具体实施方式
本发明提供了一种靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物,包括β-烟酰胺单核苷酸NMN、其他抗衰活性成分和纳米载药载体;
所述β-烟酰胺单核苷酸NMN占所述纳米组合物总质量的0.1%~10%;
所述其他抗衰活性成分包括抗氧化剂、蛋白合成促进剂、抗光老化剂以及保湿剂中的至少一种;
所述纳米载药载体的原料包括促细胞渗透剂、乳化剂、助乳化剂、液体脂质和水。
本发明提供的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物包括β-烟酰胺单核苷酸NMN;在本发明中,所述NMN的质量百分比为0.1%~10%,优选为1%~8%,进一步优选为3%~7%,更优选为5%~6%。NMN是靶向线粒体抗衰活性物,是NAD+直接前体物质;本发明合理控制NMN的含量,能够提高体内NAD+水平,恢复线粒体能量,避免能量供应不足使机体代谢能力下降,抑制衰老;并且得益于纳米化的优势,只需适量该活性成分,即可有效充分透皮、发挥功效。
生命的新陈代谢活动是许多生物化学反应的综合结果,要使皮肤抗衰防老,往往是多种生理活性物质的协同作用,除恢复线粒体功能外,还能从不同方面共同对抗衰老。本发明提供的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物包括其他抗衰活性成分。在本发明中,所述其他抗衰活性成分包括抗氧化剂、蛋白合成促进剂、抗光老化剂以及保湿剂中的至少一种。
在本发明中,所述抗氧化剂包括但不限于维生素类抗氧化剂和非维生素类抗氧化剂中的一种或多种,所述维生素类抗氧化剂优选为维生素P、维生素C及其衍生物、维生素E及其衍生物。在本发明中,维生素C衍生物包括但不限于维C乙基醚、维C磷酸酯、抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸棕榈酸酯中的一种或多种;维生素E衍生物包括但不限于维E醋酸酯、维E琥珀酸酯、维E亚油酸酯和维E糖苷中的一种或多种。所述维生素类抗氧化剂进一步优选为维生素P、维C乙基醚、维E醋酸酯;所述非维生素类抗氧化剂优选为白藜芦醇、茶多酚、肌肽、脱羧肌肽、麦角硫因、虾青素和辅酶Q10,进一步优选为白藜芦醇、脱羧肌肽、麦角硫因、辅酶Q10;更优选的,所述抗氧化剂由上述物质中的1~2种组成;最优选的,所述抗氧化剂为脱羧肌肽、麦角硫因的混合物,所述脱羧肌肽和麦角硫因的质量比优选为1∶1~5,进一步优选为1∶2。
在本发明中,当所述其他抗衰老活性成分包括抗氧化剂时,所述抗氧化剂的质量为纳米组合物总质量的0.1~10%,优选为1~8%,进一步优选为2%~6%,更优选为4%~5%。
在本发明中,所述抗氧化剂所含活性物质通过抑制自由基产生,还原自由基链反应,清除和捕集自由基。抗氧化剂稳定性较差,直接添加到化妆品中容易氧化降解,本发明采用纳米载药载体包裹抗氧化剂,将其包裹在载体内部,能够有效地延长抗氧化剂的保存时间,提高整体稳定性。进一步的,本发明合理搭配特定的抗氧化剂,再结合纳米化过程使其抗氧化性能更为突出。
在本发明中,所述蛋白合成促进剂包括但不限于信号肽和非肽类蛋白合成促进剂中的一种或多种,所述信号肽优选为乙酰基四肽-9、棕榈酰五肽-4、铜肽、棕榈酰六肽-12、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、六肽-9和肉豆蔻酰五肽-11中的一种或多种,进一步优选为棕榈酰五肽-4、铜肽、棕榈酰三肽-1和六肽-9中的一种或多种;所述非肽类蛋白合成促进剂优选为γ-氨基丁酸、腺苷和羟丙基四氢吡喃三醇,进一步优选为γ-氨基丁酸、腺苷;更优选的,本发明所述蛋白合成促进剂由上述物质中的1种、2种或3种组成;最优选的,所述蛋白合成促进剂为棕榈酰三肽-1、六肽-9和γ-氨基丁酸的混合物;当同时含有棕榈酰三肽-1和六肽-9时,所述棕榈酰三肽-1和六肽-9的质量比优选为0.5~2∶1,进一步优选为1∶1。
在本发明中,当所述其他抗衰老活性成分包括蛋白合成促进剂时,所述蛋白合成促进剂的质量为纳米组合物总质量的0.1~10%。其中,当所述蛋白合成促进剂包括信号肽时,所述信号肽的质量优选为纳米组合物总质量的0.1~1%,进一步优选为0.3%~0.8%,更优选为0.5%~0.6%;当所述蛋白合成促进剂为γ-氨基丁酸、腺苷和羟丙基四氢吡喃三醇时,所述γ-氨基丁酸、腺苷和羟丙基四氢吡喃三醇的质量优选为纳米组合物总质量的1~8%,进一步优选为3%~6%,更优选为4%~5%。
在本发明中,所述蛋白合成促进剂刺激成纤维细胞更新,从而促进胶原蛋白、弹性蛋白及糖胺聚糖的合成,减少肌肤细纹,增加皮肤厚度,增强肌肤紧致感和光泽度,达到皮肤抗衰老的效果。进一步的,本发明合理搭配特定蛋白合成促进剂,再结合纳米化过程,加速胶原蛋白等的合成,抗衰老性能更为突出。
在本发明中,所述抗光老化剂包括但不限于基质金属蛋白酶抑制剂和细胞修复剂中的一种或多种,所述基质金属蛋白酶抑制剂优选为视黄醇、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇乙酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯和视黄醇视黄酸酯中的一种或多种,进一步优选为视黄醇棕榈酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯和视黄醇视黄酸酯中的一种或多种;所述细胞修复剂优选为依克多因和/或烟酰胺,进一步优选为依克多因;更优选的,本发明所述抗光老化剂由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述抗光老化剂为羟基频哪酮视黄酸酯和依克多因的混合物,二者的质量比优选为0.5~2∶1,最优选为1∶1。
在本发明中,当所述其他抗衰老活性成分包括抗光老化剂时,所述抗光老化剂的质量优选为纳米组合物总质量的0.1~10%,进一步优选为1~8%,进一步优选为2%~7%,更优选为4%~6%。
在本发明中,所述基质金属蛋白酶抑制剂能够抑制基质金属蛋白酶(MMP)被紫外线过度刺激后产生的活性,减少对胶原蛋白和纤维组织的伤害,阻止光老化,防止皮肤皱纹、松弛的情况出现;而细胞修复剂能对抗紫外线对皮肤的伤害,修复紫外线导致的细胞DNA损伤。进一步的,本发明合理搭配特定抗光老化剂,再结合纳米化过程,使其抗光老化以及修复性能更为突出。
在本发明中,所述保湿剂包括但不限于生理性脂质、多糖类吸湿剂和与水结合的生物大分子中的一种或多种,所述生理性脂质优选为神经酰胺、脂肪酸和胆固醇中的一种或多种,进一步优选为神经酰胺;所述多糖类吸湿剂优选为银耳多糖、β-葡聚糖和海藻糖中的一种或多种,进一步优选为银耳多糖和β-葡聚糖;所述与水结合的生物大分子优选为聚谷氨酸钠、透明质酸和聚天冬氨酸钠中的一种或多种,进一步优选为聚谷氨酸钠和透明质酸;更优选的,本发明所述保湿剂由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述保湿剂为聚谷氨酸钠和透明质酸的混合物,二者的质量比优选为0.5~2∶1,进一步优选为1∶1。
在本发明中,当所述其他抗衰老活性成分包括保湿剂时,所述保湿剂的质量优选为纳米组合物总质量的0.1~10%,进一步优选为1~8%,更优选为3%~7%,最优选为4%~5%。
在本发明中,所述保湿剂一方面调节皮肤屏障功能,另一方面使皮肤吸收大量水,并填充胶原蛋白和真皮内其他结构之间的空间,使得基质网状结构弹性增强,加强细胞的紧致性和肌肤的弹性。进一步的,本发明合理搭配特定保湿剂,再结合纳米化过程,使其吸水保湿性能更为突出。
在本发明中,所述其他抗衰老活性成分与NMN合理搭配,存在协同增效作用。复配后的多靶点给药的抗衰老效果优于单一抗衰老成分的高浓度使用,即本发明通过NMN与其他抗衰老成分的复配提高了抗衰老效果。
本发明提供的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物包括纳米载药载体。本发明所述纳米载药载体用于包裹NMN和其他抗衰老活性活性成分。在本发明中,所述纳米载药载体的原料包括促细胞渗透剂、乳化剂、助乳化剂、液体脂质和水。
在本发明中,所述促细胞渗透剂包括但不限于聚季铵盐类促细胞渗透剂和磷脂酰胆碱类促细胞渗透剂中的一种或多种,所述聚季铵盐类促细胞渗透剂优选为聚季铵盐-51;所述磷脂酰胆碱类促细胞渗透剂优选为二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种,进一步优选为二棕榈酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱;更优选的,本发明所述促细胞渗透剂由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述促细胞渗透剂为二月桂酰磷脂酰胆碱和聚季铵盐-51的混合物,二者的质量比优选为0.5~2∶1,进一步优选为1∶1。
在本发明中,所述促细胞渗透剂的质量优选为纳米组合物总质量的0.1~5%,进一步优选为0.5~3%,更优选为1.5%~2.5%,最优选为1.8%~2%。
在本发明中,所述促细胞渗透剂具有与人体细胞膜极其相似的成分及特性,包含磷酰胆碱的结构,非常亲和人体细胞,具有良好的生物相容性,通过增强皮肤角质层的通透性,促进活性成分透过角质层,能够防止活性成分的氧化变质,从而进一步提高了整体的稳定性。
在本发明中,所述乳化剂包括但不限于卵磷脂、聚甘油类乳化剂、葡糖苷类乳化剂和聚乙二醇类乳化剂中的一种或多种,所述卵磷脂优选为羟基化卵磷脂和/或大豆卵磷脂,进一步优选为羟基化卵磷脂;所述聚甘油类乳化剂优选为聚甘油-10油酸酯、聚甘油-10月桂酸酯和聚甘油-10肉豆蔻酸酯中的一种或多种,进一步优选为聚甘油-10油酸酯和聚甘油-10月桂酸酯;所述葡糖苷类乳化剂优选为鲸蜡硬脂基葡糖苷和/或椰油基葡糖苷,进一步优选为椰油基葡糖苷;所述聚乙二醇类乳化剂优选为辛癸酸聚乙二醇甘油酯和/或聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,进一步优选为辛癸酸聚乙二醇甘油酯;更优选的,本发明所述乳化剂由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述乳化剂为羟基化卵磷脂和椰油基葡糖苷的混合物,所述羟基化卵磷脂和椰油基葡糖苷的质量比优选为1∶1~5,进一步优选为1∶2。
在本发明中,所述乳化剂的质量为纳米组合物总质量的1~20%,优选为5~15%,进一步优选为6%~13%,更优选为7%~10%。
本发明采用特定非离子乳化剂起到乳化作用,皮肤相容性好,温和无刺激,通过形成牢固的乳化膜降低油水界面张力,并且对活性成分还能起到增溶效果。所述乳化剂的用量比例要适当,用量过少时乳化能力较低,性质不稳定,用量过多时则容易形成胶束,直接影响到药物的释放。当不同乳化剂搭配使用时,由于乳化剂分子之间的相互作用,导致形成更加紧密、更高强度的复合膜,使得纳米组合物更加稳定。
在本发明中,所述助乳化剂包括但不限于多元醇类助乳化剂和醚类助乳化剂中的一种或多种,所述多元醇类助乳化剂优选为甘油、丁二醇、1,3-丙二醇、二丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇和辛基十二醇中的一种或多种,进一步优选为甘油、丁二醇、1,3-丙二醇和1,2-戊二醇中的一种或多种;所述醚类助乳化剂优选为二乙二醇单乙基醚、PPG-26-丁醇聚醚-26和乙氧基二乙二醇油酸酯中的一种或多种,进一步优选为二乙二醇单乙基醚和/或PPG-26-丁醇聚醚-26;更优选的,本发明所述助乳化剂由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述助乳化剂为1,3-丙二醇和丁二醇的混合物,所述混合物中1,3-丙二醇和丁二醇的含量比例优选为1∶1~5,进一步优选为4∶5。
在本发明中,所述助乳化剂的质量为纳米组合物总质量的1~20%,优选为5~15%,进一步优选为6%~13%,更优选为9%~10%。
本发明所述助乳化剂起到助乳化作用,既能够提高油水界面膜的柔顺性和牢固性,又可增加乳化剂的溶解性,协助乳化剂调节亲油亲水平衡值,降低界面张力和整个体系的黏度。
在本发明中,所述液体脂质包括但不限于植物油脂和合成油脂中的一种或多种,所述植物油脂优选为橄榄油、角鲨烯、大豆油和蓖麻油中的一种或多种,进一步优选为角鲨烯、大豆油和蓖麻油中的一种或多种;所述合成油脂优选为肉豆蔻酸异丙酯、中链甘油三酯、棕榈酸异丙酯、辛酸癸酸甘油三酯、亚油酸甘油酯和异壬酸异壬酯中的一种或多种,进一步优选为中链甘油三酯、棕榈酸异丙酯和辛酸癸酸甘油三酯中的一种或多种;更优选的,本发明所述液体脂质由上述物质中的1种或2种组成;最优选的,所述液体脂质为大豆油、棕榈酸异丙酯的混合物,其含量比例优选为1∶1~5,进一步优选为4∶5。
在本发明中,所述液体脂质的质量为纳米组合物总质量的1~20%,优选为5~15%,进一步优选为6%~12%,更优选为8~10%。
在本发明中,液体脂质和水在乳化剂的作用下形成油水界面膜来包裹活性成分,维持活性成分的稳定性,增加了活性成分的溶解性能和抗衰老功效。油脂对纳米乳单相区的存在及药物的增溶非常重要,单一的油脂有时不能满足纳米乳制剂对油相的要求,需要进行不同油脂的混合。
本发明还含有余量的水;所述水优选为蒸馏水或纯化水。本发明采用水作为溶剂,溶解其他抗衰老活性成分中的水溶性成分。
本发明还提供了上述技术方案所述靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物的制备方法,包括以下步骤:
将液体脂质、促细胞渗透剂、乳化剂、助乳化剂和非水溶性的其他抗衰活性成分混合,得到油相;
将NMN和水溶性的其他抗衰活性成分与水混合,得到水相;
将所述油相与所述水相混合乳化后微米化处理,得到微米级分散体;
将所述微米级分散体进行纳米化处理,得到靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物。
本发明提供的制备方法,根据其他抗衰老活性成分的水溶性分为水溶性抗衰老活性成分和非水溶性抗衰老活性成分,并且分别采用不同的溶剂进行溶解,提高了抗衰活性物的溶解度;依次进行微米化、纳米化处理,促进了功效成分透过皮肤屏障进入皮肤深层组织,增加了功效成分进入抗衰靶细胞和线粒体,显著提高了功效成分的生物利用度,增强了抗衰、抗氧化功效。此外,纳米组合物具有良好的稳定性,对皮肤温和无刺激。
本发明将液体脂质、促细胞渗透剂、乳化剂、助乳化剂和非水溶性的其他抗衰活性成分混合,得到油相。在本发明中,所述混合的温度优选为20~60℃,进一步优选为30~50℃,更优选为35~45℃。
本发明将NMN以及水溶性的其他抗衰老活性成分和水混合,得到水相。在本发明中,所述混合的温度优选为20~60℃,进一步优选为30~50℃,更优选为35~45℃。
得到水相和油相后,本发明将所述油相与所述水相混合乳化后微米化处理,得到微米级分散体。在本发明中,所述混合乳化的方式包括:将所述水相滴加至所述油相中。所述滴加的速度优选为1~5滴/秒,进一步优选2~3滴/s;更优选的,所述滴加水相在搅拌条件下滴加,所述搅拌速率优选为500r/min~800r/min,优选为600r/min~700r/min;所述混合乳化的温度优选为20~60℃,进一步优选为30~50℃,更优选为35~45℃。
在本发明中,所述微米化处理的方式优选为高速剪切乳化,所述剪切乳化的剪切转速优选为4000~10000rpm,进一步优选为5000~8000rpm,更优选为6000~7000rpm;剪切时间优选为1~10min,进一步优选为3~8min,更优选为4~6min。在本发明中,所述微米化处理得到的微米化分散体粒径为1~100μm,优选为2~80μm,进一步优选为5~50μm。
得到微米级分散体后,本发明将所述微米级分散体进行纳米化处理,得到靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物。
在本发明中,所述纳米化处理的方式优选为高压均质处理或高压微射流处理。
当选择高压均质处理微米级分散体至纳米级时,所述高压均质的压力优选为300~1600bar,进一步优选为500~1200bar,更优选为600~1000bar,最优选为800~900bar。所述高压均质的循环次数优选为1~10次,进一步优选为2~7次,更优选为3~6次,最优选为4~5次。所述高压均质的温度优选为20~60℃,进一步优选为30~50℃,更优选为35~45℃。
当采用高速微射流技术处理微米级分散体至纳米级时,所述处理压力优选为5000~16000psi,进一步优选为6000~12000psi,更优选为8000~10000psi;所述循环次数优选为1~10次,进一步优选为2~7次,更优选为4~6次;所述高速微射流处理温度优选为20~60℃,进一步优选为30~50℃,更优选为35~45℃。
在本发明中,所述纳米化处理得到的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物粒径优选为10~300nm,更优选为20~200nm。
本发明还提供了上述技术方案所述靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物在制备化妆品中的应用。具体的,本发明所述纳米组合物用于制备具有抗衰功效、抗氧化功效等作用的化妆品。所述化妆品的形式包括但不限于化妆水、精华、膏霜、乳液、面膜和凝胶。本发明利用所述靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物制备为化妆品时,可直接将所述纳米组合物添加于各类抗衰、抗氧化产品基质中,使用方便。所述纳米组合物占化妆品总质量的1~30%,优选为5~20%。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物及其制备方法和应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例,如无特殊说明,所提及的百分含量均为相应组分在靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物中所占质量的比例。
实施例1
将5%肉豆蔻酸异丙酯、0.1%视黄醇、6%腺苷、0.5%聚季铵盐-51、3%辛癸酸聚乙二醇甘油酯、3%大豆卵磷脂、5%二乙二醇单乙基醚混合,35℃水浴加热溶解,得到油相;
将10%NMN、0.1%维生素P、0.05%铜肽、0.05%棕榈酰六肽-12、10%海藻糖加入到57.2%纯化水中,35℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于35℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为500rpm,混合完成后,在转速为5000rpm的条件下高速剪切乳化8min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为35℃、压力为500bar的条件下进行高压均质处理,循环5次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为13.8nm。
实施例2
将1%角鲨烯、5%羟基频哪酮视黄酸酯、3%脂肪酸、0.1%二棕榈酰磷脂酰胆碱、1%聚甘油-10月桂酸酯、0.5%羟基化卵磷脂、1%PPG-26-丁醇聚醚-26混合,55℃水浴加热溶解,得到油相;
将0.1%NMN、5%茶多酚、5%肌肽、0.5%乙酰基四肽-9、0.5%棕榈酰五肽-4、5%依克多因、5%β-葡聚糖加入到67.3%纯化水中,55℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于55℃水浴加热条件下将水相以2滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为7000rpm的条件下高速剪切乳化7min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为55℃、压力为700bar的条件下进行高压均质处理,循环4次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为290.6nm。
实施例3
将5%棕榈酸异丙酯、4%大豆油、8%维E醋酸酯、1%视黄醇棕榈酸酯、3%二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、5%聚甘油-10油酸酯、5%鲸蜡硬脂基葡糖苷、5%丁二醇、4%1,3-丙二醇混合,45℃水浴加热溶解,得到油相;
将7%NMN、1%羟丙基四氢吡喃三醇、4%聚谷氨酸钠加入到48%纯化水中,45℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于45℃水浴加热条件下将水相以2滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为700rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化5min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为45℃、压力为600bar的条件下进行高压均质处理,循环3次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为198.1nm。
实施例4
将8%中链甘油三酯、12%棕榈酸异丙酯、1%白藜芦醇、8%视黄醇乙酸酯、0.1%神经酰胺、2.5%二月桂酰磷脂酰胆碱、2.5%聚季铵盐-51、10%聚甘油-10肉豆蔻酸酯、10%椰油基葡糖苷、10%乙氧基二乙二醇油酸酯、5%甘油混合,60℃水浴加热溶解,得到油相;
将1%NMN、8%γ-氨基丁酸加入到21.9%纯化水中,60℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于60℃水浴加热条件下将水相以1滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为800rpm,混合完成后,在转速为8000rpm的条件下高速剪切乳化4min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为60℃、压力为800bar的条件下进行高压均质处理,循环6次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为261.8nm。
实施例5
将10%辛酸癸酸甘油三酯、5%亚油酸甘油酯、3%虾青素、2%胆固醇、3%维E琥珀酸酯、3%视黄醇丙酸酯、4%二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、10%聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、5%辛癸酸聚乙二醇甘油酯、6%二丙二醇、6%1,2-戊二醇混合,20℃水浴加热溶解,得到油相;
将3%NMN、5%羟丙基四氢吡喃三醇加入到35%纯化水中,20℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于20℃水浴加热条件下将水相以3滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为500rpm,混合完成后,在转速为9000rpm的条件下高速剪切乳化3min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在压力为温度为20℃、900bar的条件下进行高压均质处理,循环3次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为156.1nm。
实施例6
将8%橄榄油、8%异壬酸异壬酯、3%维E亚油酸酯、2%视黄醇视黄酸酯、1%神经酰胺、2%聚季铵盐-51、10%椰油基葡糖苷、12%1,2-己二醇混合,25℃水浴加热溶解,得到油相;
将2%NMN、4%维C乙基醚、0.4%棕榈酰三肽-1、0.4%棕榈酰三肽-5加入到47.2%纯化水中,25℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于25℃水浴加热条件下将水相以3滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为4000rpm的条件下高速剪切乳化8min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为25℃、压力为1000bar的条件下进行高压均质处理,循环2次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为137.3nm。
实施例7
将5%大豆油、3%蓖麻油、1.5%二棕榈酰磷脂酰胆碱、3%聚甘油-10油酸酯、4%大豆卵磷脂、5%辛基十二醇混合,40℃水浴加热溶解,得到油相;
将4%NMN、2%脱羧肌肽、4%麦角硫因、0.6%六肽-9、5%烟酰胺、3%聚谷氨酸钠加入到59.9%纯化水中,40℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于40℃水浴加热条件下将水相以2滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为800rpm,混合完成后,在转速为5000rpm的条件下高速剪切乳化9min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为40℃、压力为1200bar的条件下进行高压均质处理,循环2次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为110.4nm。
实施例8
将4%辛酸癸酸甘油三酯、5%棕榈酸异丙酯、1%辅酶Q10、3%二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、4%羟基化卵磷脂、8%椰油基葡糖苷、5%二乙二醇单乙基醚、15%丁二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将5%NMN、1%维C磷酸酯、0.5%肉豆蔻酰五肽-11、4%依克多因、5%银耳多糖加入到39.5%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以5滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为500rpm,合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化5min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为800bar的条件下进行高压均质处理,循环7次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为83.5nm。
实施例9
将3%中链甘油三酯、5%橄榄油、2%维E糖苷、7%视黄醇棕榈酸酯、1.8%二月桂酰磷脂酰胆碱、5.5%聚甘油-10油酸酯、3.5%聚甘油-10月桂酸酯、5%甘油、5%1,3-丙二醇混合,35℃水浴加热溶解,得到油相;
将6%NMN、2%抗坏血酸葡糖苷、0.2%棕榈酰五肽-4、3%γ-氨基丁酸、3%透明质酸加入到48%纯化水中,35℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于35℃水浴加热条件下将水相以1滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为800rpm,混合完成后,在转速为7000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为35℃、压力为700bar的条件下进行高压均质处理,循环5次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为170.2nm。
实施例10
将6%角鲨烯、6%大豆油、6%视黄醇视黄酸酯、2.5%二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、6%鲸蜡硬脂基葡糖苷、7%椰油基葡糖苷、5%1,2-戊二醇、8%1,2-己二醇混合,45℃水浴加热溶解,得到油相;
将8%NMN、2%抗坏血酸棕榈酸酯、3%维生素P、0.7%铜肽、4%羟丙基四氢吡喃三醇、4%聚天冬氨酸钠、3%海藻糖加入到28.8%纯化水中,45℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于45℃水浴加热条件下将水相以2滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为700rpm,混合完成后,在转速为8000rpm的条件下高速剪切乳化4min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为45℃、压力为900bar的条件下进行高压均质处理,循环6次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为237.7nm。
实施例11
将2%棕榈酸异丙酯、4%辛酸癸酸甘油三酯、3%白藜芦醇、1.5%聚季铵盐-51、3%聚甘油-10油酸酯、2%聚甘油-10月桂酸酯、3%丁二醇、3%二丙二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将3%NMN、0.15%棕榈酰三肽-1、0.15%六肽-9、2%γ-氨基丁酸、5%依克多因、3%聚谷氨酸钠、3%透明质酸加入到62.2%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为9000psi的条件下进行高速微射流处理,循环6次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为57.9nm。
实施例12
将5%肉豆蔻酸异丙酯、5%棕榈酸异丙酯、10%腺苷、0.5%羟基频哪酮视黄酸酯、2.5%二棕榈酰磷脂酰胆碱、3%羟基化卵磷脂、7%椰油基葡糖苷、5%PPG-26-丁醇聚醚-26、5%甘油混合,30℃水浴加热溶解,得到油相;
将0.5%NMN、0.2%脱羧肌肽、0.3%麦角硫因、0.5%银耳多糖加入到55.5%纯化水中,30℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于30℃水浴加热条件下将水相以3滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为700rpm,混合完成后,在转速为5000rpm的条件下高速剪切乳化8min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为30℃、压力为8000psi的条件下进行高速微射流处理,循环4次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为44.3nm。
调整实施例11中的乳化剂含量制备纳米组合物,即对比例1和对比例2。
对比例1(乳化剂的质量低于纳米组合物总质量的1%)
将2%棕榈酸异丙酯、4%辛酸癸酸甘油三酯、3%白藜芦醇、1.5%聚季铵盐-51、0.4%聚甘油-10油酸酯、0.4%聚甘油-10月桂酸酯、3%丁二醇、3%二丙二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将3%NMN、0.15%棕榈酰三肽-1、0.15%六肽-9、2%γ-氨基丁酸、5%依克多因、3%聚谷氨酸钠、3%透明质酸加入到66.4%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为9000psi的条件下进行高速微射流处理,循环6次,冷却至室温后组合物逐渐析出晶体,体系变浑。
对比例2(乳化剂的质量高于纳米组合物总质量的20%)
将2%棕榈酸异丙酯、4%辛酸癸酸甘油三酯、3%白藜芦醇、1.5%聚季铵盐-51、15%聚甘油-10油酸酯、15%聚甘油-10月桂酸酯、3%丁二醇、3%二丙二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将3%NMN、0.15%棕榈酰三肽-1、0.15%六肽-9、2%γ-氨基丁酸、5%依克多因、3%聚谷氨酸钠、3%透明质酸加入到37.2%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为9000psi的条件下进行高速微射流处理,循环6次,冷却至室温,得到纳米组合物。
对上述纳米组合物的粒径进行检测,可得该纳米组合物粒径为7.3nm。
测试例1
稳定性试验
将实施例1~12以及对比例1~2制备得到的纳米组合物在密闭容器、室温条件下放置3、6、9、12个月后,对样品的粒径进行检测,观察样品性状,并通过高效液相色谱HPLC检测各样品中NMN的含量,并计算12个月后NMN剩余含量百分比,综合评价纳米组合物的稳定性。具体检测结果如表1所示。
表1 实施例1~12和对比例1~2所得纳米组合物的稳定性试验结果
由表1中实施例1~12可以看出:本发明高压均质处理和高速微射流处理制备的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物粒径在10~300nm之间,满足实际应用要求。图1为实施例11制备得到的纳米组合物在室温条件下放置12个月前后的样品状态对比图,从图片能够观察到样品未出现团聚、变色、分层现象。高压均质处理得到的实施例1~10样品和高速微射流处理得到的实施例11、12样品粒径室温条件下放置12个月后未发生显著性变化,且NMN室温条件下放置12个月后含量没有出现显著变化,仍然满足实际应用需求,尤其在活性成分浓度高的情况下仍然较稳定,未发现结晶析出现象。
对比例1中乳化剂含量为0.8%,制备后的组合物在室温下逐渐析出晶体,体系变浑,无法测定粒径大小,说明乳化剂含量过低时,乳化能力不足导致体系不稳定,出现活性物易结晶析出、油水分层等现象;对比例2中乳化剂含量为30%,粒径小于10nm,从图2中可以看出样品在室温条件下放置12个月后颜色加深,从表1可看到NMN在室温条件下放置12个月后含量显著下降,说明乳化剂含量过高时,易形成胶束,不利于组合物中活性成分的稳定性。
可见,本发明提供的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物具有良好的稳定性。
测试例2
体外药物释放性能试验
分别准确移取3g实施例11以及对比例2制备得到的纳米组合物于透析袋中,透析袋两头用夹子夹住悬放于烧杯中,加入100mL接收液(接收液组成为质量分数10%乙醇和90%纯化水),避光37℃水浴搅拌。分别在1h、2h、3h、5h、7h、9h、12h、14h、16h取1mL袋外液同时补充相同体积的接收液。利用HPLC进行测试,计算NMN的累计释放量,结果见图3和表2。
表2 实施例11和对比例2所得纳米组合物的体外药物释放性能试验结果
从图3和表2中可看出,实施例11制备的纳米组合物中NMN在12h才基本释放完全,说明本申请制备的纳米组合物具有良好的缓释性能,能够对皮肤进行持续有效地护肤作用。从图3中可看出对比例2制备的纳米组合物中NMN的释放速率明显高于实施例11,在5h内基本释放完全,缓释性能较差,说明乳化剂含量过高时组合物易形成胶束,影响活性物的缓慢释放。
对比例3
制备空白霜剂:将5%辛酸癸酸甘油三酯、5%白油、2%十六十八醇、2%硬脂醇聚醚-2、2%硬脂醇聚醚-21于75℃水浴中加热熔融后得到油相;将5%1,3-丙二醇、0.15%卡波姆和余量的纯化水于75℃水浴溶解,得到水相;得到油相和水相后,于75℃条件下将油相以5滴/秒的速度滴加至水相中,滴加过程中控制搅拌速率为800rpm,混合完成后于10000rpm转速下剪切乳化3min,加入0.15%三乙醇胺,继续剪切2min,冷却后加入0.5%苯氧乙醇,搅拌均匀即得空白霜剂。
测试例3
刺激性试验
将实施例1~6所制得的纳米组合物样品,分别与对比例3中的空白霜剂按照质量百分含量3:7进行复配,进行皮肤刺激性试验。
取健康家兔42只,体重2.0±0.2kg,随机分为7组,每组动物6只,于实验前24h将家兔背部皮肤两侧去毛,去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤,受伤皮肤不宜做皮肤刺激性试验。每天涂抹使用实施例1~6制得的纳米组合物制备的复合霜剂3次,连续涂抹7天,同时涂抹空白霜剂进行对照,观察试验结果,将试验结果列于表3中。
表3 实施例1~6样品制备的复合霜剂及空白组皮肤刺激性观察结果
注:“+”家兔皮肤充血、红肿;“++”表示充血、红肿现象仍在,但有增加趋势;“—”表示无充血、红肿现象。
根据表3中的试验结果可以看出,使用实施例1~6纳米组合物制备的复合霜剂及空白霜剂涂抹于家兔皮肤后均无充血、红肿现象,说明本发明提供的纳米组合物对皮肤没有刺激性,安全性高。
应用例1
制备纳米复合霜剂:将实施例11制备的纳米组合物和对比例3中的空白霜剂按照质量比1:9进行复配,于10000rpm转速下剪切2min,即得到纳米复合霜剂。
纳米复合霜剂中功效成分及含量分别为:0.3%NMN、0.3%白藜芦醇、0.015%棕榈酰三肽-1、0.015%六肽-9、0.2%γ-氨基丁酸、0.5%依克多因、0.3%聚谷氨酸钠、0.3%透明质酸。
对比例4
制备与纳米复合霜剂中功效成分及含量相同的普通霜剂:将0.3%白藜芦醇、5%辛酸癸酸甘油三酯、5%白油、2%十六十八醇、2%硬脂醇聚醚-2、2%硬脂醇聚醚-21于75℃水浴中加热熔融后得到油相;将0.3%NMN、0.015%棕榈酰三肽-1、0.015%六肽-9、0.2%γ-氨基丁酸、0.5%依克多因、0.3%聚谷氨酸钠、0.3%透明质酸、5%1,3-丙二醇、0.15%卡波姆和余量的纯化水于75℃水浴溶解,得到水相;得到油相和水相后,于75℃条件下将油相以5滴/秒的速度滴加至水相中,滴加过程中控制搅拌速率为800rpm,混合完成后于10000rpm转速下剪切乳化3min,加入0.15%三乙醇胺,继续剪切2min,冷却后加入0.5%苯氧乙醇,搅拌均匀,即得与纳米复合霜剂中功效成分及含量相同的普通霜剂。
测试例4
体外透皮实验
采用垂直式Franz扩散池法进行离体鼠皮的透皮实验。将SD雄性大鼠腹部皮肤固定于接收室和供给室之间,取应用例1制备的纳米复合霜剂和对比例4制备的普通霜剂各1g于供给室中,以质量分数20%丙二醇和80%的生理盐水为接收液,37℃下搅拌扩散。于1,2,4,6,8,10,12h取0.5mL接收液,并即时补充等量恒温的新鲜接收液。HPLC分析,计算不同时间特定药物单位面积累积透过量。12h后,取下皮肤,洗净后剪碎,研磨成匀浆液,加适量接收液离心,取上清液HPLC分析,计算特定药物的单位面积皮肤滞留量。本实验中测定的药物为NMN。实验数据如图4、图5和表4。
图4为应用例1制备的纳米复合霜剂和对比例4制备的普通霜剂在12h后体外皮肤累积透过量;图5是应用例1制备的纳米复合霜剂和对比例4制备的普通霜剂的体外皮肤滞留量。
表4 应用例1和对比例4在12h后体外皮肤累积透过量和皮肤累积滞留量结果
组别 |
应用例1 |
对比例4 |
皮肤累积透过量(μg/cm<sup>2</sup>) |
112.4 |
65.3 |
皮肤累积滞留量(μg/cm<sup>2</sup>) |
16.8 |
7.4 |
由图4和表4可知,对比例4制备的普通霜剂12h后皮肤累积透过量仅为65.3μg/cm2,而应用例1制备的纳米复合霜剂12h后皮肤累积透过量为112.4μg/cm2,表明抗衰活性物经纳米组合物包载后在皮肤中的累积透过量显著提高。游离活性物由于皮肤屏障作用很难透过皮肤角质层到达皮肤深层结构发挥作用,经纳米包载后活性物更能有效穿透皮肤表层进入活性真皮层,提高生物利用度,发挥更好的抗衰效果。此外,纳米组合物中促细胞渗透剂可以形成仿细胞膜结构,增强活性成分对皮肤角质层的通透性,促进活性成分透过角质层。
由图5和表4可知,对比例4制备的普通霜剂12h后皮肤滞留量仅为7.4μg/cm2,而应用例1制备的纳米复合霜剂12h后皮肤累积滞留量为16.8μg/cm2,表明抗衰活性物经纳米组合物包载后在皮肤中的滞留量显著提高。抗衰活性物经纳米包载后在皮肤中能高浓度富集和长时间滞留,缓释控释,显著提高其生物利用度,增强抗衰功效。
对比例5
制备RhoB标记纳米组合物:将2%棕榈酸异丙酯、4%辛酸癸酸甘油三酯、3%白藜芦醇、1.5%聚季铵盐-51、3%聚甘油-10油酸酯、2%聚甘油-10月桂酸酯、3%丁二醇、3%二丙二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将0.5%罗丹明B(Rhodamine B,RhoB)、3%NMN、0.15%棕榈酰三肽-1、0.15%六肽-9、2%γ-氨基丁酸、5%依克多因、3%聚谷氨酸钠、3%透明质酸加入到61.7%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为9000psi的条件下进行高速微射流处理,循环6次,冷却至室温,得到RhoB标记纳米组合物。
对比例6
制备FITC标记纳米组合物:将2%棕榈酸异丙酯、4%辛酸癸酸甘油三酯、3%白藜芦醇、1.5%聚季铵盐-51、3%聚甘油-10油酸酯、2%聚甘油-10月桂酸酯、3%丁二醇、3%二丙二醇混合,50℃水浴加热溶解,得到油相;
将0.5%FITC、3%NMN、0.15%棕榈酰三肽-1、0.15%六肽-9、2%γ-氨基丁酸、5%依克多因、3%聚谷氨酸钠、3%透明质酸加入到61.7%纯化水中,50℃水浴加热溶解,得到水相;
得到油相和水相后,于50℃水浴加热条件下将水相以4滴/秒的速度滴加至油相中,滴加过程中控制搅拌速率为600rpm,混合完成后,在转速为6000rpm的条件下高速剪切乳化6min,得到微米级分散体;
将微米级分散体在温度为50℃、压力为9000psi的条件下进行高速微射流处理,循环6次,冷却至室温,得到FITC标记纳米组合物。
测试例5
组织靶向输送试验
测试样品:在空白霜剂中加入10%的对比例5制备的RhoB标记纳米组合物,得到RhoB标记纳米组合物霜剂;将0.05%RhoB加入空白霜剂得到游离RhoB霜剂作为对照组样品;两组样品中RhoB浓度相同。
将SD大鼠背部的毛发剃净,避免皮肤损伤。均匀涂抹脱毛膏,5min后用温生理盐水浸湿的脱脂棉球擦净,并用干棉球擦干皮肤。每组设立3个平行,将50μg的RhoB标记纳米组合物霜剂和游离RhoB霜剂分别涂抹在大鼠背部的给药孔内,2h和4h后轻轻擦去皮肤上的残留样品,取下目标区域内的皮肤,再次冲洗皮肤,彻底清洁后擦干残余水分。将样品冷冻切片,通过激光共聚焦显微镜观察切片并拍照,结果如图6。
由图6可知,罗丹明B在大鼠皮肤的纵切片上显示出红色荧光。观察所得图像,2h时,游离罗丹明B多集中于角质层,未能透过角质层屏障;4h时,少量游离罗丹明B已经进入活性表皮,在毛囊等皮肤附属器中有所聚集,但荧光强度较弱。与游离罗丹明B相比,RhoB标记纳米组合物的皮肤渗透性明显增强。2h时,RhoB标记纳米组合物已经透过角质层屏障,进入活性表皮和真皮层;4h时活性表皮和真皮层中的荧光强度进一步增强。与此同时,RhoB标记纳米组合物除了在皮肤中蓄积更多外,在毛囊中也存在明显聚集。皮肤渗透性试验说明本申请制备的纳米组合物可促进功效成分透过皮肤屏障进入皮肤深层组织并在皮肤中富集,实现功效成分的组织靶向输送。
测试例6
细胞靶向输送试验
将HSF细胞(人皮肤成纤维细胞)在35mm共聚焦培养皿中适应性培养1d后,弃去旧培养基,将对比例6制备的FITC标记纳米组合物用DMEM培养液稀释100倍,并设置游离FITC对照组,对照组中FITC和FITC标记纳米组合物组中FITC含量相同,两组培养基孵育2h、4h后,PBS洗涤细胞3次,加入5μg/mL罗丹明B溶液孵育15min,PBS洗涤细胞3次,用4%的多聚甲醛室温下固定细胞15min,PBS洗涤细胞3次后用5μg/mL DAPI溶液处理细胞10min进行染核,PBS洗涤细胞3次,激光共聚焦显微镜60×镜下观察HSF细胞对纳米组合物的摄取情况,结果如图7。
在图7中可以观察到,游离FITC对照组的绿色荧光多聚集于HSF细胞的细胞膜区域,在细胞质中分布较少且荧光强度很弱;而FITC标记纳米组合物组有明显绿色荧光与红色荧光的重叠,且荧光强度明显比游离FITC对照组强,表明FITC标记纳米组合物能够有效地将FITC递送入HSF细胞且广泛分布于细胞质中。细胞摄取实验结果表明,本申请制备的纳米组合物因其独特的纳米级尺寸以及载体与细胞的亲和性,并采用促细胞渗透剂修饰,使得纳米组合物更易进入成纤维细胞,显著提高HSF细胞的细胞摄取效率和胞内蓄积,实现功效成分的细胞靶向输送。
测试例7
清除活性氧自由基ROS功效测试
测试样品:将实施例9、10、11所得纳米组合物用DMEM培养液稀释800倍得到的纳米组合物培养样品,对应编号1、2、3号;取白藜芦醇、NMN、棕榈酰三肽-1、六肽-9、γ-氨基丁酸、依克多因、聚谷氨酸钠、透明质酸作为游离活性原料,利用DMEM培养液稀释,至其百分含量与3号样品相同,作为对照组,对应编号4号。
将HSF细胞以每孔3×104个细胞的密度接种到24孔板中,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后吸出细胞板中的培养基,空白对照组加入500μL的无血清培养基,用800μM H2O2处理24h的HSF细胞作为模型组,用测试样品在800μM H2O2条件下孵育24h的HSF细胞作为给药组。孵育结束后,用培养基洗涤3次,加入含有20μM DCFH-DA的培养基继续孵育20min。细胞用PBS洗涤1次后用1%Triton X-100裂解细胞,离心,并使用酶标仪检测活性氧自由基ROS荧光强度,实验结果见图8和表5。
表5 1~4号样品活性氧自由基ROS荧光强度结果
样品名称 |
空白对照 |
模型组 |
1号样品 |
2号样品 |
3号样品 |
4号样品 |
ROS荧光强度 |
22900 |
54300 |
34400 |
32300 |
36800 |
46800 |
由图8和表5可知,经H2O2诱导损伤后,ROS荧光强度显著上升,说明H2O2诱导的氧化应激刺激了HSF细胞内ROS的产生,且与模型组ROS的荧光强度(54300)比较,实施例9、10和11制得的纳米组合物均能显著降低ROS的活性,ROS的荧光强度分别为34400、32300和36800(*P<0.05),说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的纳米组合物能有效清除体内自由基;与游离活性物(4号样品)ROS荧光强度(46800)比较,实施例11制得的纳米组合物(3号样品)对ROS荧光强度的降低具有显著性差异(#P<0.05),表明活性物经纳米组合物包载后能更有效地清除HSF细胞中氧化应激的ROS。
测试例8
抗光老化测试
用ELISA检测试剂盒测定基质金属蛋白酶(MMP-1)的酶活力,测试样品同测试例7,将HSF细胞以每孔3×104个细胞的密度接种到24孔板中,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后吸出细胞板中的培养基,空白对照组和模型组加入0.5mL的无血清培养基,给药组加入等体积的测试样品。除空白对照组外,模型组和给药组采用剂量为10J·cm-2的UVA进行24h辐照,辐照结束后,进行MMP-1酶活性检测。按MMP-1试剂盒说明书进行操作,实验结果见图9和表6。
表6 1~4号样品基质金属蛋白酶(MMP-1)结果
样品名称 |
空白对照 |
模型组 |
1号样品 |
2号样品 |
3号样品 |
4号样品 |
MMP-1含量(ng/mL) |
13.9 |
28.3 |
16.7 |
14.8 |
16.1 |
21.4 |
由图9和表6可知,经UVA紫外辐照后,成纤维细胞分泌MMP-1的含量显著上升,且与模型组细胞分泌的MMP-1含量(28.3ng/mL)比较,实施例9、10和11制得的纳米组合物均能显著降低MMP-1的含量,MMP-1含量分别为15.7、16.8和15.1ng/mL,说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的纳米组合物能有效抑制基质金属蛋白酶被紫外线过度刺激后产生的活性,减少对胶原蛋白和纤维组织的伤害,阻止光老化(*P<0.05);与游离活性物(4号样品)分泌的MMP-1含量(21.4ng/mL)比较,实施例11制得的纳米组合物(3号样品)对成纤维细胞分泌的MMP-1含量降低具有显著性差异,表明活性物经纳米组合物包载后能增强抗光老化效果(#P<0.05)。
测试例9
促胶原蛋白合成测试
用ELISA检测试剂盒测定Ⅰ型胶原蛋白的含量,测试样品同测试例7。将HSF细胞以每孔8×103个细胞的密度接种到96孔板中,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后吸出细胞板中的培养基,处理组中分别加入100μL测试样品,空白对照组加入等体积的无血清培养基,继续培育72h。72h后收集细胞上清液,按照ELISA试剂盒说明书要求进行Ⅰ型胶原蛋白检测,计算细胞上清液Ⅰ型胶原蛋白的含量变化率,实验结果见图10和表7。
表7 1~4号样品Ⅰ型胶原蛋白结果
样品名称 |
空白对照 |
1号样品 |
2号样品 |
3号样品 |
4号样品 |
胶原蛋白含量(ng/mL) |
51.3 |
74.8 |
82.4 |
72.5 |
60.5 |
由图10和表7可以看出,实施例9、10和11制得的纳米组合物均能显著提高Ⅰ型胶原蛋白的含量,Ⅰ型胶原蛋白含量分别为74.8、82.4、72.5ng/mL,说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的纳米组合物能够直接作用于成纤维细胞,加速细胞外基质蛋白的合成,促使皮肤恢复弹性(*P<0.05);与游离活性物(4号样品)的Ⅰ型胶原蛋白含量60.5ng/mL相比,实施例11制得的纳米组合物(3号样品)对成纤维细胞分泌的Ⅰ型胶原蛋白含量增加具有显著性差异,表明活性物经纳米组合物包载后能有效促进胶原蛋白的分泌(#P<0.05)。
测试例10
抗衰功效测试
选用皮肤分析测试仪VISIA、皮肤弹性测试仪MPA580和皮肤水分含量测试仪CM825进行抗衰纳米组合物的皮肤纹理、皮肤弹性、皮肤含水量测试,综合评价抗衰纳米组合物抗衰功效。
测试样品:分别将实施例9、实施例10制备的纳米组合物和对比例3中的空白霜剂按照质量比1:9进行复配,得到的纳米复合霜剂分别定为5号样品、6号样品;应用例1制备的纳米复合霜剂定为7号样品,对比例4制备的普通霜剂定为8号样品。
选取4组每组30名皮肤健康、无化妆品过敏史、年龄在40~45岁之间的志愿者作为受试者,进行皮肤纹理、皮肤弹性、皮肤含水量测试。试用部位为脸部两颧,分别于试验前及连续使用样品1周、2周、4周和8周后,由同一个人测试试验部位的皮肤表面纹理、皮肤弹性、皮肤含水量,计算受试者不同时间段平均表面皱纹减少量、皮肤弹性值的增加量和皮肤含水量的增加值,实验结果如图11、表8、图12、表9、图13、表10。
表8 5~8号样品平均表面皱纹减少量结果
由图11和表8可知,5~7号样品的纳米复合霜剂均能显著减少皮肤表面皱纹量,说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的抗衰纳米组合物能有效抑制皱纹的生长,并消除原有的皱纹,具有显著的抗衰效果。8号样品为活性成分和含量与7号样品相同的普通霜剂,与8号样品相比,7号样品的纳米复合霜剂对平均表面皱纹减少量具有显著性差异(*P<0.05),表明抗衰活性物经纳米组合物包载后能有效抑制皱纹的生长,对皱纹具有很好的改善作用,具有更优异的抗衰效果。
表9 5~8号样品皮肤弹性值的增加量结果
由图12和表9可知,5~7号样品的纳米复合霜剂均能显著增加皮肤弹性,说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的抗衰纳米组合物能有效刺激成纤维细胞更新,从而促进胶原蛋白和弹性蛋白的合成,增强皮肤弹性,促进皮肤更新。与8号样品相比,7号样品的纳米复合霜剂对皮肤弹性值的增加量具有显著性差异(*P<0.05),表明抗衰活性物经纳米组合物包载后能显著增强皮肤弹性,促进胶原蛋白和弹性蛋白的合成,紧致皮肤。
表10 5~8号样品皮肤含水量的增加值结果
由图13和表10可知,5~7号样品的纳米复合霜剂均能显著增加皮肤含水量,说明本申请高压均质处理和高速微射流处理制备的抗衰纳米组合物有优异的保湿补水效果,能调节皮肤屏障功能,使皮肤吸收大量水,并填充胶原蛋白和真皮内其他结构之间的空间,使得基质网状结构弹性增强,加强细胞的紧致性和肌肤的弹性。与8号样品相比,7号样品的纳米复合霜剂对皮肤含水量的增加值具有显著性差异(*P<0.05),表明抗衰活性物经纳米组合物包载后能促进其保湿补水效果,提高细胞外基质间的水分含量,增强皮肤弹性,使皮肤显得更加细腻。
由上可知,本发明高压均质处理和高速微射流处理制备的抗衰纳米组合物具有优异的保湿补水效果,能有效减少皱纹,增强皮肤弹性,促进皮肤细胞代谢,抗衰效果显著。经验证,本发明提供的靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物将靶向线粒体抗衰活性物NMN和抗氧化剂、蛋白合成促进剂、抗光老化剂、保湿剂共同包载于同一纳米组合物中,不同机制抗衰活性成分合理搭配,协同增效。纳米组合物应用组织和细胞双重靶向技术,促进功效成分透过皮肤屏障进入皮肤深层组织,增加功效成分进入抗衰靶细胞和线粒体,从而显著提高功效成分的生物利用度,增强其抗衰、抗氧化功效。皮肤渗透性试验结果表明,本发明制备的抗衰纳米组合物具有粒径小、柔软、可变形等特性,可促进功效成分透过皮肤屏障进入皮肤深层组织并在皮肤中富集,缓释、控释,实现功效成分的组织靶向输送;细胞摄取试验结果表明,本发明制备的纳米组合物与细胞具有高度亲和性,并采用促细胞渗透剂修饰,使纳米组合物进入成纤维细胞,实现功效成分的细胞靶向输送。稳定性试验结果表明,本发明提供的纳米组合物在室温条件下放置12个月后也未出现团聚、变色、分层现象,样品粒径未发生显著性变化,且NMN在室温条件下放置12个月后含量没有出现显著变化,说明纳米组合物稳定性良好,并能显著提高抗衰活性物的稳定性,使其不易失活或被氧化降解;皮肤刺激性试验结果表明,本发明提供的纳米组合物对皮肤温和无刺激,安全性高。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。