CN107236058A - 肝素钠的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：(1)制备浆液；(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8‑9后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为20‑30min，超声功率为250‑300W，单次超声时间为2‑4s，超声时间与间歇时间比为2‑5:1，然后离心，过滤，得滤液；(3)微波提取；(4)酶解；(5)除杂；(6)吸附；(7)清洗；(8)沉淀；(9)精制。本发明的提取过程中每个步骤是环环相扣的，通过此提取过程显著提高了肝素钠的收率和纯度，收率达一亿IU/1000‑1100根猪小肠，纯度达163‑182IU/mg。
Description
技术领域
本发明属于猪小肠粘膜深加工技术领域，具体涉及一种以猪小肠粘膜为原料，提取肝素钠的方法。
背景技术
肝素钠是一种由动物结缔组织的肥大细胞产生的酸性粘多糖硫酸酯类物质，广泛存在于哺乳动物肝、肺、肠粘膜中，多与蛋白质结合成复合体存在，因其具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物。随着研究的深入，人们发现肝素钠不仅有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗癌等多种生物学功能。虽然肝素钠用于临床已有60余年的历史，但迄今还没有一种能够完全替代它的产品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物，且目前只能从动物的部分组织中提取，不能人工合成。
但采用现有的提取方法从猪小肠粘膜上提取肝素钠，提取一亿国际单位(IU)肝素钠粗品需2800-3000根猪小肠的粘膜，其收率低，产品效价也低，肝素钠的效价一般为70-90U/mg。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种肝素钠的提取方法，可有效解决现有提取方法收率低，纯度低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
肝素钠的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备浆液：将新鲜的猪小肠粘膜与水按每根小肠加水4-5kg混合，然后置于匀浆机中匀浆，得浆液；
(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8-9后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为20-30min，超声功率为250-300W，单次超声时间为2-4s，超声时间与间歇时间比为2-5:1，然后离心，过滤，得滤液；
(3)微波提取：向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率为250-300W，提取时间为5-10min；
(4)酶解：向步骤(3)所得物质中加入蛋白酶，于45-55℃条件下搅拌40-60min；其中，每升步骤(3)所得物质中加入2-4g蛋白酶；
(5)除杂：调节步骤(4)所得酶解产物的pH至9-10，然后加入氯化钠，调节盐度为2.5-3，搅拌1-2h，升温至70-75℃，然后静置10-20min，离心过滤，收集滤液，接着用孔径为2μm的滤膜粗滤，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，以除去杂质，得滤液；
(6)吸附：将步骤(5)所得滤液温度调至45-55℃，pH调至8-9，加入树脂中，吸附3-4h，收集树脂；
(7)清洗：将步骤(6)收集到的树脂用清水清洗干净，再用盐度为18-20的盐水洗脱树脂2-2.5h，收集洗脱液，再用盐度为20-22的盐水洗脱树脂1-1.5h，收集洗脱液；
(8)沉淀：将步骤(7)所得两次洗脱液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素钠粗品；
(9)精制：将肝素钠粗品加水溶解，加入盐酸溶液调节pH值为1.5-2，过滤，得滤液，然后再加氢氧化钠调节滤液pH值为10-11，再加活性炭浸泡5-6h，过滤，得滤液，最后向滤液中加入75％乙醇沉淀6-8h，除去上清液，再真空干燥，得肝素钠精品。
进一步地，步骤(2)中每升浆液中加入0.6-0.8g复合酶。
进一步地，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。
进一步地，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物。
进一步地，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g。
进一步地，步骤(2)中超声时间为30min，超声功率为280W，单次超声时间为3s，超声时间与间歇时间比为4:1。
进一步地，步骤(3)中微波功率为280W，提取时间为8min。
进一步地，步骤(6)中每升滤液中加入5g树脂。
进一步地，所用树脂为D254树脂。
本发明提供的肝素钠的提取方法，具有以下有益效果：
利用超声波提取肝素钠主要是运用超声波的机械效应和空化作用。超声波的机械作用可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散，当超声波流体介质中形成驻波时，悬浮在流体中的微小颗粒因受机械力的作用而凝聚在波节处，在空间形成周期性的堆积；超声波的空化作用是指超声波作用于液体的时候可以产生大量小气泡，一个原因是由于液体内局部出现拉应力而形成负压，压强的降低使原来溶于液体的气体过饱和，而从液体逸出，成为小气泡；另一个原因是由于强大的拉应力把液体“撕开”成一空洞，成为空化。空洞内为液体蒸汽或溶于液体的另一种气体，甚至可能是真空，因为空化作用形成的小气泡会随周围介质的振动而不断运动，长大或突然破灭，破灭时周围液体突然冲入气泡而产生高温、高压，同时产生激波，这种作用力能破坏细胞膜的结构，使细胞在瞬间破裂，超声波的这些作用都有助于肝素钠的提取。
在超声波为介质的条件下酶解，即将超声波导入溶液中，在超声波破坏细胞膜的情况下，通过酶解过程使细胞内的肝素钠和蛋白质分离，肝素保留于溶液中，而蛋白质成为固体杂渣，通过离心过滤，便可将肝素钠与蛋白质初步分离。
此过程所用的酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶混合的复合酶，三者酶按照特定的比例关系复合，有利于去除与肝素钠连接的蛋白质，并且在酶解过程不需额外加热，便可将蛋白质去除。
将超声波酶解后所得滤液在微波场的作用下引起强烈的极性震荡，从而导致细胞分子间氢键松弛，细胞膜结构电击穿破裂，加速了细胞膜的通透性，从而有助于肝素钠的提取。
在超声波震荡前，向滤液中加入了复合酶，然后一起进行超声波振动，使其在破坏细胞膜结构，增加细胞膜通透性的情况下，直接用复合酶对连接肝素钠的蛋白质进行酶解，使其与肝素钠得到进一步的分离。
经过超声波酶解和微波提取过程后，肝素钠上还连接有蛋白质，通过进一步的蛋白质酶解过程，使其剩余蛋白质得到更好的去除，有利于提供肝素钠的纯度和收率。
超声波酶解、微波提取和蛋白质酶解，三个过程依次进行，协同将肝素钠从猪小肠粘膜上提取出来，提高其收率和纯度。
经过上述三个过程后，再进一步地用碱性盐法将肝素钠从肝素钠与其他物质形成的复合物中分离出来，再次提高了肝素钠的纯度；通过升温灭酶，最后依次通过离心，孔径为2μm的滤膜粗滤，孔径为0.22μm的滤膜过滤，可有效去除酶及其他杂质。
通过吸附作用，也是进一步地提高肝素钠的纯度，再用盐度较低的盐水对树脂进行清洗，提高肝素钠收率和纯度，整个提取过程中所用盐水浓度及使用量都大大减少了。
本发明的提取过程中每个步骤是环环相扣的，通过此提取过程显著提高了肝素钠的收率和纯度，收率达一亿IU/1000-1100根猪小肠，纯度达163-182IU/mg。
具体实施方式
实施例1
肝素钠的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备浆液：将新鲜的猪小肠粘膜与水按每根小肠加水5kg混合，然后置于匀浆机中匀浆，得浆液；
(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为20min，超声功率为250W，单次超声时间为2s，超声时间与间歇时间比为2:1，然后离心，过滤，得滤液；其中，每升浆液中加入0.6g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(3)微波提取：向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率为250W，提取时间为5min；其中，每升滤液中加入0.3g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(4)酶解：向步骤(3)所得物质中加入蛋白酶，于45℃条件下搅拌40min；其中，每升步骤(3)所得物质中加入2g蛋白酶；
(5)除杂：调节步骤(4)所得酶解产物的pH至9，然后加入氯化钠，调节盐度为2.5，搅拌1h，升温至70℃，然后静置20min，离心过滤，收集滤液，接着用孔径为2μm的滤膜粗滤，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，以除去杂质，得滤液；
(6)吸附：将步骤(5)所得滤液温度调至45℃，pH调至9，加入树脂中，吸附3h，收集树脂；其中，每升滤液中加入5g树脂，所用树脂为D254树脂；
(7)清洗：将步骤(6)收集到的树脂用清水清洗干净，再用盐度为18的盐水洗脱树脂2h，收集洗脱液，再用盐度为20的盐水洗脱树脂1h，收集洗脱液；
(8)沉淀：将步骤(7)所得两次洗脱液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素钠粗品；
(9)精制：将肝素钠粗品加水溶解，加入盐酸溶液调节pH值为1.5，过滤，得滤液，然后再加氢氧化钠调节滤液pH值为10，再加活性炭浸泡5h，过滤，得滤液，最后向滤液中加入75％乙醇沉淀6h，除去上清液，再真空干燥，得肝素钠精品。
实施例2
肝素钠的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备浆液：将新鲜的猪小肠粘膜与水按每根小肠加水5kg混合，然后置于匀浆机中匀浆，得浆液；
(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为30min，超声功率为300W，单次超声时间为4s，超声时间与间歇时间比为5:1，然后离心，过滤，得滤液；其中，每升浆液中加入0.8g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(3)微波提取：向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率为300W，提取时间为10min；其中，每升滤液中加入0.2g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(4)酶解：向步骤(3)所得物质中加入蛋白酶，于55℃条件下搅拌60min；其中，每升步骤(3)所得物质中加入4g蛋白酶；
(5)除杂：调节步骤(4)所得酶解产物的pH至10，然后加入氯化钠，调节盐度为3，搅拌2h，升温至75℃，然后静置20min，离心过滤，收集滤液，接着用孔径为2μm的滤膜粗滤，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，以除去杂质，得滤液；
(6)吸附：将步骤(5)所得滤液温度调至55℃，pH调至9，加入树脂中，吸附4h，收集树脂；其中，每升滤液中加入5g树脂，所用树脂为D254树脂；
(7)清洗：将步骤(6)收集到的树脂用清水清洗干净，再用盐度为20的盐水洗脱树脂2.5h，收集洗脱液，再用盐度为22的盐水洗脱树脂1.5h，收集洗脱液；
(8)沉淀：将步骤(7)所得两次洗脱液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素钠粗品；
(9)精制：将肝素钠粗品加水溶解，加入盐酸溶液调节pH值为1.5，过滤，得滤液，然后再加氢氧化钠调节滤液pH值为10，再加活性炭浸泡6h，过滤，得滤液，最后向滤液中加入75％乙醇沉淀8h，除去上清液，再真空干燥，得肝素钠精品。
实施例3
肝素钠的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备浆液：将新鲜的猪小肠粘膜与水按每根小肠加水5kg混合，然后置于匀浆机中匀浆，得浆液；
(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8.5后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为30min，超声功率为280W，单次超声时间为3s，超声时间与间歇时间比为4:1，然后离心，过滤，得滤液；其中，每升浆液中加入0.8g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(3)微波提取：向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率为280W，提取时间为8min；其中，每升滤液中加入0.25g复合酶，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g；
(4)酶解：向步骤(3)所得物质中加入蛋白酶，于55℃条件下搅拌40min；其中，每升步骤(3)所得物质中加入3g蛋白酶；
(5)除杂：调节步骤(4)所得酶解产物的pH至10，然后加入氯化钠，调节盐度为2.5，搅拌1.5h，升温至75℃，然后静置15min，离心过滤，收集滤液，接着用孔径为2μm的滤膜粗滤，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，以除去杂质，得滤液；
(6)吸附：将步骤(5)所得滤液温度调至55℃，pH调至9，加入树脂中，吸附3.5h，收集树脂；其中，每升滤液中加入5g树脂，所用树脂为D254树脂；
(7)清洗：将步骤(6)收集到的树脂用清水清洗干净，再用盐度为20的盐水洗脱树脂2h，收集洗脱液，再用盐度为22的盐水洗脱树脂1h，收集洗脱液；
(8)沉淀：将步骤(7)所得两次洗脱液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素钠粗品；
(9)精制：将肝素钠粗品加水溶解，加入盐酸溶液调节pH值为1.5，过滤，得滤液，然后再加氢氧化钠调节滤液pH值为10，再加活性炭浸泡5h，过滤，得滤液，最后向滤液中加入75％乙醇沉淀6h，除去上清液，再真空干燥，得肝素钠精品。
实施例4
与实施例3不同之处为，缺少步骤(2)超声波酶解这个步骤。
实施例5
与实施例3不同之处为，步骤(2)超声波酶解中不添加复合酶。
实施例6
与实施例3不同之处为，步骤(2)超声波酶解中添加的酶为蛋白酶。
实施例7
与实施例3不同之处为，缺少步骤(3)微波提取这个步骤。
实施例8
与实施例3不同之处为，步骤(3)微波提取中不添加复合酶。
实施例9
与实施例3不同之处为，(3)微波提取中添加的酶为蛋白酶。
实施例10
与实施例3不同之处为，缺少步骤(4)酶解这个步骤。
实施例11
与实施例3不同之处为，步骤(5)除杂仅为离心，过滤，得滤液。
实施例12
与实施例3不同之处为，缺少步骤(6)吸附和步骤(7)清洗。
实施例1-12所提供的肝素钠的提取方法提取肝素钠，其收率和纯度见下表：
| 收率 | 纯度(U/mg) | |
| 实施例1 | 1100 | 163 |
| 实施例2 | 1080 | 175 |
| 实施例3 | 1000 | 182 |
| 实施例4 | 1300 | 139 |
| 实施例5 | 1500 | 123 |
| 实施例6 | 1360 | 132 |
| 实施例7 | 1250 | 145 |
| 实施例8 | 1475 | 128 |
| 实施例9 | 1400 | 130 |
| 实施例10 | 1216 | 150 |
| 实施例11 | 1189 | 156 |
| 实施例12 | 1225 | 151 |
上述收率是指提取一亿IU肝素钠所需的猪小肠数量。
Claims (9)
1.肝素钠的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备浆液：将新鲜的猪小肠粘膜与水按每根小肠加水4-5kg混合，然后匀浆，得浆液；
(2)超声波酶解：将步骤(1)所得浆液pH调至8-9后加入复合酶，混合，在以超声为介质的条件下进行酶解，超声时间为20-30min，超声功率为250-300W，单次超声时间为2-4s，超声时间与间歇时间比为2-5:1，然后离心，过滤，得滤液；
(3)微波提取：向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率为250-300W，提取时间为5-10min；
(4)酶解：向步骤(3)所得物中加入蛋白酶，于45-55℃条件下搅拌40-60min；其中，每升步骤(3)所得物中加入2-4g蛋白酶；
(5)除杂：调节步骤(4)所得酶解产物的pH至9-10，然后加入氯化钠，调节盐度为2.5-3，搅拌1-2h，升温至70-75℃，然后静置10-20min，离心过滤，收集滤液，接着用孔径为2μm的滤膜粗滤，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得滤液；
(6)吸附：将步骤(5)所得滤液温度调至45-55℃，pH调至8-9，加入树脂中，吸附3-4h，收集树脂；
(7)清洗：将步骤(6)收集到的树脂用清水清洗干净，再用盐度为18-20的盐水洗脱树脂2-2.5h，收集洗脱液，再用盐度为20-22的盐水洗脱树脂1-1.5h，收集洗脱液；
(8)沉淀：将步骤(7)所得两次洗脱液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素钠粗品；
(9)精制：将肝素钠粗品加水溶解，加入盐酸溶液调节pH值为1.5-2，过滤，得滤液，然后再加氢氧化钠调节滤液pH值为10-11，再加活性炭浸泡5-6h，过滤，得滤液，最后向滤液中加入75％乙醇沉淀6-8h，除去上清液，再真空干燥，得肝素钠精品。
2.根据权利要求1所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，步骤(2)中每升浆液中加入0.6-0.8g复合酶。
3.根据权利要求1或2所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。
4.根据权利要求3所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物。
5.根据权利要求4所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万U/g。
6.根据权利要求1所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，步骤(2)中超声时间为30min，超声功率为280W，单次超声时间为3s，超声时间与间歇时间比为4:1。
7.根据权利要求1所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，步骤(3)中微波功率为280W，提取时间为8min。
8.根据权利要求1所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，步骤(6)中每升滤液中加入5g树脂。
9.根据权利要求1所述的肝素钠的提取方法，其特征在于，所用树脂为D254树脂。
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