CN112656703B - 一种多肽柔性脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于个人护理品技术领域，公开了一种多肽柔性脂质体及其制备方法和应用，包括以下步骤(1)将磷脂、胆固醇、膜材软化剂、活性多肽加入有机溶剂中，超声振荡溶解，将混合液置于旋蒸容器中，旋蒸去除有机溶剂，旋蒸容器壁上得到一层脂质薄膜；(2)将含有表面活性剂的水相加入旋蒸容器中，进行水浴恒温搅拌，随后超声使旋蒸容器上的脂质薄膜完全脱落，得到多肽柔性脂质体初乳；(3)将所得的多肽柔性脂质体初乳进行高压均质处理，所得的均质液用微孔滤膜进行过滤除去杂质，最终得到多肽柔性脂质体。本发明利用脂质体对多肽进行有效的包封，大大增加了脂质囊泡的透皮性能，使多肽分子能够进入皮肤的更深层发挥作用，可应用于祛皱产品中。

Description

一种多肽柔性脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于个人护理品技术领域，特别涉及一种含多肽柔性脂质体的制备方法及其在祛皱产品中的应用。

背景技术

皮肤皱纹是内源性和外源性因素共同作用导致的。其中外源性因素包括紫外线辐射、烟雾以及有害化学物质等，它们与皮肤接触产生的活性氧自由基(ROS)会直接损伤皮肤细胞的DNA和细胞外基质的胶原蛋白、弹性蛋白或粘多糖分子，使皮肤变薄、表皮和真皮的基底膜受损、细胞的数量和供血血管数量减少，导致皮肤皱纹的产生；内源性因素是由于随着年龄的增长，表皮角质层中的保湿因子不断减少、皮肤水合能力下降、同时皮肤中的蛋白多糖和透明质酸浓度降低，皮肤真皮层中水分减少，真皮成纤维细胞活性降低，合成胶原蛋白的能力下降，导致皮肤干燥，皮肤弹性减弱，最后产生皱纹。

活性多肽作为一种信号分子，可刺激成纤维细胞产生胶原蛋白、弹力纤维和透明质酸，提高肌肤的含水量和锁水度，增加皮肤的厚度，减少皮肤细纹。但多肽进入皮肤后易被皮肤中的酶分解，且由于它难溶于水、亲水性等物理化学性质以及角质层的给药屏障作用使得活性肽在经皮给药的过程中难以发挥功效。

发明内容

为了解决以上的问题，将多肽使用柔性脂质体包裹是一种理想的方法。柔性脂质体是一种由磷脂双分子层加上边缘活化剂构成的囊泡，边缘活化剂的添加使得脂质体具有弹性，使药物在皮肤中能更有效的保存。因此，本发明首要目的在于提供一种多肽柔性脂质体。

本发明的另一目的在于提供一种上述多肽柔性脂质体的制备方法。本发明的方法简便易行，设备要求低，易于产业化生产。

本发明的另一目的在于提供上述多肽柔性脂质体在化妆品当中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种多肽柔性脂质体的制备方法，包括以下步骤

(1)将磷脂、胆固醇、膜材软化剂、活性多肽加入有机溶剂中，超声振荡使其溶解，将混合液置于旋蒸容器中，旋蒸去除有机溶剂，旋蒸容器壁上得到一层脂质薄膜；

(2)将含有表面活性剂的水相加入旋蒸容器中，进行水浴恒温搅拌，随后超声使旋蒸容器上的脂质薄膜完全脱落，得到多肽柔性脂质体初乳；

(3)将所得的多肽柔性脂质体初乳进行高压均质处理，所得的均质液用微孔滤膜进行过滤除去杂质，最终得到多肽柔性脂质体。

优选地，所述活性多肽为棕榈酰三肽-1(Pal-GHK)、棕榈酰五肽-4(Pal-KTTKS)、棕榈酰四肽-7(Palmitoyl Tetrapeptide-7)、棕榈酰六肽-19和棕榈酰寡肽中的至少一种。

优选地，所述的膜材软化剂至少为胆酸钠、脱氧胆酸钠和吐温-80中的一种。

优选地，所述的磷脂可选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、二棕榈酰卵磷脂和棕榈酰磷脂酰甘油中的一种或两种以上；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、三氯甲烷中的一种或两种以上。

优选地，所述的表面活性剂为吐温-20、单硬脂酸甘油酯、斯盘-20、斯盘-40中的一种或两种以上。

优选地，以重量份计，原料配比如下：活性多肽0.03～0.08份，磷脂3～5份，胆固醇0.2～0.3份，表面活性剂0.3～0.5份，膜材软化剂0.2～0.3份，水90～95份。

优选地，步骤(1)所述旋蒸的温度为35℃～45℃，时间为1h～3h；所述脂质薄膜还经真空干燥，直至有机溶剂彻底挥发，所述真空干燥的温度为25℃～35℃，时间为0.5h～1h。

优选地，步骤(2)所述水浴的温度为30℃～50℃；搅拌时间为30min～60min，搅拌速率为300rpm～600rpm；所述均质的压力为500bar～1500bar，均质循环次数为3～6次。

所述多肽柔性脂质体在皮肤抗皱产品中应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用柔性脂质体对多肽进行包裹，相较于传统脂质体包裹以及多肽纯样，多肽的单位面积皮肤滞留量分别提高了1.17倍以及7.46倍。且柔性脂质体在进入皮肤后能够对多肽有极强的保护作用，在6h之内被皮肤酶液的分解量仅有30％，而纯样多肽几乎已经被完全分解。

(2)本发明的多肽柔性脂质体利用脂质体对多肽进行有效的包封，且添加了使脂质囊泡软化的表面活性剂和膜材软化剂，使得脂质体具有很强的可形变性能，大大增加了脂质囊泡的透皮性能，使多肽分子能够进入皮肤的更深层发挥作用，可应用于祛皱产品当中。

附图说明

图1为透射电镜下棕榈酰五肽-4柔性脂质体的外观形貌图。

图2为棕榈酰五肽-4柔性脂质体(Pal-KTTKS FLs)、棕榈酰五肽-4传统脂质体(Pal-KTTKS CLs)、棕榈酰五肽-4纯样(Pal-KTTKS pure sample)的缓释曲线。

图3为棕榈酰五肽-4柔性脂质体以及纯样的酶解曲线。

图4为棕榈酰五肽-4柔性脂质体、棕榈酰五肽-4传统脂质体、棕榈酰五肽-4纯样的透皮累计释放率曲线。

图5为使用精华液后皮肤弹性测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

取0.03g的棕榈酰五肽-4、0.2g的胆固醇、3g的大豆卵磷脂和0.2g的胆酸钠置于旋蒸容器当中。随后加入10ml的甲醇，超声并辅以手摇加速溶解，直至溶液变成澄清透明的黄色液体为止。将有机溶液在40℃的下旋转蒸发1h，此时瓶壁上留有一层淡黄色的薄膜。

将旋蒸容器置于真空干燥箱当中，设置温度为25℃，时间为1h，真空干燥除尽薄膜中痕量的甲醇。

取90ml的水溶液，加入0.3g的吐温-20，超声将二者混合均匀，随后将溶液倾入旋蒸容器当中，在45℃的水浴下搅拌0.5h将薄膜水化，随后超声直至瓶壁上的薄膜完全脱落为止。此时得到淡黄色的乳浊液。

将得到的乳浊液用高压均质仪在800bar的条件下均质循环5次，最终得到澄清透明的多肽柔性脂质体。

实施例2

取0.08g的棕榈酰五肽-4、0.3g的胆固醇、5g的蛋黄卵磷脂和0.3g的脱氧胆酸钠置于旋蒸容器当中。随后加入10ml乙醇，超声并辅以手摇加速溶解，直至溶液变成澄清透明的黄色液体为止。将有机溶液在35℃的下旋转蒸发1.5h，此时瓶壁上留有一层淡黄色的薄膜。

将旋蒸容器置于真空干燥箱当中，设置温度为30℃，时间为0.5h，真空干燥除尽薄膜中残留的甲醇。

取95ml的水溶液，加入0.5g的斯盘-40，超声将二者混合均匀，随后将溶液倾入旋蒸容器当中，在40℃的水浴下搅拌0.5h将薄膜水化，随后超声直至瓶壁上的薄膜完全脱落为止。此时得到淡黄色的乳浊液。

将得到的乳浊液用高压均质仪在1000bar的条件下均质循环5次，最终得到澄清透明的多肽柔性脂质体。

实施例3

取0.05g棕榈酰五肽-4、4g磷脂酰胆碱、0.25g胆固醇、0.25g胆酸钠、溶于10ml三氯甲烷当中，超声并辅以手摇加速溶解，直至溶液变成澄清透明的黄色液体为止。将有机溶液倾入旋蒸容器当中，将有机溶液在45℃的下旋转蒸发2h，此时瓶壁上留有一层淡黄色的薄膜。

将旋蒸容器置于真空干燥箱当中，设置温度为35℃，时间为2h，真空干燥除尽薄膜中残留的三氯甲烷。

取90ml的水溶液，加入0.4g的斯盘-20，超声将二者混合均匀，随后将溶液倾入旋蒸容器当中，在30℃的水浴下搅1h将薄膜水化，随后超声直至瓶壁上的薄膜完全脱落为止。此时得到淡黄色的乳浊液。

将得到的乳浊液用高压均质仪在500bar的条件下均质循环5次，最终得到澄清透明的多肽柔性脂质体。

实施例4

取0.06g的棕榈酰五肽-4、0.2g的胆固醇、5g的大豆卵磷脂和0.2g的胆酸钠置于旋蒸容器当中。随后加入10ml的甲醇，超声并辅以手摇加速溶解，直至溶液变成澄清透明的黄色液体为止。将有机溶液在45℃的下旋转蒸发3h，此时瓶壁上留有一层淡黄色的薄膜。

将旋蒸容器置于真空干燥箱当中，设置温度为40℃，时间为1.5h，真空干燥除尽薄膜中残留的三氯甲烷。

取95ml的水溶液，加入0.5g的单硬脂酸甘油酯，超声将二者混合均匀，随后将溶液倾入旋蒸容器当中，在35℃的水浴下搅拌2h将薄膜水化，随后超声直至瓶壁上的薄膜完全脱落为止。此时得到淡黄色的乳浊液。

将得到的乳浊液用高压均质仪在1500bar的条件下均质循环3次，最终得到澄清透明的多肽柔性脂质体。

实施例5

取0.07g的棕榈酰五肽-4、0.3g的胆固醇、5g的二棕榈酰卵磷脂和0.3g的胆酸钠置于旋蒸容器当中。随后加入10ml的乙醇，超声并辅以手摇加速溶解，直至溶液变成澄清透明的黄色液体为止。将有机溶液倾入旋蒸容器当中，将有机溶液在45℃的下旋转蒸发2.5h，此时瓶壁上留有一层淡黄色的薄膜。

将旋蒸容器置于真空干燥箱当中，设置温度为45℃，时间为0.5h，真空干燥除尽薄膜中残留的甲醇。

取92ml的水溶液，加入0.45g的吐温-20，超声将二者混合均匀，随后将溶液倾入旋蒸容器当中，在50℃的水浴下搅拌1h将薄膜水化，随后超声直至瓶壁上的薄膜完全脱落为止。此时得到淡黄色的乳浊液。

将得到的乳浊液用高压均质仪在1000bar的条件下均质循环5次，最终得到澄清透明的多肽柔性脂质体。

效果实施例1：性能测试

(1)柔性脂质体基础理化性质的测试

取200μl实施例中的多肽柔性脂质体，用超纯水稀释100倍之后超声使柔性脂质体分散均匀。通过纳米粒度仪检测柔性脂质体的粒径、PDI和Zeta电位。以传统脂质体(棕榈酰五肽-4)作为对照组，结果如表1下：

表1：多肽柔性脂质体的基本理化性质

从检测结果可以看出来，本发明的柔性脂质体相较于传统的脂质体粒径更小，在透皮方面具有更加显著的优势。且Zeta电位的绝对值很高，证明体系的稳定性很强，能在长时间内储存。

(2)柔性脂质体包封率测试

取1ml实施例中的多肽柔性脂质体于离心管当中，加入1ml曲拉通(10％,wt)溶液超声破乳，通过HPLC检测多肽的总浓度(C总)。另取等量的柔性脂质体置于超滤离心管当中，高速离心(4000r/min)30min后取超滤过后的下层滤液，通过HPLC检测清液中游离多肽的含量(C游)，并通过以下公式进行计算，结果如表2：

包封率(EE％)(C总-C游)/C总×100％

表2：多肽柔性脂质体的包封率

从检测结果可以看出来，本发明的多肽柔性脂质体具有较高的包封率。

(3)柔性脂质体形貌的测试

取实施例1的样品使用透射电子显微镜对样品进行观察，脂质体的形貌如图1所示。

(4)脂质体囊泡形变能力测试

取1ml柔性脂质体的稀释液装入注射器当中，将注射器插入到固定在垂直支架上的挤出机套管中，针头朝下，柱塞端与一个50N的加载单元接触。钢探针以1mm/s的恒定速度与注射器柱塞接触，迫使囊泡悬浮液通过挤压机套管内的50nm聚碳酸酯薄膜。每次实验前以1ml的超纯水对膜进行预处理，以便去除死体积。

对挤压的悬浮液进行准确称重。挤压前后囊泡粒径的变化采用纳米粒度仪分析并采用如下公式进行计算：

以传统脂质体作为对照组，所得的测试结果如下表3所示。

表3：挤压前后脂质体的粒径变化率

从实验结果来看，相对于传统脂质体，柔性脂质体由于具有弹性，因此在通过聚碳酸酯薄膜时粒径变化率更小。

(5)体外释放测试

取10ml实施例1中的柔性脂质体(Pal-KTTKS FLs)置于孔径大小为1000KDa的透析袋中，用夹子密封后放入300ml生理盐水/吐温-20的缓释液(w/w＝99：1)当中。将烧杯置于37℃的恒温水浴中搅拌并开始计时，分别在0h、1h、2h、4h、6h、12h、24h从烧杯中取1ml缓释液，并及时补充。通过HPLC测试计算释放量，并以传统脂质体(Pal-KTTKSCLs)以及纯样(Pal-KTTKSpure sample)作为对照组。缓释的实验结果如图2所示，柔性脂质体和传统脂质体相较于纯样都具有良好的缓释效果，其中柔性脂质体在24h内Pal-KTTKS释放了不到20％，说明柔性脂质体的包裹使得多肽能够长时间发挥功效。

(6)药物酶解实验

取SD大鼠的新鲜腹部皮肤，称取一定量的皮肤组织，剪碎后加入纯水，快速搅拌2h，滤除大块组织后，将溶液低速离心，将上层溶液冻干即得到酶液冻干粉。冻干粉在常温下解冻后，取实施例1中的柔性脂质体(Pal-KTTKS FLs)10ml注入其中，随后将之置于摇床当中，设置摇床的温度为37℃，转速为300rpm。放入样本后立即开始计时，分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h取1ml样本用曲拉通(10％,wt)破乳后定容至10ml，将样本进入HPLC分析。以纯样(Pal-KTTKS pure sample)作为对照组。酶解实验结果如图3所示。

从图3中可看出，脂质体对多肽能有很强的保护作用，在进入皮肤后不易被快速分解，能够保证包封的多肽长时间发挥功效。

(7)透皮吸收性能测试

取健康小鼠的腹部皮肤，去除毛发以及皮下组织和脂肪，用生理盐水洗净，得到离体小鼠皮肤组织，以生理盐水/吐温-20的混合溶液(w/w＝99：1)作为接收液，将皮肤组织固定在Franz扩散池当中，在供药池中加入1ml实施例1中的柔性脂质体(Pal-KTTKS FLs)，将接收池置于37℃恒温水浴中，平衡一定时间后，开始计时，分别在1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h从扩散池中取样测定并补充等量等温的生理盐水/吐温-20的混合溶液(w/w＝99：1)，通过HPLC测试并计算累计透过量，同时以传统脂质体(Pal-KTTKS CLs)和纯样(Pal-KTTKS pure sample)作为对照组进行透皮吸收实验，并用以下公式计算累计透过率：

透皮吸收性能测试结果如下图4所示，从中可以看出多肽柔性脂质体的透皮性能比纯样以及传统脂质体具有更高的透皮吸收效果。

透皮实验结束后，从Franz扩散池中取下小鼠皮肤，剪除多余的皮肤。将剩余的皮肤用PBS溶液(0.1mmol,PH＝7.4)清洗三遍后剪碎置于离心管当中，加入5ml生理盐水/吐温-20混合溶液(99:1,wt)用于提取Pal-KTTKS。使用匀浆机破碎鼠皮细胞后，将所得的浆液离心，取上清液进入HPLC当中分析Pal-KTTKS的含量，并采用以下公式计算单位面积药物滞留量。结果如表4所示：

表4：小鼠皮肤单位面积滞留量

如表4中数据显示，多肽柔性脂质体的皮肤滞留量分别是对照组的5.26倍和11.42倍。结果表明柔性脂质体可使得多肽在皮肤中高浓度的滞留，从而使药物发挥更好的功效。

效果实施例2：在祛皱产品中的应用

以实施例1得到的柔性脂质体作为原料添加在祛皱产品中应用

(1)添加了本发明包含有多肽柔性脂质体的祛皱保湿精华液的制备工艺如下：

表5：祛皱保湿精华液的配方

1：将卡波姆分散在水中，超声30min后加入B相并搅拌均匀；将混合溶液加热至80℃并维持30min；

2：取出分散液后降至35℃，并均质使分散液分散均匀；

3：往分散液中添加好预先混合好的C相、D相的混合液，搅拌均匀后放置至室温；

4：加入E相，搅拌过夜后取样检测，合格后过滤出样。

以添加有Pal-KTTKS纯样的精华液作为对照组和不添加Pal-KTTKS的精华液作为空白对照组。以实施例1作为E相添加进入作为配方1。

(2)使用观察

对配方人群中使用进行功效评价，观察使用者在过程中皮肤各项指标的变化情况，选取年龄为25～35岁的男性，按照规定流程使用配方产品，在0day、7day、14day、28day、42day对使用这皮肤进行测试评估。

测试仪器：德国Courage+Khazaka公司制造的皮肤弹性测试仪ReviscometerRV600。

通过皮肤弹性测试仪测试试验者颈部皮肤弹性变化如图5所示。由图5可知，R2值为一个反映皮肤弹性的参数，R2值越高，皮肤弹性越好。结果显示使用柔性脂质体精华液的试验者相较于纯样对照组以及空白对照组，皮肤弹性有着显著的提升。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种多肽柔性脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤

(1)将磷脂、胆固醇、膜材软化剂、活性多肽加入有机溶剂中，超声振荡使其溶解，将混合液置于旋蒸容器中，旋蒸去除有机溶剂，旋蒸容器壁上得到一层脂质薄膜；

(2)将含有表面活性剂的水相加入旋蒸容器中，进行水浴恒温搅拌，随后超声使旋蒸容器上的脂质薄膜完全脱落，得到多肽柔性脂质体初乳；

所述表面活性剂为吐温-20、单硬脂酸甘油酯中的一种或两种以上；

(3)将所得的多肽柔性脂质体初乳进行高压均质处理，所得的均质液用微孔滤膜进行过滤除去杂质，最终得到多肽柔性脂质体；

所述活性多肽为棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰六肽-19和棕榈酰寡肽中的至少一种；

所述的膜材软化剂至少为胆酸钠、脱氧胆酸钠和吐温-80中的一种；

以重量份计，原料配比如下：

活性多肽0.03 ~ 0.08份，磷脂3~5份，胆固醇0.2~0.3份，表面活性剂0.3~0.5份，膜材软化剂0.2 ~0.3份，水90~ 95份。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、二棕榈酰卵磷脂和棕榈酰磷脂酰甘油中的一种或两种以上；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、三氯甲烷中的一种或两种以上。

3.根据权利要求1~2任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述旋蒸的温度为35 ℃~45℃，时间为1h ~ 3h；所述脂质薄膜还经真空干燥，直至有机溶剂彻底挥发，所述真空干燥的温度为25 ℃ ~35 ℃，时间为0.5 h ~ 1 h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水浴的温度为30℃~50℃；搅拌时间为30min~60 min，搅拌速率为300rpm~600rpm；步骤（3）所述均质的压力为500bar~1500bar，均质循环次数为3~6次。

5.权利要求1~4任意一项所述方法制得的多肽柔性脂质体。

6.权利要求5所述多肽柔性脂质体在制备皮肤抗皱产品中的应用。

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