CN109021096A - 一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，包括如下步骤，（1）、选取原料；（2）、破壁；（3）、分离过滤；（4）、提取藻蓝蛋白；（5）、提取螺旋藻多糖，采用冷冻干燥或喷雾干燥对纯螺旋藻多糖溶液进行处理，得纯螺旋藻多糖精提物。本发明所涉及的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，将富含螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的成分进行分离，分别进行螺旋多糖和藻蓝蛋白的提取和纯化。提高了螺旋藻的利用率，降低了企业的生产成本，提高了企业的效益。

Description

一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺
技术领域
本发明涉及天然产物深加工技术领域，尤其是一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺。
背景技术
螺旋藻是微藻中的蓝藻，它具有高蛋白、低脂肪、低糖、低胆固醇的特点，含有多种维生素、蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和微量元素，而且各种比例科学合理，其中很多成分达到药物的含量和强度，使它的药用功 能十分广泛，在促进人体新陈代谢，提高机体免疫力，提高身体素质，抗辐射，辅助癌症放、化疗，降低放疗、化疗副作用等多方面都有积极作用，是一种理想的纯天然生物活性健康食品。因此被联合国粮农组织和联合国世界食品协会推荐为“二十一世纪最理想的食品”。
螺旋藻中的多糖可以增强骨髓细胞增殖活力、促进DNA修复合成作用，有 良好抗辐射功能和降低放疗、化疗副作用，对电离辐射损伤具有明显的防护效 果，能提高机体非特异性的细胞免疫功能，提高抵御病菌、病毒入侵的能力，促进胸腺、脾腺等免疫器官生长，促进免疫血清蛋白合成，消除免疫抑制剂对免疫系统的抑制作用。
藻蓝蛋白(PC)是一种普遍存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中的捕光色素蛋白，在螺旋藻中的含量高达7％～20％，在光合作用中能以近乎100％的高效率将光能优先传递给光系统。藻蓝蛋白不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义，而且可以作为荧光分子探针应用于生物医学研究，作为无毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成染料应用于食品、化妆品以及医药中。有研究表明，藻蓝蛋白具有抗肿瘤活性，可提高免疫机能，其特性受到了 国内外的重视，并已应用于老年痴呆症和帕金森症的治疗。
在常规的生产提取过程，螺旋藻多糖和藻蓝蛋白一般只会提取其中一种，另外一种会在提取过程中以杂质的方式放弃，造成了浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，能够在提取过程中将螺旋藻多糖和藻蓝蛋白分离进而分别进行提取，避免了资源的浪费，提高了企业的生产效益。
为解决上述技术问题，本发明的目的是这样实现的：
本发明所涉及的一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，包括如下步骤：
（1）、选取原料：选取干燥的螺旋藻粉作为原料；
（2）、破壁：将螺旋藻粉置入发酵罐中，加入15-25倍螺旋藻粉质量的无菌水，控制水温为50-70℃，使得螺旋藻细胞软化和扩张；再对其进行超声波对螺旋藻粉细胞壁进行预处理，再加入破壁酶对螺旋藻进行处理，得到螺旋细胞破碎液；
（3）、分离过滤：对经过步骤（2）处理后的螺旋藻粉进行离心过滤，获得的离心液为螺旋藻细胞破碎液一，沉淀为细胞碎片；
（4）、提取藻蓝蛋白：对步骤（3）中制得的螺旋藻细胞破碎液一采用盐析沉淀后离心，将上清液与步骤（3）所制得的细胞碎片混合，获得螺旋藻细胞破碎液二；
对盐析后的沉淀进行透析除盐，制得藻蓝蛋白粗提液一，对藻蓝蛋白粗提液一采用PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物；对藻蓝蛋白粗提物进行纯化，制备高纯度藻蓝蛋白；
（5）、提取螺旋藻多糖：对步骤（4）中所得到的细胞破碎液二加入改性剂，混合均匀后进行起临界萃取，去除螺旋藻细胞中的脂类成分，得到螺旋藻细胞破碎液三；再将螺旋藻细胞破碎液三加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液；再在过滤滤渣加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液；多次进行回流提取，采用苯酚-硫酸法检测提取液的多糖含量，至糖反应不明显，将每次的提取液合并，静置后取液体部分，得到螺旋藻多糖粗提取液；
对螺旋藻多糖提取液采用等电点法除蛋白，再进行离心处理，将上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液加入至超滤机中，选择0.5万以上分子量的过滤膜进行超滤，至超滤机出口无液体流出时，分别收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，并分别干燥，得到不同分子量范围的螺旋藻多糖粗提物；
采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取所述螺旋藻多糖粗提物中的螺旋藻多糖，分配平衡后取下相，透析除盐，蒸发浓缩，获得螺旋藻多糖溶液；
采用SephadexG-150柱和DEAESephadexA-50柱进一步纯化所述螺旋藻多糖溶液后，透析除盐，获得纯螺旋藻多糖溶液；
采用冷冻干燥或喷雾干燥对纯螺旋藻多糖溶液进行处理，得纯螺旋藻多糖精提物。
作为上述方案的进一步说明，步骤（2）中，超声波的功率为320W，处理时间为30min。
作为上述方案的进一步说明，步骤（2）中，所述的破壁酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合物，其中含有纤维素酶30-40%，含有半纤维素酶25-30%，余量果胶酶。
作为上述方案的进一步说明，步骤（4）中，采用硫酸铵溶液盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液，再对沉淀进行透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液一；将PEG20000和NaCl溶解至藻蓝蛋白粗提液一，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物；所述PEG20000-NaCl沉淀体系的组分为：w/v为20%的PEG20000和0.8mol/LNaCl；用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液二；采用PEG20000/Na2SO4双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液二，分配平衡、离心分相，取下相，透析除盐，制得藻蓝蛋白精提液；PEG20000/Na2SO4双水相体系的组分包含w/w为10.5%的PEG20000，w/w为5.9%的Na2SO4和0.2mol/LNaCl；采用冷冻干燥或喷雾干燥制得藻蓝蛋白精提物。
作为上述方案的进一步说明，螺旋藻细胞破碎液一采用的盐析沉淀，是采用硫酸氨溶液分级盐析沉淀的方法，为先将硫酸铵溶解至螺旋藻细胞破碎液至30%饱和度，4-10℃静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取上清，再向上清中溶解硫酸氨至50%饱和度，4-10℃静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取沉淀；透析除盐的步骤为将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中进行透析30-40h，换5-7次透析液。
作为上述方案的进一步说明，步骤（5）中所述的改性剂为无水乙醇，所述的提取溶剂为pH为8-9的氢氧化钠溶液，所使用的微滤膜孔径0.05-1.0μm，微滤膜厚度10-150μm。
作为上述方案的进一步说明，所述乙醇/硫酸铵双水相体系的组分为36.45%（w/w）乙醇和13.4%（w/w）硫酸铵，体系相比VR为2.5；所述萃取的具体步骤如下：25℃下分配平衡30min后，于分液漏斗中静置4h。
作为上述方案的进一步说明，步骤（5）中采用SephadexG-150柱纯化时，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液；采用DEAESephadexA-50柱纯化时前10管洗脱液为去离子水，后30管洗脱液为0～2mol/L的NaCl溶液。
作为上述方案的进一步说明，其特征在于，步骤（7）和步骤（8）中的所述透析在3500Da的透析袋中进行，具体透析步骤如下：先在流动自来水中透析24h，再在去离子水中透析12h，换4次透析液。
本发明的有益效果是：本发明所涉及的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，将富含螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的成分进行分离，分别进行螺旋多糖和藻蓝蛋白的提取和纯化。提高了螺旋藻的利用率，降低了企业的生产成本，提高了企业的效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例
本实施例所涉及的一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，包括如下步骤：选取原料、破壁、分离过滤、提取藻蓝蛋白和提取螺旋藻多糖。
步骤（1）为选取原料，选取干燥的螺旋藻粉作为原料。
步骤（2）为破壁，是将干燥的螺旋藻粉置入发酵罐中，加入15-25倍螺旋藻粉质量的无菌水，控制水温为50-70℃，使得螺旋藻细胞软化和扩张，优选为20倍螺旋藻粉质量的无菌水，水温为60℃，处理3-5小时。
再对其进行超声波对螺旋藻粉细胞壁进行预处理，再加入破壁酶对螺旋藻进行处理，得到螺旋细胞破碎液。在本实施例中所使用超声波的功率为320W，处理时间为30min。使得螺旋藻细胞的细胞壁得到预处理，为后续使用破壁酶对细胞壁进一步破坏打下基础，使用破壁酶处理的时间为10-15小时。本实施例中，破壁酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合物，其中含有纤维素酶30-40%，含有半纤维素酶25-30%，余量果胶酶。优选为，纤维素酶35%，半纤维素酶28%，余量为果胶酶。
步骤（3）为分离过滤。对经过步骤（2）处理后的螺旋藻粉进行离心过滤，获得的离心液为螺旋藻细胞破碎液一，沉淀为细胞碎片。在进行离心时，转速不大于10000转每分钟。
步骤（4）为提取藻蓝蛋白。对步骤（3）中制得的螺旋藻细胞破碎液一采用盐析沉淀后离心，将上清液与步骤（3）所制得的细胞碎片混合，获得螺旋藻细胞破碎液二。
螺旋藻细胞破碎液一采用的盐析沉淀，是采用硫酸氨溶液分级盐析沉淀的方法，为先将硫酸铵溶解至螺旋藻细胞破碎液至30%饱和度，4-10℃条件下静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取上清，再向上清中溶解硫酸氨至50%饱和度，4-10℃静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取沉淀。通过盐析沉淀操作，可有效除去螺旋藻粗多糖提取液中的绝大部分蛋白质成分，这为下步双水相富集提取螺旋藻多 糖创造了有利的低浓度溶液环境。
采用硫酸铵溶液盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液，再对沉淀进行透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液一。透析除盐的步骤为将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中进行透析30-40h，换5-7次透析液。
对藻蓝蛋白粗提液一采用PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物。将PEG20000和NaCl溶解至藻蓝蛋白粗提液一中，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物； PEG20000-NaCl沉淀体系的组分为：w/v为20%的PEG20000和0.8mol/LNaCl；
对藻蓝蛋白粗提物进行纯化，制备高纯度藻蓝蛋白。用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液二。采用PEG20000/Na2SO4双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液二，分配平衡、离心分相，取下相，透析除盐，制得藻蓝蛋白精提液；PEG20000/Na2SO4双水相体系的组分包含w/w为10.5%的PEG20000，w/w为5.9%的Na2SO4和0.2mol/LNaCl；采用冷冻干燥或喷雾干燥制得藻蓝蛋白精提物。
步骤（5）为提取螺旋藻多糖。对步骤（4）中所得到的细胞破碎液二加入改性剂，混合均匀后进行起临界萃取，去除螺旋藻细胞中的脂类成分，得到螺旋藻细胞破碎液三；再将螺旋藻细胞破碎液三加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液；再在过滤滤渣加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液。回流提取多次进行回流提取，采用苯酚-硫酸法检测提取液的多糖含量，至糖反应不明显，将每次的提取液合并，静置后取液体部分，得到螺旋藻多糖粗提取液。在本步骤中所使用的改性剂为无水乙醇，提取溶剂为pH为8-9的氢氧化钠溶液。
所加入的螺旋藻粉与无水乙醇的质量比为1：2-3。经混匀后在下列条件下进行超临界萃取：萃取压力为30MPa、萃取温度为45℃，CO2流体流量为16L/h，萃取时间为3小时，得到螺旋藻脂类成分（萃取物）和去除螺旋藻脂类成分的螺旋藻粉（萃余物），螺旋藻脂类成分可供加工其它产品。
螺旋藻细胞破碎液三在加入50-80%质量的提取溶剂（pH为8～9的NaOH溶液），经常规回流提取2h后，过滤得到提取液，再在滤渣中加入6倍质量的提取溶剂（pH为8～9的NaOH溶液），经常规回流提取1.5h后，过滤得到提取液。多次进行回流提取，合并提取液，并静置2h后取液体部分，得到螺旋藻多糖提取液。
对螺旋藻多糖提取液采用等电点法除蛋白，再进行离心处理，将上清液采用微孔滤膜进行过滤，所使用的微孔滤膜孔径0.05-1.0μm，微孔滤膜厚度10-150μm。
将经过微孔滤膜所得到的滤液加入至超滤机中，选择0.5万以上分子量的过滤膜进行超滤，至超滤机出口无液体流出时，分别收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，并分别干燥，得到不同分子量范围的螺旋藻多糖粗提物。本实施中可选用的0.5万、5万、10万分子量的过滤膜，即可使用小于该分子量的大分子经过过滤膜。作为优选，实施例中选作的为5万，可根据需要进行选择。若选用5万分子量的过滤膜，则小于5万分子量的螺旋藻多糖可通过过滤膜，随水从超滤机出口流出，大于5万分子量的螺旋藻多糖则位于超滤机内的浓缩液。可根据需要选择所需要的过滤膜。分别对超滤机流出液和超滤机内的浓缩液进行干燥，得到螺旋藻粗提物。
采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取所述螺旋藻多糖粗提物中的螺旋藻多糖，分配平衡后取下相，透析除盐，蒸发浓缩，获得螺旋藻多糖溶液。
采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取螺旋藻多糖溶液，双水相萃取条件为500g双水相体系，其中各组分质量分数分别为36.45％乙醇和13.4％硫酸 铵，体系相比VR为2.5，25℃下分配平衡30min后于分液漏斗中静置4h得到下相螺旋藻多糖 溶液，其中多糖粗提物中的硫酸铵含量经甲醛法测定。
下相螺旋藻多糖溶液透析除盐：将下相多糖溶液置于透析范围为3500Da的透析袋中透析36h，先在流动自来水中透析24h，再于去离子水中透析12h，换4次透析液。将透析除盐后的螺旋藻多糖溶液旋转蒸发浓缩至原体积1/5，6000rpm离心5min去除不溶物等杂质。
采用SephadexG-150柱和DEAESephadexA-50柱进一步纯化所述螺旋藻多糖溶液后，透析除盐，获得纯螺旋藻多糖溶液。中采用SephadexG-150柱纯化时，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液；采用DEAESephadexA-50柱纯化时前10管洗脱液为去离子水，后30管洗脱液为0～2mol/L的NaCl溶液。
采用冷冻干燥或喷雾干燥对纯螺旋藻多糖溶液进行处理，得纯螺旋藻多糖精提物。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、选取原料：选取干燥的螺旋藻粉作为原料；
（2）、破壁：将螺旋藻粉置入发酵罐中，加入15-25倍螺旋藻粉质量的无菌水，控制水温为50-70℃，使得螺旋藻细胞软化和扩张；再对其进行超声波对螺旋藻粉细胞壁进行预处理，再加入破壁酶对螺旋藻进行处理，得到螺旋细胞破碎液；
（3）、分离过滤：对经过步骤（2）处理后的螺旋藻粉进行离心过滤，获得的离心液为螺旋藻细胞破碎液一，沉淀为细胞碎片；
（4）、提取藻蓝蛋白：对步骤（3）中制得的螺旋藻细胞破碎液一采用盐析沉淀后离心，将上清液与步骤（3）所制得的细胞碎片混合，获得螺旋藻细胞破碎液二；
对盐析后的沉淀进行透析除盐，制得藻蓝蛋白粗提液一，对藻蓝蛋白粗提液一采用PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物；对藻蓝蛋白粗提物进行纯化，制备高纯度藻蓝蛋白；
（5）、提取螺旋藻多糖：对步骤（4）中所得到的细胞破碎液二加入改性剂，混合均匀后进行起临界萃取，去除螺旋藻细胞中的脂类成分，得到螺旋藻细胞破碎液三；再将螺旋藻细胞破碎液三加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液；再在过滤滤渣加入提取溶剂，经回流提取，过滤得到提取液；多次进行回流提取，采用苯酚-硫酸法检测提取液的多糖含量，至糖反应不明显，将每次的提取液合并，静置后取液体部分，得到螺旋藻多糖粗提取液；
对螺旋藻多糖提取液采用等电点法除蛋白，再进行离心处理，将上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液加入至超滤机中，选择0.5万以上分子量的过滤膜进行超滤，至超滤机出口无液体流出时，分别收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，并分别干燥，得到不同分子量范围的螺旋藻多糖粗提物；
采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取所述螺旋藻多糖粗提物中的螺旋藻多糖，分配平衡后取下相，透析除盐，蒸发浓缩，获得螺旋藻多糖溶液；
采用SephadexG-150柱和DEAESephadexA-50柱进一步纯化所述螺旋藻多糖溶液后，透析除盐，获得纯螺旋藻多糖溶液；
采用冷冻干燥或喷雾干燥对纯螺旋藻多糖溶液进行处理，得纯螺旋藻多糖精提物。
2.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（2）中，超声波的功率为320W，处理时间为30min。
3.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（2）中，所述的破壁酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合物，其中含有纤维素酶30-40%，含有半纤维素酶25-30%，余量果胶酶。
4.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（4）中，采用硫酸铵溶液盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液，再对沉淀进行透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液一；将PEG20000和NaCl溶解至藻蓝蛋白粗提液一，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物；所述PEG20000-NaCl沉淀体系的组分为：w/v为20%的PEG20000和0.8mol/LNaCl；用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液二；采用PEG20000/Na2SO4双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液二，分配平衡、离心分相，取下相，透析除盐，制得藻蓝蛋白精提液；PEG20000/Na2SO4双水相体系的组分包含w/w为10.5%的PEG20000，w/w为5.9%的Na2SO4和0.2mol/LNaCl；采用冷冻干燥或喷雾干燥制得藻蓝蛋白精提物。
5.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，螺旋藻细胞破碎液一采用的盐析沉淀，是采用硫酸氨溶液分级盐析沉淀的方法，为先将硫酸铵溶解至螺旋藻细胞破碎液至30%饱和度，4-10℃静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取上清，再向上清中溶解硫酸氨至50%饱和度，4-10℃静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取沉淀；透析除盐的步骤为将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中进行透析30-40h，换5-7次透析液。
6.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（5）中所述的改性剂为无水乙醇，所述的提取溶剂为pH为8-9的氢氧化钠溶液，所使用的微孔滤膜孔径0.05-1.0μm，微孔滤膜厚度10-150μm。
7.如权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，所述乙醇/硫酸铵双水相体系的组分为36.45%（w/w）乙醇和13.4%（w/w）硫酸铵，体系相比VR为2.5；所述萃取的具体步骤如下：25℃下分配平衡30min后，于分液漏斗中静置4h。
8.根据权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（5）中采用SephadexG-150柱纯化时，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液；采用DEAESephadexA-50柱纯化时前10管洗脱液为去离子水，后30管洗脱液为0～2mol/L的NaCl溶液。
9.根据权利要求1所述的螺旋藻多糖和藻蓝蛋白的分离提取纯化工艺，其特征在于，步骤（7）和步骤（8）中的所述透析在3500Da的透析袋中进行，具体透析步骤如下：先在流动自来水中透析24h，再在去离子水中透析12h，换4次透析液。
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