CN104610459B - 一种低分子量仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低分子量仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用,它的结构式如下:。它的骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构,乙酰氨基半乳糖的O‑4/6位为硫酸酯化的。每一个二糖单元上都有一个岩藻糖支链,为2,4‑双硫酸基取代的岩藻糖,可能的连接位点为葡萄糖醛酸的O‑3位(R)、或乙酰氨基半乳糖的O‑4位(R1)或O‑6位(R2)。m=7~12。低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量(M w )在7000~12000范围内的占95%。其纯度大于98%。本发明制备的低分子量仿刺参糖胺聚糖能够应用于抗凝血和抗血栓的治疗,同时能够降低出血的风险,而且为开发具有类似结构的海参糖胺聚糖产品提够了方法支持。
Description
技术领域
本发明涉及抗凝血和抗血栓药物领域,尤其涉及一种低分子量仿刺参糖胺聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
海参一直以来就是一种名贵的滋补食品,素有“海中人参”的美誉,中医认为:海参味干咸,补肾,益精髓,摄小便,壮阳疗痿,其性温补,足底人参。而且研究表明,海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老、防止动脉硬化、糖尿病及抗肿瘤等作用。海参中含有各种有益于人体的营养物质,如蛋白质、氨基酸、海参多糖、维生素、矿物质和海参皂苷等成分。仿刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科、仿刺参属的一种食用海参,具有极高营养价值和商业价值,主要分布在北西太平洋和日本沿海地区,在中国北部有大面积的养殖,年产量极为丰富,而青岛是仿刺参的主要产地之一。
海参糖胺聚糖是近几十年来从海参体壁中提取分离得到的一种新的硫酸软骨素类化合物,它具有硫酸软骨素类的主链结构[→4GlcUAβ1→3GalNAc(4,6-diSO4)β1→],并且在葡萄糖醛酸的O-3位和乙酰氨基半乳糖的O-4/6位有硫酸化的岩藻糖支链,其相对分子质量在8-10万左右。研究表明,海参糖胺聚糖具有多种药用活性,如抗肿瘤,抗病毒作用。海参糖胺聚糖作为一种类肝素物质,具有显著的抗凝血和抗血栓形成的活性,而且没有肝素类物质导致出血的副作用。同时,作为一种非哺乳动物来源的抗凝物质,其含有对人类有害的热源物质的可能较低。但是高分子量的海参糖胺聚糖有导致血小板聚集的不利因素,而通过降解反应得到的低分子量海参糖胺聚糖能够保留其抗凝血活性,且无血小板聚集的副作用,对于开发用于心脑血管疾病的药物有重要的意义。
通过物理和化学方法对仿刺参糖胺聚糖进行解聚,得到低分子量的寡糖片段,能够提高海参糖胺聚糖的口服吸收利用度。从海参糖胺聚糖的多种药理功能可以看出开发海参糖胺聚糖及其低分子量糖胺聚糖的巨大潜力。常用的降解海参糖胺聚糖的物理方法有超声降解法、微波降解法和辐射降解发等。例如,专利CN103087214A利用超声降解的方法对海参岩藻聚糖进行了降解,反应条件温和,操作简单,但是该方法选择性差,易引起硫酸基及支链结构的脱落,微波降解法和辐射降解法也存在类似的缺陷。而常用的化学降解方法有酸降解法、自由基降解法和酶降解法。酸降解法选择性差,也会对多糖的活性结构造成破坏。酶解法需要能够降解海参糖胺聚糖的专一性酶,目前此类活性酶仍未见报道,酶解法制备海参糖胺聚糖可行性不大。自由基降解法能够选择性地进攻糖胺聚糖中无硫酸基取代的糖醛酸,而不引起硫酸基和岩藻糖支链结构的破坏丢失,是一种有效的大量制备低分子量海参糖胺聚糖的方法。专利CN103285031A建立了一种5%H2O2的2%醋酸溶液,60℃反应20小时的自由基降解体系,制备低分子量海参糖胺聚糖,得到分子量在26000Da~45000Da的寡糖;而专利CN101057859A利用5%H2O2的2%醋酸溶液,45℃的反应条件降解制备了分子量在8000-12000的低分子量海参糖胺聚糖,但是两者反应条件的酸碱度均未得到有效控制,易引起多糖的酸降解,对其结构造成破坏,而且得到的产物分子量单一、结构不明确,存在一定的缺陷。
因此,为了提高海参糖胺聚糖的生物利用度,减少生物大分子带来的不利因素,开发新的低副作用的抗心脑血管疾病药物,建立一种行之有效的可控降解海参糖胺聚糖的方法意义重大。
发明内容
本发明的目的是建立一种温和的、可控的解聚仿刺参糖胺聚糖的方法,本发明利用自由基降解技术,能够在不破坏多糖结构的前提下,迅速降解高分子量海参糖胺聚糖,条件温和,不破坏多糖的结构,操作简单。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案予以实现:
粉碎后的仿刺参体壁组织经过碱处理,酶解,醇沉,乙酸钾沉淀、透析和冷冻干燥后,得到仿刺参糖胺聚糖。
一种低分子量仿刺参糖胺聚糖,它的结构通式如下:
式中,低分子量糖胺聚糖的骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构,乙酰氨基半乳糖的O-4/6位为硫酸酯化的。每一个二糖单元上都有一个岩藻糖支链,为2,4-双硫酸基取代的岩藻糖,可能的连接位点为葡萄糖醛酸的O-3位(R)、或乙酰氨基半乳糖的O-4位(R1)或O-6位(R2)。m=7~12。
进一步的,所述低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量(Mw)在7000~12000范围内的占95%。其纯度大于99%。
进一步的,所述低分子量仿刺参糖胺聚糖的硫酸基含量为29%~33%。
本发明还提供了一种具有显著抗凝血活性的低分子量仿刺参糖胺聚糖的制备方法,它包括以下步骤:将8~15mg仿刺参糖胺聚糖溶解在1mL含25~100mmol/L过氧化氢的80~110mmol/L K2HPO4溶液中,所述溶液的pH值为7.5,向所述水溶液中加入乙酸铜至浓度为1~5mmol/L,然后在30~60℃反应0.5~2h,加入1mL 5~20mmol/L EDTA×2Na终止反应,离心去除沉淀,上清液中加入85%以上的乙醇使其沉淀,离心收集沉淀,将沉淀通过葡聚糖凝胶纯化,浓缩后经冷冻干燥得到低分子量仿刺参糖胺聚糖。
本发明还提供了所述低分子量仿刺参糖胺聚糖的体外抗凝血活性实验。
与现有技术相比,本发明的优势和积极效果是:
1)、本发明所述方法中,二价铜离子和过氧化氢共存时产生的自由基攻击非硫酸基取代的葡萄糖醛酸,而对硫酸基团和岩藻糖支链影响甚微,能够很好的保留仿刺参糖胺聚糖的活性基团结构。
2)、本发明所述方法中,利用磷酸盐缓冲液对反应pH进行调节,使其保持在中性,能够避免反应过程中出现的酸降解和碱降解,减少硫酸基和支链结构的丢失。
3)、本发明所述方法,操作简便,重现性良好,是大量制备低分子量仿刺参糖胺聚糖的有效方法。
4)、本发明所述低分子量仿刺参糖胺聚糖在体外能够显著的延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间,具有优异的抗凝血活性。
5)、本发明所提供的方法简单便捷,获得的产品纯度高,分子量、硫酸基含量固定,可以用于大规模制备低分子量仿刺参糖胺聚糖,并推广到有相似结构的海参糖胺聚糖,为开发低分子量海参糖胺聚糖,研究其广泛的生物活性提供原料和技术支持。
附图说明
图1本发明制得的低分子量仿刺参糖胺聚糖的结构通式。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1:低分子量仿刺参糖胺聚糖的制备
将10mg仿刺参糖胺聚糖(HG,重均分子量约98kDa)溶解在1mL含50mmol/L过氧化氢的100mmol/L K2HPO4溶液中,所述溶液的pH值为7.5,向所述水溶液中加入乙酸铜至浓度为1mmol/L,超声溶解,然后在55℃反应1.5h,加入1mL 20mmol/L EDTA×2Na终止反应,4000rpm离心20分钟去除沉淀。向上述上清液中加入4倍体积95%的乙醇,4℃静置过夜使其沉淀,离心收集沉淀。将沉淀溶于少量去离子水,通过葡聚糖凝胶Sephdex G25纯化,浓缩后经冷冻干燥得到低分子量仿刺参糖胺聚糖DHG-1、DHG-2、DHG-3、DHG-4。所述制得的低分子量仿刺参糖胺聚糖的结构通式如图1,其中,低分子量糖胺聚糖的骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构,乙酰氨基半乳糖的O-4/6位为硫酸酯化的。每一个二糖单元上都有一个岩藻糖支链,为2,4-双硫酸基取代的岩藻糖,可能的连接位点为葡萄糖醛酸的O-3位(R)、或乙酰氨基半乳糖的O-4位(R1)或O-6位(R2),m=7~12。
分子量及分子量分布用Waters UltrahydrogelTM Linear柱色谱(7.8mm×300mm,6mm)进行测定,以右旋糖酐标准品(中国药物生物制品检定所)作为标准,获得低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量。按照本发明方法制备的低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量与温度、反映时间的关系如表1所示。
表1低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量与温度、反映时间的关系。
实施实例2:低分子量仿刺参糖胺聚糖的体外抗凝血活性实验
应用本发明方法制得的低分子量仿刺参糖胺聚糖的主要药理活性实验结果如下,以下结果均按国家规定的方法,经系统实验研究获得。
A、低分子量仿刺参糖胺聚糖的体外抗凝血实验
活化部分凝血活酶时间(APTT)实验:将90μL羔羊血浆与10μL溶解在生理盐水中的样品混合,加入100μL预热的APTT试剂,37℃孵育5分钟,加入100μL预热的0.25mol/L的氯化钙,并开始计时,记录APTT时间。
凝血酶原时间(PT)实验:将90μL羔羊血浆与10μL溶解在生理盐水中的样品混合,37℃孵育3分钟,然后加入200μL预热的PT试剂,记录PT时间。
凝血酶时间(TT)实验:将90μL羔羊血浆与10μL溶解在生理盐水中的样品混合,37℃孵育3分钟,然后加入100μL预热的PT试剂,记录TT时间。
表2低分子量仿刺参糖胺聚糖体外对羔羊凝血指标的影响(X±S,n=3)
*:vs生理盐水;*p<0.05;**p<0.01。
结果显示:低分子量仿刺参糖胺聚糖能够明显的延长羔羊血浆的APTT和TT时间。说明此药有显著的抗凝作用。
Claims (3)
1.一种低分子量仿刺参糖胺聚糖,其特征是它的结构,如下:
低分子量糖胺聚糖的骨架结构为→4GlcUAβ1→3GalNAcβ1→二糖重复结构,乙酰氨基半乳糖的O-4/6位为硫酸酯化的,每一个二糖单元上都有一个岩藻糖支链,为2,4-双硫酸基取代的岩藻糖,可能的连接位点为葡萄糖醛酸的O-3位(R)、或乙酰氨基半乳糖的O-4位(R1)或O-6位(R2),m=7~12,低分子量仿刺参糖胺聚糖的重均分子量(Mw)在7000~12000范围内的占95%,其纯度大于99%;
所述低分子量仿刺参糖胺聚糖的硫酸基含量为29%~33%。
2.一种根据权利要求1所述的低分子量仿刺参糖胺聚糖的制备方法,其特征在于它包括以下步骤:将8~15mg仿刺参糖胺聚糖溶解在1mL含25~100mmol/L过氧化氢的80~110mmol/L K2HPO4溶液中,所述溶液的pH值为7.5,向所述水溶液中加入乙酸铜至浓度为1~5mmol/L,然后在30~60℃反应0.5~2h,加入1mL 5~20mmol/L EDTA×2Na终止反应,离心去除沉淀,上清液中加入85%以上的乙醇使其沉淀,离心收集沉淀,将沉淀通过葡聚糖凝胶纯化,浓缩后经冷冻干燥得到低分子量仿刺参糖胺聚糖。
3.根据权利要求1所述的低分子量仿刺参糖胺聚糖在制备用于抗凝血和抗血栓药物中的应用。
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