KR101967576B1 - 라멜라 리포좀으로 안정화된 백장미 추출물을 포함하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 백장미 추출물을 라멜라 리포좀으로 포집하여 사용함으로써, 피부 흡수율을 높이고 산화 안정성을 가질 수 있는 바, 아토피 피부염 및 알레르기성 피부염과 같은 염증성 피부질환, 미생물 감염에 의한 피부질환 및 다양한 물리화학적 요인에 의한 염증성 피부질환의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

라멜라 리포좀으로 안정화된 백장미 추출물을 포함하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물{Anti-Atopy, Anti-microbial and Anti-inflammatory Cosmetic Composition Containing a White Rose Extract Stabilized with Lamella Liposome}

본 발명은 라멜라 리포좀으로 안정화된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근, 환경오염이 대두됨에 따라 반려동물의 질환 발병률이 늘어나고 있는 추세이며, 특히 피부질환을 앓는 환자 수가 늘고 있다. 국내 동물병원 진료 현황을 분석해보면, 예방 차원에서 동물병원을 내원하는 경우(42.2 %)를 제외하고, 16.4 %가 피부질환, 12.0 %가 소화기계 질환, 8.5 %가 귀 질환 및 4.3 %가 호흡계 질환을 이유로 내원하는 것으로 나타났다. 전체 발병 질환 중 가장 높은 수치를 나타낸 피부질환의 경우, 총 6,774 건 중 50.0 %는 세균감염증, 12.2 %는 외부기생충증, 11.0 %는 피부사상균증, 9.8 %는 알레르기성 피부병을 이유로 내원하는 것으로 나타나, 미생물 감염으로 인한 피부질환 다음으로 아토피 및 알레르기와 같은 염증성 피부질환을 앓는 환자 수가 많음을 알 수 있다.

이러한 피부질환 중 미생물 감염에 의한 피부질환을 치료하기 위하여 현재 사용되고 있는 약제는 대부분 합성약품으로 항생제 내성이 문제될 수 있고, 아토피와 같은 염증성 피부질환은 난치성 피부질환으로 아직 효과적인 치료법이 없으며, 그나마 자주 사용되는 스테로이드 약물 또한 간 독성 및 호르몬 불균형과 같은 부작용으로 인해 장기간 적용이 어렵다는 문제가 있다.

이에, 항생제 내성이나 부작용 없이 반려동물의 미생물 감염, 또는 아토피와 같은 염증성 피부 질환을 치료하기 위한 천연물을 발굴하기 위해 많은 연구가 진행되고 있으나, 이러한 천연물은 산소, 물, 빛, 열 등에 매우 불안정하여 효능 지속력이 짧다는 단점이 있다.

한편, 피부는 다층구조를 가지며 크게 표피, 진피 및 피하지방층으로 나눌 수 있다. 이 중 표피의 가장 바깥쪽에는 각질층(Stratum Corneum)으로 알려진 피부 장벽이 존재하는데, 이러한 각질층은 세포들이 지질 이중층(세포 간 지질)의 고차원적인 배열로 이루어짐으로써, 피부로부터 수분이 증발하는 것을 막을 뿐 아니라 외부의 자극으로부터 피부 및 신체를 보호하는 중요한 역할을 한다. 각질층의 세포 간 지질은 세라마이드, 콜레스테롤, 자유 지방산 등으로 구성되어 있다.

하지만, 이러한 각질층(피부 장벽)은 피부에 적용되는 활성 성분들의 피부 흡수율을 감소시키고, 활성 성분들이 면역세포가 있는 진피층까지 도달하지 못하도록 하기 때문에, 활성 성분들을 실제 피부 치료제로 사용하였을 때, 그 효능이 제대로 발휘되지 못하는 문제가 있다.

국내공개특허 제10-2017-0094900호

본 발명자들은 반려동물의 피부질환 치료를 위하여, 항생제 내성이나 부작용이 없는 천연물 유래 물질을 사용하면서도 이러한 천연물 유래 물질이 갖는 불안정성 및 낮은 흡수율을 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 항아토피, 항균 및 항염증 활성을 갖는 백장미 추출물을 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집하여 사용하는 경우, 그 활성이 증가됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 반려동물의 피부질환 치료를 위하여, 항생제 내성이나 부작용이 없는 천연물 유래 물질을 사용하면서도 이러한 천연물 유래 물질이 갖는 불안정성 및 낮은 흡수율을 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 항아토피, 항균 및 항염증 활성을 갖는 백장미 추출물을 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집하여 사용하는 경우, 그 활성이 증가됨을 규명하였다.

본 명세서에서 용어 "백장미 추출물"은 장미의 꽃잎에 추출 용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 장미 꽃 자체를 대상자(subject)에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 장미 꽃 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 백장미 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 백장미 추출물은 다양한 추출 용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, 물, 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), 아세트산, DMFO (dimethyl-formamide) 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 아닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF (tetrahydrofuran)를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 에탄올을 백장미에 처리하여 수득한 것일 수 있고, 가장 바람직하게는, 백장미 꽃잎 및 에탄올 용매를 1:15-45의 비율로 하여 추출한 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고, 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 리포좀의 형태를 갖는 것을 의미하며, 용어 "라멜라(Lamella)"는 2 매의 단위막에 의해 만들어진 이중막구조로, 편광성 몰타 십자 구조(Maltese-Cross)를 갖는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "라멜라 리포좀"은 편광성 몰타 십자 구조를 갖는 이중막구조의 리포좀 형태를 갖는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 라멜라 리포좀은 용매, 오일, 유화제(Emulsifier), 지질(인지질 및/또는 세포 간 지질), 알코올 및 지방산을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있으며, 상기 혼합물에는 1가 알코올(예: 에탄올 등)을 이용하지 않는다는 것이 좋다.

본 발명의 라멜라 리포좀의 제조에 이용되는 용매는 수용성 극성 용매일 수 있으나, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 물, 글리세린, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜(부틸렌글리콜), 2,3-부틸렌글리콜, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨 및 솔비톨 등으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 물(Water), 글리세린(Glycerin) 및 프로필렌글리콜(Propylene Glycol)을 사용할 수 있다. 그 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 20.0 내지 35.0 중량%일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀의 제조에 이용되는 오일은 극성 또는 비극성의오일로써 당 업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 이소헥사데칸, 스쿠알란, 미네랄 오일, 디카프릴카보네이트 등으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride) 및 이소헥사데칸(Isohexadecane)을 사용할 수 있다. 그 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 10.0 내지 50.0 중량%일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀의 제조에 이용되는 유화제(Emulsifier)는 당 업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 스테아레스, 디폴리하이드록시스테아레이트, 폴리소르베이트, 알킬아실글루타메이트, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르 등으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 스테아레스-2(Steareth-2), 스테아레스-21(Steareth-21), 피이지-30디폴리하이드록시스테아레이트(PEG-30 Dipolyhydroxystearate), 폴리소르베이트 60(Polysorbate 60)을 사용할 수 있다. 그 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 3.0 내지 20.0 중량%일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀의 제조에 이용되는 인지질은 포스페이트기와 같은 극성이 높은 관능기와 다양한 사슬 구조를 갖는 지방산 2개가 결합한 물질로, 포화 또는 불포화 타입 모두 사용 가능하며, 천연 인지질(예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하고, 바람직하게는 수첨 레시틴(Hydrogenated Lecithin)을 사용할 수 있다. 인지질(수첨 레시틴)의 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 0.1 내지 20.0 중량%일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀은 세포 간 지질(Intercellular Lipid), 예를 들면, 그 구성 성분인 콜레스테롤, 세라마이드 및 피토스핑고신 등을 더 포함할 수 있으며, 이때, 세포 간 지질은 각질세포 사이에 존재하는 여러 층의 지질을 의미한다. 세포 간 지질의 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 0.01 내지 10.0 중량%일 수 있고, 보다 구체적으로는 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 콜레스테롤 0.01 내지 3.0 중량%, 세라마이드 0.01 내지 5.0 중량% 및 피토스핑고신 0.01 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀 제조에 이용되는 알코올은 고급 알코올로서, 당 업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어 세틸알코올, 세테아릴알코올, 스테아릴알코올, 베헤닐알코올, 바틸알코올 등으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 세틸알코올(Cetyl Alcohol)을 사용할 수 있다. 그 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 1.0 내지 3.0 중량%일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C_12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로, 예를 들어, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산 등으로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 스테아린산(Stearic Acid) 및 올레산(Oleic Acid)을 사용할 수 있다. 그 사용량은 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 1.0 내지 3.5 중량%일 수 있다.

본 발명의 백장미 추출물은 라멜라 리포좀에 포집된 것일 수 있다.

본 발명의 라멜라 리포좀의 제조에 이용되는 백장미 추출물은 앞서 기술한 방법으로 수득하며, 과량 투여하여도 부작용이 없으므로, 그 중량비는 효능 또는 활성을 달성하기 위해 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있으나, 바람직하게는 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 0.1 내지 10.0 중량%일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "포집(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말한다.

따라서, 상기 라멜라 리포좀은 여러 종류의 난용성 물질을 녹임과 동시에 불안정한 물질을 안정화시켜 피부 침투 효과를 극대화하는 장점을 가지고 있는바, 본 발명의 라멜라 리포좀에 포집된 백장미 추출물은 라멜라 리포좀에 백장미 추출물이 캡슐화되어 포함되어 백장미 추출물의 피부 침투 효과를 보다 개선시킴으로써, 아토피 피부염 및 알레르기성 피부염과 같은 염증성 피부질환, 및 미생물 감염에 의한 피부질환의 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 금속이온봉쇄제, 활성성분(예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate 등), 방부제, 점증제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀의 제조방법을 제공한다:

(a) 오일, 유화제, 지질, 알코올 및 지방산을 75-85 ℃에서 용해시키는 단계;

(b) 별도로 75-85 ℃에서 금속이온봉쇄제를 용해시킨 용액을 상기 단계 (a)의 결과물에 투입하고, 10-20 분 동안 교반하는 단계;

(c) 40-50 ℃까지 냉각시키는 단계;

(d) 백장미 추출물을 투입하고, 3-7분 동안 교반하는 단계; 및

(e) 점증제를 투입하고, 20-30 ℃까지 냉각시키는 단계.

본 발명의 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀의 제조는 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 단계의 성분들을 함께 교반하여 제조할 수 있다. 상기 라멜라 리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다.

본 발명을 각 단계별로 구체적으로 설명하도록 한다.

(a) 오일, 유화제, 지질, 알코올 및 지방산을 75-85 ℃에서 용해시키는 단계

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 지질은 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드 및 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 단계에서는, 오일, 유화제, 지질, 알코올 및 지방산을 온도 조절 및 교반이 가능한 용해조에 투입하고, 80±5 ℃에서 용해하여 균일화한다.

(b) 별도로 75-85 ℃에서 금속이온봉쇄제를 용해시킨 용액을 상기 단계 (a)의 결과물에 투입하고, 10-20 분 동안 교반하는 단계

본 단계에서는, 먼저 상기 (a) 단계와 별도로, 금속이온봉쇄제(예를 들면, Disodium EDTA)를 수용성 극성 용매와 함께 온도 조절 및 교반이 가능한 용해조에 투입하고, 80±5 ℃에서 용해(균일화)시켜 준비한다.

다음으로, 균일화된 용액을 상기 단계 (a)의 결과물에 투입하고, 온도를 80±5 ℃로 유지하면서 2,000±500 rpm의 속도로 15±3 분간 교반하여 1차 라멜라(Lamella) 상태의 액정 입자상을 제조한다.

(c) 40-50 ℃까지 냉각시키는 단계

본 단계에서는, 교반을 통해 만들어진 1 차 라멜라 상태의 액정 입자상을 동일한 속도로 교반하면서 45±5 ℃까지 냉각시킨다.

(d) 백장미 추출물을 투입하고, 3-7분 동안 교반하는 단계

본 단계에서는, 상기 본 발명의 백장미 추출물을 투입하고 동일한 속도로 5±2 분 동안 교반한다. 이때, 활성성분(예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate) 및 방부제(Caprylyl Glycol 및 Caprylhydroxamic Acid)를 추가로 포함시킬 수 있다.

(e) 점증제를 투입하고, 20-30 ℃까지 냉각시키는 단계

본 단계에서는, 점증제(예를 들면, Glyceryl Acrylate/Acrylic Acid Copolymer)을 투입하고, 실온(25±5 ℃)까지 냉각시키면서 동일한 속도로 교반하여 본 발명의 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀을 제조한다.

본 발명의 제조방법은 상술한 화장료 조성물과 백장미 추출물의 구성성분 및 이의 제조방법, 및 상기 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀의 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 상기 조성물의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

(b) 본 발명은 백장미 추출물을 라멜라 리포좀으로 포집하여 사용함으로써, 피부 흡수율이 높이고 산화 안정성을 가질 수 있는바, 아토피 피부염 및 알레르기성 피부염과 같은 염증성 피부질환, 및 미생물 감염에 의한 피부질환의 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 백장미 추출물을 제조하는 방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀을 제조하는 방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 실험동물에서 국소 염증 유발(히스타민 또는 Compound 48/80), 및 시험물질 적용 및 평가 방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 백장미 추출물(도 4a)이 포집된 라멜라 리포좀, 비교예 1(도 4b) 및 비교예 2(도 4c)의 편광현미경 입자사진을 나타낸다.
도 5는 아토피 환자에서의 시험물질별 경표피수분증발량(TEWL) 측정 평균값의 상대적 비율을 나타낸다.
도 6은 아토피 환자에서의 시험물질별 CADESI-4 Score를 나타낸다.
도 7은 아토피 환자에서의 시험물질별 병변의 변화 모습을 나타낸다.
도 8a는 아토피 환자에서의 시험물질별 말라세지아 균수의 상대적인 비율 변화를 나타낸다.
도 8b는 아토피 환자에서 본 발명의 화장료 조성물의 적용 전 후 말라세지아 감염 피부의 현미경 사진을 나타낸다.
도 9는 히스타민 또는 Compound 48/80으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 경표피수분증발량 변화를 나타낸다.
도 10은 히스타민으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 두드러기 크기 변화를 나타낸다.
도 11a는 Compound 48/80으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 투과전자현미경 평가 점수를 나타낸다.
도 11b는 Compound 48/80으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 투과전자현미경 평가 합산 점수를 나타낸다.
도 11c는 Compound 48/80으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 각질층 모습 변화를 나타낸다.
도 12a는 히스타민으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 염증세포수 변화를 나타낸다.
도 12b는 히스타민으로 염증을 유발한 실험동물에서의 시험물질별 표피층, 및 진피층 구조 및 염증세포 생성 변화를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. 본 발명의 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조

1-1. 백장미 추출물의 제조

본 발명에서 사용된 백장미(White Rose; Rosa hybrida Colorado) 꽃잎은 2015년에 대한민국 충청북도 진천에서 채취하여 햇빛 아래서 완전히 건조시켜 사용하였다. 백장미 추출물은 하기와 같은 방법으로 추출하였다(도 1 참조).

건조된 꽃잎을 로터 스피드 밀(Rotor Speed Mill, Laval Lab Inc.,)을 이용하여 분쇄(Pulverization)하고 분말화한 후, 분말화된 꽃잎에 70 % 에탄올을 분무하여 살균(Sterilization) 처리하여 80 ℃에서 24 시간 건조(Drying)시키고, 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관(Storage)하여 준비하였다(Preparation).

건조된 백장미 꽃잎 분말을 10-80 % 에탄올(용매)과 1:15-45 비율(꽃잎 분말:용매)로 섞어 항온 수조(75 ℃)에서 1-3 시간 동안 가열하여 추출(Extraction)한 후, 상청액(Supernatant)을 감압 필터(Whatman Paper Filter No.4)를 통해 여과(Filtration)하여 추출하였다.

추출된 추출물은 감압증류기(Evaporator)를 이용하여 용매를 증발(Evaporation)시킨 후, 동결건조(Freeze drying) 시료(Ethanol extracts powder)를 실험에 사용하였다.

1-2. 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조

하기의 방법으로 화장료 조성물을 제조하였다.

먼저, A 상(A Phase)과 B 상(B Phase)을 각각 온도 조절 및 교반이 가능한 용해조에 투입하여 80±5 에서 용해하여 균일화하였다. 그 후, A 상을 B 상에 투입하고 온도를 80±5 로 유지하면서 아지 믹서(agi mixer)를 사용하여 2,000 rpm의 속도로 10 분간 교반(1^st Agitation)하였다. 교반을 통해 만들어진 1 차 라멜라(Lamella) 상태의 액정 입자상을 동일한 속도로 교반하면서 45±5 까지 냉각시켰다(Cooling). 그 후, 활성 성분인 C 상(C Phase) 및 D 상(D Phase)을 투입하고 동일한 속도로 5 분 동안 교반(2^nd Agitation)하였다. 미리 교반해둔 E 상(E Phase)을 투입하고, 실온(25 )까지 냉각시키면서 동일한 속도로 교반하여 라멜라 리포좀을 제조하였다. 구체적인 조성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

Phase	성분		1% 백장미 추출물 + 라멜라 리포좀(중량%)
A	Water		To 100
	Glycerin		5.00
	Disodium EDTA		0.05
B	오일	Caprylic/Capric Triglyceride	40.0
		Isohexadecane	1.65
	유화제	Steareth-2	1.70
		Steareth-21	2.50
		PEG-30 Dipolyhydroxystearate	0.40
		Polysorbate 60	13.50
	지질	Hydrogenated Lecithin	0.5
		Cholesterol	0.5
		Ceramide	1.0
		Phytosphingosine	0.10
	알코올	Cetyl Alcohol	1.80
	지방산	Stearic Acid	1.25
		Oleic Acid	1.00
C	Sodium Hyaluronate		0.01
	Tocopheryl Acetate		0.10
	Caprylyl Glycol		0.35
	Caprylhydroxamic Acid		0.1
D	Water		5.00
	Glycerin		5.00
	White Rose Extract(백장미 추출물)		1.00
E	Water		4.45
	Glycerin		3.20
	Propylene Glycol		0.10
	Glyceryl Acrylate/Acrylic Acid Copolymer		0.25

비교예 1. 리포좀에 포집되지 않은 백장미 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조

상기 1-2와 동일한 방법으로 하기 표 2와 같은 조성의 화장료 조성물을 제조하였다.

Phase	성분		1% 백장미 추출물 + 일반 크림(중량%)
A	Water		To 100
	Glycerin		5.00
	Disodium EDTA		0.05
B	오일	Caprylic/Capric Triglyceride	-
		Isohexadecane	-
	유화제	Steareth-2	-
		Steareth-21	-
		PEG-30 Dipolyhydroxystearate	-
		Polysorbate 60	-
	지질	Hydrogenated Lecithin	-
		Cholesterol	-
		Ceramide	-
		Phytosphingosine	-
	알코올	Cetyl Alcohol	-
	지방산	Stearic Acid	-
		Oleic Acid	-
C	Sodium Hyaluronate		0.01
	Tocopheryl Acetate		0.10
	Caprylyl Glycol		0.35
	Caprylhydroxamic Acid		0.1
D	Water		5.00
	Glycerin		5.00
	White Rose Extract(백장미 추출물)		1.00
E	Water		4.45
	Glycerin		3.20
	Propylene Glycol		0.10
	Glyceryl Acrylate/Acrylic Acid Copolymer		0.25

비교예 2. 백장미 추출물 및 리포좀을 모두 포함하지 않는 화장료 조성물의 제조

상기 1-2와 동일한 방법으로 하기 표 3과 같은 조성의 화장료 조성물을 제조하였다.

Phase	성분		0% 백장미 추출물 + 일반 크림(중량%)
A	Water		To 100
	Glycerin		5.00
	Disodium EDTA		0.05
B	오일	Caprylic/Capric Triglyceride	-
		Isohexadecane	-
	유화제	Steareth-2	-
		Steareth-21	-
		PEG-30 Dipolyhydroxystearate	-
		Polysorbate 60	-
	지질	Hydrogenated Lecithin	-
		Cholesterol	-
		Ceramide	-
		Phytosphingosine	-
	알코올	Cetyl Alcohol	-
	지방산	Stearic Acid	-
		Oleic Acid	-
C	Sodium Hyaluronate		0.01
	Tocopheryl Acetate		0.10
	Caprylyl Glycol		0.35
	Caprylhydroxamic Acid		0.1
D	Water		5.00
	Glycerin		5.00
	White Rose Extract(백장미 추출물)		-
E	Water		4.45
	Glycerin		3.20
	Propylene Glycol		0.10
	Glyceryl Acrylate/Acrylic Acid Copolymer		0.25

실험예 1. 백장미 추출물을 함유하는 라멜라 리포좀의 입자 확인

본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)이 라멜라 구조의 특징적인 입자인 몰타 십자 구조(Maltese-Cross, 꽃잎 모양의 계면 액정) 형태를 띠고 있는지 확인하였다. 비교예 1 및 비교예 2의 조성물도 같은 방법으로 입자를 관찰하였다.

보다 구체적으로, 각 시료를 슬라이드 글라스에 도말한 후, 일반 광학현미경(Eclipse 80i, Nicon, Japan)에 편광렌즈(CS-P 757178, Nicon, Japan)를 장착하여 배율 400 배로 Dark Field에서 관찰하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)은 라멜라의 전형적인 몰타 십자 구조 형태를 보여, 내부에 캡슐화된 유용성 및 수용성 활성 성분들이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1, 도 4b) 및 백장미 추출물을 함유하지 않은 일반 크림 제형(비교예 2, 도 4c)에서는 이러한 몰타 십자 구조가 나타나지 않음을 확인하였다.

실험예 2. 피부 자극 안전성 확인

먼저, 적용하고자 하는 농도에서 피부에 자극을 일으키는지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 모든 실험동물은 구충 및 예방접종을 완료하였으며 피부질환을 비롯한 질병이 없는 것을 확인한 후, 충북대학교 실험동물센터의 동물전용사육시설에서 관리하였다. 안전성 평가는 충북대학교 동물실험윤리위원회의 심의를 받고 규정을 준수하여 실시하였다.

정상적인 비글견(1-2살) 5 마리에 대하여, 배부 및 측복부의 털을 깎아 시험물질(제조예 1-2 및 비교예 1-2의 조성물) 0.5 ml를 Finn Chamber on Scanopor 테이프를 사용하여 4 시간 동안 밀폐 첩포한 후, 패치를 제거하고 1, 24, 48 및 72 시간 후에 첩포한 부위의 부종(0-4 단계) 및 홍반/가피(0-4 단계)의 형성을 평가하였다(하기 표 4 참조). 관찰된 홍반 및 부종 점수에 의거하여 피부 1차 자극성 인덱스(PDI)를 산출하여 자극성 정도의 판정에 사용하였으며, 피부 자극 안전성 실험인 첩포 시험 방법은 CTFA 안전성 평가 가이드라인을 참고하였다.

부종 형성	홍반 및 가피 형성	점수
부종이 보이지 않는다	홍반이 보이지 않는다	0
극히 약간의 부종(겨우 인지될 정도)	극히 약간의 홍반(겨우 인지될 정도)	1
경도의 부종(명확한 융기에 의하여 명시될 부위의 주위와 명백하게 구분 가능)	명백한 홍반	2
중등도의 부종(약 1 mm의 융기)	중등도에서 강도의 홍반	3
강도의 부종(1 mm를 넘어서 융기하고 주위에도 퍼진다)	심홍색의 강한 홍반에 가벼운 가피형성(장해는 심부에)	4

그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 그룹에서 부종, 홍판/가피와 같은 증상이 나타나지 않음을 확인하였다.

	부종 (적용 전 → 4주 후)		홍반/가피 (적용 전 → 4주 후)
	총점	평균	총점	평균
제조예 1-2	0 → 0	0 → 0	0 → 0	0 → 0
비교예 1	0 → 0	0 → 0	0 → 0	0 → 0
비교예 2	0 → 0	0 → 0	0 → 0	0 → 0

실시예 1. 항아토피 및 항균 효과 확인

상기 실험 결과에 기초하여, 본 발명의 화장료 조성물의 항아토피 및 항균 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 충북대학교 동물의료센터에 내원하는 아토피 환자 중, 약물 내성 또는 부작용으로 더 이상 약물로 치료가 되지 않거나 약물 치료가 불가한 환자에 대하여 실험을 진행하였으며, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2) 및 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1)의 경표피수분증발량(TEWL), CADESI-4 Score 및 항균 활성을 비교 평가하였다.

1-1. 아토피 동물환자의 준비

아토피 진단은 Favrot's Criteria를 5개 이상 충족하고, 피내피부검사에서 알러젠(Allergen)을 가지고 있는지 여부를 확인하여 진단하였다. 모든 환자는 저 알레르기 사료를 최소 8 주간 급여하고 식이 알레르기를 감별하였으며, 연구 동의에 대한 서면합의서를 주인에게 받고 충북대학교 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하여 실시하였다.

1-2. 시험 물질의 적용 방법

각 시험물질(제조예 1-2 및 비교예　1)을 평가대상 환자에게 매일 1 회씩 총 4 주간 병변 부위에 도포하도록 하였으며, 이 기간 중, 주 1 회씩 저 알레르기용 샴푸를 적용하도록 하였다. 각각의 평가는 적용 전(0 일)과 적용 후 14 일, 28 일 총 3 회에 걸쳐 실시하였다.

1-3. 경표피수분증발량(Trans Epidermal Water Loss, TEWL) 측정

각 시험물질이 경표피수분손실량에 미치는 영향을 평가하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

경표피 수분 증발 측정 기기인 VapoMeter SWL-4001(Delfin Technologies Ltd., Kuopio, Finland)을 이용하여 실내 온도 24~25 , 습도 50~60 %가 유지되는 조건에서 30~45 초간 계측하여 총 3 회 측정하여 평균치를 비교 분석하였다. 측정 시간에 따른 오차 발생을 최소화하기 위해 하루 중 측정시간을 통일하였으며, 평가 당일에는 피부에 어떠한 물질도 도포하지 않은 상태로 내원하도록 하였다. 각 개체에서 CADESI-4 점수가 높은 2 개 부위에서의 TEWL 값을 측정하여 평균값을 산출하였다. 이때, 선정된 2 개 부위가 모든 개체에서 동일하지 않고, 부위별로 기준 값이 되는 0 일차의 측정 결과가 다를 수 있으므로, 0 일차 대비 상대적인 변화량을 이용하여 결과를 산출하였다.

그 결과, 도 5 및 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 조성물을 적용한 시험 군에서는 시간이 지남에 따라 경표피수분증발량의 유의적인 감소(약 6.7% 감소)를 확인할 수 없었으나, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군에서는 0 일차에 비하여, 14 일 및 28 일차에 유의적인 감소를 보여, 시간이 지남에 따라 크게 감소(약 38.5 %) 하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, Case 1, 3 및 4의 경우, 경표피수분증발량이 크게 감소(약 48.7 %) 하는 것으로 확인되었다.

	제조예 1-2							비교예 1
	0일		14일		28일			0일		14일		28일
	측정값	비율(%)	측정값	비율(%)	측정값	비율(%)		측정값	비율(%)	측정값	비율(%)	측정값	비율(%)
Case 1	23.4	100.0	14.4	61.5	11.2	47.9		14.6	100.0	14.8	101.4	14.5	99.3
Case 2	13.9	100.0	13.6	97.8	12.8	92.1		9.3	100.0	9.4	101.1	10.6	114.0
Case 3	33.4	100.0	17.4	52.1	15.7	47.0		11.5	100.0	8.8	76.5	8.2	71.3
Case 4	26.7	100.0	16.2	60.7	15.8	59.2		12.2	100.0	11.7	95.9	11.3	92.6
평균	24.35	100.0	15.40	68.0	13.88	61.5		11.90	100.0	11.18	93.7	11.15	94.3

1-4. CADESI-4(Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index-4) Score 측정

각 시험물질이 아토피 피부염 병변에 미치는 영향을 임상적으로 평가하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

환자 피부 상태에 대해 CADESI-4를 사용하여 3 가지 항목에 대해 물질의 효능을 평가하고 점수를 합산하여 변화 정도를 평가하였다. 평가항목은 홍반(Erythema), 태선화(Lichenification), 자가 창상(Excoriation) 및 탈모(Alopecia) 정도이고, 각 항목에 대하여 증상이 없음(0 점), 약함(1 점), 보통(2 점), 심함(3 점)으로 채점한 후 평가한 부위에 대한 모든 항목의 점수를 합산하여 최소 0 점(아무 증상 없는 상태)에서 최고 9 점(모든 항목의 증상이 심한 상태)으로 나타내었다. 각 개체에서 물질 적용 전 CADESI-4 점수가 가장 높은 2 개 부위를 선정하여 해당 부위에서의 점수 변화를 확인하고, 다음의 계산식 1에 따라 완화 정도를 평가하였다.

[계산식 1]

병변 완화 효과 (%) = [(0일차 점수 - 28일차 점수)/0일차 점수] x 100

그 결과, 도 6 및 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 조성물을 적용한 시험 군에서는 CADESI-4 Score가 거의 변하지 않는 반면(약 6.9% 감소), 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군에서는 병변 평가 점수가 시간이 지남에 따라 크게 감소(약 63.3%)하여, 28 일차에는 0 일차에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 병변이 심한 Case 4의 경우 병변 점수가 크게 감소(5.0 1.0) 하는 것을 확인할 수 있었다.

	제조예 1-2				비교예 1
	0일	14일	28일		0일	14일	28일
Case 1	3.0	0.0	0.0		2.5	2.5	2.5
Case 2	3.0	2.0	1.0		4.0	4.0	4.0
Case 3	4.0	4.0	3.5		4.0	4.0	4.0
Case 4	5.0	2.0	1.0		4.0	3.5	3.0
평균	3.75	2.00	1.38		3.63	3.50	3.38

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 조성물을 적용한 시험 군에 비하여 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 동물에서 전반적으로 병변이 눈에 띄게 완화되고, 탈모도 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

1-5. 항균효과 확인

각 시험물질이 미생물 감염증에 미치는 영향을 평가하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

병변 부위에 각 시험물질을 매일 1회 도포한 후 적용 전(0 일)과 적용 후(28 일), 총 2 회에 걸쳐 멸균된 면봉으로 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플은 슬라이드에 도말한 후 Diff-quick staining 법으로 농피증 및 외이도염을 일으키는 주요 원인균인 말라세지아(Malassezia yeasts)의 감염 여부를 광학현미경으로 관찰하였으며, 군집 배양을 통해 확인하였다. 대물렌즈 100 배 시야에서 10 개 부위의 말라세지아 균수를 측정하고 평균값을 구하여 하기 계산식 2에 따라 감소 정도를 평가하였다.

[계산식 2]

항균효과 (%) = [(0일 균수 - 28일 균수)/0일 균수] x 100

그 결과, 도 8a 및 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 조성물을 적용한 시험 군(약 93.3 %)에 비하여 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군(약 96.2 %)에서 보다 우수한 항균효과를 보임을 확인하였다.

	제조예 1-2				비교예 1
	0일	14일	28일		0일	14일	28일
Case 1	1.0	0.0	0.2		4.0	1.5	0.0
Case 2	1.8	1.3	0.0		0.5	0.3	0.3
Case 3	1.5	0.0	0.0		0.0	0.0	0.0
Case 4	1.0	0.5	0.0		0.0	0.0	0.0
평균	1.3	0.5	0.1		2.3	0.9	0.1

또한, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)의 적용 후에 유의적으로 말라세지아 감염이 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

상기 내용을 종합한 결과, 백장미 추출물을 라멜라 리포좀에 포집하였을 때, 더 효과적으로 경표피수분증발을 막아주고 염증세포가 존재하는 진피층까지 효과적으로 흡수될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 아토피 및 알레르기성 피부염과 같은 염증성 피부질환을 가진 환자에서 병변을 완화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 높은 항균력을 보이는바, 미생물 감염에 의한 피부질환을 완화시킬 수 있다.

실시예 2. 항아토피 및 항염증 효과 확인

상기 실시예 1의 결과에 기초하여, 건강한 실험동물에서 염증을 유발한 후, 추가적으로 실험을 진행하였으며, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2), 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1) 및 백장미 추출물을 함유하지 않은 일반 크림 제형(비교예 2)의 경표피수분증발량(TEWL), 두드러기 크기, 투과현미경 평가 및 병리조직학적 평가를 비교하였다.

2-1. 실험동물의 준비

건강하고 중성화를 실시하지 않은 암컷 비글견 중, 감염성 질병이나 알레르기성 질환을 가지고 있지 않으며 최소 4 주 이상 다른 약물 투여가 없는 비글견을 대상으로 실험을 진행하였다. 모든 비글견은 충북대학교 실험동물 연구지원센터에서 동일한 환경에서 사육하였다.

2-2. 염증 유발, 및 시험물질 적용 및 평가 방법

먼저, 정상 비글견의 피부에 10 % 히스타민(Histamine) 또는 10 mg/ml Compound 48/80을 총 3 회(1 일, 4 일 및 7 일)에 걸쳐 0.15 ml씩 피내로 투여하여 국소적인 염증을 유발하였다. 이때, 각 시험물질의 효과를 확인하기 위하여, 연속적으로 하루 3 회씩, 8 일간 각 시험물질(제조예 1-2, 비교예 1 및 비교예 2)을 적용하였다(도 3 참조).

2-3. 경표피수분증발량(TEWL, Trans Epidermal Water Loss) 측정

각 시험물질이 경표피수분손실량에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 실시예 1-3의 방법과 동일하게 염증 유발 전(0 일차), 및 상기 실시예 2-2의 방법으로 염증을 유발하고 15분 뒤(각 1 일, 4 일 및 7 일차)에 경표피수분증발량을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 히스타민-유도 피부염(A) 및 Compound 48/80-유도 피부염(B)에서 모두 경표피수분증발량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, Compound 48/80-유도 피부염의 경우, 7 일차에 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군이 가장 유의적으로 경표피수분증발량을 감소시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

2-4. 두드러기 크기(Wheal Diameter) 측정

각 시험물질이 두드러기 발생에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 염증 유발 전(0 일차), 상기 실시예 2-2의 방법(히스타민 한정)으로 염증을 유발하고 15분 뒤(각 1 일, 4 일 및 7 일차)에 두드러기의 크기를 측정하였다. 이때, 두드러기의 크기는 지름이 가장 긴 부분의 크기를 측정하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 1 일차에 두드러기가 발생하였으며, 시간이 지남에 따라 두드러기의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군이 다른 시험 군에 비하여 감소 폭이 가장 큰 것을 확인할 수 있었고, 7 일차에는 1 일차에 비해 유의적(P<0.05)으로 크기가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

2-5. 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy) 평가

각 시험물질이 피부염 유발로 인해 손상된 지질층에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

Medetomidine을 이용하여 실험동물을 진정시킨 후 피부 생검(8 mm)을 실시하고, 채취한 피부조직을 고정시킨 후 초미세 절편(70 nm)을 만들어 투과전자현미경 6,000~250,000의 배율로 각질층 기저 및 중간부 5개 부위를 평가하였다. 5 개 부위에서 지질이중층의 두께를 측정하고, 지질층의 연속성 및 각질세포 배열 치밀도의 2 가지 항목의 평가를 실시하였다. 각 평가별로 5 등급(1-5점)으로 평가한 후 평균값을 구하여 합산하였으며, 이를 이용하여 염증 유발 시 각 시험물질의 적용 전과 후의 값을 비교하여 지질층의 보충정도 또는 손상에 대한 방어효과를 평가하였다. 이때, 피부 생검은 0 일차(염증 유발 전), 및 상기 실시예 2-2의 방법(Compound 48/80 한정)으로 염증을 유발한 실험동물에서 2 일차(1차 염증 유발 후 24 시간 째) 및 8 일차(3차 염증 유발 후 24 시간 째)에 실시하였다.

그 결과, 도 11a 및 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 염증 유발을 반복함에 따라 지질이중층(Lipid bilayer)과 각질세포의 배열(Corneocyte arrangement)을 평가한 점수가 감소하는 경향을 보였으나, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군의 경우는 다른 시험 군에 비하여 감소 정도가 적어, 염증으로 인한 조직 변화가 가장 적은 것을 확인할 수 있었다.

	Lipid bilayer (10)				Corneocyte arrangement (5)
	0일	2일	8일		0일	2일	8일
제조예 1-2	6.4	5.1	3.3		4.0	2.9	2.1
비교예 1	6.8	5.5	2.4		3.4	3.0	1.4
비교예２	6.4	3.9	2.1		3.4	2.3	1.0

또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 지질이중층 및 각질세포의 배열 평가 점수를 합하였을 경우, 8 일차에 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1) 및 백장미 추출물을 함유하지 않은 일반 크림 제형(비교예 2)에 비하여 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군의 평균값이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

나아가, 투과전자현미경으로 관찰한 각질층의 모습을 확인한 결과, 도 11c에 나타낸 바와 같이, 염증 유발 전(Day 0)에는 비교적 각질세포 층이 균일하게 배열되어 있고 지질이중층이 관찰되었으며 층간의 공간이 넓지 않고 고르게 배열되어 있는 것을 확인할 수 있었으나, 세 번째 Compound 48/80을 처리하고 24 시간이 지난 시점(Day 8)에는 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1) 및 백장미 추출물을 함유하지 않은 일반 크림 제형(비교예 2)을 처리한 시험 군에 대해서는 각질층이 거의 남지 않을 정도로 손상되어 있는 것을 관찰할 수 있었으나, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군에서는 비록 각질층 사이 공간은 넓어졌지만, 각질층이 남아 있어 염증 유발로 인한 변화가 적은 것을 확인할 수 있었다.

2-6. 병리조직학적 평가(Histopathologic Evaluation)

각 시험물질이 피부염 유발로 인해 발생한 염증세포에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

Medetomidine을 이용하여 실험동물을 진정시킨 후 피부 생검(7 mm)을 실시하고, 채취한 피부조직을 10 % 포르말린으로 고정시킨 후, Hematoxylin/Eosin으로 염색하여 관찰하였다. 광학현미경 1,000의 배율로 진피층에서 관찰되는 염증세포의 수를 측정하였으며, 총 5 개 부위에서 평가하였다. 이때, 피부 생검은 0 일차(염증 유발 전), 및 상기 실시예 2-2의 방법(히스타민 한정)으로 염증을 유발한 실험동물에서 2 일차(1차 염증 유발 후 24 시간 째) 및 8 일차(3차 염증 유발 후 24 시간 째)에 실시하였다.

그 결과, 도 12a 및 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, 염증 유발 전(Day 0)에는 진피층에서 염증세포가 거의 관찰되지 않았으나, 히스타민 투입 후 유의적으로 염증세포의 수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 염증세포의 수는 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하는 경향을 보였으나, 2 일차 및 8 일차 모두, 다른 시험 군에 비하여 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군에서 유의적(P<0.1)으로 염증세포의 수가 적음을 확인할 수 있었다.

	제조예 1-2				비교예 1				비교예 2
	0일	2일	8일		0일	2일	8일		0일	2일	8일
Case 1	0.2	25.8	31.2		0.4	35.0	46.4		0.6	45.0	43.0
Case 2	0.2	25.4	29.8		0.6	20.0	26.0		0.2	42.2	37.4
Case 3	0.4	22.2	32.4		0.4	30.8	34.4		0.2	24.4	43.6
평균	0.3	24.5	31.1		0.5	28.6	35.6		0.3	37.2	41.3

또한, 광학현미경으로 관찰한 피부 조직을 살펴본 결과, 도 12b에 나타낸 바와 같이, 처음 히스타민을 처리하고 24 시간이 지난 시점(Day 2)에, 백장미 추출물을 함유하는 일반 크림 제형(비교예 1) 및 백장미 추출물을 함유하지 않은 일반 크림 제형(비교예 2)을 처리한 군에서는 진피층에 부종성 변화(흰색으로 보이는 부분)가 확인되었으나, 본 발명의 화장료 조성물(제조예 1-2)을 적용한 시험 군에서는 이러한 변화가 거의 관찰되지 않았다. 이러한 변화는 세 번째 히스타민을 처리하고 24 시간이 지난 시점(Day 8)에서도 마찬가지로 나타났다.

상기 내용을 종합한 결과, 백장미 추출물을 라멜라 리포좀에 포집하였을 때, 아토피 및 알레르기성 피부염에서 지질이중층과 각질세포를 보호하는데 더 효과적이고, 염증으로 인한 조직 변화를 완화해줄 수 있다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 아토피 피부염 및 알레르기성 피부염과 같은 염증성 피부질환을 효과적으로 개선시킬 수 있다.

Claims (8)

1. 라멜라(Lamella) 리포좀에 포집된 백장미 추출물을 함유하는 항아토피, 항균 및 항염증용 화장료 조성물로서,
   상기 라멜라 리포좀은 용매, 유화제, 지방산, 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 피토스핑고신, 오일 및 알코올을 포함하고;
   상기 용매, 유화제, 지방산, 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 피토스핑고신, 오일 및 알코올은 전체 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 각각 20.0 내지 35.0 중량%, 3.0 내지 20.0 중량%, 1.0 내지 3.5 중량%, 0.1 내지 20.0 중량%, 0.01 내지 3.0 중량%, 0.01 내지 5.0 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 10.0 내지 50.0 중량% 및 1.0 내지 3.0 중량%로 포함된 것인, 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 백장미 추출물은 에탄올 용매로 추출한 것인, 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 백장미 추출물은 백장미 꽃잎 및 에탄올 용매를 1:15-45의 비율로 하여 추출한 것인, 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 백장미 추출물은 상기 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀 총 중량에 대하여 0.1 내지 10.0 중량%로 포함된 것인, 조성물.
   
6. 다음 단계를 포함하는 백장미 추출물이 포집된 라멜라 리포좀의 제조방법:
   (a) 오일, 유화제, 지질, 알코올 및 지방산을 75-85 ℃ 에서 용해시키는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 별도로 75-85 ℃ 에서 금속이온봉쇄제를 용해시킨 용액을 투입하고, 10-20 분 동안 교반하는 단계;
   (c) 40-50 ℃ 까지 냉각시키는 단계;
   (d) 백장미 추출물을 투입하고, 3-7분 동안 교반하는 단계; 및
   (e) 점증제를 투입하고, 20-30 ℃ 까지 냉각시키는 단계.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 지질은 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드 및 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 방법.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 백장미 추출물은 에탄올 용매로 추출한 것인, 방법.

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