CN108059687A - 一种结晶纯化肝素钠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结晶纯化肝素钠的方法，是将肝素钠粗品加水配成溶液，加入NaHSO3超声3‑10分钟，搅拌0.5‑2小时，调pH至6‑9，超声3‑20分钟得结晶母液，加入乙醇溶液超声至母液出现轻微乳浊，加纯水至母液澄清，降温至3‑8℃保温结晶12‑24小时，抽出母液二次结晶，收集结晶，乙醇洗涤2‑4次，抽干乙醇，离心，加入NaCl溶液溶解结晶，调pH至7‑9，保温反应1‑2小时得肝素钠溶液，超滤除盐除醇，冻干干燥得效价大于180IU/mg的精品肝素钠；本发明提供了一种全新的通过结晶提纯肝素钠的方法，充分保留了肝素钠的活性基团，纯化效果好，收率高，作为原料有利于肝素制剂及低分子肝素制剂质量指标的控制。

Description

一种结晶纯化肝素钠的方法
技术领域
本发明涉及生物纯化技术领域，具体是一种结晶纯化肝素钠的方法。本发明方法利用化学结晶的方法对肝素钠粗品进行结晶纯化，制得的精品肝素钠效价达180IU/mg以上，稳定性好，纯化效率高。
背景技术
肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质结合在一起存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化，心脑血管疾病的显效药物。标准肝素的平均分子量为约为16000道尔顿，效价需达到180IU/mg以上。分子量低于6000道尔顿的低分子肝素与标准肝素相比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，在临床上应用更为广泛，近年临床常用的有：依诺肝素钠(克赛)、达肝素钠(法安明)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。
直接从猪小肠粘膜中提取得到的肝素钠粗品中含有蛋白质、核酸、无机盐等杂质，约占肝素钠粗品的40-80%，效价10-150IU/mg，不能作为医药用途的肝素钠制剂和生产低分子肝素的原料，必须经过纯化才能具有医药用途。很多生产企业在将肝素钠粗品提纯时，就因为生产工艺落后，收率低，生产成本高等原因而无法进一步生产高效价且分子结构完整的肝素钠。因此，由肝素钠粗品生产单位效价大于180IU/mg且结构完整的精品肝素钠，就成为行业内的研究重点。
目前国内外纯化肝素钠粗品的的方法都离不开多次氧化、多次乙醇沉淀的方法。氧化法纯化肝素钠粗品的方法存在下述问题：各批肝素钠粗品原料的杂质含量和种类不确定，通常需要多次氧化去除杂质，达到纯化效果，但是多次氧化去除杂质会导致肝素钠部分失活，收率下降，稳定性下降，肝素分子部分断裂、低分子量肝素钠偏多等问题，制得的精品肝素钠作为肝素制剂的原料，不利于肝素制剂的稳定性；作为低分子肝素的原料，不利于控制低分子肝素的关键质控指标，如依诺肝素钠的分子量分布比例和成环率等质量指标。因此，研究更合理的工艺方法，提高精品肝素钠的质量，尤其是在提高单位效价至大于180IU/mg的基础上，保持肝素钠分子结构完整，是提高肝素制剂及低分子肝素制剂产品质量的重要因素。
发明内容
本发明的目的就是针对目前肝素钠粗品纯化均离不开氧化纯化法，制得的肝素钠精品质量不稳定，不利于肝素制剂及低分子肝素制剂重均分子量及分子量分布等重要质量指标控制的问题，提供一种结晶纯化肝素钠的方法。
本发明的一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价300-1900IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为90-150IU/mg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体20-50g ，保温10-38℃，搅拌下超声3-10分钟；再搅拌反应0.5-2小时；用质量分数为5%-10%的NaOH溶液调pH至6.0-9.0，保温10-38℃，搅拌下超声3-20分钟，得结晶母液；
（3）母液降温至3-8℃，搅拌下20-60分钟内，缓加质量分数为50%-75%的乙醇溶液，加入量为母液体积的0.9-2倍，搅拌下超声3-20分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌，加适量纯化水，至母液体系澄清；
（4）母液降温至3-8℃，保温结晶12-24小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为60%-80%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，20-60分钟内，再加质量分数为60%-80%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至3-8℃，保温二次结晶12-24小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为60%-80%的乙醇溶液洗涤结晶2-4次，真空抽干乙醇溶液，4-20℃下冷冻高速离心；
（6）在结晶中加入质量分数为2%-5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的10-15倍，用质量分数为5%-10%NaOH溶液调节pH至7.0-9.0，保温40℃-50℃搅拌1-2小时，得肝素钠溶液；
（7） 肝素钠溶液超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠，所述精品肝素钠的单位效价在180IU/mg以上，收率95-98%。
进一步地，还可以直接采用上述步骤（6）溶解制得的肝素钠溶液再按照下述步骤进一步提纯，制成单位效价190IU/mg以上的肝素钠精品：
A.在搅拌下向肝素钠溶液中缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为肝素钠溶液总质量的0.9-1.5倍，保温5-25℃，搅拌下超声3-20分钟，超声结束后沉淀12-24小时，真空抽干去醇液收集沉淀物；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%-50%，乙醇的质量分数为50%-90%的溶液；
B.在沉淀物中加入质量分数为70-80%的乙醇溶液3-5倍沉淀物质量，搅拌下超声3-20分钟，沉淀1-2小时去醇液；再加入质量分数为95%乙醇3-5倍沉淀物质量，浸泡1-2小时，搅拌下超声3-20分钟，沉淀1-2小时去醇液；最后加入无水乙醇3-5倍沉淀物质量，浸泡1-2小时，搅拌下超声3-20分钟，沉淀3-5小时去醇液；
C.在沉淀物中加入蒸馏水10-50倍沉淀物质量溶解沉淀，保温40-50℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠，所述精品肝素钠的生物活性在190IU/mg以上。
本发明中所述超声操作时的超声强度为1500-5000W/m2，超声频率：28-40KHZ。
本发明中所述冷冻高速离心是采用KR4i离心机或DL7M-12L离心机或GL21M离心机。
本发明中所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
本发明的工艺方法，是发明人历经数年实验研究之后作出的，发明人利用肝素盐的结晶特性，通过在肝素钠溶液中加入亚硫酸氢钠超声反应，再调pH值获得合适的结晶母液，向结晶母液中加入乙醇溶液搅拌超声至母液中刚刚出现轻微乳浊，即代表溶液中形成了极少量的结晶，此时再加适量纯化水至体系澄清，保温结晶12-24小时，即得到均匀的针状肝素盐结晶，回收母液二次结晶，合并两次结晶后乙醇洗涤，再用氯化钠溶液溶解结晶，调pH值得肝素钠溶液，超滤除盐除醇，冻干干燥即得单位效价大于180IU/mg的精品肝素钠。
进一步地，为了获得单位效价更高的肝素钠，在结晶再溶解制得肝素钠溶液以后，再经甲醇乙醇混合溶液超声溶解、沉淀，不仅可以对肝素钠溶液起到脱色作用，还可以去除其他杂质，再经高浓度乙醇梯度超声脱水脱甲醇，沉淀物蒸馏水溶解，调至中性保温超滤除盐除醇、冻干干燥，制得单位效价大于190IU/mg是精品肝素钠。
本发明方法中每一步所采用的溶液浓度、温度控制、时间控制，超声条件控制等参数均是经过大量实验研究、总结后得出的，在整个生产工艺中没有采用氧化法去杂，最大限度保护了肝素活性基团的生物活性，分子量分布比例与肝素钠粗品原料保持一致，制得的精品肝素钠作为原料对生产肝素制剂及低分子肝素制剂的质量控制起到关键作用。
本发明方法与传统的肝素钠纯化方法相比，具有以下优点：
1.首次提出了肝素钠结晶纯化的方法，给出了肝素钠结晶纯化的具体操作工艺，为肝素钠纯化提供了新的工艺思路；
2.整个工艺流程没有使用氧化剂，最大限度的保证了肝素钠分子结构的完整性，从原料肝素钠粗品到制成肝素钠精品过程中，肝素钠的活性基团没有被破坏；保证了肝素制剂及低分子肝素制剂产品的质量控制；
3.在肝素钠粗品纯化工艺中引入超声操作及合理的超声参数，大大提高了工作效率，减少了生产周期，提高了产品收率；
4.整个工艺流程中引入的药剂成分简单，没有使用具有毒副作用作用的药剂，提纯后的精品肝素钠更清洁环保，作为药用制剂的原料更安全。
具体实施方式
实施例1
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价1000IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为145.1IU/mg，质量为2.520Kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体35g，保温20-25℃，搅拌下超声7分钟；再搅拌反应1.2小时；用质量分数为8%的NaOH溶液调pH至7.5，保温20-25℃，搅拌下超声7分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为3000W/m2，超声频率：35KHZ；
（3）母液降温至5℃，搅拌下40分钟内，缓加质量分数为60%的乙醇溶液，加入量为母液体积的1.5倍，搅拌下超声8分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌下加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为3000W/m2，超声频率：35KHZ；
（4）母液降温至5℃，保温结晶18小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为70%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，40分钟内，再加质量分数为70%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至5℃，保温二次结晶18小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为70%的乙醇溶液洗涤结晶3次，真空抽干乙醇溶液，4-10℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用KR4i离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为3.5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的12倍，用质量分数为8%NaOH溶液调节pH至8.0，保温43℃-47℃搅拌1.5小时，得肝素钠溶液；
（7）在搅拌下向肝素钠溶液中缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为肝素钠溶液总质量的1.2倍，保温15-20℃，搅拌下超声8分钟，超声结束后沉淀18小时，真空抽干去醇液收集沉淀物；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为30%，乙醇的质量分数为70%的溶液；所述超声操作时的超声强度为3000W/m2，超声频率为35KHZ；
（8）在沉淀物中加入质量分数为75%的乙醇溶液4倍沉淀物质量，搅拌下超声8分钟，沉淀1.5小时去醇液；再加入质量分数为95%乙醇4倍沉淀物质量，浸泡1.5小时，搅拌下超声8分钟，沉淀1.5小时去醇液；最后加入无水乙醇4倍沉淀物质量，浸泡1.5小时，搅拌下超声8分钟，沉淀4小时去醇液；所述超声操作时的超声强度为3000W/m2，超声频率：35KHZ；
（9）在沉淀物中加入蒸馏水30倍沉淀物质量溶解沉淀，保温43-47℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得1.876kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为190.6IU/mg，效价收率为97.8%；其重均分子量为16700；分子量大于24000的级分为13.8%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.31；所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
效价收率=精品肝素钠总效价/粗品肝素钠总效价；
精品肝素钠总效价=精品肝素钠重量*精品肝素钠单位效价；
粗品肝素钠总效价=粗品肝素钠重量*粗品肝素钠单位效价。
实施例2
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价1500IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为130.5IU/mg，质量为3.118Kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体40g，保温34-38℃，搅拌下超声6分钟；再搅拌反应1.5小时；用质量分数为6%的NaOH溶液调pH至7.0，保温34-38℃，搅拌下超声6分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为1900W/m2，超声频率：28KHZ；
（3）母液降温至3℃，搅拌下30分钟内，缓加质量分数为70%的乙醇溶液，加入量为母液体积的1.0倍，搅拌下超声10分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊（此乳浊现象为溶液中形成了极少量的结晶导致的），搅拌下加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为1900W/m2，超声频率：28KHZ；
（4）母液降温至3℃，保温结晶20小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为75%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，30分钟内，再加质量分数为75%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至3℃，保温二次结晶20小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为75%的乙醇溶液洗涤结晶4次，真空抽干乙醇溶液，7-15℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用DL7M-12离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的10倍，用质量分数为6%NaOH溶液调节pH至7.5，保温40-45℃搅拌1.2小时，得肝素钠溶液；
（7） 肝素钠溶液超滤除盐除醇，冻干干燥得2.142kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为185.2IU/mg，效价收率为97.5%；其重均分子量为16300；分子量大于24000的级分为15.7%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.26，所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
实施例3
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价800IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为102.3IU/mg，质量为2.883kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体30g，保温15-20℃，搅拌下超声10分钟；再搅拌反应0.8小时；用质量分数为5%的NaOH溶液调pH至8.0，保温15-20℃，搅拌下超声10分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为4000W/m2，超声频率：28KHZ；
（3）母液降温至6℃，搅拌下50分钟内，缓加质量分数为65%的乙醇溶液，加入量为母液体积的1.8倍，搅拌下超声15分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌，加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为1500W/m2，超声频率：40KHZ；
（4）母液降温至4℃，保温结晶12小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为65%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，50分钟内，再加质量分数为65%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至4℃，保温二次结晶12小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为65%的乙醇溶液洗涤结晶2次，真空抽干乙醇溶液，15-20℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用KR4i离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为4%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的14倍，用质量分数为5%NaOH溶液调节pH至7.0，保温45℃-50℃搅拌1.8小时，得肝素钠溶液；
（7） 肝素钠溶液超滤除盐除醇，冻干干燥得1.562kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为183.0IU/mg，效价收率为96.9%；其重均分子量为17200；分子量大于24000的级分为17.7%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.39，所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
实施例4
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价1900IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为150.2IU/mg，质量为2.776kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体50g，保温30-35℃，搅拌下超声8分钟；再搅拌反应2小时；用质量分数为7%的NaOH溶液调pH至8.5，保温10-15℃，搅拌下超声15分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为5000W/m2，超声频率：28KHZ；
（3）母液降温至4℃，搅拌下20分钟内，缓加质量分数为75%的乙醇溶液，加入量为母液体积的2倍，搅拌下超声5分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌，加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为4000W/m2，超声频率：40KHZ；
（4）母液降温至6℃，保温结晶24小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为80%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，20分钟内，再加质量分数为80%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至6℃，保温二次结晶24小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为80%的乙醇溶液洗涤结晶3次，真空抽干乙醇溶液，10-15℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用DL7M-12离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为2%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的15倍，用质量分数为10%NaOH溶液调节pH至8.5，保温45℃-50℃搅拌2小时，得肝素钠溶液；
（7） 肝素钠溶液超滤除盐除醇，冻干干燥得2.223kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为183.8IU/mg，效价收率为98.0%；其重均分子量为18100；分子量大于24000的级分为16.7%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.11，（）请根据条件修改；所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
实施例5
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价300IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为90.8IU/mg，质量为3.636kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体20g，保温10-15℃，搅拌下超声3分钟；再搅拌反应0.5小时；用质量分数为10%的NaOH溶液调pH至9.0，保温25-30℃，搅拌下超声3分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为1500W/m2，超声频率：40KHZ；
（3）母液降温至8℃，搅拌下60分钟内，缓加质量分数为50%的乙醇溶液，加入量为母液体积的1.2倍，搅拌下超声20分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌，加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为1500W/m2，超声频率：40KHZ；
（4）母液降温至8℃，保温结晶15小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为60%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，60分钟内，再加质量分数为60%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至8℃，保温二次结晶15小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为60%的乙醇溶液洗涤结晶2次，真空抽干乙醇溶液，10-15℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用KR4i离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为4.5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的13倍，用质量分数为9%NaOH溶液调节pH至9.0，保温42℃-46℃搅拌1小时，得肝素钠溶液；
（7） 在搅拌下向肝素钠溶液中缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为肝素钠溶液总质量的1.5倍，保温5-10℃，搅拌下超声20分钟，超声结束后沉淀12小时，真空抽干去醇液收集沉淀物；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%，乙醇的质量分数为90%的溶液；所述超声操作时的超声强度为5000W/m2，超声频率：28KHZ；
（8）在沉淀物中加入质量分数为70%的乙醇溶液3倍沉淀物质量，搅拌下超声20分钟，沉淀1小时去醇液；再加入质量分数为95%乙醇5倍沉淀物质量，浸泡1小时，搅拌下超声3分钟，沉淀2小时去醇液；最后加入无水乙醇3倍沉淀物质量，浸泡2小时，搅拌下超声20分钟，沉淀3小时去醇液；所述超声操作时的超声强度为1500W/m2，超声频率：40KHZ；
（9）在沉淀物中加入蒸馏水10倍沉淀物质量溶解沉淀，保温40-45℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得1.729kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为182.5IU/mg，效价收率为95.6%；其重均分子量为18200；分子量大于24000的级分为16.8%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.19，所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
实施例6
一种结晶纯化肝素钠的方法，包括下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价500IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为120.7IU/mg，质量为2.750kg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液中加入NaHSO3固体38g，保温25-30℃，搅拌下超声5分钟；再搅拌反应1.4小时；用质量分数为9%的NaOH溶液调pH至6.0，保温25-30℃，搅拌下超声20分钟，得结晶母液；所述超声操作时的超声强度为3000W/m2，超声频率：28KHZ；
（3）母液降温至7℃，搅拌下35分钟内，缓加质量分数为55%的乙醇溶液，加入量为母液体积的0.9倍，搅拌下超声3分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，搅拌，加适量纯化水，至母液体系澄清；所述超声操作时的超声强度为3500W/m2，超声频率：35KHZ；
（4）母液降温至7℃，保温结晶16小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为78%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，35分钟内，再加质量分数为78%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至7℃，保温二次结晶20小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为72%的乙醇溶液洗涤结晶4次，真空抽干乙醇溶液，10-18℃下冷冻高速离心；所述冷冻高速离心是采用GL21M离心机；
（6）在结晶中加入质量分数为2.5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的13倍，用质量分数为7%NaOH溶液调节pH至7.2，保温40℃-45℃搅拌1.0小时，得肝素钠溶液；
（7）在搅拌下向肝素钠溶液中缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为肝素钠溶液总质量的0.9倍，保温20-25℃，搅拌下超声3分钟，超声结束后沉淀24小时，真空抽干去醇液收集沉淀物；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为50%，乙醇的质量分数为50%的溶液；所述超声操作时的超声强度为1500W/m2，超声频率：40KHZ；
（8）在沉淀物中加入质量分数为80%的乙醇溶液5倍沉淀物质量，搅拌下超声3分钟，沉淀2小时去醇液；再加入无水乙醇3倍沉淀物质量，浸泡2小时，搅拌下超声20分钟，沉淀1小时去醇液；最后加入无水乙醇5倍沉淀物质量，浸泡1小时，搅拌下超声3分钟，沉淀5小时去醇液；所述超声操作时的超声强度为5000W/m2，超声频率：28KHZ；
(9)在沉淀物中加入蒸馏水50倍沉淀物质量溶解沉淀，保温45-50℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得1.688kg精品肝素钠，经检测，所制得精品肝素钠的抗Ⅱa因子的单位效价为191.3IU/mg，效价收率为97.3%；其重均分子量为16800；分子量大于24000的级分为16.3%；8000-16000的级分/16000-24000的级分为1.22;所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。

Claims (5)

1.一种结晶纯化肝素钠的方法，其特征在于包含下述步骤：
（1）在肝素钠粗品中加入纯化水配制成肝素钠效价300-1900IU/ml的溶液；所述肝素钠粗品的效价为90-150IU/mg；
（2）在肝素钠溶液中，每千克溶液加入NaHSO3固体20-50g ，保温10-38℃，搅拌下超声3-10分钟；再搅拌反应0.5-2小时；用质量分数为5%-10%的NaOH溶液调pH至6.0-9.0，保温10-38℃，搅拌下超声3-20分钟，得结晶母液；
（3）母液降温至3-8℃，搅拌下缓加质量分数为50%-75%的乙醇溶液，加入量为母液体积的0.9-2倍，搅拌下超声3-20分钟，使母液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水，至母液体系澄清；
（4）母液降温至3-8℃，保温结晶12-24小时，真空抽出液体；结晶用适量质量分数为60%-80%的乙醇溶液洗涤，真空抽出乙醇和残留母液；抽出液体合并至另一结晶容器中，搅拌下，20-60分钟内，再加质量分数为60%-80%的乙醇溶液，使溶液刚刚出现轻微乳浊，加适量纯化水至体系澄清，再次降温至3-8℃，保温二次结晶12-24小时；
（5）收集针状肝素盐结晶，用质量分数为60%-80%的乙醇溶液洗涤结晶2-4次，真空抽干乙醇溶液，4-20℃下冷冻高速离心；
（6）在结晶中加入质量分数为2%-5%NaCl溶液溶解结晶，加入量为结晶重量的10-15倍，用质量分数为5%-10%NaOH溶液调节pH至7.0-9.0，保温40℃-50℃搅拌1-2小时，得肝素钠溶液；
（7）肝素钠溶液超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠，所述精品肝素钠的单位效价在180IU/mg以上，效价收率95-98%。
2.根据权利要求1所述的一种结晶纯化肝素钠的方法，其特征在于，是将步骤（6）溶解制得的肝素钠溶液再按照下述步骤进行提纯，制成单位效价190IU/mg以上的肝素钠精品：
A.在搅拌下向肝素钠溶液中缓慢加入甲醇、乙醇混合溶液，加入量为肝素钠溶液总质量的0.9-1.5倍，保温5-25℃，搅拌下超声3-20分钟，超声结束后沉淀12-24小时，真空抽干去醇液收集沉淀物；所述甲醇、乙醇混合溶液中甲醇的质量分数为10%-50%，乙醇的质量分数为50%-90%；
B.在沉淀物中加入质量分数为70-80%的乙醇溶液3-5倍沉淀物质量，搅拌下超声3-20分钟，沉淀1-2小时去醇液；再加入质量分数为95%的乙醇3-5倍沉淀物质量，浸泡1-2小时，搅拌下超声3-20分钟，沉淀1-2小时去醇液；最后加入无水乙醇3-5倍沉淀物质量，浸泡1-2小时，搅拌下超声3-20分钟，沉淀3-5小时去醇液；
C.在沉淀物中加入蒸馏水10-50倍沉淀物质量溶解沉淀，保温40-50℃，超滤除盐除醇，冻干干燥得精品肝素钠，所述精品肝素钠的生物活性在190IU/mg以上。
3.根据权利要求1或2所述的一种结晶纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述超声操作时的超声强度为1500-5000W/m2，超声频率：28-40KHZ。
4.根据权利要求1所述的一种结晶纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述冷冻高速离心是采用KR4i离心机或DL7M-12L离心机或GL21M离心机。
5.根据权利要求1或2所述的一种结晶纯化肝素钠的方法，其特征在于：所述超滤是采用截留分子量为500-600的纳滤膜。
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