CN108329405A - 一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，是以肝素钠粗品为原料，溶解后进行树脂吸附，在树脂吸附状态下，采用混合盐解去除核酸，盐解去除结合蛋白，盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物，盐梯度洗脱解吸附，甲醇、乙醇混合溶液超声脱色，无水乙醇超声脱水脱甲醇，沉淀物溶解超滤除盐除醇，最后冻干干燥制得精品肝素钠；本发明方法舍弃了传统的化学氧化去杂纯化肝素钠的方法，制得的肝素钠分子结构较完整，断裂少，稳定性好，单位效价180IU/mg以上，效价收率98%‑99.5%；作为原料有利于肝素制剂的稳定性；有利于低分子肝素制剂如依诺肝素钠的重均分子量及分子量分布等重要质量指标的控制。

Description

一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法

技术领域

本发明涉及生物纯化技术领域，具体是一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法。本发明方法舍弃了传统的化学氧化去杂纯化肝素钠的方法，制得的肝素钠分子结构较完整，断裂少，稳定性好，单位效价180IU/mg以上，效价收率98%-99.5%。

背景技术

肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质结合在一起存在于肠粘膜、肺、肝等器官内。肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化，心脑血管疾病的显效药物。标准肝素的平均分子量约为16000道尔顿，效价需达到180IU/mg以上。分子量低于6000道尔顿的低分子肝素与标准肝素相比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，在临床上应用更为广泛，近年临床常用的有：达肝素钠(法安明)、依诺肝素钠(克赛)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。

直接从猪小肠粘膜中提取得到的肝素钠粗品中含有蛋白质、核酸、无机盐等杂质，约占肝素钠粗品的40-80%，效价10-100IU/mg，不能作为医药用途的肝素钠制剂和生产低分子肝素的原料，必须经过纯化才能具有医药用途。

目前国内外纯化肝素钠粗品的方法都离不开多次氧化、多次乙醇沉淀的方法，氧化法纯化肝素钠粗品的方法存在下述问题：各批肝素钠粗品原料的杂质含量和种类不确定，通常需要多次氧化去除杂质，达到纯化效果，但是多次氧化去除杂质会导致肝素钠部分失活，收率下降，稳定性下降，肝素分子部分断裂、低分子量肝素钠偏多等问题，制得的精品肝素钠作为肝素制剂的原料，不利于肝素制剂的稳定性；作为低分子肝素的原料，不利于控制低分子肝素的关键质量控制指标，如依诺肝素钠的分子量分布比例和成环率等质量指标。因此，提高精品肝素钠的质量，是提高肝素制剂及低分子肝素制剂产品质量的重要因素。

发明内容

本发明的目的就是针对目前肝素钠粗品纯化均离不开氧化纯化法，制得的精品肝素钠质量不稳定，不利于控制肝素制剂及低分子肝素制剂成品质量稳定性的问题，提供一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法。

本发明的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，是将肝素钠粗品经过溶解、树脂吸附，然后转移至树脂洗脱罐中，树脂经纯水洗涤后，再去除核酸、去除盐溶蛋白、结合蛋白、盐乙醇混合溶液超声去除醇溶物之后，加盐液梯度洗脱解吸附得洗脱液，洗脱液脱色、沉淀，将沉淀物加无水乙醇进行脱水脱甲醇后，溶解、保温超滤、冻干干燥得精品肝素钠。

所述去除核酸是采用混合盐解法去除核酸：具体是在树脂洗脱罐中加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液5-10倍树脂重量份，保温45-58℃，搅拌盐解0.5-2小时，停止加热，缓加质量分数50-75%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达6-30%，搅拌半小时，静置5-12小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.1-1.5%NaCl溶液5-10倍树脂重量，洗涤两次，每次20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.01-1.5%，Mg²⁺质量分数为0.01-1.5%，Na⁺质量分数为0.01-1.5%。当然本发明中也可以采用其他方法去除核酸，如氧化法。

所述去除结合蛋白是采用盐解法去除结合蛋白：具体是在树脂洗脱罐中加入质量分数为6.0-6.8%的NaCl溶液5-10倍树脂重量，用质量分数5-8%的NaOH溶液调pH至8.3-8.8，保温45-58℃，搅拌盐解1-4小时，加入5-10倍树脂重量的纯化水，吸附6-10小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干。当然本发明中也可以采用其他方法去除结合蛋白，如酶解法，氧化法等。

所述盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：是在树脂洗脱罐中加入NaCl、乙醇混合溶液5-10倍树脂重量，保温5-40℃搅拌1-4小时，搅拌下超声3-20分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为50-75%的乙醇2-3倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12%-15%的NaCl溶液与质量分数为75-95%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；所述超声时的超声强度为1500-5000W/m²，超声频率为28-40KHZ。

所述加盐梯度洗脱解吸附：是在树脂洗脱罐中加入质量分数为8-10%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为10-12%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为12-14%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉3-12小时，过滤收集洗脱液。

所述洗脱液脱色、沉淀是采用甲醇乙醇混合溶液超声脱色、沉淀法，具体是在加盐梯度洗脱解吸附得到的洗脱液中搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的0.9-1.5倍，保温5-25℃，搅拌下超声3-20分钟，沉淀12-24小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%-50%，乙醇的质量分数为50%-90%的溶液；所述超声时的超声强度为1500-5000W/m²，超声频率为28-40KHZ。当然本发明中也可以采用氧化法进行脱色、沉淀。

所述肝素钠粗品溶解、树脂吸附是称取肝素钠粗品，加纯化水溶解成质量分数为1-5%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入1-3g经过活化处理的强碱性离子交换树脂，用质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至8.0-8.5，保温50-58℃动态吸附10-12小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附，排出树脂吸附罐中的溶液，真空抽干，然后将吸附肝素钠的树脂转移至树脂洗脱罐中。当然本发明方法在树脂吸附过程中，也可以加入胰蛋白酶进行酶解吸附，以便在树脂吸附过程中，就通过酶解将部分结合蛋白洗脱至溶液中，即在树脂吸附时就进行了第一次蛋白除杂。

所述溶解超滤得精品肝素钠是在脱水脱甲醇后的沉淀物中加蒸馏水10-50倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至7.0-7.5，保温50-56℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠；所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

所述肝素钠粗品的单位效价为50-110IU/mg，所述制得的精品肝素钠的单位效价在180IU/mg以上，效价收率为98%-99.5%。

所述强碱性离子交换树脂是采用Lewatit MP-500树脂或Amberlite IRA-400树脂或S5428树脂中的任意一种。

本发明方法舍弃了传统的氧化纯化肝素钠的方法，利用树脂选择性吸附的特性，特异性选择吸附肝素钠，在树脂吸附保护状态下，首先采用混合盐溶液保温盐解，乙醇降极性，一定浓度氯化钠溶液洗脱的方法，将核酸盐解去除；然后采用一定浓度氯化钠溶液洗涤，去除盐溶蛋白；再采用一定浓度的氯化钠溶液弱碱性条件下盐解，去除结合蛋白（此步采用纯水稀释盐浓度利于肝素重新吸附回树脂，避免不必要的浪费）；再采用盐、乙醇混合溶液超声溶解去除醇溶物杂质（包括部分类肝素）；然后采用不同浓度的氯化钠溶液梯度洗脱，将肝素钠从树脂上洗脱下来；再经甲醇乙醇混合溶液超声溶解脱色、沉淀、抽滤，沉淀物采用无水乙醇超声脱水脱甲醇，最后将沉淀物蒸馏水溶解，调至中性保温超滤除盐除醇、冻干干燥，得精品肝素钠。本发明方法中每一步所采用的溶液浓度、温度控制、时间控制，超声条件控制等参数均是经过大量实验研究、总结后得出的，在整个生产工艺中没有采用氧化法去杂，最大限度保护了肝素活性基团的生物活性，制得的精品肝素钠作为原料对生产肝素制剂及低分子肝素制剂的质量控制起到关键作用。

本发明的主要发明点之一在于：采用混合盐解的方法去除核酸，首先在树脂洗脱罐中加入混合盐液，使钙、镁、钠等离子与核酸结合成盐，然后加入乙醇溶液使树脂洗脱罐中乙醇的质量分数达到6%-30%，降低核酸盐结合物的溶解度使核酸盐结合物从吸附肝素的树脂上被洗脱下来进而真空抽滤去除；

本发明的主要发明点之二在于：采用盐解去除结合蛋白，首先在树脂洗脱罐中加入质量分数为6.0%-6.8%的NaCl溶液5-10倍树脂质量，分解蛋白肝素结合物，盐解蛋白，再加纯化水稀释盐浓度至3%-3.4%，使部分被盐解至溶液中的肝素重新吸附回树脂，再真空抽滤洗涤出结合蛋白；采用本发明独创的盐解法去除结合蛋白，而不是采用氧化法去除结合蛋白，这样可以最大限度的保留肝素分子结构的完整性，避免肝素大分子结构被氧化、断裂成为小分子肝素，避免肝素活性基团被破坏，保证效价回收率；作为原料保证了肝素制剂及低分子肝素制剂关键质量指标的控制；

本发明的主要发明点之三在于：采用盐、乙醇混合溶液超声去除醇溶物（包括部分类肝素）：在肝素纯化工艺中引入超声操作，首次采用氯化钠、乙醇混合溶液洗脱出树脂上吸附的醇溶杂质，其中包括部分类肝素，提高肝素的纯度；

本发明的主要发明点之四在于：采用甲醇、乙醇混合溶液超声脱色，在树脂洗脱液（已经是比较纯的肝素钠溶液）中加入甲醇、乙醇混合溶液，超声3-20分钟，沉淀，收集到的沉淀复溶后更接近无色溶液，品质大大提升，并且对肝素活性基团及肝素分子结构完整性没有影响；传统工艺中脱色处理一般是加入氧化脱色剂，虽然也能达到脱色效果，但是不可避免的又会存在肝素分子结构、活性基团被破坏的问题，降低效价回收率。

除上述四个主要发明点之外，本发明的每个工艺步骤均是经过大量实验研究，为提高肝素钠收率及保持肝素钠分子结构完整性，给出最合适的工艺条件。此外，本发明方法中所采用的每个独立操作单元均可以与现有纯化工艺相结合，来提高现有工艺的纯化效果和效价收率。

本发明方法与传统的肝素钠纯化方法相比，具有以下优点：

1.整个工艺流程没有使用氧化剂，最大限度的保证了肝素钠分子结构的完整性，作为原料保证了肝素制剂及低分子肝素制剂产品的质量控制；

2.首次在肝素钠纯化工艺中引入新方法，在树脂吸附状态下，保护肝素有效基团，去除核酸、蛋白、类肝素及醇溶杂质；

3.在肝素钠粗品纯化工艺中引入超声操作及合理的超声参数，大大提高了工作效率，减少了生产周期，提高了产品收率；

4.整个工艺流程中引入的药剂成分简单，没有使用具有毒副作用作用的药剂，提纯后的精品肝素钠更清洁环保，作为药用制剂的原料更安全。

具体实施方式

实施例1

一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取肝素钠粗品，加纯化水溶解成质量分数为1-5%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入1-3g经过活化处理的强碱性离子交换树脂，用质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至8.0-8.5，加入溶液体积0.03-0.06%的胰蛋白酶，保温50-58℃动态酶解吸附10-12小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水8-10倍树脂重量，保温35-45℃洗涤两次，每次20-60分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液5-10倍树脂重量份，保温45-58℃，搅拌盐解0.5-2小时，停止加热，缓加质量分数50-75%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达6-30%，搅拌半小时，静置5-12小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.1-1.5%NaCl溶液5-10倍树脂重量，洗涤两次，每次20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.01-1.5%，Mg²⁺质量分数为0.01-1.5%，Na⁺质量分数为0.01-1.5%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.3-3.6%的NaCl溶液5-10倍树脂重量，保温45-58℃，搅拌1-4小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.0-6.8%的NaCl溶液5-10倍树脂重量，用质量分数5-8%的NaOH溶液调pH至8.3-8.8，保温45-58℃，搅拌盐解1-4小时，加入5-10倍树脂重量的纯化水，吸附6-10小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液5-10倍树脂重量，保温5-40℃搅拌1-4小时，搅拌下超声3-20分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为50-75%的乙醇2-3倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12%-15%的NaCl溶液与质量分数为75-95%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为8-10%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为10-12%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为12-14%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉3-12小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色、沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的0.9-1.5倍，保温5-25℃，搅拌下超声3-20分钟，沉淀12-24小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%-50%，乙醇的质量分数为50%-90%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为70-80%的乙醇溶液3-5倍沉淀物质量，搅拌下超声20-60分钟，沉淀1-2小时去醇液；再加入无水乙醇3-5倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡1-2小时，搅拌下超声20-60分钟，沉淀3-5小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水10-50倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至7.0-7.5，保温50-56℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠，所述精品肝素钠的单位效价在180IU/mg以上，效价收率为98%-99.5%。

所述肝素钠粗品的效价为50-110IU/mg。

所述强碱性离子交换树脂是采用Lewatit MP-500树脂或Amberlite IRA-400树脂或S5428树脂中的任意一种。

所述超声时的超声强度为1500-5000W/m²，超声频率为28-40KHZ。

所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

实施例2

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为95.8IU/mg肝素钠粗品6.053kg，加纯化水溶解成质量分数为3%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入2g经过活化处理的德国Lewatit MP-500树脂，用质量分数为6%的NaOH溶液调pH至8.2，加入溶液体积0.03-0.06%的胰蛋白酶，保温52-55℃动态酶解吸附10小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水8倍树脂重量，保温38-42℃洗涤两次，每次40分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液8倍树脂重量份，保温50-55℃，搅拌盐解1小时，停止加热，缓加质量分数65%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达20%，搅拌半小时，静置8小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.8%NaCl溶液8倍树脂重量，洗涤两次，每次40分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为1.0%，Mg²⁺质量分数为0.2%，Na⁺质量分数为0.1%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.4%的NaCl溶液8倍树脂重量，保温50-55℃，搅拌2小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.5%的NaCl溶液8倍树脂重量，用质量分数6%的NaOH溶液调pH至8.4-8.6，保温50-55℃，搅拌盐解2.5小时，加入8倍树脂重量的纯化水，吸附8小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液8倍树脂重量，保温20-25℃，搅拌2.5小时，超声强度：3000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声8分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为65%的乙醇2.5倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤40分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为13.5%的NaCl溶液与质量分数为85%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为10%的NaCl溶液3倍树脂重量，保温45-50℃洗脱2小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为12%的NaCl溶液3倍树脂重量，保温45-50℃洗脱2小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为14%的NaCl溶液3倍树脂重量，保温45-50℃洗脱2小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉8小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色、沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的1.2倍，保温20-25℃，超声强度：3000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声8分钟，沉淀20小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为30%，乙醇的质量分数为70%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为75%的乙醇溶液4倍沉淀物质量，超声强度：3000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声40分钟，沉淀1.5小时去醇液；再加入无水乙醇4倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡1.5小时，超声强度：3000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声40分钟，沉淀4小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水30倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为6%的NaOH溶液调pH至7.2-7.3，保温52-54℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得3.090kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为185.6IU/mg，效价收率为98.9%；其重均分子量为16200；分子量大于24000的级分为15.8%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.16。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

效价收率=精品肝素钠总效价/粗品肝素钠总效价；

精品肝素钠总效价=精品肝素钠重量*精品肝素钠单位效价；

粗品肝素钠总效价=粗品肝素钠重量*粗品肝素钠单位效价。

实施例3

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为78.5IU/mg肝素钠粗品7.036kg，加纯化水溶解成质量分数为5%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入2.5g经过活化处理的美国Amberlite IRA-400树脂，用质量分数为7%的NaOH溶液调pH至8.4，加入溶液体积0.03-0.06%的胰蛋白酶，保温50-54℃动态酶解吸附11小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水9倍树脂重量，保温35-40℃洗涤两次，每次60分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液6.5倍树脂重量份，保温54-58℃，搅拌盐解1.5小时，停止加热，缓加质量分数70%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达15%，搅拌半小时，静置10小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为1.0%NaCl溶液6.5倍树脂重量，洗涤两次，每次60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.06%，Mg²⁺质量分数为1.2%，Na⁺质量分数为0.8%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.3%的NaCl溶液9倍树脂重量，保温45-50℃，搅拌3小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.3%的NaCl溶液7倍树脂重量，用质量分数5%的NaOH溶液调pH至8.3-8.5，保温45-50℃，搅拌盐解3小时，加入7倍树脂重量的纯化水，吸附7小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液7倍树脂重量，保温5-10℃，搅拌4小时，超声强度：4000W/m²，超声频率：35KHZ，搅拌下超声12分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为60%的乙醇3倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤30分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为14%的NaCl溶液与质量分数为75%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为8%的NaCl溶液4倍树脂重量，保温50-55℃洗脱2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为10%的NaCl溶液4倍树脂重量，保温50-55℃洗脱1.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为12%的NaCl溶液4倍树脂重量，保温40-45℃洗脱2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉10小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色、沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量与洗脱液总质量相等，保温15-20℃，超声强度：4000W/m²，超声频率：35KHZ，搅拌下超声10分钟，沉淀18小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为20%，乙醇的质量分数为85%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为78%的乙醇溶液3倍沉淀物质量，超声强度：4000W/m²，超声频率：35KHZ，搅拌下超声20分钟，沉淀2小时去醇液；再加入无水乙醇3.5倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡1小时，超声强度：4000W/m²，超声频率：35KHZ，搅拌下超声30分钟，沉淀3小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水20倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为5%的NaOH溶液调pH至7.0-7.2，保温50-53℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得2.988kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为181.5IU/mg，效价收率为98.2%；其重均分子量为17200；分子量大于24000的级分为16.7%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.32。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

实施例4

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为107.3IU/mg肝素钠粗品4.732kg，加纯化水溶解成质量分数为4%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入1.5g经过活化处理的国产Lewatit MP-500树脂，用质量分数为6.5%的NaOH溶液调pH至8.3，保温54-56℃动态吸附11.5小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水9.5倍树脂重量，保温37-40℃洗涤两次，每次50分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液9倍树脂重量份，保温18-52℃，搅拌盐解1.8小时，停止加热，缓加质量分数68%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达25%，搅拌半小时，静置7小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为1.2%NaCl溶液9倍树脂重量，洗涤两次，每次50分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为1.5%，Mg²⁺质量分数为1.0%，Na⁺质量分数为0.01%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.5%的NaCl溶液7倍树脂重量，保温43-48℃，搅拌3.5小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.6%的NaCl溶液6倍树脂重量，用质量分数7%的NaOH溶液调pH至8.5-8.8，保温55-58℃，搅拌盐解3.5小时，加入6倍树脂重量的纯化水，吸附9小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液6倍树脂重量，保温35-40℃，搅拌3.5小时，超声强度：2000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声15分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为70%的乙醇2.3倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤20分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12.5%的NaCl溶液与质量分数为90%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为8.5%的NaCl溶液2.5倍树脂重量，保温43-48℃洗脱1.8小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为10.5%的NaCl溶液2.5倍树脂重量，保温42-47℃洗脱1.8小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为11.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温42-47℃洗脱1.8小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉5小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的1.3，保温8-13℃，超声强度：2000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声15分钟，沉淀15小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为40%，乙醇的质量分数为60%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为72%的乙醇溶液3倍沉淀物质量，超声强度：2000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声50分钟，沉淀1.3小时去醇液；再加入无水乙醇4.5倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡1.3小时，超声强度：2000W/m²，超声频率：30KHZ，搅拌下超声50分钟，沉淀4.5小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水40倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为6.5%的NaOH溶液调pH至7.3-7.5，保温52-54℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得2.690kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为186.3IU/mg，效价收率为98.7%；其重均分子量为18200；分子量大于24000的级分为16.9%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.16。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

实施例5

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为115.2IU/mg肝素钠粗品4.220kg，加纯化水溶解成质量分数为1%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入3g经过活化处理的德国Lewatit MP-500树脂，用质量分数为8%的NaOH溶液调pH至8.5，保温52-55℃动态吸附10.5小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水8.5倍树脂重量，保温32-35℃洗涤两次，每次30分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液5倍树脂重量份，保温52-56℃，搅拌盐解0.5小时，停止加热，缓加质量分数50%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达30%，搅拌半小时，静置5小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.1%NaCl溶液5倍树脂重量，洗涤两次，每次20分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.15%，Mg²⁺质量分数为0.01%，Na⁺质量分数为0.05%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.5%的NaCl溶液5倍树脂重量，保温48-52℃，搅拌4小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.8%的NaCl溶液5倍树脂重量，用质量分数7%的NaOH溶液调pH至8.5-8.7，保温48-52℃，搅拌盐解4小时，加入5倍树脂重量的纯化水，吸附6小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液10倍树脂重量，保温25-30℃，搅拌1小时，超声强度：5000W/m²，超声频率：28KHZ，搅拌下超声3分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为75%的乙醇2.8倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤50分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为15%的NaCl溶液与质量分数为80%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为9.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为11.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为13.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉12小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的1.5倍，保温18-22℃，超声强度：5000W/m²，超声频率：28KHZ，搅拌下超声3分钟，沉淀12小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为50%，乙醇的质量分数为50%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为80%的乙醇溶液4.5倍沉淀物质量，超声强度：5000W/m²，超声频率：28KHZ，搅拌下超声30分钟，沉淀1.8小时去醇液；再加入无水乙醇3倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡1.8小时，超声强度：5000W/m²，超声频率：28KHZ，搅拌下超声60分钟，沉淀3.5小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水50倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为7%的NaOH溶液调pH至7.3-7.5，保温53-55℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得2.560kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为188.2IU/mg，效价收率为99.1%；其重均分子量为17800；分子量大于24000的级分为16.4%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.22。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

实施例6

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为58.9IU/mg肝素钠粗品6.125kg，加纯化水溶解成质量分数为2%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入3g经过活化处理的国产S5428树脂，用质量分数为5%的NaOH溶液调pH至8.0，加入溶液体积0.03-0.06%的胰蛋白酶，保温55-58℃动态酶解吸附12小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水10倍树脂重量，保温40-45℃洗涤两次，每次20分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液10倍树脂重量份，保温45-50℃，搅拌盐解2小时，停止加热，缓加质量分数75%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达6%，搅拌半小时，静置12小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为1.5%NaCl溶液10倍树脂重量，洗涤两次，每次60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.01%，Mg²⁺质量分数为0.05%，Na⁺质量分数为1.5%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.6%的NaCl溶液10倍树脂重量，保温55-58℃，搅拌1小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.0%的NaCl溶液7倍树脂重量，用质量分数8%的NaOH溶液调pH至8.6-8.8，保温55-58℃，搅拌盐解1小时，加入10倍树脂重量的纯化水，吸附10小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液5倍树脂重量，保温10-15℃，搅拌1.5小时，超声强度：15000W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声20分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为50%的乙醇2倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12%的NaCl溶液与质量分数为95%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为9%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温40-45℃洗脱1.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为11%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温40-45℃洗脱2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为13%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温50-55℃洗脱1.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉3小时，过滤收集洗脱液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质的0.9倍，保温5-10℃，超声强度：1500W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声20分钟，沉淀24小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%，乙醇的质量分数为90%的溶液；

（9）沉淀物脱水脱甲醇：加入质量分数为70%的乙醇溶液5倍沉淀物质量，超声强度：1500W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声60分钟，沉淀1小时去醇液；再加入无水乙醇5倍沉淀物质量洗涤两次，每次洗涤时先浸泡2小时，超声强度：1500W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声20分钟，沉淀5小时去醇液；

（10）溶解超滤得精品肝素钠：加蒸馏水10倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为8%的NaOH溶液调pH至7.3-7.5，保温54-56℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得1.980kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为181.3IU/mg，效价收率为99.5%；其重均分子量为18100；分子量大于24000的级分为16.7%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.11。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

实施例7

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为95.2IU/mg肝素钠粗品4.350kg，加纯化水溶解成质量分数为1%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入3g经过活化处理的德国Lewatit MP-500树脂，用质量分数为8%的NaOH溶液调pH至8.5，温52-55℃动态吸附10.5小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水8.5倍树脂重量，保温32-35℃洗涤两次，每次30分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）混合盐解去除核酸：加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液5倍树脂重量份，保温52-56℃，搅拌盐解0.5小时，停止加热，缓加质量分数50%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达30%，搅拌半小时，静置5小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.1%NaCl溶液5倍树脂重量，洗涤两次，每次20分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.15%，Mg²⁺质量分数为0.01%，Na⁺质量分数为0.05%；

（4）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.5%的NaCl溶液5倍树脂重量，保温48-52℃，搅拌4小时，排空盐液，真空抽干；

（5）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.8%的NaCl溶液5倍树脂重量，用质量分数7%的NaOH溶液调pH至8.5-8.7，保温48-52℃，搅拌盐解4小时，加入5倍树脂重量的纯化水，吸附6小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（6）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液10倍树脂重量，保温25-30℃，搅拌1小时，超声强度：5000W/m²，超声频率：28KHZ，搅拌下超声3分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为75%的乙醇2.8倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤50分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为15%的NaCl溶液与质量分数为80%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（7）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为9.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为11.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为13.5%的NaCl溶液3.5倍树脂重量，保温48-52℃洗脱2.3小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉12小时，过滤收集洗脱液；

（8）加纯化水2-5倍稀释洗脱液，保温15-30℃，20%NaOH调pH9-11,按溶液体积的0.8-2%加入过氧化氢氧化，保持pH9-11的条件下，氧化10-15小时，过滤收集氧化液；

（9）超滤冻干得精品肝素钠：再加入质量分数为10%的HCL溶液调pH至6.8-7.5，超滤除盐，冻干干燥得2.232kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为182.2IU/mg，效价收率为98.2%；其重均分子量为15800；分子量大于24000的级分为13.4%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.42。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

本实施例中，在用氯化钠梯度洗脱解吸附得到洗脱液以后，采用氧化法来对洗脱液进行进一步脱色、去杂，也制得了单位效价180IU/mg以上的精品肝素钠，但是产品的重均分子量有所下降，8000-16000的级分/16000-24000的级分比值有所上升，说明采用本实施例的方法，由于其中加入了氧化法，对肝素钠重均分子量及分子量分布比例还是产生了一定影响，但是产品的收率及效价收率仍然高于现有的采用氧化法工艺纯化肝素钠的方法。

实施例8

本实施例的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，包含下述步骤：

（1）肝素钠粗品溶解、树脂吸附：称取单位效价为68.9IU/mg肝素钠粗品5.023kg，加纯化水溶解成质量分数为2%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入3g经过活化处理的国产S5428树脂，用质量分数为5%的NaOH溶液调pH至8.0，加入溶液体积0.03-0.06%的胰蛋白酶，保温55-58℃动态酶解吸附12小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附；

（2）纯水洗涤：排出吸附罐中的溶液，真空抽干，将吸附肝素钠的树脂转移至洗脱罐中，加纯化水10倍树脂重量，保温40-45℃洗涤两次，每次20分钟，每次洗涤完，均真空抽干洗涤；

（3）加盐液去除盐溶蛋白：加入质量分数为3.6%的NaCl溶液10倍树脂重量，保温55-58℃，搅拌1小时，排空盐液，真空抽干；

（4）盐解去除结合蛋白：加入质量分数为6.0%的NaCl溶液7倍树脂重量，用质量分数8%的NaOH溶液调pH至8.6-8.8，保温55-58℃，搅拌盐解1小时，加入10倍树脂重量的纯化水，吸附10小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干；

（5）盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：加入NaCl、乙醇混合溶液5倍树脂重量，保温10-15℃，搅拌1.5小时，超声强度：15000W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声20分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为50%的乙醇2倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12%的NaCl溶液与质量分数为95%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；

（6）加盐梯度洗脱解吸附：加入质量分数为9%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温40-45℃洗脱1.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为11%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温40-45℃洗脱2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为13%的NaCl溶液2倍树脂重量，保温50-55℃洗脱1.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉3小时，过滤收集洗脱液；

（7）第一次氧化：加纯化水2-5倍稀释洗脱液，保温15-30℃，20%NaOH调pH9-11,按溶液体积的0.3-1%加入过氧化氢氧化，保持pH9-11的条件下，氧化10-15小时，过滤收集氧化液；

（8）甲醇、乙醇混合溶液超声脱色、沉淀：在搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质的0.9倍，保温5-10℃，超声强度：1500W/m²，超声频率：40KHZ，搅拌下超声20分钟，沉淀24小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%，乙醇的质量分数为90%的溶液；

（9）第二次氧化：加纯化水10-20倍溶解沉淀物，保温15-30℃，20%NaOH调pH9-11,按溶液体积的0.3-1%加入过氧化氢氧化，保持pH9-11的条件下，氧化10-15小时，过滤收集氧化液；

（10）超滤冻干得精品肝素钠：加入质量分数为10%的HCL溶液调pH至6.8-7.5，超滤除盐，冻干干燥得1.711kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为192.2IU/mg，效价收率为95.0%；其重均分子量为15100；分子量大于24000的级分为11.3%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.52。所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

本实施例中，在用氯化钠梯度洗脱解吸附得到洗脱液以后，采用两步氧化法来进一步脱除溶液中剩余的核酸、蛋白质等杂质，制得了单位效价180IU/mg以上的精品肝素钠，但是产品的重均分子量下降明显，8000-16000的级分/16000-24000的级分比值上升同样明显，说明采用本实施例的方法，由于其中加入了两步氧化法，对肝素钠重均分子量及分子量分布比例还是产生了一定影响，但是产品的收率及效价收率仍然高于现有的采用氧化法工艺纯化肝素钠的方法。

Claims (10)

1.一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，是将肝素钠粗品经过溶解、树脂吸附，然后转移至树脂洗脱罐中，经纯水洗涤之后，再去除核酸、去除盐溶蛋白、结合蛋白、盐乙醇混合溶液超声去除醇溶物之后，加盐液梯度洗脱解吸附得洗脱液，洗脱液脱色、沉淀，将沉淀物加无水乙醇进行脱水脱甲醇后，溶解、保温超滤、冻干干燥得精品肝素钠。

2.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述去除核酸：是在树脂洗脱罐中加入CaCl₂、MgCl₂、NaCl混合溶液5-10倍树脂重量份，保温45-58℃，搅拌盐解0.5-2小时，停止加热，缓加质量分数50-75%的乙醇至洗脱罐中，使洗脱罐中乙醇质量分数达6-30%，搅拌半小时，静置5-12小时，排空液体，真空抽干；再加入质量分数为0.1-1.5%NaCl溶液5-10倍树脂重量，洗涤两次，每次20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述混合溶液中Ca²⁺质量分数为0.01-1.5%，Mg²⁺质量分数为0.01-1.5%，Na⁺质量分数为0.01-1.5%。

3.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述去除结合蛋白：是在树脂洗脱罐中加入质量分数为6.0-6.8%的NaCl溶液5-10倍树脂重量，用质量分数5-8%的NaOH溶液调pH至8.3-8.8，保温45-58℃，搅拌盐解1-4小时，加入5-10倍树脂重量的纯化水，吸附6-10小时，检测盐液效价＜4IU/ml，排空盐液，真空抽干。

4.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述盐、乙醇混合溶液超声去醇溶物：是在树脂洗脱罐中加入NaCl、乙醇混合溶液5-10倍树脂重量，保温5-40℃搅拌1-4小时，搅拌下超声3-20分钟；检测液体效价＜4IU/ml，排空液体，真空抽干，加入质量分数为50-75%的乙醇2-3倍树脂重量洗涤两次，每次洗涤20-60分钟，每次洗涤完均真空抽干洗涤液；所述NaCl、乙醇混合溶液是采用质量分数为12%-15%的NaCl溶液与质量分数为75-95%的乙醇溶液按质量比为1:1的比例配置而成；所述超声时的超声强度为1500-5000W/m²，超声频率为28-40KHZ。

5.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述加盐梯度洗脱解吸附：是在树脂洗脱罐中加入质量分数为8-10%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；再加入质量分数为10-12%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；最后加入质量分数为12-14%的NaCl溶液2-4倍树脂重量，保温40-55℃洗脱1.5-2.5小时，排出洗脱液，真空抽干；合并三次洗脱液，静沉3-12小时，过滤收集洗脱液。

6.根据权利要求1或5所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述洗脱液脱色、沉淀，是在加盐梯度洗脱解吸附得到的洗脱液中搅拌下缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为洗脱液总质量的0.9-1.5倍，保温5-25℃，搅拌下超声3-20分钟，沉淀12-24小时，真空抽干去醇液；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%-50%，乙醇的质量分数为50%-90%的溶液；所述超声时的超声强度为1500-5000W/m²，超声频率为28-40KHZ。

7.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述肝素钠粗品溶解、树脂吸附是称取肝素钠粗品，加纯化水溶解成质量分数为1-5%的肝素钠粗品溶液，过滤，将滤液转入吸附罐中，按每10000IU肝素钠加入1-3g经过活化处理的强碱性离子交换树脂，用质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至8.0-8.5，保温50-58℃动态吸附10-12小时，检测排出液肝素效价＜4IU/ml，停止吸附，排出树脂吸附罐中的溶液，真空抽干，然后将吸附肝素钠的树脂转移至树脂洗脱罐中。

8.根据权利要求1所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述溶解超滤得精品肝素钠是在脱水脱甲醇后的沉淀物中加蒸馏水10-50倍沉淀物质量溶解沉淀物，再加入质量分数为5-8%的NaOH溶液调pH至7.0-7.5，保温50-56℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠；所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

9.根据权利要求1或7或8所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述肝素钠粗品的单位效价为50-110IU/mg，所述制得的精品肝素钠的单位效价在180IU/mg以上，效价收率为98%-99.5%。

10.根据权利要求1或7所述的一种树脂吸附状态下保护及纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述强碱性离子交换树脂是采用Lewatit MP-500树脂或Amberlite IRA-400树脂或S5428树脂树脂中的任意一种。