CN102993335A - 一种肝素钠平衡提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝素钠提取的方法，其特点在于解决了传统酶解工艺中肠粘膜酶解不充分，吸附效果不佳的问题。传统酶解工艺中会产生酶解不均匀现象，本发明通过在不同的酶解阶段引入不同的超声波对其进行充分酶解使得酶解液肝素钠含量提高，充分释放了肝素钠。在吸附阶段，本发明通过过滤净化了吸附母液水质，使得吸附环境更清洁，树脂更易吸附，少被污染和堵塞，从而提高了肝素钠生产效率。本发明通过以上两步骤使得肝素钠收率提高10％-20％，具有显著经济效益。

Description

一种肝素钠平衡提取方法

技术领域

本发明方法涉及的是一种以猪小肠粘膜为材料的提取肝素钠技术，方法通过超声波生物酶解技术、层析技术提高了现有技术水平，从而提高了肝素钠产量的一种提取方法。

背景技术

心脑血管疾病是人类的头号疾病杀手。随着人们生活水平提高带来的营养过剩、全球环境的恶化、生活节奏加快、人口老龄化加剧，致使全球心脑血管疾病的发病率和死亡率正逐年增高，肝素的出现为众多心脑血管疾病患者创造了生命的奇迹。目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。肝素是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素能够用于临床治疗。肝素原料药的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生猪的小肠粘膜，由于含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素，从而制成肝素原料药。肝素钠原料药是标准肝素制剂的唯一有效成分和低分子肝素原料的生产起点，目前肝素制剂只有按照注射给药方式用于临床，这使得肝素原料药需要有很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。

有报道称采用超声波辅助酶解和盐解过程可提高收率，如“黑龙江八一农垦大学，宋大魏毕业论文，《肝素的高效提取和分离纯化技术研究》，通过研究发现，超声波通过高压强空化效应确实可以帮助细胞破裂，释放更多的肝素，但在单频和双频下还不能完全适应肝素钠酶解过程，通过研究发现被分解物质的分子量大小与频率的关系密切，酶解肝素钠的过程又需要不同的频率完成，比如28KHz、40KHz、68KHz之所以要采用这样的顺序，是因为酶解过程是一个由大到微小的过程，28KHz是将大组织分解成小结构的液态组织在这个时候会释放10％肝素钠，40KHz是将液态组织分解成细小的水解液这样会释放60％肝素钠，68KHz是将细小水解液分解成微小水解液这会释放30％肝素钠。三个步骤加载一起基本可以完整表达超声波酶解肝素钠过程。所以本发明提供的是一种适宜于完整酶解过程所需要的多种频率的超声波结合在一起的方法，并且适用于大规模生产，产业化效果显著。

研究传统方法发现，采用树脂吸附方式提取肝素钠的方法都存在一个问题，树脂投入吸附罐后，并不是所有树脂都得到了充分利用，在树脂搅拌吸附时，酶解液在罐内形成旋涡，底部树脂密度大于上部，恰恰底部肝素浓度低，上部浓度高，且底部有杂质沉淀，另外漂浮在吸附罐内上部树脂易被酶解液中的油脂成分堵塞，堵塞后的树脂吸附能力大大下降，这些问题影响了树脂吸附，本发明是针对上述问题采用层析方法解决这一难题，目前未发现在肝素钠粗品生产中采用层析方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超声波正确的频率对整个酶解过程提高肝素钠收率的方法，其成本低、收率高、能耗低、污染小。

本发明采用如下技术方案，其特征包括如下步骤：

A采用常规酶解法在酶解罐中混合猪小肠粘膜、盐、碱、蛋白酶和水；B对混合后的液体分别加入三种频率的超声波进行酶解，其频率分别为28KHz、40KHz、68KH，工作时间分别为20分钟、30分钟、10分钟，功率分别为500W、400W、500W，制得猪小肠酶解液；C采用常规法加热酶解液使蛋白酶失活蛋白变性；D采用带有10μm-50μm的过滤装置过滤杂质并采用带有恒温循环装置的层析设备进行吸附；E采用常规法洗脱树脂；F采用常规法沉淀肝素钠；G采用常规法纯化肝素钠；H最后采用常规法干燥得到肝素钠。

本发明具有以下优点：

1.工艺简单，操作简便，投资少，对现有设备改变不大，适合大规模工业化生产。

2.肝素钠收率提高，质量稳定。以本方法生产的肝素钠纯度可达105-120IU/mg，肝素钠收率可达1亿IU/1500-1700根重量在1200克-1400克猪小肠粘膜，较现有技术提高20-30％。

3.减少污染，降低成本。本发明方法可以杜绝在吸附罐的树脂在洗脱时流入排水系统进而对水源造成长期污染。

4.降低能耗，减少生产成本。本发明方法采用循环水系统，较传统工艺节电力30％。

具体实施方式

实施例1

一种肝素钠平衡提取方法，包括以下步骤：

A混合酶解液：采用传统酶水解工艺，用健康猪小肠粘膜为原料，加入水、蛋白酶、肠衣盐、氢氧化钠，其比例分别为(本专利按份来计算)，取100份肠粘膜加：加500L水：500克蛋白酶：3000克肠衣盐，一起投入反应罐中，搅拌均匀后，用2mol浓度氢氧化钠调节酶解液PH至8.0-9.0。

B超声波工作过程：在酶解液中温度达到40度时分别加入28KHz、40KHz、68KHz超声波发生器，设定其工作时间分别为20分钟、30分钟、10分钟，功率分别为5000W、4000W、5000W。超声波结束后开始升温至55-60℃，恒温搅拌酶解2H。

C蛋白酶失活过程：将酶解液快速加温至85-90℃，保温10-30分钟，开始过滤。

D过滤吸附：待蛋白酶失活过程结束，开始过滤，先用100-120目滤网过滤杂质，收集滤液。滤液，再用10μm-50μm的过滤装置过滤，过滤后的液体变清澈，将酶解液降温后，通过自循环装置，把酶解液循环通过预装好树脂的层析柱，循环为封闭式循环，隔绝了与空气的接触，柱高为树脂高度的3倍，循环8H，同时保持温度60℃，压力表显示1.01MPa，流速表显示3m³/H。

E洗脱：将吸附后的树脂用15％-19％氯化钠溶液(树脂量的1倍)搅拌洗脱2-4H 2次，收集洗脱液，然后再用20％氯化钠溶液(树脂量的1倍)洗脱1次，收集洗脱液。

F肝素钠沉淀：将步骤E中洗脱液合并，加入85％-95％乙醇搅拌，直到沉淀液乙醇浓度达到45-50度，停止搅拌，静置12H，将上部酒精回收待下次使用，收集下部肝素钠沉淀物。

G肝素钠纯化：将步骤F所得肝素钠沉淀用3％氯化钠溶液溶解，用200-300目滤网过滤，除去杂质，在加入85％-95％乙醇搅拌，直到溶液浓度达到45％-50％，静置沉淀8H，回收上部酒精，收集下部肝素钠沉淀，然后加入85％-95％乙醇脱水，收集肝素钠沉淀。

H烘干：将收集的肝素钠沉淀至于鼓风干燥箱中风干，至半干时，加入蒙脱石干燥，可得肝素钠。

实施例2

本实施例的步骤同实施例1只是在吸附层析柱的流速和压力上作了改变，实施例2改为：压力表显示1.02MPa，流速表显示5m³/H。

实施例3

本实施例的步骤同实施例1只是在吸附层析柱的流速和压力上作了改变，实施例3改为：压力表显示1.025MPa，流速表显示10m³/H。

本发明可用其它不违背本发明精神或主要特征的具体形式来概述，在不脱离本发明上述主题范围的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出来的各种变更和替换，均落入本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种肝素钠平衡提取方法，具体步骤如下：

A采用常规酶解法在酶解罐中混合猪小肠粘膜、盐、碱、蛋白酶和水；B对混合后的液体分别加入三种频率的超声波进行酶解，其频率分别为28KHz、40KHz、68KH，工作时间分别为20分钟、30分钟、10分钟，制得猪小肠酶解液；C采用常规法加热酶解液使蛋白酶失活蛋白变性；D采用带有10μm-50μm的过滤装置过滤杂质并采用带有恒温循环装置的层析设备进行吸附；E采用常规法洗脱树脂；F采用常规法沉淀肝素钠；G采用常规法纯化肝素钠；H最后采用常规法干燥得到肝素钠。

2.根据权利要求1所述的一种肝素钠平衡提取方法，其特征在于：所述步骤B、D中采用的三种超声波特有的频率对应整个酶解过程，和一种10μm-50μm过滤装置、恒温、循环、密封、层析的方法。

3.根据权利要求2所述的一种肝素钠平衡提取方法，其特征包括如下步骤：

A混合酶解液：采用传统酶水解工艺，用健康猪小肠粘膜为原料，加入水、蛋白酶、肠衣盐、氢氧化钠，其比例分别为(本专利按份来计算)5份肠粘膜加：25L水：25克蛋白酶：150克肠衣盐，一起投入反应罐中，搅拌均匀后，用2mol浓度氢氧化钠调节酶解液PH至8.0-9.0。

B超声波工作过程：在酶解液中温度达到40度时分别加入28KHz、40KHz、68KHz超声波，其工作时间分别为20分钟、30分钟、10分钟，功率分别为500W、400W、500W。超声波工作结束后开始升温至55-60℃，恒温搅拌酶解2H。

C蛋白酶失活过程：将酶解液快速加温至85-90℃，保温10-30分钟，开始过滤。

D过滤吸附：待蛋白酶失活过程结束，开始过滤，先用100-120目滤网过滤杂质，收集滤液。滤液再用10μm-50μm的过滤装置过滤，过滤后的液体变清澈，将酶解液降温后，通过自循环装置，把酶解液循环通过预装好树脂的层析柱，循环为封闭式循环，隔绝了与空气的接触减少氧化，柱高为树脂高度的3倍，循环8H，同时保持温度60℃，压力1.025MPa。

E洗脱：将吸附后的树脂用15％-20％氯化钠溶液(树脂量的1倍)搅拌洗脱2-4H 2次，收集洗脱液，然后再用20％氯化钠溶液(树脂量的1倍)洗脱1次，收集洗脱液。

F肝素钠沉淀：将步骤E中洗脱液合并，加入80％-95％乙醇搅拌，直到沉淀液乙醇浓度达到40-50度，停止搅拌，静置12H，将上部酒精回收待下次使用，收集下部肝素钠沉淀物。

G肝素钠纯化：将步骤F所得肝素钠沉淀用3％氯化钠溶液溶解，用200-300目滤网过滤，除去杂质，在加入85％-95％乙醇搅拌，直到溶液浓度达到45％-50％，静置沉淀8H，回收上部酒精，收集下部肝素钠沉淀，然后加入85％-95％乙醇脱水，收集肝素钠沉淀。

H烘干：将收集的肝素钠沉淀至于鼓风干燥箱中风干，至半干时，加入蒙脱石干燥，可得肝素钠。