JPS62236803A - 高純度デルマタン硫酸の製法およびこれを含有する薬用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高純度デルマタン硫酸（ｄｅｒｍａｔａｎｓ
ｕｌｐｈａｔｅ）の製造方法、および活性成分としてこ
れを含有する薬用組成物に関する。

デルマタン硫酸（ＤＳ　）は、次の構造式を有する、１
，３グルコシド結合によシ連結したイズロン酸１モルと
Ｎ−アセチルガラクトサミンスルホン酸とから成る二糖
単位の繰返しによって構成されるムコ多糖（ＭＰＳ　）
であることは知られている。

ＤＳの分子量は、プロテオグリカンの抽出法およびこれ
をＭＰＳから分離するために用いる方法によって変更す
ることができる。

カルゲキシル基の、スルホン基に対する比は連輪的には
１：１であるが、これも実際には、若干のガラクトサミ
ンおよびイズロン酸に比較的多数のスルホン化ヒドロキ
シルが存在するために変動し得る。

Ｄ８が最近かなシ広く関心を集めているのは、それがヘ
ノ臂すン助因子■を選択的に活性化し、これによってか
なシ大きい抗トロンビン活性をあられし、しかも血液凝
固プロセスを調節する他の多数のセリンプロテアーゼ阻
害物質を妨害しないことが判明したからである。

しかしこれを薬剤として使用できるかどうかは、とれを
、存在する種々の基の分解または化学豹変形をおこすこ
となくほとんど変化しない形で天然プロテオグリカンか
ら抽出でき、マイナスの副作用をおこし得る異物、たと
えば蛋白質およびヌクレオチドをほぼ完全に除去できる
かどうかにかかっている。

実際的観点からは、上述の要求を満足するＤｓ製造法を
確立することは極めて困難であることがわかっている。

したがって、種々濃度の無機塩溶液でラット皮膚プロテ
オグリカンを抽出する研究では（ＣｈｅｍｉｅａｌＡｂ
ｓｔｒａｃｔｓ　−８４巻−１９７６−１９４ページ要
約７１１７３ｄ）、少量のデルマタン硫酸とその他のプ
ロテオグリカン類との混合物が生成した。

グリコサミノグリカン混合物から純粋なデルマタン硫酸
を分離することはむづかしく、最終生成物の収量は非常
に低くなる。

（欧州特許出願第０．０９７．６２５号に提案されてい
るように）、グリコサミノグリカン水溶液から種々の温
度で分別結晶化することによシ生成したデルマタン硫酸
も、所望の純度要求を満たしていない。

我々は今回、本発明の主題、すなわち動物器官からのＤ
Ｓ抽出法を発見した；この方法においてＤＳは、出発原
料中に存在するときの分子量および構造を＃丘とんど変
化させることなく、不都合な副作用をおこす汚染残留物
を完全に排除して得られる。

新しい方法は本質的には次の段階から成る：ａ）好まし
くは、ウシまたはブタ腸粘膜、またはブタ肺、膵臓、大
動脈、牌臓、脳、胸腺、ｔたは軟骨の形の生原料を選び
、変化を避けるためにそれを直ちに速かに凍結する段階
と、ｂ）生原料そのものまたは冷アセトンで均質化した
生原料をＣａ　ＣＬ２水溶液と共に超微粒子化する段階
と、 Ｃ）水性生原料／　ＣａＣｔ２ホモジネートをアルカリ
性−１低温度で蛋白分解酵素によシ酵素性消化をする段
階と； ｄ）溶解質を酸性にし、加熱し、ろ過する段階と、 ｅ）澄明なる液を、ＭＰＳと錯化合物を生成し得る第四
級アンモニウム塩で処理する段階と、ｆ）高純度のＤＳ
を選択的に炉取する段階。

以上に概略記した個々のプロセス段階の実施法を次いで
一層詳細に説明する。

段階ａ）は生原料の製造に関係し、次の段階に適した材
料をつくるため等しく適当した種々の方法により実施さ
れる。

段階ｂ）は新規な方法に必須の重要な段階の一つである
Ｃａ　Ｃ１０との混合に関するものであシ、実際には、
本発明の本質を決して変えるものでない種種の方法で行
われる。

それだけで冷凍された生原料ホモジネートの場合には、
それを、原料：溶液の重量比が１：０．５になるような
割合で加え九〇−０１Ｍ　ＣＩＬＣＡ２水溶液で超微粒
子化する。

生原料をアセトン処理粉末の形で用いる場合は、最初の
冷凍原料を、原料：溶液の重量比１：１の割合のＩ　Ｍ
　ＣａＣｔ２水溶液で超微粒子化し、それを重量比１：
３の割合の冷アセトン（＋５℃）と共に攪拌し、濾過し
、残液を再び１：２の比の冷アセトン中にとシ、濾過し
、その後残渣を比１：１で冷アセトン中にとる。最終産
物を３５℃で真空下で乾かし、その後の酵素的溶解のた
めに低温で保存するか、または直ちに溶解段階にまわし
て、適当な反応器中で、１：２０の比の脱イオン水と混
合する。

また別の方法によると、冷凍した出発原料を、原料：溶
液の重量比１：１０の割合で加えた０、　１Ｍ　ＣａＣ
ｔ２溶液で超微粒子化する。混合物を小口径のローター
と導入空気とで噴霧乾燥し、この時の空気が温度１５０
℃以上にならないようにし、接触時間が数秒以上になら
ないようにする。この方法で生成した粉末は、プラスチ
ックバッグ中に低温で保存してその後の溶解に備えても
よいし、それを、粉末：水の重量比１：２０になるよう
に加えた脱イオン水と共に、反応器に加えることによっ
て直ちに使用することもできる。

ＤＳを胸腺、下垂体または心臓のような特にデリケート
な器官から抽出する場合には、小規模処理のための凍結
乾燥を利用するのが有利である。この場合には冷凍した
原料を、粉末ソルビトール１０％を含むＩ　Ｍ　ＣａＣ
ｔｚ水溶液と共に超微粒子化する、この場合、生原料：
　ＣａＣＡ２溶液の重量比は１：１である。

２ｃｍの厚さに層別後、−４０℃に凍結し、＋２５℃で
凍結乾燥し、最後には残留水分を除去するために拡散？
ンプを用いる。凍結乾燥生成物は水分含量約２チの脆い
粉末の形である。凍結乾燥粉末を、その後溶解するまで
再び保存してもよいし、直ちに脱イオン水で１：２０に
希釈して次の段階にまわしてもよい。

酵素的溶解を含む段階Ｃ）の特徴は、ＤＳの解重合また
は分解を阻止する特に緩和な条件で、普通の蛋白分解酵
素、たとえばトリプシン、キモトリプシン、一層好まし
くはアルカラーゼ、モキサターゼおよびスペラーゼを用
いて行われることである。

水性混合物を、好ましくはＣａ　（ＯＨ）　２でｐＨ７
〜９の間にアルカリ性にし、それから４０’〜５５℃の
温度に加熱する。それから酵素を、原料：酵素の重量比
が１：０．０００１〜１：０．００１の間になるように
加える。溶解は６〜２４時間続き、その間連続的に電気
泳動的チェックを行って、プロテオグリカン溶解が完了
する時を決定する。この時点ではこの材料は完全に液体
である。

上記液体溶解質について段階ｄ）を行う。これは好まし
くはＨＣｌを用いて（これは１既に存在する塩素イオン
”以外のイオンの導入を回避する）、多分少量の他の酸
も同時に用いてｐＨ３〜６の間姉軽度に酸性にし、その
液体材料を約１時間７０〜８０℃に加熱することから成
る。

段階ｄ）の条件は、存在するＣａ塩との錯化合物という
形で、蛋白質凝固および核蛋白質誘導体の沈澱をおこす
。その間、声および温度条件はＭＰＳをＣａ塩の形で水
中に溶解させる。その溶液を回転濾過機で濾過し、多分
さらにフィルタープレスを通して濾過して加塩した脂肪
酸の痕跡すら除去する。

との方法で、Ｃａ塩の形の、したがってほとんど純粋の
ＭＰＳのみを含む完全に透明なり液が得られる。

この透明な溶液は、直接次の段階ｅ）へ移すととができ
るかあるいは、先づ電気泳動法によって分析し、存在す
るＭＰＳの性質および量を確認する。

最初に述べたように、段階ｅ）は本質的には、ＭＰＳ　
Ｃａ塩を含む水溶液を、ＭＰＳと不溶性錯化合物を形成
することのできるアンモニウム塩で処理することから成
る。しかしながら本発明の目的は薬物学的純度のＤＳを
得・ることであり、このためにはどちらで本選び得る二
つの方法がある、す外わち１）溶液を、ジメチルー二チ
ルーセチルアンモニウムエチル硫酸で処理して錯化合物
を形成し、ＤＳを選択的に沈澱させるかまたは２）存在
するすべてのＭＰＳを錯化合物の形で沈澱させる能力を
有する、ハイアミン、セチル−トリメチルアンモニウム
ブロミドおよびセチル−ジメチルエチルアンモニウムプ
ロミドから成る群からなるべく選ばれる第四級アンモニ
ウム塩でその溶液を処理し、その錯化合物から有機溶媒
による選択的可溶化によ）ＤＳ錯化合物を単離する。

どちらの方法を選択するかは、本質的には、溶液中にあ
るＤＳおよびその他のＭＰＳの相対酌量次第であり、ま
たＤＳに加えて他のＭＰＳも回収する意図があるかどう
かにかかっている。

一般には方法１）によるＤＳの選択的沈澱が好ましい。

ジメチル−エチル−セチルアンモニウムエチル硫酸で沈
澱させるためには、出発生原料を冷凍ホモジネートの形
で用いる場合は、この塩をこの出発生原料に対する重量
比が１：１５００になるように溶液に加え、出発生原料
を粉末の形で用いる場合には、重量比１：３００になる
ように加える。

混合物を数時間放置する。ＤＳ錯化合物はＣａイオンの
存在のために速かに沈澱する。それを傾瀉し、遠沈によ
）錯化合物を集める。

しかし方法２）によシすべてのＭＰＳを沈澱することが
必要な場合には、透明溶液の温度を６０−７０℃に上げ
、電気泳動で測定したＭＰＳの重量に等しい量のアンモ
ニウム塩を加え、混合物を脱イオン水で希釈して溶液の
モル濃度を０．４　Ｍに下げる。

それをそのまま５−１２時間放置し、それから遠沈して
、沈澱した固体錯化合物の混合物を回収する。混合物を
水で洗って過剰のアンモニウム塩を除去し、乾燥する。

アンモニウム塩による沈澱が方法１）によるか２）によ
るかによって、段階ｆ）による高純度ＤＳの選択的回収
の方法は異なる。

ＤＳ／ジメチル−エチル−セチルアンモニウムエチル硫
酸錯化合物を選択的に沈澱させ単離した場合には、上記
錯化合物を、エタノール１０チを含む２　Ｍ　ＣａＣ２
ｚ水溶液で処理する。ＤＳ錯化合物の、Ｃａ　Ｃ２２ヒ
ドロアルコール溶液に対する重量比は１：５である。溶
液のｐＨをＣａ　（ＯＨ）　２で７〜９に調節し、１−
３時間、６０〜８０℃に加熱し、濾過した。

溶液は２０ｍ２らせんカラムで分子を１０，０００で切
断する処理を含む精製段階に誘導される。溶液は１：１
０に濃縮され、ｌ：１に希釈され、塩および最後の痕跡
の汚染成分も完全に除去されるまで、絶え間なく通過さ
せる。ＤＳは、１０：１濃縮溶液から、１：０．３の比
のアセトン（溶液容量：アセトン容量）で処理すること
によシ、または１：０．５の比のエタノールまたはメタ
ノールで処理することによシ沈澱する。デルマタン硫酸
は軽い粉末の形で沈澱する。

この方法で得られたＤＳは、ＤＳ重量；塩溶液容量比１
：１０を用いて、２Ｍの塩化Ｎａ　Ｋ　ＬｉまたはＭｇ
溶液に溶解することによってアルカリ塩に転化させるこ
とが好ましい。混合物を２−１０時間攪拌し、蒸溜水で
１＝２に希釈し、ろ過し、１：０．５の比でアセトンで
沈澱させる。

この方法で、用いた塩溶液に依って、デルマタン硫酸の
Ｎａ−、に−、Ｌｉ−またはＭｇ−塩が得られる。

アンモニウム塩による沈澱が段階ｅ）の方法２）によっ
て行われる場合には、段階ｆ）のＤＳ分離および精製段
階は次のように行われる。ＭＰＳアンモニウム塩錯化合
物の混合物を約２５℃の温度で１−２時間、アセトンに
分散させる。

ＤＳ錯化合物は選択的にアセトンに溶け、一方その他の
錯化合物は溶けないで残り、分離処理を受けて分離され
る。ＤＳ錯化合物の完全な可溶化のためにはアセトン使
用量が重要である。処理混合物が１０％ＤＳ錯化合物を
含む場合、アセトン１容量（処理錯化合物の容量に対し
）を加え、混合物が２０％ＤＳ錯化合物を含む場合には
アセトン２容量を加える、等々。こうして常に、ＤＳ含
量パーセント二使用アセトン量の比が一定になる。

溶媒で処理した混合物を遠心分離または濾過する。

透明なアセトンろ液を周囲温度で、３Ｍ塩溶液（Ｎａ　
、　Ｋ　、　Ｌｉ　、またはＭｇの塩化物）で、アセト
ン抽出液；塩溶液の容量比が０．２５と１との間にある
ようにして処理する。

これらの条件下でＤＳアンモニウム錯化合物は分離し、
使用した塩溶液によって、Ｎａ−、Ｋ−、Ｌｉ−または
Ｍｇ塩の形で沈澱する。

すべての場合、上に説明した段階ｆ）から生成するＤＳ
塩は次の特性を有するニ ー　種々の緩衝液系で電気泳動を行った場合、単−バン
ドを形成。

−分子量：２０，０００〜４０，０００−　有機硫黄：
６〜８ｑ６ −　ウロン酸：３０〜３６％ −硫酸基の、カルボキシル基に対する比：１、２〜１．
５ −　ウロン酸の、ガラクトサミンに対する比＝１：１ −　イズロン酸；総ウロン酸の８０〜９０％−〔α）Ｄ
ニー６０°〜−６５゜ −ヘノ千リン活性：　１０　Ｕ／９　ＵＳＰ本発明の方
法を用いる場合、ＤＳ収量は原料とする器官または組織
によって変動し、生原量１０，０００時につき１〜８ゆ
である。

出発原料中にあるその他のＭＰＳも回収しなければなら
ない場合には、使用する操作法は段階ｅ）の方法２）、
すなわちアンモニウム塩錯化合物として総ＭＰＳを沈澱
する方法が好ましい。

前記の段階ｆ）で述べたようにＤ８錯化合物をアセトン
で溶解後、溶解しない材料を２容量の蒸溜水に分散させ
、アセトン残留物を排除し、遠沈し、アセトンに関して
説明した方法によってエタノールに溶解−懸濁させる。

この方法でへ・千ラン硫酸が分離する。

エタノールに溶けない材料からは、他の溶媒について述
べた同じ方法を用いて、メタノール処理によって純粋な
ヘパリンが抽出される。

本発明による方法によって得られるデルマタン硫酸のナ
トリウム、カリウム、リチウム、カルシウムまたはマグ
ネシウム塩は、いわゆるヘパリン助因子ｉｆ活性化する
点で生物学的に活性であるが（約６０μＡＩＩＩＬＡ）
、それらは部分的トロンボプラスチン活性化時間に与え
る抗凝固性に関しては活性をもたず、弱い因子Ｘａ阻害
活性を有する（約２０　ＵＡ　Ｘａ／ＩＱ　）。

生体内では、との生成物は無毒であり、山崩をおこさな
い、しかしかなシの血管拡散をおこすようにみえる。静
脈内−９皮下−および回腸的投与される場合、それは実
験的血栓症を効果的に阻止する、そしてアドリアマイシ
ン投与によって生ずる損傷から動物を一部防御すること
ができる。

表層性静脈循環の血栓症によって銹起された変化にこの
生成物を局所適用すると、その線維素溶解性−並びに抗
炎症性活性のために症状は急速に緩解する。

本発明の方法によって生成したＤＳは、以下に説明する
ように実験動物で毒物学的並びに薬物学的に評価された
。

急性毒性 急性毒性は、本発明の方法により生成したデルマタン硫
酸をスイス・マウスに経口、静脈内、腹腔内および皮下
投与した後に評価した。

相対的ＬＤ５ｏ値を１表に示す、この表はデルマタン硫
酸の急性毒性が低いととを示している。

１表　デルマタン硫酸の急性毒性 投与法　　　　　　　　　ＬＤ５ｏψｇ１、Ｖ、（静脈
内）　　　　　　　　　２７００８、ｃ、　（皮下）　
　　　　　　３６００１、ｐ、　　（腹腔内）　　　　
　　　　）５０００ｏ、ａ、　（経　口）　　　　　　
　）５０００反復投与による毒性 ＤＳ毒性を、ウィスタ一種ラットに５週間にわたって反
復経口−および筋肉内投与した後忙評価した。生成物を
異なるラット群に、２００　ｍ９７に９７日量を経口投
与で、２０および４０　ｍ１ｉＡＩＡ３を筋肉内投与で
毎日与えた。

生理的食塩溶液をそれぞれ経口−および筋肉内投与した
２群のラットを対照として用いた。

治療期間中、ＤＳ治療ラット群には、賦形剤のみで治療
したラット群に比較して、行動、重量または食餌消費量
の変化は認められなかった。

治療終了時にラットをエーテル麻酔下で殺した。

筋肉注射したラットは、注射部分に何の変化も示さなか
った。血液学的−９血液化学的指標または尿の指標には
有意な変化はなかった。４０号句を筋肉内注射したラッ
トは、膵臓の軽度の重量増加を示した、しかし組織学的
試験では肺臓構造の損傷は認められなかった。

その他の変化は器官には認められなかった。

抗トロンビン活性 ＤＳの抗トロンビン活性を二つの実験的血栓症モデルに
よシ評価した。第一に、ウメッＴ、サナイＫ。

の＠Ｔｈｒｏｍｂｏ、　Ｈａｅｍｏｓｔａ８、　”　３
９　、１９７８．７４の方法によるラットの動静脈吻合
により、静脈性および動脈性特徴の入シ混った血栓症を
形成した。

第二には、レヤーズ（Ｒｅｙｅｒ８）外の”血栓症の動
物モデルの標準化（５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ａｎｌｍｍｌｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　）”（第１７回血管学シンポジウム、キッツ
ビューエル；ブレジンに、、チン寸−マン編、９９ペー
ジ、１９８３）にょシラットの大静脈を結紮して、静脈
性の血栓症を形成した。

■、動静脈吻合：ＤＳの抗トロンビン活性と抗凝血活性
の比較 吻合の循環を活性化する直前にＤＳを静脈注射した。テ
スト終了時に血栓をとシ出し秤量した。血栓の測定直後
に血液の一部を試験管の底に集め、試験管壁に最初の凝
塊が生成するまでの時間を測定する（全血凝固時間）。

２表に示した血栓重量および凝固時間に関する結果は、
デルマタン硫酸が強力な抗トロンビン活性をあられし得
ることを示している。この点に関しては、使用した最小
量（０，１２５ｍ９７ｋｇ１／Ｉｖ　）でさえ、血栓重
量はかなシに軽減する。同時に凝血過程に関連する現象
に対しても、よシ軽度であるが影響を与える。この点に
関して、凝血時間の中程度の増加−統計的にのみ有意で
、生物学的には有意でない増加−をおζすためにすら、
抗トロンビン的に有効である量よりずっと多量のＤＳが
必要であった。

２表　生体内におけるデルマタン硫酸の抗トロンビン−
および抗凝血活性の比較。ラットにおける動静脈吻合。

Ｏｐｏ、０５ ２、大静脈結紮：種々の投与法の比較 ＤＳを静脈注射する場合は結　１０分前に与え、皮下投
与の場合には結紮１時間前に、回腸内適用の場合には結
紮１５分前に与えた。テスト終了時に血栓を除去し秤量
した。

結果を３表に示す。この表から、ＤＳは静脈内、皮下ま
たは回腸内に投与したとき、ラットの下部大静脈の結紮
によって生ずる血栓症を有効に阻止することがわかる。

予備的評価によシ投与量−効果一曲線が作成される、そ
れらは、考慮した時点で、３種類の投与方法、すなわち
静脈内、皮下および回腸内投与では、１：４：１６の比
の面積の範囲を定める。

３表　ラットの大静脈を結紮し九場合のデルマタン硫酸
の抗トロンビン活性。異なる投与法の比較。

静脈内　　皮　下　　　回腸内 本発明は、表面および深部血栓症の治療に有効な一定量
のデルマタン硫酸を含む薬用製剤〔バイアル、錠剤、カ
プセル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ　）　＋軟膏（ｕｎｇ
ｕａｎｔ　）　＊シロップ、米菓９点滴剤等〕にも関係
している。次の製剤が例として挙げられる。

−２０−５０−１００−２００■のＤＳを含むカプセル
　　　　　　　　　　　　　　・−２Ｏ−５０−１００
−２００Ｉｎ９のＤＳ十賦形薬。

解凝集剤等（一般に医薬分野で用いられるもの）を含む
錠剤； −２Ｏ−５０−１００ＩｖのＤＳＳ氷水性賦形剤含むバ
イアル； −２Ｏ−５０−Ｚｏｏ−２００雫ゲのＤＳＳ氷水性賦形
剤保存剤等（一般に医薬分野で用いられるもの）を含む
点滴剤； −２Ｏ−５０−１００−２００ｒｎ９のＤＳ＋一般に医
薬分野で用いられる賦形剤を含む生薬；−２０−５０−
１００−２００？’ＰのＤＳ＋一般に医薬分野で用いら
れる賦形剤を含む軟膏。

本発明による方法を一層容易に再現可能にさせるように
、このあとに本法の実際的実施例をいくつか記載する。

４、好ましい実施例 実施例　１ １０．０００ｋｇの冷凍ウシ−およびブタ腸粘膜を超微
粒子化し、０．０１ＭＣａＣｌ２水溶液５．Ｏ，ＯＯｔ
を入れた反応器に移した。

その材料を完全に均質化するまで７０　ｒｐｍで攪拌し
続け、その後Ｃａ　（ＯＨ）２溶液でｐＨ７に調節し、
４５℃に加熱した。

水５０を中に１０ｋｇのアルカラーゼホモジネートを加
え、生成した混合物を絶えず攪拌しながら１２時間、４
５℃に保った。この時間の終シに、との液状材料に塩酸
を加えてＰＨ４とし、その後３０分間９０℃に加熱した
。

溶液を、セライトで作られたフィルタープレスを通して
濾過し、澄明な溶液を反応器に移し、澄明化カードをつ
けたプレスを通して済過した。完全に澄明な溶液が約１
２，０ＯＯｔ得られた。これに、水１００ｔに溶かした
ジメチル−エチル−セチルアンモニウムエチル硫酸溶液
を、攪拌下で少量づつ加えた。

６時間経過後、澄明な溶液を傾瀉し、残留物をトニアッ
チ（Ｔｏｎｊａｔｔｉ　）遠心分離器で１０．００Ｏｒ
、ｐ、ｍで回収した。

集められた錯化合物をエタノール１００を含む２　Ｍ　
ＣａＣｔ２溶液１，０００／、中に注入した。飽和Ｃａ
　（ＯＨ）　２溶液を加えて−を約８に調節し、ゆっく
り攪拌しながら約２時間８０℃に加熱した。濾過助剤ｌ
Ｏゆを加えた後、その混合物を、溶液が澄明になるまで
プレスを通して濾過した。液体（ケークを洗浄後１．２
００　ｔ　）を、１０，０００で切断するらせんカラム
（２０ｍ２）を通して限外濾過する。

２００ｔに濃縮した後、それを希釈して１０００ｔとし
、再び約１００ｔまで濃縮する。この操作を、透過物が
Ｃａ塩に対して完全に負になるまで続けた。

アセトン３０ｔを溶液に加えてＤＳを沈澱させた。

沈澱物を集め、アセトン中で洗い、乾燥した。

収量：無水粉末の形で８−０ この粉末を２　Ｍ　ＮａＣＬ溶液（１２％）８０４中で
１時間攪拌し、その後溶液を１５０ｔに希釈し、ろ過し
、無水アセトン４５１で沈澱させた。

沈澱物をフィルタープレス上に集め、４０チアセトン水
溶液で洗い、真空下で乾かした。

収量：ＤＳナトリウム塩７ｋｌ！。

粉末を脱イオン水１００を中に溶かし、アニオン樹脂を
通過させるととによって脱色し、−晩加熱状態下に置く
ことによって２４イロジエンを除き、１；１アセトンで
沈澱させ、ろ過し、凍結乾燥した。

収量二次の特性を有するＤＳ　４　ｋｇニー　Ｍ、Ｗ、
　３５，０００ −〔α）ｎ　−６５゜ 一硫酸基の、カルボキシル基に対する比１．２５−ウロ
ン酸の、ガラクトサミンに対する比１：１ 一電気泳動で単一バンド 実施例　２ ウシ膵臓および肺から得たアセトン粉末１，０００ゆを
０．０１　Ｍ　ＣａＣ２２水溶液で超微粒子化し、０．
０１Ｍ　ＣａＣ２ｚ溶液で希釈して容量２０，０００ｔ
にする。

約３０分間混合し、４５℃に加熱した後、５０を水中に
１０ｋｇモキサターゼホモジネートを加え、攪拌下で１
２時間、温度を４５℃に維持した。

実施例１に記載の方法を正確に行った。

収量二次の特性を有するＤＳ　５　ｋ＃　ニーＭ、Ｗ、
　　４０，０００ −〔α）Ｄ　−６５゜ 一硫酸基の、カルボキシル基に対する比１．２−ウロン
酸の、ガラクトサミンに対する比１：１ 一電気泳動で単一バンド 噴霧乾燥によって得られた上記器官の粉末から出発する
場合にも、方法および結果は同じである。

実施例　３ 冷凍新鮮動物器官（肺、血管、腸）の混合物１００ｋｇ
をすυつぶしてノ４ルプにし、それを０．０１Ｍ　Ｃａ
Ｃｔ２水溶液５０１を含む反応器に入れた。

その材料を完全に均質化するまで攪拌し続け、それから
Ｃａ　（ＯＨ）　２で声７．２に調節し、５０℃に加熱
した。

０．０５重量％のスペラーゼを含み、５０℃に加熱した
酵素溶液２００ｔをその後加えた。

混合物を攪拌しながら８時間５０℃に保った。

この時間後に溶解（１ｙａｉ＠）は終了した。混合物を
ＨＣ／、でＰ）（５に酸性にし、８０℃に加熱し、高温
状態のもとで７４　ｋターアース（ｆｌｌｔｅｒ　ｅａ
ｒｔｈ）を濾過助剤として用いて濾過した。

ろ液試料を分析してＭＰＳ含量および特にＤＳ含量を測
定し、次の段階に用いる第四級アンモニウム塩基および
有機溶媒の量を計算した。分析的測定は次の方法によっ
て行った： 涙液１０ｄを濃縮してＩＩＬｌにし、それから蒸溜水を
加えて総量２ゴにした。酢酸バリウムおよび酢酸から成
る緩衝溶液を用いる電気泳動のための３％アガロースプ
レートを別箇に作った。被験試料５〜１０μｔをこのプ
レート上に置き、第一の電気泳動を１５　ｖｏｌｔ／ｃ
ｎ１（１２０ｖｏｌｔ　）で行った。

それから第二の電気泳動を同じ条件下でプロパンジアミ
ン緩衝溶液中で行い、そのプレートを赤外線源によって
乾かした。それを２％トルイジンブルーで染色し、５チ
酢酸で脱色した。

この時点で光濃度計の読みを記録し、参照標準との比較
によって個々のＭＰＳ領域を測定した。

ＭＰＳの分析測定の結果、ＭＰＳ全量が２００ｇで、そ
の中デルマタン硫酸含量が５０ｇであることが判明した
。

分析データに基づいて、ハイアミン２００ｇをろ液に加
えた。

攪拌しながら１時間７０℃に保ち、脱イオン水で希釈し
て、溶液のモル濃度を０．４Ｍとした。

５時間放置し、ＭＰＳ・第四級アンモニウム塩錯化合物
の混合物の形の沈澱物を遠沈によシ回収した。

このパター状外観の沈澱物を先づ水で洗って過剰の塩を
除去し、その後デルマタン硫酸錯化合物を選択的に溶解
させるために、アセトン１ｔを加えた、その間懸濁液を
３時間攪拌しながら周囲温度に保った。懸濁液を遠沈し
て約１ｔのＤＳ溶液を得た、これに２ｔの３　Ｍ　Ｎａ
Ｃｔ溶液を加え、次に２ｔのアセトンを加え、ＤＳを沈
澱させ、それを遠沈によシ分離し、エタノールで洗い、
乾燥する。

この方法で、次の特性を有する乾燥Ｄａ　５０９が得ら
れたニ ーＭ、Ｗ、　　３５，０００ −〔α］Ｄ　−６０゜ 一硫酸基の、カルボキシル基に対する比１．５−ウロン
酸とガラクトサミンとの比１：１−電気泳動下で単一バ
ンド 実施例　４ 実施例３に記載のようにしてＭＰＳ混合物を処理するこ
とによって得られたＤＳ錯化合物の選択的可溶化によシ
生成した残留固体物質を、アセトン残留物を除去するた
めに５００１蒸溜水に分散させ、遠沈によってアセトン
残留物を水と共に除去した。

不溶性沈澱物を１．８ｔエタノールで処理し、生成懸濁
液を攪拌しながら３時間温度５０℃に保ち、ヘノ４ラン
硫酸錯化合物の選択的可溶化を実現する。

その後のへΔラン硫酸を得るだめの段階は実施例３にデ
ルマタン硫酸について説明した通シに行われた。

次の特性を有するへ）４ラン硫酸６０ｇが得られたニ ーＭ、Ｗ、　３０，０００ −〔α〕、＋５５゜ 一電気泳動によ）単一バンド 実施例　５ 実施例４に記載した処理によって得られたへ・９ラン硫
酸錯化合物の選択的可溶化に由来する残留固体物質を３
を蒸留水に分散させてエタノール残留物を除去し、その
後遠沈した。

不溶性沈澱物を５ｔメタノールで処理し、生成した懸濁
液を攪拌しながら３時間、温度５０℃に保ち、ヘノ４　
リン錯化合物の可溶化を実現する。

その後のへノＪ？　リン回収および精製段階は、実施例
３のＤＳについて記載したように行った。

この方法で薬物的特性を有する純粋なヘパリンが５０ｇ
得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ムコ多糖（ＭＰＳ）に富む動物器官から薬物学的純
   度のデルマタン硫酸（ＤＳ）を製造する方法において、 ａ）新鮮な器官を、そのままか或いは粉末の形で冷凍す
   ることによって安定化し、 ｂ）ＭＰＳを含む材料をＣａＣｌ＿２水溶液と共に超微
   粒子化し、 ｃ）生原料とＣａＣｌ＿２とを含むホモジネートをアル
   カリ性ｐＨ、低温度で、蛋白分解酵素により消化し、 ｄ）溶解質を酸性にし、加熱し、濾過し、 ｅ）濾液を、ＤＳのみとまたはすべてのＭＰＳと選択的
   に錯化合物を形成してそれらを沈澱させることのできる
   第四級アンモニウム塩で処理し、 ｆ）ＤＳを含むアンモニウム錯化合物からＤＳを回収し
   、精製する、 上記諸段階から成る方法。 ２、超微粒子化が、０．０１ＭＣａＣｌ＿２水溶液と重
   量比１：１の割合で混合した冷凍有機材料で行われる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、超微粒子化が、１ＭＣａＣｌ＿２水溶液と重量比１
   ：１の割合で混合した冷凍有機材料に対して行われ、そ
   の材料が冷アセトンで反復処理され、濾過され、最後に
   乾燥される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、超微粒子化が、０．１ＭＣａＣｌ＿２水溶液と重量
   比１：１の割合で混合された冷凍材料に対して行われ、
   生成した混合物は１５０℃以下の温度の空気で噴霧乾燥
   される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、超微粒子化が、１０％ソルビトールを含む１ＭＣａ
   Ｃｌ＿２水溶液と重量比１：１の割合で混合された冷凍
   材料に対して行われ、生成した混合物は凍結乾燥される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、蛋白分解酵素による消化が、水で希釈され、ｐＨ７
   −９に調節され、４０−５５℃に加熱された超微粒子化
   混合物に酵素を加えることにより行われる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ７、生原料の、酵素に対する重量比が１：０．０００１
   〜１：０．００１の間になるように酵素を加える特許請
   求の範囲第６項記載の方法。 ８、Ｃａ（ＯＨ）＿２によってｐＨを７〜９の間に調節
   する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、溶解質が、ｐＨ３〜６の間に酸性にされ、７０〜９
   ０℃に加熱される特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、溶解質がＨＣｌで酸性にされる特許請求の範囲第
   ９項記載の方法。 １１、濾過した溶解質をジメチル−エチル−セチルアン
   モニウムエチル硫酸で処理して、ＤＳ錯化合物を選択的
   に沈澱させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、濾過した溶解質を、ハイアミン、セチル−トリメ
   チルアンモニウムブロミドおよびセチル−ジメチル−エ
   チルアンモニウムブロミドから成る群から選ばれる第四
   級アンモニウム塩で、温度６０−７０℃で処理し、存在
   するすべてのＭＰＳを錯化合物の形で沈澱させる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １３、ＤＳ錯化合物をアセトンで選択的に可溶化する特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ＤＳをアンモニウム錯化合物から回収するために
   、後者を１０％エタノール含有２ＭＣａＣｌ＿２水溶液
   で処理し、ｐＨ７〜９に調節し、６０〜８０℃に加熱す
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、ＤＳをアンモニウム錯化合物から回収するために
   、アセトン抽出液の塩溶液に対する容量比が０．２５と
   １との間になるような量の３Ｍ−塩溶液で処理する特許
   請求の範囲第１３項記載の方法。 １６、アセトン処理の結果生ずる残留物をエタノールで
   処理して、ヘパラン硫酸錯化合物を選択的に可溶化する
   特許請求の範囲第１２項あるいは第１３項記載の方法。 １７、エタノール処理の結果生ずる残留物をメタノール
   で処理して、ヘパリン錯化合物を選択的に可溶化する特
   許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、特許請求の範囲第１項記載の方法によって得られ
   る薬物学的純度のデルマタン硫酸。 １９、特許請求の範囲第１項に記載の方法によって得ら
   れる薬物学的純度のデルマタン硫酸を活性成分として含
   む、抗トロンビン活性を有する治療用組成物。