大类新兴的优良经皮渗透剂，具有天然、高效等优点；另一种是使用纳米载体如传统脂质体，但存在透皮效果有限等问题，传递体相比脂质体具有更高的膜流动性及变形性，能够穿过小于自身粒径数倍的皮肤细胞间隙因而具有更好的透皮效果，透皮肽可以短暂、可逆的干扰皮肤角质层的有序排列，快速促进有效成分的透皮吸收。本发明将植物精油、传递体、透皮肽三者联用，协同增强外泌体及小分子美容肽的透皮效果，以期改善传统护肤品吸收量低、新兴微针、水光针等物理导入手段创伤性强等缺点。
因此，本发明将传递体与外泌体进行膜融合构建为一种新型纳米载体，该纳米载体包裹具有多重美容功效的小分子肽如寡肽-1等，表面修饰有透皮肽，同时与具有透皮作用的天然植物精油联用，以实现对小分子肽高效包封的同时促进有效成分向皮肤深层的渗透，更好的发挥美容效果，同时将外泌体与传递体进行膜融合后，利于改善外泌体载药量以及自身稳定性差等问题。
此外，本发明中使用的植物精油是一类新型性质优良的透皮促渗剂，但是本发明中发现本发明特定的传递体、透皮肽并不是与所有的促渗透植物精油均有较好的促渗透效果，只有与芳香类植物精油如桉叶油的结合后透皮的效果最为突出，植物精油桉叶油不仅可以作为护肤成分的渗透促进剂，还具有抗炎、抑菌、抗氧化、赋香等作用，功效全面，来源天然，在护肤品领域有着良好的开发和应用前景。本发明中使用特定的桉叶油透皮效果显著，优于化学合成促渗剂氮酮。(表2)；传递体、透皮肽、植物精油联用可以取得最佳的透皮效果(图3)。
本发明制备的传递体-外泌体膜融合制剂能显著改善小分子肽的载药量，与传统脂质体相比具有更高的变形性、更优异的透皮效果，与具有透皮作用的植物精油协同起效，以更好地促进功效美容成分向皮肤深层的渗透，通过简单涂抹而非借助微针、水光针等物理手段即有望实现紧致肌肤，恢复皮肤活力，改善细纹，对抗松弛、暗哑，使肌肤重现立体与饱满等多重美容功效(主要由小分子肽与外泌体提供)，使用方便无痛感，对皮肤无刺激，安全、稳定、高效，在医疗市场和美容化妆品领域具有巨大的应用市场和开发前景。
有益结果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、大多数化妆品的有效成分只能停留在皮肤的浅层，无法进入皮肤深层，也就无法从根本上改善肌肤问题。本发明将具有优异变形性及透皮性能的传递体表面修饰有短链的透皮肽，辅以天然高效的植物精油作为透皮吸收促进剂，三者联用，协同起效，用于增强有效成分在皮肤中的深层渗透以改善美容效果，有望克服传统护肤品透皮吸收效果差、新兴美容手段如微针、水光针等皮肤损伤性强等缺点，为各类护肤成分的高效递送提供了新的策略。
2、选用生物相容性好的小分子美容肽及仿生载体外泌体为美容活性成分，二者协同起效，利用生物手段，从细胞层面实现对肌肤全面、立体、深度修护。
3、将外泌体与传递体进行膜融合，克服了外泌体载药量差、稳定性差的缺点，同时保留了外泌体原有的生物活性。
4、本发明将外泌体与经皮给药有效结合，为外泌体在其他慢性皮肤病或需经皮给药发挥全身治疗作用中的应用提供了可能。
5、植物精油来源天然，对皮肤无毒、无刺激，本身具有赋香、抗炎、抑菌、抗氧化等药理作用，同时具有一定的保湿等基础护肤功效，将其应用在护肤品中，能够避免防腐剂、香精等化学物质的添加，符合天然护肤的现代理念。
6、植物精油种类多样，但并非所有的植物精油均具有透皮促渗功效，本发明通过在体外实验发现芳香类植物精油桉叶油的透皮促渗效果与本发明特定的传递体、透皮肽结合显著优于其他植物精油，甚至优于化学合成的渗透促进剂氮酮，为该类别植物精油在护肤品中的应用奠定了一定基础。
附图说明
图1为透射电子显微镜对外泌体、传递体、传递体-外泌体膜融合载体的形态表征。
图2为不同植物精油作用下的单位面积累积透过量-时间曲线图。
图3为倒置荧光显微镜对不同组成的传递体-外泌体膜融合载体的透皮吸收效果表征。注：G1：空白对照组(空白凝胶)；G2：等浓度的游离药物凝胶组；G3：游离药物与空白传递体物理混合物凝胶组；G4：脂质体凝胶组；G5：传递体凝胶组；G6：传递体-外泌体膜融合凝胶组；G7：透皮肽修饰+传递体-外泌体膜融合凝胶组；G8：传递体-外泌体膜融合载体+植物精油凝胶组；G9：传递体-外泌体膜融合载体+透皮肽修饰+植物精油凝胶组。
图4为具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对动物皮肤的安全性评价。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步说明本发明，并不以任何方式限制本发明，这些实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
人脐带间充质干细胞，购自购于上海ATCC细胞库；透皮肽粉末(序列为ACTGSTQHQCG)，由上海生工合成；大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，胆固醇，均购自上海艾伟特医药科技有限公司；寡肽-1、三肽-1、六肽-12，购自sigma；荷荷巴油，乳木果油，鳄梨油，杏仁油，桉叶油均购自江西吉水益康天然香料油提炼厂。
其他试剂原料均市售可得。
实施例1
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化：
以含10％胎牛血清的DMEM为培养基，于37℃，5％CO2条件下培养人脐带来源的间充质干细胞至第4代，细胞贴壁生长至培养皿90％时(约1×107个)，换用无血清的DMEM培养基继续37℃培养24h，收集培养基，使用超高速离心机以4℃，2000g离心10min去除细胞碎片，取上清过0.22μm滤膜，于100000g，离心70min，得到外泌体，-80℃储存备用；
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取寡肽-1(5mg)，用5mL PBS(pH7.4)溶解，作为水合液备用。称取EPC(45mg),胆固醇(5mg)、吐温80(8mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(截留分子量＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体溶液按5:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm、1μm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出10次再换下一种，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体溶液；加入透皮肽，使透皮肽与载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的质量比为0.1:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；
(4)植物精油凝胶的制备：
称取桉叶油(0.25g)，甘油(2g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(2g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.0，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油联用的多功效美容制剂的制备：
将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按2:1质量比混合，搅拌均匀形成凝胶剂，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例2
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1；
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取三肽-1(4mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取EPC(44mg)，胆固醇(6mg)，吐温80(8mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有三肽-1的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体溶液按4:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出10次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.2:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取桉叶油(0.5g)，甘油(4g)，丙二醇(1g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(1.5g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.0，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按2:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例3
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1；
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取三肽-1(5mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取SPC(87.50mg),胆固醇(12.50mg)，吐温80(8mg)，脱氧胆酸钠(7mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有三肽-1的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按3:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出10次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.3:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取桉叶油(0.5g)，鳄梨油(0.2g)，丙二醇(5g)，无水乙醇(2g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(1g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.0，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按2:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例4
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取六肽-12(2mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取SPC(130mg),胆固醇(20mg)，胆酸钠(13mg)，脱氧胆酸钠(12mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有六肽-12的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按2:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出12次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.4:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取荷荷巴油(0.8g)、丙二醇(4g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(0.5g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.5，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按2:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例5
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取寡肽-1(2.5mg)，三肽-1(2.5mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取DSPC(160mg)，胆固醇(30mg)，脱氧胆酸钠(28mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于55℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1及三肽-1的PBS溶液5mL，于55℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按1:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出15次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.5:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取乳木果油(1.0g)、甘油(6g)、无水醇(2g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(0.5g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.5，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例6
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取寡肽-1(3mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取SPC(184mg)，胆固醇(26mg)，脱氧胆酸钠(30mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按1:2质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出20次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.6:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取桉叶油(2g)、甘油(10g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(1g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至5.5，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
取实施例6步骤(1)-(3)制备的外泌体、传递体、传递体-外泌体膜融合载体样品，纯化水按质量比稀释50倍，然后点样于专用铜网上自然晾干，再用1％的磷钨酸染色，使用透射电子显微镜对三者的形态结构进行拍摄，结果如图1所示，表明所制备的外泌体、传递体及膜融合载体均具有纳米结构，并且制备成功。
实施例7
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取寡肽-1(3.5mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取HSPC(150mg)，胆固醇(25mg)，吐温80(20mg)，脱氧胆酸钠(5mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于55℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1的PBS溶液5mL，于55℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按1:3质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出15次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.5:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取杏仁油(2.5g)、丙二醇(6g)，无水乙醇(4g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(1.5g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至6.0，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例8
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取六-1(1.8mg),用5mL PBS溶解，备用。称取SPC(45mg),HSPC(45mg)，胆固醇(12mg)，脱氧胆酸钠(16mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于55℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1的PBS溶液5mL，于55℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按1:4质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出10次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.6:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取荷荷巴油(2g)、鳄梨油(0.5g)、无水乙醇(3g)、丁二醇(7g)，添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(1g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至6.0，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：
将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例9
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取三肽-1(1.5mg),六肽-12(1.5mg)，用5mL PBS溶解，备用。称取EPC(90mg)，HSPC(30mg)，胆固醇(20mg)，吐温80(10mg)，胆酸钠(10mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于55℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有三肽-1及六肽-12的PBS溶液5mL，于55℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按1:5质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出10次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.3:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取荷荷巴油(2g)、桉叶油(0.3g)、乳木果油(0.2g)、丙二醇(8g)、添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(0.5g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至6.5，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：
将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:2质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
实施例10
一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备：
(1)间充质干细胞外泌体的提取及分离纯化，同实施例1
(2)载小分子肽传递体的制备：
称取寡肽-1(2mg),用5mL PBS溶解，备用。称取EPC(35mg)，胆固醇(5mg)，胆酸钠(8mg)于100mL茄形瓶，加入5mL无水乙醇超声溶解，于25℃减压成膜除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入含有寡肽-1的PBS溶液5mL，于25℃，120rpm条件下旋转水合20min，得传递体混悬液，使用透析袋(mW＝30kD)过夜透析除去传递体混悬液中未被包封的游离肽，得到传递体溶液，4℃储存备用；
(3)透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的制备：
将步骤(1)的外泌体与步骤(2)的传递体按2:1质量比混合，用挤出器分别过孔径为5μm,1μm,400nm,200nm的聚碳酸酯膜，每种滤膜反复挤出15次，得到载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；加入透皮肽，使透皮肽与膜融合载体的质量比为0.5:1，摇床振摇3h后于4℃，150000g条件下离心1h，弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体。
(4)植物精油凝胶的制备：
称取桉叶油(1.5g)、杏仁油(1g)、甘油(8g)、丙二醇(2g)、添加纯化水，使总量为50g，搅拌均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆940粉末(0.25g)，均匀分散于50g植物精油均相溶液表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH至6.5，形成植物精油凝胶；
(5)透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体与植物精油的联用：将步骤(3)的膜融合载体与步骤(4)的植物精油凝胶按1:1质量比混合，搅拌均匀，即得具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
试验例1
采用实施例6中步骤(2)中的传递体制备方法，研究传递体制备方法中，小分子肽与总脂质的质量比(药脂比)对传递体包封率的影响。
各组分的比例同实施例6，所用脂质为SPC(184mg)，胆固醇(26mg)，所用小分子肽为寡肽-1，不同之处在于：
组1：药脂比1:5(w/w)；
组2：药脂比＝1:10(w/w)；
组3：药脂比＝1:20(w/w)；
组4：药脂比＝1:25(w/w)；
组5：药脂比＝1:30(w/w)；
组6：药脂比＝1:40(w/w)；
组7：药脂比＝1:70(w/w)；
组8：药脂比＝1:80(w/w)；
使用透析袋除去游离的寡肽-1后，取样加甲醇稀释50倍，HPLC测定包封在传递体中的寡肽-1质量，测定八组实验组寡肽-1传递体的包封率，计算公式如下：
E(％)＝(m1/m)×100％
式中，E(％)—包封率；
m1—包封在传递体中的寡肽-1质量,mg；
m—寡肽-1的总投药量，mg；
结果如表1所示。
表1八组寡肽-1传递体的包封率
组别 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8
E(％) 11.04 17.81 29.21 33.05 46.16 59.43 74.11 73.9
由表1以上数据可以看出，随着药脂比的增加，寡肽-1传递体的包封率也随之增加，当药脂比＝1:70(w/w)效果最好，继续增加对寡肽-1传递体的包封率改善不大。
试验例2
试验动物：雄性ICR小鼠28只(20±2g)，购自南京青龙山动物场。
本试验例通过透皮扩散实验仪，初步评价了不同植物精油(荷荷巴油，乳木果油，鳄梨油，杏仁油，桉叶油)的离体透皮效果。
选用健康且皮肤完好的雄性ICR小鼠，2％的水合氯醛麻醉后剔除其腹部被毛，脱颈处死，剥离下腹部皮肤，并小心剔除多余脂肪，-20℃保存备用。按照实施例6的方法制备含不同植物精油的透皮肽修饰的传递体-外泌体膜融合制剂凝胶，将实施例6中桉叶油替换成等浓度的氮酮制成凝胶作为阳性对照，不含植物精油或氮酮的空白凝胶作为空白对照，比较不同植物精油的透皮效果。设置五组实验组(荷荷巴油，乳木果油，鳄梨油，杏仁油，桉叶油组)及两组对照组(阳性对照及空白对照组)，每组4只小鼠。
离体小鼠皮肤室温解冻后，固定于Franz扩散池，角质层朝上，PBS为接收液，供给室加入0.5g各组制剂，于37℃，300rpm条件下进行体外透皮实验，1-12h内每隔1h取样0.2mL，并立即补充等温等体积的新鲜空白接受液，测定12h的单位面积累积透过量(Q12)。计算公式如下：
式中，Cn为第n个取样点药物浓度(μg/mL)，Ci为第i个取样点药物浓度(μg/mL)，A为有效给药面积(3.14cm2)，V为接收液体积(mL)。绘制Q-t曲线图(图2)，所得斜率为透皮吸收速率Jss。结果见表2。
表2不同植物精油作用的经皮渗透参数
由表2可知，不同植物精油中，含桉叶油组在12h内的单位面积透过量最高，透皮吸收速率最大，甚至且优于化学合成的透皮促进剂氮酮，同时采用植物精油安全无刺激性，而氮酮具有皮肤刺激性及不可逆的皮肤损伤，所以本发明的制剂是一种天然、高效的促渗剂，有望应用于多种护肤品，安全的促进有效成分的高效吸收。
试验例3
试验动物：雄性ICR小鼠36只(20±2g)，购自南京青龙山动物场。
本试验例研究了植物精油及透皮肽对透皮吸收效果的影响。
选用健康且皮肤完好的雄ICR小鼠36只，2％的水合氯醛麻醉剔除其腹部被毛，去毛面积为2cm×1cm。以下九组均以FITC代替寡肽-1作为模型药(即实施例6中的小分子肽寡肽-1，便于在荧光显微镜下观察渗透情况)，按照实施例6的方法制备各组所需载体(脂质体的制备除不添加边缘活性剂外，其余条件同传递体的制备)，设置以下九组，每组4只小鼠。
G1：空白对照组(采用实施例6步骤(4)卡波姆940粉末1g，均匀分散于50g纯化水表面，室温下溶胀过夜，使用三乙醇胺调节pH为5.5，形成空白凝胶)；
G2：游离药物凝胶组(称取与实施例6中步骤(2)寡肽-1等质量的FITC，溶于PBS(pH7.4)，再与G1的空白凝胶按1:1质量比混匀，即得)；
G3：游离药物与空白传递体物理混合物凝胶组(G2的游离药物溶液与实施例6步骤(2)的空白传递体(不含寡肽的得传递体混悬液)直接等体积混合均匀后，各组分比例同实施例1步骤(2)传递体溶液，再与G1的空白凝胶按1:1质量比混匀，即得)；
G4：脂质体凝胶组(采用实施例6步骤(2)方法，其中FITC代替寡肽1，不添加边缘活性剂脱氧胆酸钠，同法制备脂质体溶液，与G1的空白凝胶按质量比1:1混匀，即得)；
G5：传递体凝胶组(采用实施例6步骤(2)传递体溶液，其中FITC代替寡肽1，与空白凝胶按1:1质量比混匀，即得)；
G6：传递体-外泌体膜融合凝胶组(采用实施例6步骤(1)-(3)，其中FITC代替寡肽1，步骤(3)不添加透皮肽，同法制备传递体-外泌体膜融合载体与G1的空白凝胶按1:1质量比混匀，即得)；
G7：透皮肽修饰+传递体-外泌体膜融合凝胶组(实施例6步骤(1)-(3)制备的透皮肽修饰的传递体-外泌体膜融合载体与G1的空白凝胶按1:1质量比混匀，其中其中FITC代替寡肽1，即得)；
G8：传递体-外泌体膜融合载体+植物精油凝胶组(实施例6步骤(1)-(3)，其中FITC代替寡肽1，不添加透皮肽，同法制备传递体-外泌体膜融合载体与步骤(4)植物精油凝胶按1:1质量比混匀，即得)；
G9：传递体-外泌体膜融合载体+透皮肽修饰组+植物精油凝胶组(实施例6最终的制剂，其中FITC代替寡肽1)。
取各组制剂0.5g，均匀涂抹于去毛皮肤表面，8h后去除残余制剂，温水洗净给药部位皮肤，剪下并剔除多余脂肪组织，冷冻切片机制备厚度为8μm的皮肤切片，倒置荧光显微镜观察不同组别的模型药在体皮肤渗透情况(图3)。图3中从上到下为皮肤表面逐步到深层次皮肤，深层皮肤中的荧光分布越多，荧光强度越高，表明透皮效果越好。
与空白对照相组(G1)比，游离药物凝胶组(G2)仅有少量停留在皮肤浅表，大部分难以克服角质层的屏障限制进入皮肤。将游离药物与空白传递体通过简单的物理混合(G3)后，皮肤中的荧光强度略有提高，证明空白载体本身也可以与在一定程度上干扰皮肤的角质脂质排列，引起游离的药物渗透增加，但效果仍然不够明显，同时单独的外泌体凝胶制剂由于其较小的纳米粒径，虽然可以渗透进入皮肤，但受其膜流动性较差、变形性不足的影响也较难进入皮肤深层。包裹于脂质体后的药物(G4)可以在皮肤角质层中观察到一定的荧光分布，证明脂质体的脂质与皮肤角质层脂质发生了相互作用，引起药物在皮肤表层的积累，但受载体限制，其在深层皮肤中的渗透效果仍然较差。传递体组(G5)在深层皮肤也有荧光分布，证明了传递体利用自身的高流动性、高变形性，可以携带模型药物进入皮肤深层；将传递体与外泌体融合后得到的载体(G6)同样保留了传递体可以进入皮肤深层这一特点，证明膜融合对传递体原有的高流动性、高变形性的影响不大。当传递体-外泌体膜融合载体经透皮肽修饰或与植物精油联用(G7、G8)后，皮肤中的荧光强度在一定程度上得到增强，但只有当传递体、透皮肽、植物精油三者联用时(G9)，模型药在皮肤中的荧光分布深度和强度才会得到显著提升，证明了传递体、透皮肽、植物精油三者联用对透皮作用增强的有效性。
试验例4
试验动物：雄性ICR小鼠3只(20±2g)，购自南京青龙山动物场。
本试验例研究了具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对动物皮肤刺激性的影响。
选用健康且皮肤完好的雄性ICR小鼠3只，2％的水合氯醛麻醉。剔除其腹部被毛，去毛面积为2cm×1cm。取本发明实施例6制备的透皮肽修饰的膜融合载体植物精油凝胶(即最后的凝胶制剂)0.5g，涂于去毛皮肤表面，空白对照组小鼠涂抹空白凝胶。12h后去除残余制剂，温水洗净给药部位皮肤，观察涂抹部位皮肤反应，处死并取下给药部位皮肤，HE染色，光学显微镜下观察红斑及水肿情况。
与空白对照相比，试验动物皮肤表面未见任何红斑、红肿、发炎现象(图4)，表明本发明制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对试验动物皮肤无激性。
试验例5
小鼠B16 F10黑色素瘤细胞，购于上海ATCC细胞库；L-左旋多巴，购于南京何苗生物技术有限公司。
本试验例以小鼠B16 F10黑色素瘤细胞及实施例6制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂为研究对象，以小鼠黑色素瘤细胞的增殖情况、酪氨酸酶活性、黑色素合成量为指标，在离体层面上评价了具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的美白功效。
(1)MTT法测定具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠B16 F10黑色素瘤细胞增殖率及形态的影响，实验步骤如下：
(a)种板：收集生长至对数期的细胞，以7000个/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔含有100μL完全培养基，每组设5个复孔，在5％CO2及37℃条件下培养24h；
(b)给药：吸弃培养基，每孔加入100μL含有不同浓度药物(50、100、200、400、500μg/mL)的透皮肽修饰的膜融合载体植物精油凝胶(实施例6的最终制剂)(溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)，另设置对照组(即不含药物的细胞全活组，溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)、调零组(即不含细胞及培养基的调零孔，溶剂为PBS)，在5％CO2及37℃条件下继续培养24h；
(c)检测：吸弃培养基，每孔加入120μL含有MTT 0.5mg/mL DMEM培养基溶液，培养4h后，吸弃上清，每孔加入DMSO溶液150μL，500rpm下振荡摇匀10min，用酶标仪于490nm处检测各孔的吸光度(A)；
(d)各组细胞的存活率按照下式计算：
存活率(％)＝(A制剂组-A空白组)/(A对照组-A空白组)；
测定结果见表3。
表3具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠黑色素瘤细胞增殖率的影响
药物浓度(μg/mL) 0 50 100 200 400 500
细胞增殖率(％) 100.00 99.16 98.27 98.12 97.65 96.24
由表3可知，具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠黑色素瘤细胞的增殖率无影响，证明了载体的安全性。
(2)酪氨酸酶活性抑制实验：
(a)种板：收集生长至对数期的细胞，以7000个/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔含有100μL完全培养基，并设5个复孔，在5％CO2及37℃条件下培养24h；
(b)给药：移去培养基，加入100μL含有不同浓度药物(50、100、200、400、500μg/mL)的透皮肽修饰的膜融合载体植物精油凝胶(溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)，另设置对照组(即不含药物的细胞全活组，溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)，在5％CO2及37℃条件下培养24h；
(c)测定：药物处理24h后，吸弃上清，每孔加入含1％TritonX-100的PBS缓冲液90μL和1mg/mL的L-左旋多巴10μL，超声30秒后置于30℃恒温水浴中30min，测定475nm处的吸光度(A)，计算公式如下：
酪氨酸酶活性(％)＝A实验组/A对照组×100％；
测定结果见表4。
表4具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响
药物浓度(μg/mL) 50 100 200 400 500
酪氨酸酶活性(％) 84.09 70.56 57.43 44.18 36.07
酪氨酸酶是细胞内黑色素合成的关键酶之一，其活性对黑色素的合成具有直接影响。由表4可知，具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的抑制呈一定的剂量依赖作用，结合细胞增殖实验，说明本发明可在不影响细胞活力的前提下下调酪氨酸酶活性，酶活性降低引起黑色素合成减少。
(3)黑色素合成量测定
(a)种板：收集生长至对数期的细胞，接种于6孔板，每孔含有2mL完全培养基，并设4个复孔，在5％CO2及37℃条件下培养24h；
(b)给药：移去培养基，加入100μL含有不同浓度药物(50、100、200、400、500μg/mL)的透皮肽修饰的膜融合载体植物精油凝胶(溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)，另设置对照组(即不含药物的细胞全活组，溶剂为含1％DMSO的DMEM培养基)，在5％CO2及37℃条件下培养24h；
(c)测定：药物处理24h后，吸弃上清液，用PBS溶液洗涤2次，收集细胞于离心管中，1500rpm离心10min,弃上清，加入2mL PBS重悬，后加入500μL乙醇-乙醚(1:1,v/v)，室温下放置30min，3000rpm离心5min，加入1mL含有10％DMSO的1mol/L的NaOH溶液，85℃水浴45min，测定其405nm处的吸光度(A)，计算公式如下：
黑色素合成量(％)＝A实验组/A对照组×100％。
测定结果见表5。
表5透皮肽修饰的载小分子肽的传递体-外泌体膜融合制剂对小鼠黑色素瘤细胞黑色素合成量的影响
药物浓度(μg/mL) 50 100 200 400 500
黑色素合成量(％) 96.22 80.97 67.48 52.80 47.64
由表5可知，本发明所制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂在一定浓度范围内可以抑制黑色素的生成，说明本发明的制剂在美白祛斑中具有很好的的应用前景。

Claims (8)

1.一种具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）间充质干细胞外泌体的提取分离：培养间充质干细胞，超速离心法提取外泌体；
（2）载有小分子肽的传递体制备：称取磷脂，胆固醇，边缘活性剂，加入小分子肽溶液，采用薄膜分散法制备含有小分子肽的传递体混悬液；
（3）透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体的构建：将步骤（1）的外泌体和步骤（2）的传递体混悬液混合，采用挤出法使得载有小分子肽的传递体与外泌体的膜融合，加入透皮肽，混合后离心弃去上清，得到透皮肽修饰的载有小分子肽的传递体-外泌体膜融合载体；
（4）植物精油凝胶的制备：称取植物精油、增溶剂、纯化水混合均匀，形成植物精油的均相溶液；称取卡波姆粉末，均匀分散于植物精油均相溶液表面，溶胀过夜，形成植物精油凝胶；
（5）具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合美容制剂：将步骤（3）的膜融合载体与步骤（4）的植物精油凝胶混合，搅拌均匀，即得；
步骤（2）中所述边缘活性剂为吐温80、胆酸钠、去氧胆酸钠中的一种或几种的组合物；所述小分子肽为寡肽-1、三肽-1和六肽-12中的一种或几种的组合物；
步骤（3）中所述透皮肽由十一个氨基酸组成，序列为ACTGSTQHQCG；
步骤（4）中所述植物精油为桉叶油、荷荷巴油、乳木果油、鳄梨油、杏仁油中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述磷脂为大豆磷脂(SPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述磷脂与胆固醇的质量比为9:5-1，边缘活性剂与总脂质的质量比为1:5-7，小分子肽与总脂质的质量比为1:10-80，薄膜分散法中的成膜及水合温度为25-55℃。
4.根据权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述外泌体与传递体的质量比为5:1-1:5，透皮肽与膜融合载体的质量比为0.1-0.6:1；挤出法使用滤膜为聚碳酸酯膜，滤膜孔径包括5 μm、1 μm、400 nm和200nm，每种滤膜反复挤出10-20次。
5.根据权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中植物精油、增溶剂、卡波姆的质量比为0.25-2.5:2-10:0.25-2。
6.根据权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）中膜融合载体与植物精油凝胶的质量比为2:1-1:2。
7.一种权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法所制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂。
8.一种权利要求1所述的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂的制备方法所制备的具有透皮增强作用的传递体-外泌体膜融合制剂在制备皮肤深层美白的试剂或者药物中的应用。
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