CN102010460B - 一种油茶籽多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶籽多肽及其制备方法，其中油茶籽多肽占总氮含量(以干基计)≥95.0％，肽含量(以干基计)≥90.0％，所得的相对分子质量均在4000Da以下，相对分子质量800Da以下的肽段含量≥80％，三氯乙酸氮溶解指数(TCA-NSI)≥95.0％，水分含量≤5.0％，灰分含量(以干基计)≤5.0％，粗脂肪含量(以干基计)≤1.0％。其制备方法为冷榨发的油茶籽饼粕粉碎，并去除里面的油脂；再采用碱溶酸沉方法提取分离油茶籽饼粕里的蛋白；蛋白水解为多肽粗液；用超滤膜过滤多肽粗液，收集超滤液；超滤液在阴阳离子交换树脂洗脱，得油茶籽多肽液。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用冷榨油茶籽油生产剩余的冷榨油茶籽饼，采用蛋白酶水解工艺，制备油茶籽生物活性肽的方法。
背景技术
油茶(Camellia oleifera A bel)系山茶科山茶属植物，是一种常绿、长寿、果实含油率高的我国特有的油料作物，也是与油棕、橄榄、椰子齐名的四大木本食用油源树种之一。根据相关资料表明，中国是唯一一个将油茶作为食用油料栽培的国家，虽然在日本和东南亚各国也有油茶，但数量极少，可以忽略不计。通过农业部油料及制品质量监督检测中心介绍，现今全国油茶林达到400万hm2，主要分布在南方的16个省(区)1100多个县，占全国木本油料面积的80％以上，年产油茶籽60余万吨。油茶籽粕中蛋白质含量约为12％-15％，其氨基酸组成为15种，其中8种为人体必需氨基酸。油茶籽粕蛋白具有很高的经济价值，可将其作为生产蛋白饮料、冲调食品、焙烤食品的蛋白质强化剂以及作为酱油等发酵产品的蛋白原料。因此，以油茶籽粕为原料提取蛋白，进行开发和利用是非常有意义的。油茶籽蛋白在生物酶法条件下，水解生成多肽及氨基酸等物质，具有很高的营养价值与功能特性，因此该法已成为研究热点。很多种植物蛋白质酶解后产生的多肽除了具有易被人体消化吸收的特性外，还具有很强的抗氧化、降低胆固醇等功能特性。开展对油茶籽多肽保健功能活性的研究具有重要的现实意义。
肽是由氨基酸通过肽键连接而成的化合物，它是机体组织细胞的基本组成成分。最简单的肽是由两个氨基酸组成的二肽，其中含有1个肽键；含有3个、4个、5个等氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。由2个到10个氨基酸通过肽键形成的直键肽称为寡肽或小肽；由肽键结合起来的多于10个氨基酸的聚合体则称为多肽。科学家已在人体中发现了100多种生物活性肽，这些肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要，所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与多肽有关系。
油茶籽肽是指油茶籽蛋白经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程得到的蛋白质水解产物。油茶籽肽具有较好的功能特性，如油茶籽肽溶液在高浓度下黏度依然较低，能在较宽的pH值范围内保持溶解状态；具有较高的吸湿性和保湿性；渗透压比氨基酸低得多；能抑制蛋白质形成凝胶，减少了由于油茶籽蛋白大分子引起的过敏原性，增加了产品的稳定性等。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种油茶籽多肽。
本发明的另一目的在于提供所述油茶籽多肽的制备方法。
本发明的第一方面，提供了一种油茶籽多肽，其中油茶籽多肽占总氮含量(以干基计)≥95.0％，肽含量(以干基计)≥90.0％，所得的相对分子质量均在4000Da以下，相对分子质量800Da以下的肽段含量≥80％。
在一较佳实施例中，油茶籽多肽占总氮含量(以干基计)的三氯乙酸氮溶解指数(TCA-NSI)≥95.0％，水分含量≤5.0％，灰分含量(以干基计)≤5.0％，粗脂肪含量(以干基计)≤1.0％；
在一较佳实施例中，本方法制备的油茶籽肽为白色或淡黄色粉末，100％通过80目筛，无肉眼可见外来物质；在所有的pH条件下都能溶于水。
本发明的另一方面，提供了一种制备该油茶籽多肽的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将油茶籽饼粕粉碎，并用溶剂去除里面的油脂；
(2)采用碱溶酸沉方法提取分离油茶籽饼粕里的蛋白；
(3)采用酶解方法将步骤(2)中的蛋白水解为多肽粗制液；
(4)用超滤膜过滤步骤(3)所得的多肽粗液，收集超滤液；未透过超滤膜部分为浓缩液，将浓缩液回收至反应罐中再次水解并再次超滤，收集超滤液；
(5)超滤液在阴阳离子交换树脂洗脱，得油茶籽多肽液。
在本发明的较佳实施例中，步骤(5)之后，还包括步骤：
(6)油茶籽多肽液经浓缩之后，喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。
在本发明的较佳实施例中，所述的油茶籽饼粕为冷榨法制油后的油茶籽饼粕。
在本发明的较佳实施例中，所述的步骤(1)的方法为：将油茶籽饼粕碎，过40～120目筛，用95％正己烷溶剂在40～50℃条件下浸提2～3次，每次2～3h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，待用。
在本发明的较佳实施例中，所述的步骤(2)的方法为：
(a)将步骤(1)的去除油脂后的油茶籽饼粕按1∶5～1∶10(W/V)溶解至水中，加热至45～55℃，用碱调节pH至8.0～10.0，不停搅拌15min，之后再3000～4000r/min，15min，离心取上清液；
(b)将步骤a的上清液加热至70～90℃，用酸调节pH至3.0～5.0，不停搅拌15min，之后再3000～4000r/min，15min，离心收集沉淀。
在本发明的较佳实施例中，步骤(3)所述的方法为
(a)将步骤(2)的沉淀按1∶10～1∶20溶解至水中，加热至90～100℃，保持15～30min，然后冷却至40～50℃，用NaOH试剂调节并保持pH在7.5～9.0，加入碱性蛋白酶Alcalase 70～80AU/Kg蛋白，酶解2～4h，酶解过程中不断搅拌；
(b)待酶解结束后，迅速加热至90～95℃，并保持10～20min，之后3000～5000r/min，15min，离心取上清液，即为油茶籽多肽粗制液。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)所述的方法为：
将步骤(3)中的油茶籽多肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为3000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至反应罐中再次水解。
在本发明的较佳实施例中，步骤(5)所述的方法为
去离子交换树脂于水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸或10％NaOH对其进行处理，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用水清洗至微酸性或微碱性待用；
将步骤(4)中所得的油茶籽多肽超滤液，以5～10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过0H-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：
(1)直接以冷榨油茶籽饼为原料，提高了原料利用率；
(2)油茶籽饼里还含有少量油脂、以95％正己烷溶剂浸提去除油脂之后，可减少油脂的干扰，提高后续的蛋白的纯度；正己烷作为油脂浸出的溶剂，对油脂浸出非常有效，它很少浸出非油物质且易于从油及粕中脱除。
(3)采用超滤法对油茶籽肽进行分级处理，保证95％的油茶籽肽分子量在3000Da以下，并对于分子量3000～5000Da以上的油茶籽肽进行二次酶解，提高原料的利用率；
(4)利用阴阳交换树脂对油茶籽肽粗品进行脱盐，在脱盐的同时，也可去除油茶籽肽中的色素成分，提高了油茶籽多肽的纯度；
(5)由本发明制备并精制的油茶籽肽，分子量低、产品稳定性好，具有良好的抗疲劳、降血压、抗氧化等效果。
(6)本发明方法易于工业化生产。
具体实施方式
原料：冷榨油茶籽饼，厦门中盛粮油集团
碱性蛋白酶Alcalase，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司
阴阳离子交换树脂：长沙市大禹化工有限公司型号：001×7(732)阳离子交换树脂；201×7(717)阴离子交换树脂。
试剂：所用试剂均为市售的分析纯试剂。
实施例一
(1)取油茶籽饼100g，用植物粉碎机粉碎，过80目筛，将筛下物在95％的正己烷溶剂中浸提脱脂，水浴加热溶剂温度为50℃，浸提2次，每次2h，浸提完成后晾晒至试剂完全挥发，待用；
(2)将步骤1的油茶籽饼粕溶解在1000mL水中，加热至50℃，用NaOH溶剂调节pH至8.0，不断搅拌15min，再3000r/min离心15min，取上清液待用；
(3)将步骤2的上清液加热至70℃，用柠檬酸调节pH至5.0，不断搅拌15min，3000r/min离心15min，收集沉淀待用；
(4)将步骤3的油茶籽蛋白按1∶10加入去离子水，加热至90℃保持15min，然后冷却并保持溶液温度至45℃，用NaOH试剂调节并保持溶液pH为8.0，加入碱性蛋白酶Alcalase 75AU/Kg蛋白，在此条件下进行酶解，酶解时间为2h，在酶解过程中需不停搅拌；
(5)待酶解结束，迅速加热至90℃，保持15min，3000r/min离心15min，取上清液待用，为油茶籽肽粗制液；
(6)将步骤5中的油茶籽肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为3000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至反应罐中再次水解。
(7)去离子交换树脂(001×7(732)阳离子交换树脂；201×7(717)阴离子交换树脂)于水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸或10％NaOH对其进行处理，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用水清洗至微酸性或微碱性待用。
将步骤6中所得的油茶籽肽超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样。
(8)将滤液冷冻干燥，为油茶籽肽成品。
实施例二
(1)取油茶籽饼100g，用植物粉碎机粉碎，过80目筛，将筛下物在95％的正己烷溶剂中浸提脱脂，水浴加热溶剂温度为50℃，浸提2次，每次2h，浸提完成后晾晒至试剂完全挥发，待用；
(2)将步骤1的油茶籽饼粕溶解在1000mL水中，加热至50℃，用NaOH溶剂调节pH至8.0，不断搅拌15min，3000r/min离心15min，取上清液待用；
(3)将步骤2的上清液加热至70℃，用柠檬酸调节pH至5.0，不断搅拌15min，3000r/min离心15min，收集沉淀待用；
(4)将步骤3的油茶籽蛋白按1∶10加入去离子水，加热至90℃保持15min，然后冷却并保持溶液温度至45℃，用NaOH试剂调节并保持溶液pH为8.0，加入碱性蛋白酶Alcalase 75AU/Kg蛋白，在此条件下进行酶解，酶解时间为2h，在酶解过程中需不停搅拌；
(5)待酶解结束，迅速加热至90℃，保持15min，3000r/min离心15min，取上清液待用，为油茶籽肽粗制液；
(6)将步骤5中的油茶籽肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为3000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至反应罐中再次水解。
(7)去离子交换树脂于水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸或10％NaOH对其进行处理，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用水清洗至微酸性或微碱性待用。
将步骤6中所得的油茶籽肽超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样。
(8)将滤液喷雾干燥，为油茶籽肽成品。
实施例三
(1)取油茶籽饼100g，用植物粉碎机粉碎，过80目筛，将筛下物在95％的正己烷溶剂中浸提脱脂，水浴加热溶剂温度为50℃，浸提2次，每次2h，浸提完成后晾晒至试剂完全挥发，待用；
(2)将步骤1的油茶籽饼粕溶解在1000mL水中，加热至50℃，用NaOH溶剂调节pH至8.0，不断搅拌15min，3000r/min离心15min，取上清液待用；
(3)将步骤2的上清液加热至70℃，用柠檬酸调节pH至5.0，不断搅拌15min，3000r/min离心15min，收集沉淀待用；
(4)将步骤3的油茶籽蛋白按1∶10加入去离子水，加热至90℃保持15min，然后冷却并保持溶液温度至45℃，用NaOH试剂调节并保持溶液pH为8.0，加入碱性蛋白酶Alcalase 75AU/Kg蛋白，在此条件下进行酶解，酶解时间为2h，在酶解过程中需不停搅拌；
(5)待酶解结束，迅速加热至90℃，保持15min，3000r/min离心15min，取上清液待用，为油茶籽肽粗制液；
(6)将步骤5中的油茶籽肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为3000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至反应罐中再次水解。
(7)去离子交换树脂于水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸或10％NaOH对其进行处理，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用水清洗至微酸性或微碱性待用。
将步骤6中所得的油茶籽肽超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样。
(8)将滤液冷冻干燥，为油茶籽肽成品。
按本发明实施例方法制备的油茶籽肽，其产品包括如下特点：
(1)本方法制备的油茶籽肽为白色或淡黄色粉末，100％通过80目筛，无肉眼可见外来物质；
(2)本方法制备的油茶籽肽溶解度高，在所有的pH条件下都能溶于水，吸湿性和热稳定性强，起泡性和泡沫稳定性均较好；
(3)本方法制备的油茶籽肽产总氮含量(以干基计)≥95.0％，肽含量(以干基计)≥90.0％，所得的相对分子质量均在3000Da以下，相对分子质量1000Da以下的肽段含量≥80％，三氯乙酸氮溶解指数(TCA-NSI)≥95.0％，水分含量≤5.0％，灰分含量(以干基计)≤5.0％，粗脂肪含量(以干基计)≤1.0％；
(4)本方法制备的油茶籽肽具有良好的抗氧化、抗疲劳、降血压、提高机体免疫力等功能，能够广泛用于食品、医药等领域。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (7)
1.一种制备油茶籽多肽的方法，包括如下步骤：
(1)将油茶籽饼粕粉碎，并用溶剂去除饼粕的油脂；
(2)采用碱溶酸沉方法提取分离油茶籽饼粕里的蛋白；
(3)采用酶解方法将步骤(2)中的蛋白水解为多肽粗制液；
(4)用超滤膜过滤步骤(3)所得的多肽粗制液，收集超滤液；未透过超滤膜部分为浓缩液，将浓缩液回收至反应罐中再次水解并再次超滤，收集超滤液；
(5)超滤液在阴阳离子交换树脂洗脱，得油茶籽多肽液；
其中，所述的步骤(2)的方法为：
(a)将步骤(1)的去除油脂后的油茶籽饼粕按g/ml比为1∶5～1∶10的比例溶解至水中，加热至45～55℃，用碱调节pH至8.0～10.0，不停搅拌15min，之后再3000～4000r/min，15min，离心取上清液；
(b)将步骤a的上清液加热至70～90℃，用酸调节pH至3.0～5.0，不停搅拌15min，之后再3000～4000r/min，15min，离心收集沉淀。
2.如权利要求1所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于，步骤(5)之后，还包括步骤(6)：油茶籽多肽液经浓缩之后，喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。
3.如权利要求1所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于，所述的油茶籽饼粕为冷榨法制油后的油茶籽饼粕。
4.如权利要求1所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于：所述的步骤(1)的方法为：
将油茶籽饼粕碎，过40～120目筛，用95％正己烷溶剂在40～50℃条件下浸提2～3次，每次2～3h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，待用。
5.如权利要求1所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于，步骤(3)所述的方法为：
(a)将步骤(2)的沉淀按1∶10～1∶20的比例溶解至水中，加热至90～100℃，保持15～30min，然后冷却至40～50℃，用NaOH试剂调节并保持pH在7.5～9.0，加入碱性蛋白酶Alcalase 70～80AU/Kg蛋白，酶解2～4h，酶解过程中不断搅拌；
(b)待酶解结束后，迅速加热至90～95℃，并保持10～20min，之后3000～5000r/min，15min，离心取上清液，该上清液即为油茶籽多肽粗制液。
6.如权利要求5所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于，步骤(4)所述的方法为：
将步骤(3)中的油茶籽多肽粗制液注入储槽中，调节至一个固定的流速，溶液经微滤后通过分子量截留量为3000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至反应罐中再次水解。
7.如权利要求6所述的制备油茶籽多肽的方法，其特征在于，步骤(5)所述的方法为：
去离子交换树脂于水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸或10％NaOH对其进行处理，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用水清洗至微酸性或微碱性待用；
将步骤(4)中所得的油茶籽多肽超滤液，以5～10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈弱酸性时停止加样。
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