CN111631978B - 一种鱼籽小分子肽面膜液、面膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种鱼籽小分子肽面膜液的制备方法，包括小分子肽提取和面膜液制备，其特征在于：所述小分子肽提取是采用鱼籽预处理后进行脱脂处理、水解、除杂、沉降制备鱼籽多肽粗粉末，再用复合酶水解、分段分离纯化提取小分子肽。本发明制备的鱼籽小分子肽面膜稳定性好、小分子肽的肽键数少、且分布窄，在3~6个之间，小分子肽在面膜中的溶解性大、具有优异的分散均匀性，有利于皮肤均匀、有效吸收，具有优异的抗氧化性能和渗透性能，其对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为80.6%和64.7%。

Description

一种鱼籽小分子肽面膜液、面膜的制备方法

技术领域

本发明涉及日用化妆品技术领域，具体涉及一种鱼籽小分子肽面膜液、面膜的制备方法。

背景技术

皮肤氧化主要是由于皮肤在有氧呼吸过程中产生大量的自由基，过多的自由基，攻击肌肤细胞，掠夺皮肤的营养，引起机体老化、器官组织突变、肌肤衰老以及免疫力下降。皮肤被氧化最重要的特征就是脸色变黄、斑点和瑕疵增多，这就像苹果氧化后”发黄“，钢铁氧化后”生锈”。这种破坏发生在肌肤上，会造成胶原和弹性纤维松弛和脆裂，表皮细胞新生减缓。而且细胞核受到自由基的伤害，就无法分裂出健康的细胞了，细胞间的脂质也会被破坏，变得无法维持住肌肤中的水分。

多肽在自然界中广泛存在，是氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物。有文献把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)，10～50个氨基酸组成的肽称为多肽，由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。生物活性多肽具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、抗氧化、降血压和降血脂等功能，且可作为药物或药物的前体，使用安全，人体吸收速率比氨基酸高，所以日益受到人们的重视。

很多护肤品中会添加多肽这是因为它会产生特别的功效，能够使皮肤的问题得到改善，多肽在护肤品当中的功效与作用主要体现在以下几点，第一点，它能够起到抗衰老的效果，因为多肽能够给皮肤的组织补充所需要的营养，从而使皮肤从细胞层发生变化，那么皮肤衰老的速度就会有所减缓，尤其适合年龄比较大的人群选择含有多肽的护肤品。第二点，能够有效地保护皮肤，避免皮肤出现过敏现象，因为它能够保护皮肤的皮脂膜，只有皮脂膜健康，外界的污染物或者是过敏因素才不会影响到皮肤的健康。

目前市售的护护品中添加的多肽的相对分子质量大，且分子量分布宽，结构复杂多样，使得皮肤吸收能力差。另外，多肽中容易形成α-螺旋、β-折叠和β-转角等二级结构，通常情况下肽链越长，二级结构越稳定。在6肽以下的多肽中，没有α-螺旋、β-折叠，主要是β-转角；10肽以上不仅存在β-转角，还有β-折叠，一般没有α-螺旋。β-转角还有连接蛋白质分子中的其他二级结构(α-螺旋和β-折叠)的作用，使肽链形成更稳固复杂非重复多肽区，使得多肽溶解性变差，多肽的分散均匀性差，进一步阻碍了皮肤吸收，降低了其护肤效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鱼籽小分子肽面膜液的制备方法。

本发明另一目的是提供含有上述面膜液的面膜的制备方法

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种鱼籽小分子肽面膜液的制备方法，包括小分子肽提取和面膜液合成，其特征在于：所述小分子肽提取是采用鱼籽预处理后进行脱脂处理、木瓜蛋白酶水解、除杂、沉降制备鱼籽多肽粗粉末，再依次用复合酶解、分离纯化提取小分子肽；上述复合酶解是将鱼籽多肽粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:1～5的质量比混合的复合酶在pH为7～9、温度为40～45℃下持续震荡水解10～15h，酶解结束后，将温度降至5～10℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，上述复合酶用量占木瓜蛋白酶水解过程中木瓜蛋白酶质量的0.3～0.5％。

上述鱼籽选用青鱼鱼籽。

进一步，上述鱼籽预处理将鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为25～40℃，转速为10000～15000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:0.5～2。

进一步，上述脱脂是将粉碎后的鱼籽混合物，浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝1～3：2～5:1的混合溶液中，料液比为1:15～45g/mL，在5～30℃,搅拌速度为200～500rpm下脱脂处理15-60h，然后用纯化水洗涤，并沥干，备用。

进一步，上述水解是向脱脂物中加入pH为8.4～9.6的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:15～30，混合均匀；在30～55℃的水浴中活化20～40min；加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量为脱脂物质量的0.5％～3％，酶活力≥2.5×104U/g；在40～50℃下酶解55～70min；反应结束后升温至105～120℃灭活；采用稀醋酸调整pH值至中性。

进一步，所述除杂是将水解后的剩余物置于0.1-0.5M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为100～300rpm，于10～15℃去杂12～24h，水洗至中性；在温度为5～10℃、转速为7000～10000rpm下离心20～30min，收集滤液。

进一步，上述沉降是将滤液置于质量浓度为3～5.5％的硫酸铵中盐析18～36h，盐析温度控制在5～10℃；采用纯化水透析，取沉淀冷冻干燥得鱼籽多肽粗粉末。

进一步，上述冷冻干燥是在-30～-10℃下冷冻0.5～3h，然后开启真空泵，压力为10～100Pa，升温至40～50℃，干燥12～20h。

进一步，上述分离纯化具体是将滤液采用分子筛层析柱对复合酶解后的产物进行一步分离纯化，其中分子筛层析柱的类型为Sephadex G-10，分子量分离范围为<700，分离并收集分离物，收集到的分离物进行离心、纯化水透析，冷冻干燥制得3～6个肽键的小分子肽粉末，收率为83～91％。

由于静电力、氢键及疏水作用的存在，使得多肽形成了α-螺旋、β-折叠及β转角等二级结构，其中β转角又将α螺旋和β这点连接起来，形成非重复多肽区的稳定二级结构，降低了多肽的溶解度(蛋白质在水中的分散量和分散水平)，使得多肽在面膜中分散均匀性差，降低了皮肤对其的吸收效果。

本发明通过木瓜蛋白酶一次酶解和羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶复合二次酶解，先通过一次酶解将青鱼鱼籽中复杂肽链结构内切水解成特定多组肽链、再由羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶分别从一次水解后的肽链的C端和N末端同时开始逐个降解，当羧肽酶A水解过程中遇到某些氨基酸如脯氨酸，会停止水解，而脯氨酸氨肽酶则会从这些氨基酸N端水解成游离氨基酸，从而促进羧肽酶持续水解，最终制得3～6个肽键的小分子肽、其收率达到83～91％，显著消除了多肽中常见的α-螺旋和β-折叠的二级结构，降低了多肽中的氢键作用，破坏了二级结构的稳定性。

进一步，上述面膜液制备是采用1～3重量份羟乙基纤维素和0.5～2重量份卡波姆制备成A组分，取5～10重量份去纯化水，向水中加入适量的2～5重量份丙二醇、2～8重量份甘油、4～5重量份竹醋液、1～4重量份透明质酸，3～6份烷基糖苷，2～5重量份癸酸甘油三酯、0.01～0.05重量份茉莉花精油、0.01～0，1重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分，然后配制鱼籽小分子肽水溶液，再将组分A、组分B和小分子肽水溶液混合制备成面膜液。

进一步，上述A组分是取羟乙基纤维素和卡波姆用量总和的4～6倍的纯化水，将纯化水的1/3～1/2升温至70～90℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由羟乙基纤维素和卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充剩余的纯化水，维持上述温度并以200～300r/min的速率进行搅拌20～30min；然后降温至25～45℃，优选30～40℃，搅拌转速提升至500～700rpm，搅拌10～15min，使其完全溶胀，形成A组分。

面膜液中的水通常以束缚水和自由水两种形式存在，通常束缚水在皮肤失水时可以起到替代细胞中水分的作用，从而达到补水保湿的效果，由于表面活性剂的使用，使得束缚水逐渐饱和，自由水比例增大。本发明采用上述羟乙基纤维素和卡波姆，通过两步加水，温度搅拌速率的变化配合，使得增稠剂与水分子搭接形成水化网格结构，使得加入的自由水大量转变成网格中的束缚水，使得面膜液具有优异的保湿补水效果。

进一步，上述配置小分子肽水溶液是将0.01～0.5重量份的小分子肽粉末溶解于10～20重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在35～45℃、200～400rpm下搅拌60～90min，混合物占小分子肽重量的1～5％。

发明人发现，在二级结构较稳定的情况下，加入乙酸和乙醇的混合物对肽的二级结构中氢键的破坏较弱，而本发明中采用复合酶二次水解，消除了小分子肽中的部分二级结构，氢键作用降低，打破了二级结构的稳定性，乙酸和乙醇混合物能高效争夺小分子肽内部残余氢键，从而破坏小分子肽二级结构β-转角中剩余的氢键，使得二级结构无法维系，从而提高了小分子肽的溶解度，使得小分子肽具有优异的分散均匀性，利于皮肤的有效吸收，发挥其抗氧化、美白、补水等功效。

进一步，上述面膜液具体是将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为25～45℃优选30～40℃，搅拌转速提升至500～700rpm，搅拌时间是10～15min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌50～90min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌40～50min。

最优选的，一种鱼籽小分子肽面膜液的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：

S01、鱼籽肽提取

(1)将鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为25～40℃，转速为10000～15000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:0.5～2；

(2)将粉碎后的鱼籽浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝1～3：2～5：1的混合溶液中，料液比为1:15～45g/mL，在5～30℃,搅拌速度为200～500rpm下脱脂处理15-60h，然后用纯化水洗涤，并沥干，形成脱脂物备用；

(3)向脱脂物中加入pH为8.4～9.6的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:15～30，混合均匀；在30～55℃的水浴中活化20～40min；加入木瓜蛋白酶，用量为脱脂物质量的0.5％～3％，酶活力≥2.5×10⁴U/g；在40～50℃下酶解55～70min；反应结束后升温至105～120℃灭活；采用稀醋酸调整pH值至中性；

(4)将水解后的物质置于0.1-0.5M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为100～300rpm，于10～15℃去杂12～24h，水洗至中性；在温度为5～10℃、转速为7000～10000rpm下离心20～30min，收集滤液；

(5)将滤液置于质量浓度为3～5.5％的硫酸铵中盐析18～36h，盐析温度控制在5～10℃；采用纯化水透析，取沉淀物在-30～-10℃下冷冻0.5～3h，然后开启真空泵，压力为10～100Pa，升温至40～50℃，干燥12～20h得鱼籽多肽粗粉末；

(6)将鱼籽多肽粗粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:1～5质量比例组成的复合酶在pH为7～9、温度为40～45℃下持续震荡水解10～15h，酶解结束后，将温度降至5～10℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，复合酶用量占木瓜蛋白酶质量的0.3～0.5％；

(7)将滤液采用分子筛层析柱分离纯化，其中分子筛层析柱的类型为Sephadex G-10，分子量分离范围为<700，收集分离物，最后收集到的小分子肽离心、纯化水透析，冷冻干燥制得3～6个肽键的小分子肽粉末，收率为83～91％；

S02、面膜液制备

(1)取羟乙基纤维素和卡波姆用量总和的4～6倍的纯化水，将纯化水的1/3～1/2升温至70～90℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由1～3重量份羟乙基纤维素、0.5～2重量份卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充剩余的纯化水，维持温度并以200～300r/min的速率进行搅拌20～30min；然后降温至25～45℃，优选30～40℃，搅拌转速提升至500～700rpm，搅拌10～15min，使其完全溶胀，形成A组分；

(2)取5～10重量份去纯化水，向水中加入适量的2～5重量份丙二醇、2～8重量份甘油、4～5重量份竹醋液、1～4重量份透明质酸，3～6份烷基糖苷，2～5重量份癸酸甘油三酯、0.01～0.05重量份茉莉花精油、0.01～0，1重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分；

(3)将0.01～0.5重量份的小分子肽粉末溶解于10～20重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在35～45℃、200～400rpm下搅拌60～90min，混合物占小分子肽重量的1～5％；

(4)将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为25～45℃优选30～40℃，搅拌转速为500～700rpm，搅拌10～15min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌50～90min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌40～50min。

一种鱼籽小分子肽面膜的制备，其特征在于：取上述面膜液25g于容器中，纯棉面膜基布折好放人其中，待完全浸透后取出，就可以使用。

本发明通过制备肽键分布窄的小分子多肽、破坏其二级结构，增加小分子肽的溶解性，另外使得小分子肽在面膜液中分散均匀性好，在特定的面膜乳液中，小分子肽链段以单链形式存在，避免了小分子肽的肽链之间的相互缠绕和团聚，使得皮肤对活性成分鱼籽小分子肽充分、均匀吸收。

本发明具有如下技术效果：

本发明制备的鱼籽小分子肽面膜液稳定性好、小分子肽的肽键数少、且分布窄，在3～6个之间，小分子肽在面膜中的溶解性大、具有优异的分散均匀性，有利于皮肤均匀、有效吸收，具有优异的抗氧化性能和渗透性能，其对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为80.6％和64.7％，鱼籽小分子肽的在皮肤上的渗透率为65.3％，本发明制备的面膜液具有优异的保湿功效。

附图说明

图1：本发明实施例1制备的面膜液与对比例制备的面膜液自由基清除率对比图。

图2：本发明实施例1制备的面膜液与对比例1制备的面膜液分子肽在皮肤上的渗透率对比图。

图3：对比例2余实施例1制备的面膜液的保湿性能曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

一种鱼籽小分子肽面膜的制备方法，按如下步骤进行：

S01、鱼籽肽提取

(1)将青鱼鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为30℃，转速为12000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:1；

(2)将粉碎后的鱼籽浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝2：3：1的混合溶液中，料液比为1:35g/mL，在25℃,搅拌速度为400rpm下脱脂处理40h，然后用纯化水洗涤，并沥干，形成脱脂物备用；

(3)向脱脂物中加入pH为8.8的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:25g/mL，混合均匀；在40℃的水浴中活化30min；加入木瓜蛋白酶，用量为脱脂物质量的2％，酶活力≥2.5×10⁴U/g；在45℃下酶解60min；反应结束后升温至110℃灭活；采用稀醋酸调整pH值至中性；

(4)将水解后的物质置于0.2M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为200rpm，于10～15℃去杂14h，水洗至中性；在温度为8℃、转速为8000rpm下离心25min，收集滤液；

(5)将滤液置于质量浓度为5％的硫酸铵中盐析25h，盐析温度控制在8℃；采用纯化水透析，取沉淀物在-20℃下冷冻2.5h，然后开启真空泵，压力为40Pa，升温至45℃，干燥16h得鱼籽多肽粗粉末；

(6)将鱼籽多肽粗粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:3质量比混合的复合酶在pH为8、温度为40℃下持续震荡水解12h，酶解结束后，将温度降至7℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，复合酶用量占木瓜蛋白酶的0.4％；

(7)将滤液采用分子筛层析柱分离纯化，收集不同分子量的多肽，其中分子筛层析柱的类型为Sephadex G-10，分子量分离范围为<700，分离纯化，最后将收集到的分离物离心、纯化水透析，冷冻干燥制得3～6个肽键小分子肽粉末；

S02、面膜液制备

(1)将6份纯化水升温至80℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由2重量份羟乙基纤维素、1重量份卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充9份纯化水，维持温度并以250r/min的速率进行搅拌25min；然后降温至35℃，搅拌转速提升至600rpm，搅拌12min，使其完全溶胀，形成A组分；

(2)取7重量份去纯化水，向水中加入适量的3重量份丙二醇、6重量份甘油、4重量份竹醋液、3重量份透明质酸，4份烷基糖苷，4重量份癸酸甘油三酯、0.02重量份茉莉花精油、0.05重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分；

(3)将0.1重量份的小分子肽粉末溶解于15重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在40℃、300rpm下搅拌70min，形成小分子肽水溶液，混合物占小分子肽粉末重量的4％；

(4)将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为35℃，搅拌转速为600rpm，搅拌10～15min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌60min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌45min；

S03、制备面膜

取面膜液25g于容器中，纯棉面膜基布折好放人其中，待完全浸透后取出，就可以使用。

对比例1

与实施例1一样，采用相同的青鱼鱼籽提取多肽，并制备成面膜液，与实施例1不同的是，提取多肽过程中，仅仅采用木瓜蛋白酶进行粗提取，然后二次酶解是仅采用羧肽酶A、苯丙氨酸氨肽酶及天冬氨酸蛋白酶按照1:1:1质量比进行复合酶解，其余步骤与实施例1相同。对比例1最终制备的鱼籽多肽肽键数分布在9～23个。

对比例2

与实施例1相同，制备出肽键数分布为3～6个的小分子肽，采用同样的工艺制备成面膜液，与实施例1不同的是：复合增稠剂中的羟乙基纤维素和卡波姆直接混合后再80℃下加入B组分中搅拌混合。

1.肽键数的检测：

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与肽键数浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，此方法适用于多肽含量的测定。采用此方法对本发明制备的小分子肽和对比例1制备的鱼籽多肽的肽键数完成了检测，数据见表1。

表1：本发明制备的鱼籽小分子肽与对比例1中鱼籽多肽的肽键数分布。

从表1可知，本发明方法所制备的鱼籽小分子肽的肽键数分布为2～7，主要集中在3～6个；对比例1制备的鱼籽多肽肽键数分布为9～23，主要集中在10～23个。可见，对比例1制备的鱼籽多肽肽键数比本发明实施例1中制备的鱼籽小分子肽肽键数大，且分布更宽。可知，本发明制备的鱼籽小分子肽分子量小，肽键分布范围窄，更易形成游离态氨基酸被皮肤吸收。

2.抗氧化性检测

关于多肽的抗氧化原理，一般认为与抗氧化肽包含的特定氨基酸，氨基酸的种类、序列、构性有关。抗氧化检测方法包括：DPPH清除能力测定、羟基自由基清除能力测定、高价铁还原力测定等。

(1)对DPPH自由基的清除能力测定

将DPPH自由基溶于无水乙醇中配制成2×10^-8mol/L的DPPH溶液；将对比例1和本发明实施例1制备的等量面膜液溶于蒸馏水中静置24h后的上清液，再加入2mlDPPH溶液强烈振荡后放于暗处静置30min分别测定各反应液的吸光度值计算各待测样品对DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率＝[1-(A1-A2)/A3]×100％

式中：A1为样液与DPPH试剂混合液的吸光度值；A2为样液与95％乙醇混合液的吸光度值；A3为DPPH试剂与蒸馏水混合液的吸光度值。

(2)对羟基自由基的清除能力测定

向试管中加入2ml 9mol/L的FeSO₄溶液，再加入2ml 9mol/L的水杨酸乙醇溶液；将对比例1与实施例1制备的等量面膜溶于蒸馏水中静置24h后的上清样液，最后加入2ml8.8mmol/L的H₂O₂启动反应，振荡混合。测其吸光度值，计算各待测样品对羟基自由基的清除率。

羟基自由基清除率＝[A4-(A5-A6)]/A4×100％

式中：A4为不加样液的吸光度值；A5为加入样液后的吸光度值；A6为用水代替H₂O₂测得的吸光度值。

面膜清除DPPH自由基、羟基自由基能力图1。可知，本发明制备的鱼籽小分子肽面膜抗氧化性优异，对DPPH自由基的清除率达到80.6％，对羟基自由基的清除率达到64.7％，对比例1中对DPPH自由基的清除率达到47.7％，对羟基自由基的清除率达到40.2％。

3.渗透性能测试

取健康的SPF级雄性小鼠腹部皮肤，去除脂肪层鼠毛，用生理盐水洗净，将小鼠皮肤固定在扩散池和接收池之间，皮肤的角质层面向扩散池，真皮层面向接收池，与接收池中的溶剂刚好接触，以防止有气泡产生。接收池的体积为15mL。取自制美白面膜液lmL置于扩散池中，在预先加入磁力搅拌子的接收池中加入蒸馏水，并将接收池放在智能透皮试验仪的磁力搅拌器上，设置水浴温度37℃，搅拌速率350r/min，每隔5min，通过取样口取样(同时补充等量的接收液)分析。

面膜中多肽渗透量随时间变化图，见图2。从图2可知，自制鱼籽小分子肽面膜比市售多肽面膜的渗透率高，即是说，本方案的所列措施有利于提高其渗透率。

4.保湿性能测试

以小型玻璃板和医用透气胶带为仿角质层、表皮等生物材料模拟在人皮肤上涂抹霜剂的过程在制成的2cm×4cm的模拟装置上涂抹0.5g的面膜液，放入25℃的烘箱中每间隔5min精确称取模拟装置整体的质量，根据烘烤前的质量m1和烘烤后的质量m2计算保湿率：

保湿率＝m2/m1×100％

对比例2和本发明制备的面膜液在25℃时的随时间的保湿率见图3，在35min时，本发明实施例1制备的微乳面膜表现出较好的保湿性能，保湿性率达到78.9％，对比例2制备的微乳面膜液(62.7％)高。说明制备的微乳面膜具优异的保湿性能。

实施例2

一种鱼籽小分子肽面膜的制备方法，按如下步骤进行：

S01、鱼籽肽提取

(1)将青鱼鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为25℃，转速为15000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:2；

(2)将粉碎后的鱼籽浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝3：2：1的混合溶液中，料液比为1:15g/mL，在30℃,搅拌速度为200rpm下脱脂处理60h，然后用纯化水洗涤，并沥干，形成脱脂物备用；

(3)向脱脂物中加入pH为8.4的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:15g/mL，混合均匀；在30℃的水浴中活化40min；加入木瓜蛋白酶，用量为脱脂物质量的0.5％，酶活力≥2.5×10⁴U/g；在50℃下酶解55min；反应结束后升温至105℃灭活；采用稀醋酸调整pH值至中性；

(4)将水解后的物质置于0.5M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为100rpm，于15℃去杂12h，水洗至中性；在温度为10℃、转速为7000rpm下离心30min，收集滤液；

(5)将滤液置于质量浓度为5.5％的硫酸铵中盐析18h，盐析温度控制在5℃；采用纯化水透析，取沉淀物在-10℃下冷冻3h，然后开启真空泵，压力为10Pa，升温至50℃，干燥12h得鱼籽多肽粗粉末；

(6)将鱼籽多肽粗粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:5质量比组成的复合酶在pH为7、温度为45℃下持续震荡水解15h，酶解结束后，将温度降至5℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，复合酶用量占木瓜蛋白酶质量的0.3％；

(7)将滤液采用分子筛层析柱分离纯化，收集不同分子量的多肽。其中分子筛层析柱的类型为Sephadex G-10，分子量分离范围为<700，分离纯化，最后将收集到的分离物离心、纯化水透析，冷冻干燥制得3～6个肽键小分子肽粉末；

S02、面膜液制备

(1)将7重量份纯化水升温至70℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由3重量份羟乙基纤维素、0.5重量份卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充7重量份纯化水，维持温度并以200r/min的速率进行搅拌30min；然后降温至25℃，优选搅拌转速提升至700rpm，搅拌10min，使其完全溶胀，形成A组分；

(2)取10重量份去纯化水，向水中加入适量的5重量份丙二醇、2重量份甘油、4重量份竹醋液、1重量份透明质酸，6份烷基糖苷，2重量份癸酸甘油三酯、0.05重量份茉莉花精油、0.01重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分；

(3)将0.5重量份的小分子肽粉末溶解于20重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在35℃、400rpm下搅拌60min，混合物占小分子肽粉末重量的1％；

(4)将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为45℃，搅拌转速为500rpm，搅拌15min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌50min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌50min；

S03、制备面膜

取面膜液25g于容器中，纯棉面膜基布折好放人其中，待完全浸透后取出，就可以使用。

实施例3

一种抗氧化面膜的制备方法，按如下步骤进行：

S01、鱼籽肽提取

(1)将青鱼鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为40℃，转速为10000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:0.5；

(2)将粉碎后的鱼籽浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝1：5：1的混合溶液中，料液比为1:45g/mL，在5℃,搅拌速度为500rpm下脱脂处理15h，然后用纯化水洗涤，并沥干，形成脱脂物备用；

(3)向脱脂物中加入pH为9.6的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:30g/mL，混合均匀；在55℃的水浴中活化20min；加入木瓜蛋白酶，用量为脱脂物质量的3％，酶活力≥2.5×10⁴U/g；在50℃下酶解70min；反应结束后升温至120℃灭活，采用稀醋酸调整pH值至中性；

(4)将水解后的物质置于0.1M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为300rpm，于10℃去杂24h，水洗至中性；在温度为5℃、转速为10000rpm下离心20min，收集滤液；

(5)将滤液置于质量浓度为3％的硫酸铵中盐析36h，盐析温度控制在10℃；采用纯化水透析，取沉淀物在-30～℃下冷冻0.5h，然后开启真空泵，压力为100Pa，升温至40℃，干燥20h得鱼籽多肽粗粉末；

(6)将鱼籽多肽粗粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:1的质量比组成的复合酶在pH为9、温度为45℃下持续震荡水解10h，酶解结束后，将温度降至10℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，复合酶的用量占木瓜蛋白酶质量的0.5％；

(7)将滤液采用分子筛层析柱分离纯化，收集不同分子量的多肽，其中分子筛层析柱的类型为Sephadex G-10，分子量分离范围为<700，分离纯化，最后将收集到的分离物离心、纯化水透析，冷冻干燥制得小分子肽粉末；

S02、面膜液制备

(1)将6重量份纯化水升温至90℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由1重量份羟乙基纤维素、2重量份卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充12份纯化水，维持温度并以300r/min的速率进行搅拌20min；然后降温至45℃，搅拌转速提升至500rpm，搅拌15min，使其完全溶胀，形成A组分；

(2)取5重量份去纯化水，向水中加入适量的2重量份丙二醇、8重量份甘油、5重量份竹醋液、4重量份透明质酸，3份烷基糖苷，5重量份癸酸甘油三酯、0.01重量份茉莉花精油、0.1重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分；

(3)将0.01重量份的小分子肽粉末溶解于10重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在45℃、200rpm下搅拌90min，混合物占小分子肽重量的5％；

(4)将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为25℃，搅拌转速为700rpm，搅拌10min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌90min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌40min；

S03、制备面膜

取面膜液25g于容器中，纯棉面膜基布折好放人其中，待完全浸透后取出，就可以使用。

Claims (2)

1.一种鱼籽小分子肽面膜液的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：

S01、鱼籽肽提取

（1）预处理：将青鱼鱼籽和纯化水混合，高速剪切粉碎，粉碎温度为25~40℃，转速为10000~15000rpm，鱼籽和纯化水的重量比为1:0.5~2；

（2）脱脂处理：将粉碎后的鱼籽浸于体积比为甲醇：乙二醇:环己烷＝1~3：2~5：1的混合溶液中，料液比为1:15~45g/mL，在5~30℃，搅拌速度为200~500rpm下脱脂处理15-60h，然后用纯化水洗涤，并沥干，形成脱脂物备用；

（3）木瓜蛋白酶水解：向脱脂物中加入pH为8.4~9.6的甘氨酸-NaOH缓冲液，料液比为1:15~30，混合均匀；在30~55℃的水浴中活化20~40min；加入木瓜蛋白酶，用量为脱脂物质量的0.5%~3%，酶活力≥2.5×10⁴U/g；在40~50℃下酶解55~70min；反应结束后升温至105~120℃灭活；采用稀醋酸调整pH值至中性；

（4）将水解后的物质置于0.1-0.5M NaOH中连续低速搅拌，搅拌速度为100~300rpm，于10~15℃去杂12~24h，水洗至中性；在温度为5~10℃、转速为7000~10000rpm下离心20~30min，收集滤液；

（5）将滤液置于质量浓度为3~5.5％的硫酸铵中盐析18~36h，盐析温度控制在5~10℃；采用纯化水透析，取沉淀物在-30~-10℃下冷冻0.5~3h，然后开启真空泵，压力为10~100Pa，升温至40~50℃，干燥12~20h得鱼籽多肽粗粉末；

（6）将鱼籽多肽粗粉末用羧肽酶A和脯氨酸氨肽酶按照1:1~5质量比例组成的复合酶在pH为7~9、温度为40~45℃下持续震荡水解10~15h，酶解结束后，将温度降至5~10℃，离心、过滤、除杂，收集滤液，复合酶用量占木瓜蛋白酶质量的0.3~0.5%；

（7）将滤液采用分子筛层析柱一步分离纯化，其中分子筛层析柱的分子量分离范围为<700，收集分离物，将收集到的分离物离心、纯化水透析，冷冻干燥制得3~6个肽键的小分子肽粉末，收率为83~91%；

S02、面膜液制备

（1）取羟乙基纤维素和卡波姆用量总和的4~6倍的纯化水，将纯化水的1/3~1/2升温至70~90℃，然后在搅拌过程中缓慢加入由1~3重量份羟乙基纤维素、0.5~2重量份卡波姆组成的混合物；混合物加完后补充剩余的纯化水，维持温度并以200 ~300r/min的速率进行搅拌20~30min；然后降温至25~45℃，搅拌转速提升至500~700rpm，搅拌10~15min，使其完全溶胀，形成A组分；

（2）取5~10重量份纯化水，向水中加入适量的2~5重量份丙二醇、2~8重量份甘油、4~5重量份竹醋液、1~4重量份透明质酸，3~6份烷基糖苷，2~5重量份癸酸甘油三酯、0.01~0.05重量份茉莉花精油、0.01~0.1重量份檀香精油搅拌使其充分溶解，形成B组分；

（3）将0.01~0.5重量份的小分子肽粉末溶解于10~20重量份的纯化水中，再加入乙酸和乙醇按照1:1质量比组成的混合物，在35~45℃、200~400rpm下搅拌60~90min，混合物占小分子肽重量的1~5%；

（4）将组分A加入组分B中搅拌混合，搅拌温度为25~45℃，搅拌转速为500~700rpm，搅拌10~15min，再加入鱼籽小分子肽水溶液，搅拌50~90min，再持续补充纯化水至100份，持续搅拌40~50min。

2.含有如权利要求1所述的面膜液的面膜的制备方法，其特征在于：取所述面膜液25g于容器中，纯棉面膜基布折好放人其中，待完全浸透后取出，就可以使用。

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