CN109721664A

CN109721664A - 一种青口贝多糖及其提取方法和应用

Info

Publication number: CN109721664A
Application number: CN201910195132.7A
Authority: CN
Inventors: 谭道鹏; 何芋岐; 秦琳; 张倩茹; 鲁艳柳; 杜艺玫
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-05-07

Abstract

本方案公开了药物提取制备领域的一种青口贝多糖，包括D‑葡萄糖醛酸、D‑乙酰氨基半乳糖、L‑岩藻糖和半乳糖四种单糖，以摩尔比计，四种单糖比例为1:1:1:1；所述的青口贝多糖的重均分子量范围为：8000～15000Da；其制作方法包括以下步骤：1)取青口贝适量，加入5～10倍重量体积比的0.3～0.7mol/L的NaOH溶液，搅拌；加6mol/L HCl溶液至混合后的溶液pH值为2～3；将上清液浓缩到约青口贝原料重量2倍体积后，加入三倍体积的95％食用乙醇，静置8‑12小时，得青口贝粗多糖；2)向青口贝粗多糖中加5～10倍重量体积比的水溶解；分别加入0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc(乙酸钠)和4.0mmol/L乙酸后；匀速滴加1～2L 10％H₂O₂；待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝纯多糖；其可应用于制备抗凝血药物或保健品。

Description

一种青口贝多糖及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及药物提取制备领域，特别涉及一种青口贝多糖及其提取方法和应用。

背景技术

青口贝，也叫翡翠贻贝，又名海红。干制后即称为“淡菜”。分布于东海南部和南海沿岸。贝壳较大，壳长达13～14厘米。青口贝味咸、性温，无毒，入肝、肾经。可补肾益精、调肝养血、消瘿瘤、调经血、降血压之功效；用于虚劳羸瘦、眩晕、盗汗、阳痿、腰痛、呈血、崩漏、带下、瘿瘤、疝瘕等症。

青口贝的营养均衡,多糖、蛋白质及氨基酸含量较高，富含人体生命活动所必需的各种氨基酸、不饱和脂肪酸、无机元素等营养物质,必需氨基酸占总氨基酸量的33.2％。粗脂肪和脂肪酸含量丰富，特别是EPA和DHA总量占总脂肪酸的26.01％。除富含Ca、Mg、Fe等无机元素外,Se的含量也较高。其中牛磺酸、EPA、DHA和硒等生物活性物质对机体更具有抗病、解毒、增强免疫力等重要功能,具有较高的开发利用价值。

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动、植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。由同一种类型的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成，在化学结构上实属多种多样。就分子量而论，有从0.5万个分子组成的到超过106个的多糖。

青口贝多糖是青口贝中碳水化合物的主要存在形式，含量高达干重的20％～30％。青口贝多糖具有抗辐射损伤和改善放、化疗引起的副反应作用、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗衰老、增强免疫力等多种功能。有关青口贝多糖的报道已有很多文献，但大多局限于粗多糖，目前，并没有文献就青口贝中均一多糖的提取和应用进行研究。

发明内容

本发明意在提供一种具有抗凝血活性的青口贝多糖及其提取方法和应用。

本方案中的一种青口贝多糖，其特征在于：包括D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖。

进一步，所述D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖的摩尔比为0.5～1:0.5～1:0.5～1:1。

进一步，所述的青口贝多糖的重均分子量范围为8000～15000Da。

进一步，所述青口贝多糖以其碱金属盐或碱土金属盐的形式存在。

进一步，包括以D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯以β-1，3-糖苷键组成的主链，以α-1，3-糖苷键连接L-岩藻糖硫酸酯形成侧链，末端以α-1，3-糖苷键连接半乳糖，所述青口贝多糖结构如下：

进一步，所述的青口贝多糖以其碱金属或碱土金属盐的形式存在。

进一步，所述的碱土金属盐是青口贝多糖的钠盐、钾盐或钙盐。

本发明还提供了一种上述青口贝多糖的提取方法，按如下步骤进行：

1)取青口贝，加入所述青口贝5～10倍重量体积比的0.3～0.7mol/L的NaOH溶液，于60℃的温度下搅拌1.5～2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液至冷却后的溶液pH值为2～3；再离心处理得上清液；将上清液浓缩到约青口贝重量2倍体积后，加入浓缩后上清液三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖；

2)向青口贝粗多糖中加5～10倍重量体积比的水溶解；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，直至其浓度分别达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mmol/L乙酸；然后再匀速滴加1～2L浓度为10％的H₂O₂；待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝多糖。

本方案的有益效果：取青口贝适量，加入5～10倍重量体积比的0.3～0.7mol/L的NaOH溶液，如青口贝1kg，加入5～10L的0.3～0.7mol/L的NaOH溶液。向青口贝粗多糖中加入NaCl、NaAc和乙酸可使超大分子量的青口贝多糖降解到所需的分子量范围；本发明中的青口贝多糖具有延长血浆凝聚时间的作用，显示该青口贝多糖具有治疗和预防凝血基本的潜在应用价值，可以用于凝血的治疗或预防。

进一步，所述青口贝多糖用于制备抗凝血药物或保健品。本发明的青口贝多糖或其盐可以与药学上可接受的辅料形成药用组合物用于抗凝血药物或保健品。

本发明中，所述的重量体积比单位均为kg/L。

附图说明

图1为本发明中青口贝多糖的HPGPC色谱图；

图2为本发明中青口贝多糖的红外吸收图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

实施例1：一种青口贝多糖的提取方法，具体操作步骤为：

取青口贝2Kg，加入16L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值为2.5；再离心处理得上清液。上清液减压浓缩到约4L，加入15L的95％食用乙醇，静置10小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖600g。

取上述青口贝粗多糖200g，加水1.6L溶解；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，直至其浓度分别达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mmol/L乙酸后；然后再匀速滴加1.5L浓度为10％的H₂O₂；待反应3小时，反应完成后，通过8K Da的超滤膜进行超滤处理，得到青口贝均一多糖150g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为10000Da。

实施例2：一种青口贝多糖的提取方法，具体操作步骤为：

取青口贝2Kg，加入10L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值至2；再离心处理得上清液。将上清液减压浓缩到约4L，加入15L的95％食用乙醇，静置11小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖450g。

取上述青口贝粗多糖200g，加水1L溶解；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，直至其浓度分别达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc、4.0mmol/L乙酸；匀速滴加1L浓度为10％的H₂O₂；反应2小时，待反应结束后，通过8K Da的超滤膜进行超滤处理，得到青口贝均一多糖130g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为15000Da。

实施例3：一种青口贝多糖的提取方法，具体操作步骤为：

取青口贝2Kg，加入20L 0.5mol/L的NaOH溶液，于60℃的溶液温度下搅拌提取2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液调节pH值为3；再离心得上清液。将上清液减压浓缩到约4L，加入15L的95％食用乙醇，静置12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖550g。

取上述青口贝粗多糖200g，加水2L溶解；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，直至其浓度分别达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mmol/L乙酸；匀速滴加2L浓度为10％的H₂O₂；反应4小时，待反应终止后，通过8K Da的超滤膜进行超滤处理，得到青口贝均一多糖144g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为8500Da。

青口贝多糖的抗凝血活性

材料：上述实施例中制备的青口贝多糖。

试剂：兔贫血小板血浆(广州瑞特生物科技有限公司)；活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)。

仪器：BICO双通道血凝仪(Minivolt公司)。

方法：准确称取各样品10.0mg，溶解并定容至100mL，再稀释10倍。按试剂盒说明书的方法操作，测定各样品的APTT时间，扣除空白血浆的凝血时间，即是样品延长凝血的时间△APTT(Sec)。

实验结果如表1所示：

表1青口贝多糖对家兔血浆凝血时间的影响

结果显示本发明中的青口贝多糖可以显著延长家兔血浆APTT时间，表明其能够抑制内源性凝血。

取青口贝多糖10mg加入氘代吡啶溶解后，经核磁共振波谱仪分析，其¹H/¹³C-NMR数据如表2所示：

表2青口贝多糖¹H/¹³C-NMR谱图数据及归属

结论：本方案制得的青口贝多糖具有较高的抗凝血活性。

以上实施例只是例举了钠盐形式存在的青口贝多糖的提取方法；如需制备钾盐、钙盐等碱金属盐或碱土金属盐形式存在的青口贝多糖；只需在提取方法步骤二中，将NaCl溶液替换成相应的KCl或CaCl，NaAc替换为KAc或CaAc等相应碱金属溶液或碱土金属溶液即可。制备的其他碱金属盐或碱土金属盐形式存在的青口贝多糖也具有与上述钠盐形式存在的青口贝多糖相同或相近的抗凝血活性。

Claims

1.一种青口贝多糖，其特征在于：包括D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖四种单糖。

2.根据权利要求1所述的一种青口贝多糖，其特征在于：所述D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖、L-岩藻糖和半乳糖的摩尔比为0.5～1:0.5～1:0.5～1:1。

3.根据权利要求2所述的一种青口贝多糖，其特征在于：所述的青口贝多糖的重均分子量范围为8000～15000Da。

4.根据权利要求3所述的一种青口贝多糖，其特征在于：所述青口贝多糖以其碱金属盐或碱土金属盐的形式存在。

5.根据权利要求4所述的一种青口贝多糖，其特征在于：包括以D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯以β-1，3-糖苷键组成的主链，以α-1，3-糖苷键连接L-岩藻糖硫酸酯形成侧链，末端以α-1，3-糖苷键连接半乳糖，所述青口贝多糖结构如下：

6.根据权利要求1～5中任一项所述的一种青口贝多糖的提取方法，其特征在于：1)取青口贝，加入所述青口贝5～10倍重量体积比的0.3～0.7mol/L的NaOH溶液，于60℃的温度下搅拌1.5～2小时；冷却后，加6mol/L HCl溶液至冷却后的溶液pH值为2～3；再离心处理得上清液；将上清液浓缩到约青口贝重量2倍体积后，加入浓缩后上清液三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖；

2)向青口贝粗多糖中加5～10倍重量体积比的水溶解；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，直至其浓度分别达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mmol/L乙酸；然后再匀速滴加1～2L浓度为10％的H2O2；待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝多糖。

7.根据权利要求1～5中的任一项所述的一种青口贝多糖的应用，其特征在于：所述青口贝多糖用于制备抗凝血药物或保健品。