CN105294870B

CN105294870B - 一种螺旋藻多糖及其制备方法

Info

Publication number: CN105294870B
Application number: CN201510312393.4A
Authority: CN
Inventors: 谭道鹏; 冯贻东; 于琳; 王春宴; 曾伟珍
Original assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: CN105294870A

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的螺旋藻多糖及其制备方法。该螺旋藻多糖衍生物由D‑葡萄糖醛酸、D‑乙酰氨基半乳糖、L‑岩藻糖和半乳糖四种单糖组成，分子量为5000～18000Da，本发明提取的单一螺旋藻多糖对肿瘤细胞有显著的抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种螺旋藻多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于天然药物提取制备领域，更具体涉及一种螺旋藻多糖及其制备方法。

背景技术

螺旋藻是蓝藻纲，颤藻科的一类低等生物，原核生物，由单细胞或多细胞组成的丝状体，体长200-500μm，宽5-10μm，圆柱形，呈疏松或紧密的有规则的螺旋旋形弯曲，形如钟表发条，故而得名。螺旋藻具有降低胆固醇、调节血糖、增强免疫力、保护肠胃功能、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗辐射等多种功能。

螺旋藻营养成分的特点是蛋白质含量高达60％-70％，而脂肪、纤维素含量低,并且还含有种类繁多的维生素,它是维生素B12和β-胡萝卜素含量最高的食品.此外,它还是所有食物中可吸收性铁质含量最高的,同时还发现它含有具有防癌、治癌作用的藻类蛋白,以及其他大量矿质元素和提高机体免疫力的生物活性物质。

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。由同一种类型的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成，在化学结构上实属多种多样。就分子量而论，有从0.5万个分子组成的到超过106个的多糖。

螺旋藻多糖是螺旋藻藻体中碳水化合物的主要存在形式，含量高达干重的14％～16％。螺旋藻多糖具有抗辐射损伤和改善放、化疗引起的副反应作用、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、增强免疫力等多种功能。有关螺旋藻多糖的报道已有很多文献，但大多局限于粗多糖，目前，并没有文献就螺旋藻中单一多糖的提取和应用进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的螺旋藻单一多糖及其制备方法，该螺旋藻多糖具有很好的抗肿瘤活性，具有重要的临床治疗和预防肿瘤疾病的应用价值。

为实现上述发明目的，本发明提供一种螺旋藻多糖，由D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA)、D-乙酰氨基半乳糖(GalN)、L-岩藻糖(L-Fuc)和半乳糖(Gal)四种单糖组成，以摩尔比计，四种组成单糖比例为：3.5～4.5:3.5～4.5:1.7～2.3:1，优选4:4:2:1；所述的螺旋藻多糖的重均分子量范围为：5000～18000Da；该螺旋藻多糖以其碱金属、碱土金属盐的形式存在，优选钠盐、钾盐或钙盐。

进一步的，所述的螺旋藻多糖由1个硫酸软骨素E和7个其它非硫酸化软骨素及单硫酸化软骨素组成的主链，和以α-1，3-糖苷键连接4个L-岩藻糖硫酸酯形成侧链，末端以α-1，3-糖苷键连接2个半乳糖；

具体的，主链是以D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯以β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键链接形成[-4GlcAβ1→3GalNAc4S/6Sβ1-]硫酸软骨素二糖结构单元，所述螺旋藻多糖结构如下：

本发明还提供了一种上螺旋藻多糖的制备方法，按以下步骤进行：

1)取螺旋藻适量，加入10～30倍重量体积比的0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调pH值为2～3；离心处理得上清液；将上清液浓缩到约螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖；

2)向螺旋藻粗多糖中加20～40倍重量体积比的水溶解；在35℃水浴下，分别加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc(乙酸钠)；4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加1～3L 10％H2O2；待反应终止后，进行超滤处理，得到螺旋藻纯多糖。

作为优选方案，所述的螺旋藻多糖的制备方法按以下步骤进行：

1)取螺旋藻适量，加入20倍重量体积比的0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调pH值为2.5；离心处理得上清液；将上清液浓缩到约螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95％食用乙醇，静置10小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖；

2)向螺旋藻粗多糖中加30倍重量体积比的水溶解；35℃水浴，分别加入0.5mol/LNaCl、0.5mol/L NaAc；4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加2L 10％H2O2；待反应终止后，进行超滤处理，得到螺旋藻纯多糖。

本发明中的螺旋藻多糖具有抑制人肝癌细胞增殖的作用，显示该螺旋藻多糖具有治疗和预防肿瘤的潜在应用价值，可以用于抗肿瘤的治疗。

另外，本发明的螺旋藻多糖或其盐可以与药学上可接受的辅料形成药用组合物用于抗肿瘤治疗。

以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。

附图说明

图1本发明中螺旋藻多糖HPGPC色谱图

图2本发明中螺旋藻多糖红外吸收图谱

图3本发明中螺旋藻多糖1H-NMR图

图4本发明中螺旋藻多糖13C-NMR图

具体实施方式

为更好地理解本发明的本质，下面通过对本发明较佳实施方式的进行描述，详细说明本发明但不限制本发明。

以下实施例中使用的材料和试剂，除特殊说明，均为普通市售。

实施例1：一种螺旋藻多糖的制备方法，具体为：

取螺旋藻2Kg，加入40L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值为2.5；离心处理得上清液。上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置10小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖300g。

取上述螺旋藻粗多糖200g，加水6L溶解；在35℃水浴下，加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc；4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加2L 10％H2O2；待反应4小时，反应完成后，通过超滤处理，得到螺旋藻均一多糖150g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为13500Da。

实施例2：一种螺旋藻多糖的制备方法，具体为：

取螺旋藻2Kg，加入20L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值至2；离心处理得上清液。将上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置11小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖270g。

取上述螺旋藻粗多糖200g，加水4L溶解；在35℃水浴下，加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc；4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加1L 10％H2O2；反应4小时，待反应结束后，进行超滤处理，得到螺旋藻均一多糖143g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为17600Da。

实施例3：一种螺旋藻多糖的制备方法，具体为：

取螺旋藻2Kg，加入60L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值为3；离心得上清液。将上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置12小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖313g。

取上述螺旋藻粗多糖200g，加水8L溶解；在35℃水浴下，加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc；4.0mmol/L乙酸；匀速滴加3L 10％H2O2；反应4小时，待反应终止后，进行超滤处理，得到螺旋藻均一多糖144g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为9500Da。

实施例4：螺旋藻多糖对人肝癌细胞Be17402细胞增殖的抑制作用的应用，具体为：

将人肝癌细胞Be17402细胞复苏，培养瓶传代培养，待细胞生长到对数生长期，消化细胞制成细胞悬液，用0.4％的台盼蓝染色，计数。

取对数生长期的细胞以1×104/mL密度接种于96孔板，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。吸弃培养液，加入200μL不同浓度的螺旋藻多糖溶液(以含10％胎牛血清RPI1640培养液配制成终浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL)，每一浓度设5个平行孔。培养24小时、48小时、72小时后，每孔加MTS 20μL混匀，于37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时，吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜200μL，用酶标仪于490nm处测吸光值。重复实验3次。计算抑制率(实验结果见表1)。

细胞生长抑制率(％)＝[(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％。

表1螺旋藻多糖对Be17402细胞增殖的抑制作用

结果显示本发明中螺旋藻多糖对人肝癌细胞Be17402增殖具有抑制作用，并呈剂量依赖关系。表明本发明中螺旋藻多糖具有治疗和/或预防肿瘤的潜在应用价值。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种螺旋藻多糖，其特征在于：由D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖组成，以摩尔比计，四种单糖比例为：3.5～4.5:3.5～4.5:1.7～2.3:1；

所述的螺旋藻多糖的重均分子量范围为：5000～18000Da。

2.如权利要求1所述的螺旋藻多糖，其特征在于：以摩尔比计，四种单糖比例为：4:4:2:1。

3.如权利要求1中所述的螺旋藻多糖，其特征在于：包括由1个硫酸软骨素E、7个其它非硫酸化软骨素及单硫酸化软骨素组成的主链，以α-1，3-糖苷键连接4个L-岩藻糖硫酸酯形成侧链，末端以α-1，3-糖苷键连接2个半乳糖。

4.如权利要求3中所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述主链是以D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯以β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键链接形成[-4GlcAβ1→3GalNAc4S/6Sβ1-]硫酸软骨素二糖结构单元，所述螺旋藻多糖结构如下：

5.如权利要求1或2所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述螺旋藻多糖以其碱金属或碱土金属盐的形式存在。

6.如权利要求5所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述的碱土金属盐是螺旋藻多糖的钠盐、钾盐或钙盐。

7.一种螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于：按以下步骤进行：

1)取螺旋藻适量，加入10～30倍重量体积比的0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加入6mol/L HCl溶液至混合后的溶液pH值为2～3，离心处理得上清液；将上清液浓缩到螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖；

2)向螺旋藻粗多糖中加20～40倍重量体积比的水溶解；在35℃水浴下，分别加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc、4.0mol/L乙酸后；匀速滴加1～3L 10％H₂O₂；待反应终止后，进行超滤处理，得到螺旋藻纯多糖，该螺旋藻纯多糖由D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖组成。

8.如权利要求7所述的螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于：

1)取螺旋藻适量，加入20倍重量体积比的0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加入6mol/L HCl溶液至混合后的溶液pH值为2.5；离心处理得上清液；将上清液浓缩到螺旋藻原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95％食用乙醇，静置10小时，离心收集沉淀，得螺旋藻粗多糖；

2)向螺旋藻粗多糖中加30倍重量体积比的水溶解；在35℃水浴下，分别加入0.5mol/LNaCl、0.5mol/L NaAc；4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加2L 10％H2O2；待反应终止后，进行超滤处理，得到螺旋藻纯多糖。

9.一种螺旋藻多糖，其特征在于：采用权利要求7或8所述方法制备，所述螺旋藻多糖由D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖组成；以摩尔比计，四种组成单糖比例为：3.5～4.5:3.5～4.5:1.7～2.3:1；所述螺旋藻多糖的重均分子量范围为：5000～18000Da。