CN104311685A

CN104311685A - 一种螺旋藻多糖及其提取方法

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Publication number: CN104311685A
Application number: CN201410564398.1A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 李瑞昌; 颜晓琳; 肖湘
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2014-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-10-21
Also published as: CN104311685B

Abstract

本发明涉及一种螺旋藻多糖及其提取方法，包括以下步骤：将螺旋藻粉悬浊液反复冻融破壁后，离心获得细胞破碎液1和细胞碎片；在细胞破碎液1中加入硫酸铵至其饱和度为50％，盐析沉淀后，离心去除藻胆蛋白，获得上清液，将上清液与细胞碎片混匀，获得细胞破碎液2；采用热水浸提法获取螺旋藻多糖粗提物；将粗提物加入到乙醇/硫酸铵双水相体系中萃取，获得具有较高纯度的螺旋藻多糖的下相溶液；下相溶液经透析除盐后，用Sephadex G-150层析柱和DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱洗脱，获得纯螺旋藻多糖溶液；冷冻干燥后，制备成纯螺旋藻多糖成品。本提取方法可以避免传统去除蛋白的繁琐操作步骤，成本低，收率高，且多糖纯度和活性高，适用于间歇性和规模化生产加工。

Description

一种螺旋藻多糖及其提取方法

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，尤其涉及一种螺旋藻多糖及其提取方法。

背景技术

螺旋藻中包含多种生物活性物质，其中的螺旋藻多糖(含量约为2.0％～3.0％)是一种水溶性的酸性杂多糖，是从螺旋藻藻体、螺旋藻培养液中提取分离出来的一类呈白色粉末状的生物活性物质。螺旋藻多糖是螺旋藻中除藻胆蛋白外的另一种具有抗肿瘤、抗辐射、抗突变功能的生物活性物质，能够提高机体细胞和体液免疫功能，抵制癌细胞增殖，减轻辐射所引起的遗传损伤等；可用于防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面。但因传统热水浸提法分离纯化螺旋藻多糖中去除蛋白时需要消耗大量的有机溶剂，并且操作步骤繁琐，同时对多糖活性也有一定程度的损害，进一步的柱层析纯化多糖更是产量有限，使得螺旋藻多糖分离纯化难以工业化生产。目前，我国螺旋藻产业化生产已获得成功，其生产和发展过程中的突出问题是：螺旋藻深加工产品处于初级阶段，国内关于螺旋藻多糖提取与纯化技术多停留在实验室研究阶段，应用于生产实践较少。

目前，螺旋藻多糖的分离纯化通常采用Sevage法、TCA或者酶解法去除其中的蛋白，然后通过葡聚糖凝胶柱层析和阴离子交换柱得到纯多糖。Sevage法是去蛋白质的经典方法,但通常只适用于除少量蛋白,而且必须重复多次；TCA法去蛋白能缩短流程，多糖损失率降低，有利于后继纯化，但多糖活性损失严重；用酶法降解蛋白质能提高多糖粗产品的得率，但所得成分中仍有较多的蛋白质。

而且，这些去除蛋白方法所用的有机溶剂具有一定毒性，在去除蛋白的过程中会在一定程度上降低多糖的活性，且操作繁琐费事；而进一步纯化螺旋藻多糖所用的层析柱每次得到的多糖量有限，此外，层析柱的填充介质也存在价格昂贵、可使用次数有限等缺陷，限制了螺旋藻多糖工业化分离纯化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种操作简单、成本低、得率高的螺旋藻多糖的提取方法。

本发明的目的是通过下述技术方案完成的：

(1)将螺旋藻粉溶解于磷酸盐缓冲液中，获得螺旋藻粉悬浊液；

(2)反复冻融所述螺旋藻粉悬浊液，使螺旋藻细胞破壁后离心，上清液为螺旋藻细胞破碎液1，沉淀为细胞碎片；

(3)在所述螺旋藻细胞破碎液1中加入硫酸铵，盐析沉淀藻胆蛋白后离心，将上清液与步骤(2)中获得的所述细胞碎片混合，获得螺旋藻细胞破碎液2；

(4)热水浸提所述螺旋藻细胞破碎液2，离心，获得螺旋藻多糖粗提物；

(5)采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取所述螺旋藻多糖粗提物中的螺旋藻多糖，分配平衡后取下相，获得螺旋藻多糖溶液；

(6)采用Sephadex G-150柱和DEAE Sephadex A-50柱进一步纯化所述螺旋藻多糖溶液后，透析除盐，蒸发浓缩，获得纯螺旋藻多糖溶液；

(7)冷冻干燥所述纯螺旋藻多糖溶液，获得纯螺旋藻多糖成品。

现有技术中，在螺旋藻多糖粗提过程中多数采用三氯乙酸沉淀蛋白质，但是其最适宜的用量还需要在实验中不断确定，三氯乙酸使用过量或者不足，会导致蛋白质不能完全沉淀，同时影响多糖纯度及提取率，如果三氯乙酸过量，而有机溶剂的浪费会污染到环境，另外，溶液的提取过程中提取次数的多少也关系到能否将多糖充分溶解。本发明方法对螺旋藻多糖提取工艺进行了优化，采用硫酸铵盐析结合双水相萃取技术来去除多糖中的蛋白质，具有分离操作简单、条件温和、活性损失小且不存在有机溶剂残留等优点

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(1)中螺旋藻粉与磷酸盐缓冲液混合时的W/V为1:50，W/V为重量/体积比，其表示的比例关系是，例如，每1g螺旋藻粉对应50mL磷酸盐缓冲液。优选地，所述磷酸盐缓冲液PBS为0.01mol/L，pH为7。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(2)反复冻融的具体步骤如下：将所述螺旋藻粉悬浊液于4℃静置4h后，放于-20℃冰冻3h，然后采用机械方法将冰冻后的冰块破碎，如此反复三次；步骤(2)中离心转速为6000rpm/min，离心时间为20min。离心速度虽然在概念上和操作上比较简单，前人很少提到对它的研究，但对于能源短缺的今天来说，这个问题非常重要，因为它关系到我们在生产中对能生产成本的降低。因此，发明人实验了一系列不同的离心速度，发现去蛋白离心和沉淀多糖离心过程的理想速度为6000rpm，这样不仅降低了因高速离心耗费的能源，而且减轻了工作人员和机器的工作负荷，提高了工作效率。另外，发明人发现在未达到最佳离心速度前，上清液中可明显看出未沉淀完全，上清液呈混浊状，不清澈，不透明，并且沉淀软且易被冲起。当达到最佳速度后，上清液基本澄清，沉淀硬而不易被冲起。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(3)中加入硫酸铵的量为至其饱和度的50％；盐析温度为4℃，盐析时间为12h；离心转速为9000rpm/min，离心时间为30min。本发明通过正交试验，发现硫酸铵浓度、提取时间、提取温度均对多糖提取率有很大影响，最终确定出提取多糖的最佳浓度、时间和温度。在本实施方式中，采用硫酸铵进行藻胆蛋白盐析初步沉淀，被初步沉淀的蛋白还可复性利用，有利于资源的高效利用。本发明中采用甲醛法测定硫酸铵的浓度。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(4)热水浸提的具体操作如下：将所述螺旋藻细胞破碎液2置于80℃恒温水浴锅中提取4h，并不断搅拌，提取完成后冷却至室温；步骤(4)中离心转速为6000rpm/min，离心时间为20min。通过盐析沉淀和热水浸提两步操作，可有效除去螺旋藻粗多糖提取液中的绝大部分蛋白质成分，这为下步双水相富集提取螺旋藻多糖创造了有利的低浓度溶液环境。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(5)中所述乙醇/硫酸铵双水相体系的组分为36.45％(w/w)乙醇和13.4％(w/w)硫酸铵，体系相比V_R为2.5；所述萃取的具体步骤如下：25℃下分配平衡30min后，于分液漏斗中静置4h。本发明采用乙醇/硫酸铵这种廉价的双水相体系分离提取螺旋藻多糖，对不同萃取条件下多糖在双水相体系中的分配情况进行研究，最终建立乙醇/硫酸铵双水相体系萃取分离多糖的最佳工艺条件。根据化学滴定法测定的硫酸根浓度推算出螺旋藻粗多糖溶液中硫酸铵的浓度，再根据乙醇/硫酸铵双水相相图配制相应的乙醇和硫酸铵浓度，以获得双水相萃取所需的组分浓度和成相相比。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(6)中采用Sephadex G-150柱纯化时，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液；采用DEAE Sephadex A-50柱纯化时前10管洗脱液为去离子水，后30管洗脱液为0～2mol/L的NaCl溶液。与其他的化学方法相比，本实施例中的离子交换方法不容易引起分子结构的变化并且分离条件相对温和。

作为对上述技术方案的进一步改进，步骤(6)和步骤(7)中的所述透析在3500Da的透析袋中进行，具体透析步骤如下：先在流动自来水中透析24h，再在去离子水中透析12h，换4次透析液。

本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的螺旋藻多糖溶液。

本发明的再一目的在于提供一种采用上述方法制备的纯螺旋藻多糖成品。本发明制得的螺旋藻纯多糖成品中，螺旋藻多糖与螺旋藻藻粉的比得率为22.38mg/g。本发明所得螺旋藻多糖溶液能够很好的保持螺旋藻多糖抗氧化活性，对DPPH自由基、羟自由基(-OH)的清除率随着螺旋藻多糖浓度的增加而显著增加，制得的螺旋藻多糖溶液的DPPH半清除率IC₅₀＝0.199mg/mL；羟自由基半清除率IC₅₀＝0.45mg/mL；超氧阴离子半清除率为IC₅₀＝1.5mg/mL。

本发明的螺旋藻多糖提取方法具有的优点：

(1)本发明依次采用硫酸铵盐析，乙醇/硫酸铵双水相萃取和透析除盐方法纯化螺旋藻多糖，避免了传统层析技术的成本高、收率低(<1.5％藻蓝蛋白/藻粉)等弊端，提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的螺旋藻多糖成品。

(2)本发明制得的螺旋藻多糖粗提物可于4℃下保存30多天不变性，可用于螺旋藻多糖的贮存，使具有抗氧化活性的螺旋藻多糖长时间贮存。

(3)本发明制得的螺旋藻多糖溶液纯度高、具有良好的抗氧化清除自由基效果，将本发明不同步骤所得的螺旋藻多糖实施相关抗氧化活性的测定，均未随提取步骤的增加而明显损失。

附图说明

图1是本发明的螺旋藻多糖提取工艺一个具体实施例的流程图。

图2是本发明实施例不同提取过程中螺旋藻多糖的纯度和蛋白残留；从左到右依次是细胞破碎液1、盐析后上清液、螺旋藻多糖粗提物、螺旋藻多糖溶液和层析过柱后纯多糖溶液。

图3是本发明实施例螺旋藻多糖提取过程中不同时期样品外观图；其中，(a)螺旋藻多糖细胞破碎液1；(b)螺旋藻多糖溶液；(c)为层析过柱后螺旋藻多糖纯品。

图4是本发明实施例中螺旋藻多糖溶液依次加入层析柱时洗脱曲线，(a)是螺旋藻多糖溶液加入Sephadex G-150洗脱曲线；(b)为加入SephadexG-150最大峰处多糖溶液经柱DEAE Sephadex A-50时洗脱曲线。

图5是本发明实施例螺旋藻多糖溶液2抗氧化活性效果图，其中，(a)从左到右依次为Vc、螺旋藻多糖溶液和螺旋藻纯多糖溶液对DPPH自由基的清除率；(b)从左到右依次为Vc、螺旋藻多糖溶液2和螺旋藻多糖纯品对羟自由基的清除率；(c)为螺旋藻多糖溶液2和螺旋藻多糖纯品对超氧阴离子的清除率。

图6是本发明实施例中螺旋藻多糖红外光谱图，其中一条线为螺旋藻多糖溶液冷冻干燥后测定；另一条线为经过柱层析后纯多糖成品测定。

具体实施方式

实施例1

制备螺旋藻多糖提取物

本实施例中制备螺旋藻多糖提取物的具体流程如图1所示。

(1)制备螺旋藻粉悬浊液：称取8g钝顶螺旋藻藻粉溶解于400mL磷酸盐缓冲液中(0.01mol/L，pH＝7)，制得螺旋藻粉悬浊液。

(2)制备螺旋藻细胞破碎液1：将螺旋藻粉悬浊液置于4℃下静置4h后放于-20℃冰冻3h，将冰块绞碎，再次4℃下静置4h后放于-20℃冰冻3h，将冰块绞碎，如此反复三次，6000rpm离心20min，制得螺旋藻细胞破碎液1和细胞碎片；

(3)制备螺旋藻细胞破碎液2：向螺旋藻细胞破碎液1中加入硫酸铵固体至其饱和度为50％，使用磁力搅拌器搅拌使之完全溶解后于4℃静置12h，9000rpm离心30min得到上清液和藻胆蛋白，将上清液与步骤(2)中的细胞碎片混匀溶解，制得螺旋藻细胞破碎液2；

(4)制备螺旋藻多糖粗提物：将螺旋藻细胞破碎液2置于80℃恒温水浴锅中热水浸提4h，并用混匀器不断搅拌，取出放至室温后6000rpm离心20min，制得螺旋藻多糖粗提物。

(5)制备螺旋藻多糖溶液：采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取螺旋藻多糖溶液1，双水相萃取条件为500g双水相体系，其中各组分质量分数分别为36.45％乙醇和13.4％硫酸铵，体系相比V_R为2.5，25℃下分配平衡30min后于分液漏斗中静置4h得到下相螺旋藻多糖溶液，其中多糖粗提物中的硫酸铵含量经甲醛法测定。

下相螺旋藻多糖溶液透析除盐：将下相多糖溶液置于透析范围为3500Da的透析袋中透析36h，先在流动自来水中透析24h，再于去离子水中透析12h，换4次透析液。将透析除盐后的螺旋藻多糖溶液旋转蒸发浓缩至原体积1/5，6000rpm离心5min去除不溶物等杂质。

(6)制备纯多糖溶液：采用Sephadex G-150和DEAE Sephadex A-50进一步纯化螺旋藻多糖液2，制得螺旋藻纯多糖溶液。将螺旋藻多糖溶液依次加入Sephadex G-150柱，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液，苯酚硫酸法测定洗脱曲线获得最高峰处多糖溶液再次加入DEAE Sephadex A-50柱，前10管洗脱液为去离子水，后30管为0～2mol/L的NaCl溶液，同样苯酚硫酸法测定洗脱曲线并收集最大峰处多糖透析除盐后，旋转蒸发浓缩得到纯多糖溶液。

(7)冷冻干燥制得白色粉末状螺旋藻纯多糖成品。

计算公式如下：

式中：m_多糖为纯多糖成品或者螺旋藻多糖溶液冷冻干燥后质量；m_藻粉为相应的螺旋藻粉量；m_蛋白为获得的多糖样品中用考马斯亮蓝法测定的蛋白量。图2显示了不同提取过程中螺旋藻多糖的纯度和蛋白残留，由图2可以经柱层析后，多糖的纯度极高。最终结果显示该方法获得纯多糖成品得率为1.168％，纯度为98.85％；经过该方法获得的螺旋藻多糖溶液得率为2.274％，纯度为97.15％，而传统方法过柱得到的螺旋藻多糖纯品得率仅为1.132％，纯度仅为92.5％。图3显示提取不同时期样品外观图，可以看出经柱层析后制得的多糖成品为纯白色，颜色均一，无杂质。图4是螺旋藻多糖溶液依次加入层析柱时洗脱曲线，可以看出在洗脱体积为40时，吸收峰达到最大。

实施例2

抗氧化活性测定指标评定

本实施例中样品溶液为不同提取步骤中的多糖提取液。

DPPH体系：参考Capek.P等方法以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，测定DPPH自由基清除率。将样品或Vc溶于水中分别配制成6个梯度的样品或Vc溶液(20、40、80、160、320、640μg/mL)。根据表1，在试管中依次加入2mL上述溶液(空白管不加)、2mL DPPH溶液(本底管不加)，各管用蒸馏水补足至4mL，振荡器混匀，室温静置30min，在517nm处以蒸馏水调零测定吸光度，计算公式为：

式中：V_DPPH为未加入样品或Vc的DPPH溶液的吸光度；A_实验为DPPH溶液加入样品或Vc后的吸光度；A_本底为未加入DPPH的样品溶液的吸光度。

表1DPPH自由基清除率测定

Feton体系：以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，测定羟自由基清除能力。将样品或Vc溶于水中分别配制成6个梯度的样品或Vc溶液(20、40、80、160、320、640μg/mL)。根据表2，在试管中依次加入1mL上述溶液(空白管不加)，1mL 2mmol/L的FeSO₄溶液，1mL 6mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，最后在各管加1mL 6mmol/L的H₂O₂启动反应(本底管不加)，各管用蒸馏水补足至4mL，振荡器混匀，37℃水浴保温置30min，在510nm处以蒸馏水调零测定吸光度，计算公式如下：

式中：A_空白为未加入样品或VC溶液的吸光度；A_实验为加入样品或Vc溶液的吸光度；A_本底为未加入6mmol/L的H₂O₂启动反应的溶液的吸光度。

表2羟自由基清除能力的测定

邻苯三酚自氧化速率的测定：取4.5mL pH 8.250mmol/L Tris-HCl缓冲液、1mL去离子水、1mL 60％的乙醇于试管中，加入10μL 45mmol/L邻苯三酚(加入的同时要计时)，混匀后立即倒入1cm光径比色杯中，在紫外可见分光光度计上测定325nm下吸光值，1分钟时开始读数，继续反应1分钟读数。(通过调整邻苯三酚的量来使自氧化速率要接近0.07/min)

式中：A_{邻苯三酚自氧化速率}为未加入样品或VC溶液的吸光度变化值；A_加样后自 _氧化速率为加入样品或Vc溶液的吸光度变化值。

如图5所示，由不同处理过程得到的螺旋藻多糖能够较好的保持其抗氧化活性，均随着浓度的增加而增加；其中，

(a)从左到右依次为Vc、螺旋藻多糖溶液和螺旋藻纯多糖溶液对DPPH清除率；Vc与样品均为“S”型清除率曲线，但Vc的IC₅₀约为0.35μg/mL，而IC₅₀约为199μg/mL，螺旋藻纯多糖溶液IC₅₀约为201μg/mL，即螺旋藻多糖溶液DPPH清除活性为Vc的0.176％，螺旋藻纯多糖溶液活性为Vc的0.174％；

(b)Vc的IC₅₀约为8.35μg/mL，而螺旋藻多糖溶液IC₅₀约为450μg/mL，螺旋藻纯多糖溶液IC₅₀约为426μg/mL，即螺旋藻多糖溶液羟自由基清除活性为Vc的1.856％，螺旋藻纯多糖溶液羟自由基清除活性为Vc的1.96％；

(c)样品浓度为1.4mg/mL时，螺旋藻多糖溶液自由基清除率为41.35％，螺旋藻多糖纯品为54.33％。

实施例3

红外光谱图测定结构

红外光谱图测定：将得到的下相螺旋藻多糖和过柱后的螺旋藻多糖溶液透析除盐后冷冻干燥，获得螺旋藻多糖粉末。用KBr压片，用红外光谱仪在400-4000cm^-1范围扫描。

螺旋藻多糖溶液过Sephadex G-150凝胶柱层析步骤：

(1)预处理：称取Sephadex G-150约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2)装柱：凝胶层析柱的直径与柱长为1.6×40cm。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的尼龙布垫底。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2-3h即可加样品分离。

(3)加样：加样前先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止。然后由柱的上端加水解液2mL，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2-3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4)洗脱与收集：洗脱时，用0.1M NaCl溶液作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。流速控制在1.2ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3.6ml，共收集40管。然后采用苯酚硫酸法测定洗脱曲线，并收集最高峰处多糖溶液浓缩备用。

DEAE Sephadex A-50预处理：称取5g DEAE Sephadex A-50悬浮于500mL蒸馏水中，浸泡1h后倾去上层细粒，按1:15的比例加入0.5M NaOH浸泡30min，抽虑，用蒸馏水洗至pH＝7，再以0.5M HCl重复上述过程。装柱过程同上，加样前先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止，然后加入5mL多糖溶液，吸附5min后前10管洗脱液为去离子水，后30管为0～2mol/L的NaCl溶液，同样苯酚硫酸法测定洗脱峰并收集该峰处多糖透析除盐后旋转蒸发后浓缩得到精多糖溶液。

如图6所示，螺旋藻多糖溶液2粉末和螺旋藻多糖纯品粉末所得红外图谱极为相似：3412.94cm^-1表示有-OH的O-H键，存在着分子间和分子内的氢键；2067.88cm^-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰；1620.70cm^-1处的吸收峰是芳环C＝C吸收峰，1400.60cm^-1处的吸收峰是＝CH₂的变形吸收峰，提示该多糖可能有糖醛酸基团；1142.53cm^-1为吡喃环特征峰，是其糖苷键C-O-C的非对称振动峰；说明该纯化后多糖可能为酸性糖蛋白。

以上实施例旨在说明本发明的内容，不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的工艺、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Claims

1.一种螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(5)采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取所述螺旋藻多糖粗提物中的螺旋藻多糖，分配平衡后取下相，透析除盐，蒸发浓缩，获得螺旋藻多糖溶液；

(6)采用Sephadex G-150柱和DEAE Sephadex A-50柱进一步纯化所述螺旋藻多糖溶液后，透析除盐，获得纯螺旋藻多糖溶液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中螺旋藻粉与磷酸盐缓冲液混合时的W/V为1:50。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)反复冻融的具体步骤如下：将所述螺旋藻粉悬浊液于4℃静置4h后，放于-20℃冰冻3h，然后采用机械方法将冰冻后的冰块破碎，如此反复三次；步骤(2)中离心转速为6000rpm/min，离心时间为20min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入硫酸铵的量为至其饱和度的50％；盐析温度为4℃，盐析时间为12h；步骤(3)中离心转速为9000rpm/min，离心时间为30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)热水浸提的具体操作如下：将所述螺旋藻细胞破碎液2置于80℃恒温水浴锅中提取4h，并不断搅拌，提取完成后冷却至室温；步骤(4)中离心转速为6000rpm/min，离心时间为20min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述乙醇/硫酸铵双水相体系的组分为36.45％(w/w)乙醇和13.4％(w/w)硫酸铵，体系相比V_R为2.5；所述萃取的具体步骤如下：25℃下分配平衡30min后，于分液漏斗中静置4h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中采用SephadexG-150柱纯化时，洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液；采用DEAE Sephadex A-50柱纯化时前10管洗脱液为去离子水，后30管洗脱液为0～2mol/L的NaCl溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)和步骤(7)中的所述透析在3500Da的透析袋中进行，具体透析步骤如下：先在流动自来水中透析24h，再在去离子水中透析12h，换4次透析液。

9.一种采用权利要求1～5任一项所述方法制备的螺旋藻多糖溶液。

10.一种采用权利要求1～8任一项所述方法制备的纯螺旋藻多糖成品。