JPS63278901A - 通常の構造の低分子量のヘパリンとその製法並びに生物学的な応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、通常の構造の低分子量のヘパリンとその製法
並びに生物学的応用に関する。

本発明は、より詳しくは、抗トロンビン■（ＡＴＩＩＩ
）を経て行使される抗凝固活性をほとんど完全に失なっ
ていながら成る生理系統の調整の分野に成る活性を示す
ヘパリンに特に向けられている。

ヘパリンが主に抗トロンビンｍ　（ＡＴｍ）を経て行使
される抗凝固活性を示すことは知られている。

ヘパリンの構造／活性の関係についての研究によって、
この抗凝固活性が、いわゆるヘパリンの不整領域、より
特定的には、次式 ％式％ を有する、フランス特許願！２５３５３２４号に記載さ
れたＤＥＦＧＨ構造の五糖類に対応する領域に特に相関
されていることが明らかにされた。

また、ＡＴＩ［Ｉとの結合部位がなくとも、またこの結
合部位が変性されていても、ヘパリン又はヘパリンのフ
ラグメントの成る活性が成る程度まで保持されうろこと
も知られている（これらの活性をひき起こす構造は明ら
かにされていない）。

フォルクマン等（「サイエンスＪ、Ｖ、２２１．１９８
３．７１９−７２５頁）は、フルチコイドと組合せて使
用された、抗凝固活性のない六糖類混合物について、血
管形成の禁止作用を報告している。

カルノフスキー等は、〇−説硫鑓化及びＮ−脱硫酸化ヘ
バリンについて実験を行ない、これらのものが、比較的
少ない度合においてでも、成る割合まで、平滑筋細胞の
増殖に対する標準ヘパリンの禁止活性を常に示すことを
示している。

また、抗凝固活性と別に、ヘパリンの抗補体活性も確か
められている。

その他の研究によって、過沃素酸ナトリウムによって、
非硫酸化ウロン酸のＣ２−ｃ、炭素のレベルでの切断を
行なうことによって、ヘパリンの抗凝固活性を変性しう
ろことが示されている。

即ち、フランソン及びルイスは、ｐＨ３，４℃又はｐＨ
７，３７°Ｃでヘパリンに過沃素酸塩を作用させること
から成る操作条件を、「フェブ拳しターズ（Ｆｅｂｓ、
Ｌｅｔｔｅｒｓ）Ｊ　、　Ｖ　、　９７、崩、１．１１
９−１２３頁、１９７９において記述している。第１の
条件の下では、得られたヘパリン鎖は、Ｄ−グルクロン
酸のレベルにおいて選択的に酸化されているが、第２の
条件の下では、非硫酸化ウロン酸の全ての単位のところ
で、酸化が生じている。

結果した鎖は、ＮａＢＨ４で還元されるか、又は、アル
カリ性の媒質中のβ脱離によって分断される。

この文献の著者らは、Ｄ−グルクロン酸単位の酸化及び
開裂が１分子量のわずかな減少によって表わされるが、
抗凝固活性の保持によっても表わされると結論している
。

その反対に、ｐＨ７，３７℃において、弗硫酸化Ｄ−グ
ルクロン酸及び２−イズロン酸を切断すると、抗凝固活
性が抑制されると共に１分子が更に強く細分化される。

フランソンは、「カーボハイドレートΦリサーチＪ　、
３３９−３４８頁、１９７４に発表した論説において、
いろいろのｐＨと４℃又は３７℃の温度に硫酸デルマタ
ンにおけるウロン単位の過沃素酸による酸化について報
告している。

著者は、ｐＨ５で操作した場合、グルクロン酸のレベル
においての切断が５％より少ない比率においてしか生じ
ないこと、ｐ）１３で操作した場合、切断が全く生じな
いこと、を指摘している。この結果は、ｐＨ３について
切断が優先的にＤ−グルクロン酸のレベルにおいて生ず
るヘパリンの場合と逆のように思われる。

過沃素酸塩の作用は、カース等によって、「アルツナイ
ミッテル・フォルシュング」　ドラッグ・リサーチ、３
６　（１）　Ｎｏ、　４，６３９−６４２．１９８６に
も報告されている。

この論説によれば、種々のヘパリン調製物は、（ｐＨ５
，３，４℃で２４時間）過沃素酸塩の酸化作用にかける
ことによって、全部の非硫酸化ウロン酸を２位置と３位
置との炭素の間で切断される。比較のため、成る調製物
は、後工程にょうて、部分的に酸加水分解処理され、得
られたフラグメントは透析される。

フランソンが「カーボハイドレート・リサーチＪ　８０
．１３１−１４５　（１９８０）において指摘している
ように、この部分的な酸加水分解の工程によって、鎖が
著しく細分化されると共に、少くとも部分的に、官能基
が破壊される。

更に、この方法によれば１分子量が広い範囲内で変化し
ている鎖の混合物、特に、多数の二糖類、四糖類及び六
糖類の混合物が必然的に生成される。

ところで、本発明者らは、成る生理系統を調節するため
に治療上利用可能な医薬組成物を取得するには、抗凝固
活性に関係した不所望な効果がさけられるように、フラ
グメントの長さ、電荷率並びにＡＴｍへの結合部位の不
在という３つの特徴の組合せが不可欠であることを確か
めた。

分断の手段と過沃素酸による切断の過程の研究を通じて
１本発明者らは、成る特定の操作条件の下に過沃素酸に
よる融化を行なうと共に、特別の工程を組合せることに
よって、その官能基の少くとも主要部分を保持しながら
、望ましい間隔において、ＡＴ［への結合部位を失なっ
ている低分子量のヘパリンフラグメントの組成物が得ら
れることを見出した。

従って、本発明の目的は、抗凝固性を示すことの不具合
なしに、ヘパリンと実質的に同等の、非常に有用な薬理
学的性質を活性用量において示すヘパリン組成物を提供
することにある。

本発明の別の目的は、天然のヘパリン鎖における対応し
た連鎖のものに電荷率がほぼ対応していて、ＡＴＩＩＩ
との結合部位を失なっている、所定の分子量のフラグメ
ントを得ることを可能とする、ヘパリンの分断方法を提
供することにある。

本発明の更に別の目的は、特に成る生理系統の調節のた
めに有用な医薬を調製するために、前記組成物を応用す
ることにある。

本発明による組成物は、非硫酸（塩）化ウロン酸−Ｎ硫
酸塩グルコサミン型の、二糖類の鎖のないフラグメント
から基本的に成り、このフラグメントが、次の一般式（
Ｉ） Ｒ−（Ｘ−Ｙ）　ｎ　−Ｒ’　　　　　　（Ｉ）に対応
し、ここに −Ｘは、次式ＩＩ による、硫酸化イズロン酸の単位を表わすか、又は、少
なくとも鎖２つについて１単位の割合で、次式（ＩＩＩ
） による、２位置と３位置の炭素原子の間で開環された非
硫酸化ウロン酸（Ｄグルクロン酸もしくはＬ−イズロン
酸）の単位を表わし、 Ｙは、次式（ＩＶ） による、Ｄ−グルコサミン単位を表わし、Ｒ１は、水素
原子又は−５０３−基を表わし、Ｒ２は、−５０３−又
は−Ｃｏ−ＣＨ３基を表わし、基−８０３−の割合は、
少くとも約９０％であり、 Ｒ３は、−５ｏ３’″基又は水素原子を表わし、−５０
３−基の比率は、少くとも約７０％であり。

Ｒは、水素原子を表わすか、又は、単位１４Ｒ２ を表わし、 Ｒ１−Ｒ，は、前記の意味を有し、 Ｒ４は、水素原子又はウロン酸の残基を表わし、Ｋは、
水素原子を表わすか、天然のウロン酸単位を表わすが、
過沃素酸による酸化の間に変性され、そのアルデヒド官
能基がアルコールに還元されている、ウロン酸残基を表
わし。

ｎは、主要な化学種について、７≦ｎ≦１５であり、こ
れが分子量約４８００−９０００の鎖に対応する ことを特徴とする。

なお、開環された単位Ｘは、アルカリ性ｐ）Ｉにおいて
のβ脱離工程において、グリコサミノ−グリカン鎖に合
体されたままになっている単位である。この単位は、２
位置と３位置との炭素の間の結合が切断されている、弗
硫酸化Ｄ−グルクロン酸又は弗硫酸化Ｌ−イズロン酸で
ある。

本発明による組成物は、２０５ｎｍ測光検出器に結合さ
れたＴＳＫｊ０００ＳＷカラムによって定めたＨＦＬＣ
において、０．５ＭのＮａ２ＳＯ４を溶剤として、１ｍ
Ｊ／分の流量において使用して、−平均分子量が６００
０−７０００Ｄａ、より正確には５８００−７０００Ｄ
ａ、特に、６０００Ｄａであり、化学種の７０％が４８
００−９０００ダルトンであり、９０％は、３６００−
１１０００Ｄａであり、 −ビークの頂点の分子量が、５５００−６５００Ｄａの
オーダーであり、より正確には。

５５００−６５００Ｄａ、特に、５５００−６０００Ｄ
ａのオーダーであり、 電調の５％以下がｍ＝糖類以下であり、−鎖の５％以下
が１１，０００を超過していることを特徴とする。

本発明の好ましい実施態様によるヘパリン組成物は、予
め過沃素酸の作用を与えた後、過沃素酸による酸化の際
に形成されたアルデヒド基を還元した、ヘパリン鎖に、
強塩基を作用させることによる、ヘパリンの解重合の結
果混合物を、鉱物塩の存在下にアルコールによって分別
することによって得られた、ヘパリンのフラグメントに
よって形成される。

有利には、本発明による組成物の、モルによる硫酸塩５
０３−基対カルボキシル基Ｃ００−の比は、２．２−２
．８の範囲にあり、特に、２．４である。この比の値が
ヘパリン鎖の平均値に比べて非常に高いのは、基本的に
三硫酸化二糖類単位によって形成された本発明による低
分子量のヘパリン鎖の構造に由来する。低分子量のヘパ
リンは、Ａ、Ｓ、パーリン、Ｂ、カース及びＧＲ，サン
ダーソン共著、の科学文献ｒヘパリン、コンドロイチン
及び他のムコ多糖類の２２０ＭＨｚスペクトラムＪＣａ
ｎ、　Ｊ、Ｃｈｅｍ、　　１９７０；４８：２２６０−
８を参照して、また二軸類の単位の存在に留意して、通
常の構造と呼ばれる。

本発明は、前記組成物の塩、特に、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム及びマグネシウムの塩、並びに、生理学
に認容可能な有機陽イオンの塩を提供する。

本発明は、過沃素酸塩によってヘパリンを酸化すること
から成る、前記のヘパリンフラグメントの組成物の製造
方法も提供する。

本発明による製造方法は、 ａ）最終濃度が０．５−５容量％のヘパリン水溶液を、
０−１ｏ℃の温度で、ＰＨ４、５−６，５において最終
濃度が０．５−４容量％の過沃素酸によって処理し、 ｂ）　得られたヘパリン酸を、強塩基を用いてＰＨ約１
１以上で処理し、 Ｃ）得られた解重合フラグメントを還元剤で処理し、 ｄ）必要ならば、過剰な還元剤を除去した後、アルコー
ル溶剤を用いて、鉱物塩の添加後に、還元されたフラグ
メントを沈殿させ、ｅ）鉱物塩が添加された、前記のよ
うにして得た沈殿の水溶液を、アルコールに・よって処
理し、 ｆ）前記のように生成された沈殿を回収し、必要ならば
、使用した強塩基に対応する塩を、薬理学的に認容可能
な別の塩に変換する ことを特徴とする。

ここに、前記の工程ｅ）は、一般的な沈殿ではなく、成
る鎖を除去するための分別に対応している。

本発明による製造方法は、より詳しくは、次の工程即ち 一最終的な濃度が０．５−５容量％のヘパリン水溶液を
、光線を遮断した状態で、１５−４８時間０’−１０℃
の温度で、ｐＨ４，５−６，５において、最終的な濃度
０．５−４容量％において、過沃素酸塩と反応させ、 −得られたヘパリン鎖を、約１１以上、特に１１−１２
、有利には１１．２−１１．６、好ましくは１１．５の
ｐＨにおいて、塩基の最終的なモル濃度が約０．１−０
．３Ｎとなる量において、強塩基１例えば、炭酸ナトリ
ウムを添加することによって解重合し、 一還元剤を用いて、解重合フラグメントを還元し、必要
ならば未反応の還元剤を除去した後に。

一還元されたヘパリンのフラグメントが不溶の溶剤を用
いて、該フラグメントを沈殿させて回収し、 電子め単離した沈殿を水に溶解させ、生成した沈殿を回
収して、鉱物塩の存在下に、得られた水溶液のアルコー
ル分別によって、所望のフラグメントを単離する各工程
の組合せから戊っている。

本発明の製造方法において使用するために分別工程に組
合された、特別の工程による解重合によって、特に治療
上満足な指標を備えた特別の治療上のプロフィルに対応
するフラグメントの組成物の単離が可能となる。

過沃素酸による酸化工程において、好ましくは、最終的
な濃度がそれぞれ１．５−５％（ｐ／マ）及び１．５−
２．５％（ｐ／りとなる量においてヘパリンと過沃素酸
塩とを使用する。

過沃素酸塩は、有利には、メタ過沃素酸ナトリウムであ
る。

残留過沃素酸塩を除去するために、多孔（透過）率が３
−４０００Ｄａの透析ガツト（ｂｏｙａｕｘｄｅ　ｄｉ
ａｌｙｓｅ）を用いて約１５時間透析を行なう。

陰イオン交換樹脂、例えば「アンバーライトＩＲＡ４０
０Ｊ　　（商標名）の下に市販されている樹脂を用いた
グロマトグラフィーによる操作を行なってもよく、この
樹脂は、残留過沃素酸塩及び反応中に生成した過沃素酸
の誘導体を保持するに足る量、例えば１反応量の１７６
−１／８の量において使用する。透析よりも迅速で再現
性の高いこの方法によれば、標準化の容易な条件から出
発してβ脱離操作を行なうことが可能となる。

本発明の好ましい実施態様によれば、４℃の水、特に鉱
物質を除去した水にヘパリンを約５容量％の濃度に溶解
させ、次に、最終的な濃度が約２容量％となるように、
過沃素酸塩、例えば、メタ過沃素酸ナトリウムを添加す
る。この溶液のｐＨは、希塩醜又は希ソーダによって直
ちに５に調節する。

この溶液は、４℃で好ましくは２４時間、暗所に放置す
る。

残留過沃素酸塩を除去するために、多孔率が３−４００
０Ｄａの透析ガツトを用いて、鉱物質を含まない流水中
において約１５時間透析を行なう。

得られたヘパリン鎖は、塩基性媒質中において解重合、
処理される。

このためには、最終的な塩基のモル濃度が０．２Ｎとな
るように、強塩基、より特定的には、炭酸ナトリウムの
濃洗浄液を添加する。

得られた塩基性溶液は、周囲温度で２時間撹拌する。

ヘパリン解重合フラグメントは、ウロン単位の炭素Ｃ２
と０３の間の結合の切断によって生じたアルデヒド基を
変換するために還元処理される。

処理中のヘパリンｔｇ当り５０ｍｇの割合で、水素化ホ
ウ素ナトリウムのような還元剤を使用し、６時間周囲温
度で撹拌を続ける。

未反応の還元剤は、酸、例えば塩酸によって、有利には
約１５分間激しく撹拌することによって、酸性のｐ）１
４ζすることによって分解する。

還元されたヘパリンフラグメントは、沈殿させて回収す
る。

有利には、塩基特に濃ソーダを用いて、ｐＨを７に調節
し、次に鉱物塩を２０　ｇ／ｌ添加し、アルコール１．
５容量を用いて沈殿させる。

使用する鉱物塩は、有利には、塩化ナトリウムである。

アルコールによる沈殿のためには、好ましくはエタノー
ルを使用する。

形成された沈殿は、遠心分離によって回収し、沈殿が不
溶の溶剤例えばエタノールを用いて洗浄し、４０℃で真
空下に乾燥させる。

この沈殿から本発明によるフラグメントを単離するため
には、分別工程が用いられる。

アルコールによる分別は、有利には、次のようにして行
なう。

ヘパリンフラグメントの沈殿を、周囲温度、特に、約１
８°−２０℃の温度で、水、特に鉱物質を除いた水に、
濃度が５容量％となるように溶解させる。

最終的な濃度を１％とするに足る量の鉱物塩、例えば、
塩化ナトリウムを添加する。酸、例えば、希塩酸によっ
て溶液のｐＨを３．５に調節する。

次に、目的フラグメントが不溶の溶剤、例えば、エタノ
ール０．８５容積を、緩徐なかき混ぜの下に添加する。

次に混合物全体を１８°−２０℃で約１０時間放置する
。

沈殿を遠心分離によって回収し、溶剤、例えば、エタノ
ールにて洗浄し、４０℃で２４時間真空下に乾燥する。

沈殿は、存在していることのある不純物を除去するため
に、鉱物質を除いた水に溶解させた後、陰イオン交換樹
脂、例えば、反応容積の１／１０のオーダーの容積をも
った「アンバーライトＩＲＡ４００、ＯＨ−」によるク
ロマトグラフィーによって、補助的に精製が処理される
。

この沈殿は、化学種の大部分が約４８００−９０００Ｄ
ａの分子量を有するヘパリンのフラグメントの混合物か
ら成っている。

得られた生成物は、必要ならば、既知の方法によって、
薬理学的に容認可能な別の塩１例えば、カルシウム塩、
カリウム塩又はマグネシウム塩に変換することができる
。

ＡＴｍとの結合部位のない、分子量が約４８００−９０
００のフラグメントから基本的に成っている、本発明に
よるヘパリン組成物は、ヘパリンの通常の領域に結び付
いている非常に有用な薬理学的性質を活用することを可
能とする。この組成物の活性用量は、非常にわずかな抗
凝固活性を示すに過ぎない。

これらの組成物が平滑筋の細胞の成長に対してヘパリン
とほぼ同等の禁止作用を示すことが、その薬理学的研究
によって示された。

また、種々の実験によって、他の禁止効果、特に補体活
性化、遅延型感作過多炎症反応並びにヘパラナーゼの酵
素活性に対する禁止効果が立証された。

前記組成物は、細胞の成長の成る因子に対して相乗作用
並びに安定化作用も示すことができる。

また、これらの組成物は、高度に無毒性であり、安定性
が非常にすぐれている。

更に、これらの化合物は、医薬の有効成分を形成する上
に特に適切である。

従って、本発明は、以上に定義されたヘパリンのフラグ
メント（画分）によって基本的に形成された組成物の有
効量を薬理学的な基剤と共に含有していることを特徴と
する医薬調製物を提供する。

本発明による医薬は、その性質に留意して、特に次の治
療上の指示において使用することができる。

ｍｍ管形成の間に平滑筋細胞の増殖を防止する。

−特に皮膚病の際に、組織の回復を早める。

−進化性アセロゲン病変（１＆５ｉｏｎｓ　ａｔｂｅｒ
ｏｇｅｎｅｓｅｖｏｌｕｔｉｖｅｓ）の進行と動脈硬化
の変性現象とを防止する。

−ショック状態を防止する。

一成る種の転移の進行を防止する。

本発明による医薬調製物は、いろいろの形で投与される
。

経口投与の場合には、特に、ゼラチン嚢、タブレット、
錠剤、ピル、リポソームなどを使用する。調製物は、有
利には、１服用量位当り５０ｍｇ−５ｇ含有させ、好ま
しくは、ゼラチン嚢、タブレット又はピルについて、２
００−２５０Ｉ１ｇとする。

従って、投与形態は、木質的に、投与すべき服　゛用量
に依存する０服用量が少ない場合には、ゼラチン嚢、タ
ブレット又はピルが実用的であるが、服用量より大きい
場合には、飲用可能とした水溶液がより実用的なことが
ある。

本発明の他の段用形態は、スプレー、エーロゾル、ポマ
ード又はクリームである。

本発明は、静脈、筋肉又は皮下投与による注射可能、無
菌又は滅菌可能な医薬組成物を提供する。

この溶液は、皮下注射による場合には、約１０−１５０
ｍｇ／−の有効成分を含有し、また静脈注射又は潅流に
よる場合には、１０−１００ｍｇ／ｍｌの有効成分を含
有することが望ましい。

次に、本発明を説明するために、ヒトに利用可能な用量
例が示される。この用量例は、−例として、１日に２回
又は３回皮下注射によって、１回の服用量について約５
００ｍｇを患者に投与する場合である。静脈注射の場合
には約１０００ｍｇを１日に投与するが、潅流の場合に
は、注入可能な量は、数１０−となる。これらの場合の
投与は、一定の間隔で不連続的に行なってもよく、また
潅流によって連続的に行なってもよい。

本発明は、以上に定義したヘパリン画分組成物によって
有効成分が形成された生物学的な反応物質も提供する。

これらの生物学的な反応物質は、その調整にＧＡＧが関
与する種々の生理系統の比較研究において、比較対照の
ための標準として利用することができる。

本発明のその他の特徴及び利点は、図面を参照とした以
下の実施例の説明によって一層明らかとなるであろう。

実」１例」２　ヘパリン画分組成物の取得方法ｎ）１　
、　に　　ヘパリン ナトリウム塩の形の、ブタの粘液の注入可能なヘパリン
１０ｇ（コデックス用量中の適定量１５７　ｕ　Ｉ／ｍ
ｇ、　イン等のアンチＸミツアフター用量中の適宜量１
５５単位／　ｍｇ）を、鉱物質を除いた４０℃の水２５
０−中に溶解させた。′ｍ塩酸によって溶液のｐＨを５
．０に調節した。鉱物質を除いた４℃の水２５０−中に
溶解させたメタ過沃素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４，分子
量２１３．８Ｊ）Ｌｏｇを、緩徐なかきまぜの下の添加
した。全体のｐ）ｌを濃塩酸によって５．０に調節した
。溶液を２４時間＋４℃の低温の暗室中に放置した。

ｉｉ　）腹五過仄１敢１豆弥法 次ニ、反応溶液ｔ−１ＮＯＪＡＸ４　、ＯＲ（７）３本
のガツト（腸多孔率３−４００００ａ）中に分散させ、
鉱物質を除いた流水に対して１５時間透析にかけた。

１１１）　　　　　　　　　　　　に　　（透析後に得
た溶液７８０−に、ＩＯＨのソーダ１６−を添加して得
た混合物を、（１８°−２１°Ｃ程度の）周囲温度で３
時間撹拌した・１ｖ）Ｌｆ。

水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨａ、分子量３７．８
３）５００ｍｇを次に添加して得た溶液を再び４時間周
囲温度で撹拌した。溶液のｐＨを濃塩酸によって４に調
節した。１５分間かき混ぜた後にｐＨを濃ソーダによっ
て７に調節した。

得られた溶液８２０ｗＪに、ＮａＣ１１６，４ｇを添加
し、次にエタノール１２７０ａＺを添加した。

得られた混合物を３時間放置した後、２０分間２５００
回転／分で遠心分離した。

沈殿物を回収し、次に純エタノール２００ｗＪ中に懸濁
させ、ウルトラ・トウラックス（商標名）を用いて破砕
し、フリット化ビュヒナー（ｂｕｃｈｎｅｒ　ｆｒｉｔ
ｔ＆、ブフナーロート）上の濾過によって回収した。

次にこのものを真空下４０℃で５時間乾燥した。

次の性質 一コデックス用量（ｄｏｓａｇｅ　Ｃｏｄｅｘ）　　８
　ｕ　Ｉ　／ｌａｇ−ＡＰＴＴ用量（ｄａｇａｇ＠ＡＰ
Ｔ？）　　　７　ｕ　Ｉ　／　ｔｒｒｇ−アンチＸ　＆
　７　ｙフタ−８単位（ｕ）／ｍｇを備えた中間体８．
９ｇを回収した。

この組成物の、前記の条件の下に定めたＨＰＬＣ曲線に
対応する分子量分布を第１図に示す。

Ｖ）二基≦ヒニ配立勇 周囲温度で、鉱物質を除いた本釣１２０４中に、前記の
もの８．９ｇを溶解させた。ＮａＣ１１，７８ｇを添加
し、溶液のｐＨを塩酸によって３．５に下げた。鉱物質
を除いた水によって溶液の容積を１７８−に調節した。

純エタノール１５１−を撹拌下に添加した。添加終了後
１５分間撹拌を続けた後、混合物を周囲温度で１０時間
静置した。

沈殿物を、２０分間２５００回転／分で遠心分離によっ
て回収した。この沈殿物を純エタノール１５〇−中に懸
濁させ、ウルトラ・トウラックスによって破砕し、フリ
ット化ビュヒナー上の炉温によって回収し、純エタノー
ル３００−によって洗浄魁、最終的に、２４時間４０℃
で乾燥した。

このようにして、次の性質 一コデックス力価　　　１１ｕＩ／腸ｇ−ＡＰＴＴ力価
　　　　　９ｕＩ／ｍｇ−アンチＸａの力価　　１２ｕ
Ｉ／層ｇを有する生成物ＩＣ１７７２５，０ｇを白色粉
末の形で回収した。

得られた組成物の分子量分布を、第２図に示すが、これ
は、前述の条件の下に定めたＨＰＬＣ曲線に対応してい
る。

巳立二且ｙ上±１ 炭素１３のＲＭＮスペクトルを第５図に示す。

このスペクトルは、２５ＭＨｚ、３５℃で重水中に溶解
させた化合物の溶液中において作成された。化学シフト
をメタノールに対して測定した（５１　・　６　　ｐｐ
ｍ）　。

このスペクトルを吟味することによって、２−〇−スル
ホーα−Ｌ−イズロン（１−＞４）６−０−スルホ−α
−Ｄ−グルコサミン（１−＞４）斂型のジサッカライド
の付勢（ｅｎｃｈａｆｎｅ■ｅｎｔ）の特徴信号が明ら
かにされた。

特に、１０１．７　ｐｐｍ（２−０−スルホ−α−Ｌ−
イズロン酸）の不斉炭素セグメントの存在が確認される
。しかし、ウロン酸の全信号の３０−４０％まで非硫酸
化り−グルクロン酸及びＬ−イズロン酸が存在しうるヘ
パリン調製物のスペクトルとは対照的に、この非硫酸化
り−グルクロン酸及びＬ−イズロン酸（１０４，５ｐｐ
ｍ）の特徴信号は存在しない。

グルコサミンのＣ−２域には、６０．５ＰｐＨ（Ｎ−ス
ルホ−グルコサミンのＣ−２）の信号のみが存在してい
る。Ｎ−アセチル−グルコサミン（５６、４ｐｐｍ）の
特徴信号は、はとんど検出できないが、出発ヘパリン中
には存在している。

グルコサミンのＣ−６域（Ｃ−８−ＯＢについては６２
．５．Ｃ−６−Ｏ５については６９）においては、非硫
酸化種及び硫酸化種の２つの信号の存在が確認される。

重要なことは、信号の強度比が９９．４ｐｐｍ対１０１
．７ｐｐ鳳即ちほぼ１に等しいことであり、これは、２
−０−スルホ−Ｌ−イズロン酸のみが存在していること
を確認する。

Ｎ−７セチルーグルコサミンの若干の残基の存在が示さ
れる。同様に、ＮＨＡｃ信号（２４，６ｐｐ■）も見ら
れる。

嘩 電気伝導度の測定によって定めた硫酸化度は２．３であ
った。ジサッカライド１単位当り電荷数は３．３であっ
た。

１施１」 ｉ）ナトリウム塩としての注射可能なヘパリン（コデッ
クス用量中力価１５４＃１／−ｇ、アンチＸミツアフタ
ー用量中力価１５８単位／諺ｇ）２００ｇを、鉱物質を
除いた水９ｆＬ中に、＋４℃において溶解させた。

濃ＨＣＩによって溶液のｐＨを５．０に調節した。鉱物
質を除いた水５文中に溶解させたメタ過沃素酸ナトリウ
ム２００ｇを＋４℃において緩徐なかき混ぜの下に添加
した。得られた混合物のＰＨを再び濃ＨＣ見によって５
．０に調節した。

得られた溶液を緩徐な撹拌の下に＋４℃の低温の暗室中
に２４時間放置した。

ｉｔ　）次のこの溶液を、透析用の５０木のガツトに分
配し、周囲温度で、鉱物質を除去した流水に対して１４
時間透析した。

ｉｉｉ　）透析終了後に、溶液１４．５１を回収し、ペ
レット状の純ソーダ１１６ｇを添加した。得られた溶液
を３時間周囲温度で撹拌した。

ｉｖ）水素化ホウ素ナトリウム１０ｇを次に添加し、４
時間撹拌を続けた。

溶液のｐＨ１１５分間かけて濃ＨＣ！Ｌによって。

４に低下させた後、再び濃ソーダによって７に調節した
。

得られた溶液の容積は１５．２ｆＬであった０次に、Ｎ
ａＣｕ３０４ｇを添加し、その後にエタノール２２．８
文を添加した。

次にこの混合物を周囲温度で４８時間静置した。透明な
上澄みをサイフオン作用にかけ、沈殿物を回収し、純エ
タノール３交中に懸濁させ、ウルトラ・トウラックスに
よって破砕し、フリット化ガラス上で濾過し回収した。

このものは、真空下４０℃で１５時間かけて最終的に乾
燥した。

次の特性を有するヘパリン画分１８１ｇを回収した。

コデックス用量　　１０ｕＩ／ｍｇ ＡＰＴＴ用量　　　　９ｕＩ／ｍｇ アンチＸａ用量　　　９単位／Ｉ１ｇ 分子量分布は第３図に示す。

Ｖ）この１８１ｇを、鉱物質を除いた本釣３文中に周囲
温度で溶解させた。

ＮａＣｕ３６．２ｇを添加し、溶液のｐＨを濃ＨＣ文に
よって３．５に調節した。

鉱物質を除去した水によって溶液の容積を３．６２ｆＬ
に調節した０次に緩徐なかきまぜの下に純エタノール３
．０７７文を添加した。添加終了後にかき混ぜを１５分
間続けた後、混合物を１０時間周囲温度に静置した。形
成された沈殿物を２０分かけて２５００回転／回転速心
分離によって回収した。このものを純エタノール２文中
に懸濁させ、ウルトラ・トウラックスによって破砕し、
アリット化物上のが温によって回収し、純エタノール３
立によって洗浄し、真空下、４０℃で２４時間かけて最
終的に乾燥させた・次の特性 コデックス力価　　　１３ｕＩ／ｍｇ ＡＰＴＴ力価　　　　１０　ｕ　Ｉ　／　ｒａｇ　　　
。

アンチＸａ力価　　　１３単位／ｍｇ 分子量分布　　　　　第４図参照 を有する白色粉末１０４ｇが最終的に得られた。

実」ｕｌ】 １／−１に　　ヘパリン ナトリウム塩の形とした、ブタの粘液の注射可能なヘパ
リン４５ｇを、鉱物質を除いた水６００−中に溶解させ
た。鉱物質を除いた水２００−中に溶解させたメタ過沃
素酸ナトリウム１８ｇを、５℃で、緩徐なかき混ぜの下
に添加した。濃塩酸を添加して、ｐ）１５に調節し、蒸
留水によって反応容積を９００４とじた。低温（０’−
１０℃）の暗室内に溶液を２４−２６時間保持した。生
成した沈殿は濾過によって除去した。

２／−′ 反応容積（１１０ｗＪ）の１７８の容積をもったイオン
交換樹脂「アンバーライトＩＲＡ４００、Ｃｉ−（米国
、ローム・アンド・ハース社製）上において、ヘパリン
の酸化反応生成物９００ｗＪを２時間かけて濾過した。

鉱物質を除いた水２２５文によってカラムを洗浄した。

この洗浄に濾過溶液を組合せた。過沃素酸塩及び沃素酸
塩の除かれた溶液１１２５ｄが得られた。過沃素酸塩の
不在はタイターメトリー（滴定）によって監視した。ｌ
Ｎ炭酸ナトリウム２　、５ｍｌに対するオキシヘパリン
溶液５−の滴定曲線によって、過沃素酸塩の不在が目視
により確認された。溶解している過沃素酸塩は、ｐＫａ
約７．８において特徴的な屈曲によって示された。

ｐＨ１１，５が得られるまで複数の工程でＩＯＮソーダ
を添加することによってβ脱離を開始した。撹拌下に周
囲温度（１８°−２３℃）で１時間反応を継続した。

４／−と 処理中の反応物質１００ｇ当りＬｏｇの割合で水素化ホ
ウ素ナトリウムを添加した。

この還元は、少くとも３時間撹拌下に行なった０次にＮ
ａＣ１を２５ｇ／ｉ添加して、過剰な還元剤を除去した
後、濃ＨＣ見によって溶液をｐ１４に調節した０次に濃
ＮａＯＨによって溶液のｐＨを中性に調節した。

純エタノール１．５容積を添加して生成物を沈殿させた
。４８−７２時間かけて、沈殿を傾しゃさせ、次にエタ
ノールで脱水し、１２時間かけて真空下に４０℃で乾燥
した。

５／−７ｔＬｙ二二及血ｊ （処理中のヘパリンｌｏｇ当り１８０−の）鉱物質を除
いた水（脱イオン水）中に生成物を仕込み、１０ｇ当り
２ｇｃ７）ＮａＣＪｌを添加した。　ＰＨ３，５に調節
し、処理量１０ｇ当り２００−の容積の、鉱物質を除去
した水の添加によって、溶液を完全にした。

緩徐な撹拌の下に、エタノール０．８５容積を添加した
。４８−７２時間かけて沈殿を傾し令させた。沈殿を仕
込み、純エタノールで脱水し、「ウルトラ・トウラック
ス」　（登録商標）によって破砕し、４０℃で乾燥した
。白色粉末の形の生成物が得られた。

アルコール中に可溶の生成物をＨＰＬＣにて分析した。

少糖類が、３５００のオーダーの分子量を有することが
確かめられた。

６／−ｕ 前記の工程によって得た生成物を、鉱物質を除いた水中
の５％溶液とし、陰イオン交換樹脂「アンバーライトＩ
ＲＡ４００．０Ｈ−（反応容積の１／１０ｆｆｉ）のカ
ラムによって精製した。

生成物を次の特徴について試験した。

硫酸化度（Ｊ、Ｒ，ヘルベルト及びＭ、Ａ、マリニ、「
生化学Ｊ、１９６３．２．１１０１−１１０６の方法に
よって測定） ５０３／Ｃｏｏ−比・・・２．２−２．４抗ＩＩ　ａ活
性及び抗Ｘａ活性 −ＴＣＫ　（１）　　　　　　　　　　４単位／ｌａｇ
−ＵＳＰ（２）　　　　　　　　　１３単位／Ｉ１ｇ抗
ＩＩ　ａ活性（３）　　　　　　１２単位／ｍｇ測定を
行なうために使用した系の参考文献は次の通りである。

（１）Ｒ，Ｒ，ブロクター及びＳ、ラバボー）　　−Ａ
ｎｎ、　　　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　　Ｐａｔｌｏｌ、　　　
１　９６　１　　、　１　６　　。

２１２、−２１９ （２）第２１回米国薬理学会 （３）トロンビン時間の延長による測定（４）Ｅ、Ｔ、
イン、Ｓ、ウニスラー及びＪ。

■、パトラー１Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｗｅｄ、
　１９７３　。

８１．２７８−３１０゜ ＣＣが　　　　　ロン Ｉ　Ｃ１７７２の５％溶液の１００℃、ｐＨ３における
１時間の５ｗ１ｔｈ分解は、Ｃ２と０３間の開裂、すな
わち、ウロン酸レベルのオリゴ糖鎖の特異な切断を銹発
する。その結果、屈折計による検出を伴うＴＳＫ２００
０を用いたゲルー過により観察したところ、製剤の平均
分子量は低下していた。

結果は、以下のように表わすことができる二Ｍｎａは、
以下のような被験製剤の％１．　％１１．　ＹＡＩＪ。

Ｊ、　Ｊ、　ＫＩＲＫＬＡＮＤ及びり０口、　ＢＬＹの
定義［Ｍａｄｅｒｎｓｉｚｅ　　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　
　１ｉｑｕｉｄ　　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　　
（最新サイズ除外液体クロマトグラフィ）、　ｌ＋Ｈ１
ａ７Ｉｎｔｅｒｇｃｉｅｎｃｅ出版〕によるｒｎｕ鳳ｂ
ｅｒ　ａｕｅｒａｇｅｍｏｌｅｃｕ、１ａｒｗｅｉｇｈ
ｔ　　（数平均分子量）」テある；Ｍｎｂは、上述のよ
うに５ｗ１ｔｈ分解を行なった後の「数平均分子量」を
表わす。

（Ｍｎ　ａ／Ｍｎｂ）−１は、オリゴ糖鎖によるこの５
ｗ１ｔｈ分解に感応する部位の数を与える。

これは、Ｃ２とＣ３間開裂ウロン酸の数に等しい。

試験は２０ツトのＩＣ１７７２製剤について行なわれた
。

（表） Ｐ　４８　ＶＨＰ　５５　ＶＨ Ｍ　ｎ　ａ　　　　　　　　５５０３　　　　５５７３
Ｍ　ｎ　ｂ　　　　　　　　３８９８　　　　３７４５
（Ｍｎａ／Ｍｎｂ）　　　０．４　　　　０．５従って
、この分析条件下で、ＩＣ１７７２が少なくとも２鎖に
１つの開裂ウロン酸を含んでいることがわかる。

ａ）いろいろの系統においての試験管中の抗１１ａ及び
抗Ｘａ活性 ｂ）　　）ロンピンによる凝固時間（ＴＣＴ）について
得られた結果を次表に示す。

Ｔ　ＣＫ　１　　　　　　　　　１０　　　　　１８０
Ｕ　Ｓ　Ｐ２１３−１５　　　　　１８０抗ＩＩ　ａ活
性３１１３　　　　　１８０測定を行なうために使用し
た系についての引用文献は次の通りである。

（１）Ｒ，Ｒ，ブロクター及びＳ、ラバボート　、　　
Ａｎｎ、　　　Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｐａｔｈｏｌ、
　　　１　９　６　１　　、　３　６　　。

（２）第２１回アメリカ合衆国薬理学会報（３）トロン
ビン時間の延長による測定（４）Ｅ、Ｔ、イン、Ｓ、ウ
ニスラー及びＪ。

■、パトラーＪ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、
　１９７３　。

炙１．２９８−３１０ ｉｉ）ＴＣＴ ＡＰＴＴ活性を研究するために利用された３つの形式の
血漿についての３回の実験の結果を、秒（ｓｅｅ）で表
わした凝固時間の形で次表工に示す。正常な血漿媒質中
において実験を行った。これらの結果は、２回の独立し
た実験の平均を表わしている。

表工 ２．５　　３８　　２８　　２４　　　　２２５ルｇ／
ｒｄ特に１０ｐｇ／−の用量において、ＨＣＩＩに依存
すると思われるトロンビン時間の増大が見られる。

中　　　・　　　、　　　　　ＣＭＬ　　　　　　　　
の止 実ｌピＬｆを　　　　　・ スプラーグ・ドーリ一種のラットの大動脈の腹部の１区
画から採取した平滑筋細胞（ＣＭＬ）を使用した。ウシ
の胎児の血清２０％を添加したＲＰＭＩ−１６４０媒地
中において小片状の試料を培養した。ｌ−２週間後にＣ
ＭＬは組織外に移行して増殖し始めた。

多数のピットを有する板（複数）中において５−８・ｉ
ｏｓ個のＣＭＬを培養した。２４時間後に、洗浄と、７
２時間かけたＲＰＭＩ＋２％脱ブラケット（ｄｅｐｌａ
ｑｕｓｔｔｅ）　［ｌＩＩ漿（又はＲＰＭＩ＋０．４％
５ＶＦ）媒地の添加によって、ＣＭＬの成長を停止させ
た。

次にこれらの細胞を、いろいろの濃度で、被験化合物と
共にか、又はなしに、５ＶＦ２０％を添加したＲＰＭＩ
培地中に５−７日間移した。

対照試験又は被検生成物を添加した試験においてのＣＭ
Ｌの正味の成長は、実験終了時の細胞の数から出発時の
細胞の数（クールデー計数器による複式の計数による）
を減算することによって求められる。

阻止率（％）は、次式によって与えられる。

阻止率（％）！ （カステロ等、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、、　１０
２　。

１９８６．１９７９−１９８４） Ｉ　Ｃ１７７２培養物の濃縮によって得た成果は次の通
りである（比較のために、ヘパリンを用いて得た阻止値
も示す） １虚隻ＪＬ　　　　　　　　ＬＬ！！ １ＣＩ？？２　　　　ヘパリン １ルｇ／−培養物　　　２５　＄　　　　　２０　＄１
０ルｇｏｄ　　／／　　　　　４５　　　　　　Ｈ１０
０ルｇｏｄ　　／／　　　　　７０　　　　　８０この
実験モデルにおいて、標準ヘパリンの活性に非常に近い
活性が見られる。

刃金５ケ月、体重的５００ｇの、スプラーグ・ドーリ一
種の雄ラットについて実験を行なった。

ラットを麻酔させ、左頚動脈の内皮を、頚動脈の外側分
枝に挿入した栓塞切除用バロン・カテーテルの腔内挿入
によって剥除した。

被検生成物又は無菌の対照溶液を左頚静脈中にラクトー
ス添加リンゲル溶液中に絶えず潅流させることによって
投与した（ラットの背中に配置したアルツェット（Ａｌ
ｇｅｔ）製潅流浸透ポンプを使用した）、１時間２終文
の割合で４週間この処理を継続した。投与した量は、１
　ｍｇ／　ｋｇ／時間であった。

２８日後にラットを麻酔し、！ｌ動脈を採取した。麻酔
前１７．９．１時間、トリチェ（ｔｒｉｔｉｅｅ）チミ
ジンを腹膜内注射によってラットに投与した。

結果は、次の計算に従って、損傷した右側の頚動脈（Ｃ
Ｄ）と損傷しない左側の頚動脈（ＣＧ）とのＤＮＡの含
量によって表わされる。

阻止率（％）＝ （Ａ、Ｗ、クローズ及びＭ、Ｍ、クローズ、Ｌａｂｏｒ
、Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、、１９８５　、５２　（６）　、
　６１２１０匹のラットに対する最初の実験においては
、被検生成物ＩＣ１７７２の場合、ヘパリンの阻止率に
近い阻止率（約５０％）が得られた。

１止及五皿上 ヘパリンは、Ｃ，ｂとＢとの間の２分子鎖体の形成を阻
止することによって、補体の交互増幅Ｃ３コンベルダー
ゼの生成を阻止する。

蛋白質Ｃｓｂ　（Ｅ’　Ｃａｂ）を保持する羊の赤血球
及Ｕ　１２’ｌ　（１２１ＪＩ　−Ｂ　）　ノ４１１に
＆　モッタ蛋白質を利用してＣ３ｂ−Ｂ結合に対する生
成物ＩＣ１７７２及びヘパリンの効果を研究した。

ここにＩＣ５０は、錯体ないしは複合体ｃ、ｂ−Ｂの形
成を５０％禁止するために必要な、試験された少糖類又
はヘパリンの濃度を表わしている。

生成した蛋白質系において試験管内で測定を行った。

支並五 ３０分間３０℃で０．１％のゼラチンと５ｍＭのＭｇ計
を含有するベロナール緩衝液中において、いろいろの濃
度の１２５１−ＢでＥ３Ｃ３ｂ（０，７５−２，５Ｘｌ
Ｏツ）を培養した。

容量０．５ｓＪのポリプロピレン管中に、ジブチルフタ
レート（フランス国、メルクークレベノー製）とジノニ
ルフタレート（フランス国、パリ市、コシエール製）の
混合物（７：３マｌす３００μ皇中に、各々の反応につ
いて２つずつの７０ｇ１及び３００　ｕ４のサンプルを
入れた。

ベックマン型マイクロヒュージ（フランス国、パリ市、
ベックマン製）中において、１分間８０００ｇ　（ジー
）で管を遠心分離に付し、次に沈殿物の直上において切
断した。結合した配位子の放射能をカウントした。

ヘパリンと比較してＩＣ１７７２生成物の用量を定めた
。ＩＣ５０として表わしたこの結果は次の通りである。

ＩＣ１７７２０，４終ｇ／ｄ 標準ヘパリン　　０．５終ｇ／− 註直座１ 実験前１５分及び１時間に５　ｙｒｇ／　ｋＨの用量で
家ウサギに５　ｍｇ７　ｋｇの用量で静脈注射によって
生成物を投与した。

実験モデルは、カードのモデルであり、これは、カード
等、Ｔｈｒａｓｈ、　Ｒｅｓ、３５　、６１３−６２５
．１９８６に記載されている。

静脈注射による５ｍｇ／ｋｇの用量においての出血時間
のいかなる増大も生成物が惹起させないことが、実験に
よって示された書 Ｉ　Ｃ１７７２ロンビン　　　　−・ 使用したモデルは次の通りである。

筋肉内注射による、「ケタセット」（ブリストル・ラボ
ラトリーズ、米国ニューヨーク州、シラキューズ、商標
名）　７０　ｍｇ／　ｋＨによって、動物を麻酔した。

外科技法によって、左右の頚動脈から２ｃｍの長さの切
片を採取した。トロンビン生成物質、例えば、まむし毒
（ｖｅｎｊｎ　ｄｅ　ｖｉｐｅｒｅ　ｖｅｎｕｍ）とプ
ロトロンビン濃縮複合体の混合物の注射の正確に５分前
に、被検生成物を、耳の末梢静脈内に注射した。２０秒
後に、頚静脈を結紮し、１０分間の閉塞後に、血管の切
片を取得し、これを生理血清中に入れ、Ｏ−４スケール
（４は自由な赤血球中の単一の血餅を表わす）に従って
、血餅形成の度合を評価した（ファレード、Ｊ、ウォレ
ンガー、Ｊ　、Ｍ、キラマー２及びＡ、ロック共著。

「ヘパリン及びそのフラクションの抗トロンビン作用を
研究するための変形されたスタンス・トロンボシスモデ
ル）。

１０頭の家兎の群に１ａ＋ｇ／ｋｇの用量で静脈を経て
投与されたＩＣ１７７２は、全ての動物について良好な
抗トロンビン活性を示した。

【図面の簡単な説明】

第１−３図及び第２−４図は、還元された解重合混合物
及び本発明による組成物のＨＰＬＣ曲線をそれぞれ示す
線図、第５図は、本発明による組成物の”Ｃ−ＲＭＮス
ペクトルを示す線図である。 −−〇 手続補正書 昭和６３年　７月１１日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第　９１８９１号 ２、発明の名称　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　番３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　サノフィ ４、代理人 ５、補正命令の日付　自　発 ［１発明の詳細な説明の欄を以下のように補正す５゜ け）明細書第４７頁の表ｉ）中に記載のｒ　　　ＩＣ１
７２２標準ヘパリン （μｇ／ｍｇｌ　　　　（μｇ／　ｍｇ）　Ｊを、ｒ　
　　　ＩＣ１７２２標準ヘパリン ［単位（ｕ）／ｍｇｌ　　　［単位（ｕ）　／　ｍｇｌ
　Ｊ＝補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗凝固活性がほぼ完全に失われている低分子量のヘ
   パリン組成物において、非硫酸（塩）化ウロン酸−Ｎ硫
   酸塩グルコサミン型の、二糖類の鎖のないフラグメント
   から基本的に成り、これらのフラグメントが、次の一般
   式（ I ） Ｒ−（Ｘ−Ｙ）＿ｎ−Ｒ′（ I ） に対応し、ここに −Ｘは、次式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） による、硫酸化イズロン酸の単位を表わすか、又は、少
   なくとも鎖２つについて１単位の割合で、次式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） による、２位置と３位置の炭素原子の間で開環した非硫
   酸化ウロン酸（Ｄグルクロン酸もしくはＬ−イズロン酸
   ）の単位を表わし、 −Ｙは、次式（IV） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） によるＤ−グルコサミン単位を表わし、 Ｒ＿１は、水素原子又は−ＳＯ＿３＾−基を表わし、Ｒ
   ＿２は、−ＳＯ＿３＾−又は−ＣＯ−ＣＨ＿３基を表わ
   し、基−ＳＯ＿３＾−の割合は、少くとも約９０％であ
   り、 Ｒ＿３は、−ＳＯ＿３−基又は水素原子を表わし、−Ｓ
   Ｏ＿３＾−基の割合は、少くとも約７０％であり、 Ｒは、水素原子を表わすか、又は、単位 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） を表わし、 Ｒ＿１−Ｒ＿３は、前記の意味を有し、 Ｒ＿４は、水素原子又はウロン酸残基を表わし、−Ｒ′
   は、水素原子を表わすか、天然のウロン酸単位を表わす
   か、過沃素酸による酸化の間に変性され、そのアルデヒ
   ド官能基がアルコールに還元されている、ウロン酸残基
   を表わし、 ｎは、主要な化学種について７≦ｎ≦１５であり、これ
   は、分子量約４８００−９０００の鎖に対応する ことを特徴とするヘパリンの組成物及びその薬理学的に
   認容可能な塩。 ２）二糖類単位について平均３．３の電荷を示すことを
   特徴とする請求項１項記載の組成物。 ３）２０５ｎｍ側光検出器に結合されたＴＳＫ２０００
   ＳＷカラムによって定めたＨＦＬＣにおいて、０．５Ｍ
   　Ｎａ＿２ＳＯ＿４を１ｍｌ／分の流量において、溶剤
   として、使用して、 −平均分子量（ｐｏｉｄｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ　
   ｍｏｙｅｎ）が６０００−７０００Ｄａのオーダー、よ
   り正確には５８００−７０００Ｄａ、特に、６０００Ｄ
   ａのオーダーであり、化学種の７０％が４８００−９０
   ００ダルトンであり、９０％が、３６００−１１０００
   Ｄａであり、 −ピークの頂点の分子量が、６０００−６５００Ｄａの
   オーダーであり、より正確には、５５００−６５００Ｄ
   ａ、特に、５５００−６０００Ｄａのオーダーであり、 −鎖の５％以下が十二糖類よりも少なく、 −鎖の５％以下が１１，０００を超過していることを特
   徴とする請求項１又は２記載の組成物。 ４）ＲＭＮスペクトルが第５図に対応している請求項１
   −３のいずれか１記載の組成物。 ５）予め過沃素酸塩の作用を与えた後、過沃素酸による
   酸化の際に形成されたアルデヒド基を還元した、ヘパリ
   ン鎖に強塩基を作用させることによる、ヘパリンの解重
   合の生成混合物を、鉱物塩の存在下にアルコールによっ
   て分別することによって得られた、ヘパリンのフラグメ
   ントによって形成された組成物。 ６）ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウ
   ムの塩の形でそのフラグメントが存在していることを特
   徴とする請求項１−５のいずれか１記載の組成物。 ７）請求項１記載の低分子量のヘパリン組成物の製造方
   法において、 ａ）最終濃度が０．５−５容量％のヘパリン水溶液を、
   ０〜１０℃の温度で、ｐＨ４．５−６．５において最終
   濃度が０．５−４容量％の過沃素酸によって処理し、 ｂ）得られたヘパリン鎖を、塩基の最終的なモル濃度が
   ０．１−０．３Ｎの強塩基で処理し、 ｃ）得られた解重合フラグメントを還元剤で処理し、 ｄ）場合により、過剰な還元剤を除去した後、アルコー
   ル溶剤を用いて、鉱物塩の添加後に、還元されたフラグ
   メントを沈殿させ、 ｅ）鉱物塩が添加された、前記のようにして得た沈殿の
   水溶液を、アルコールによって処理し、 ｆ）前記のように生成した沈殿を回収し、必要ならば、
   使用した強塩基に対応する塩を、薬理学的に認容可能な
   別の塩に変換する ことを特徴とする製造方法。 ８）次の工程、即ち −最終的な濃度が０．５−５容量％のヘパリン水溶液を
   、光線を遮断した状態で、１５−４８時間０°−１０℃
   のの温度で、ｐＨ４．５−６．５において、最終的な濃
   度０．５−４容量％によって、過沃素酸塩と反応させ、 −得られたヘパリン鎖を、約１１以上、特に１１−１２
   、有利には１１．２−１１．６、好ましくは１１．５の
   ｐＨにおいて、塩基の最終的なモル濃度が約０．１−０
   ．３Ｎとなる量において、強塩基例えば炭酸ナトリウム
   を添加することによって、解重合し、 −還元剤を用いて、解重合フラグメントを還元し、必要
   ならば未反応の還元剤を除去した後に、 −還元されたヘパリンのフラグメントが不溶の溶剤を用
   いて該フラグメントを沈殿させて回収し、 −予め単離した沈殿を水に溶解させ、生成した沈殿を回
   収して、鉱物塩の存在下に、得られた水溶液のアルコー
   ル分別によって、所望のフラグメントを単離する各工程
   を組合せて含むことを特徴とする請求項７記載の製造方
   法。 ９）過沃素酸による酸化工程において、最終的な濃度が
   それぞれ１．５−５容積％及び１．５−２．５容積％と
   なる量においてヘパリンと過沃素酸塩とを使用すること
   を特徴とする請求項７又は８記載の製造方法。 １０）ｐＨ５．４℃で過沃素酸による酸化工程を行なう
   ことを特徴とする請求項７−９のいずれか１に記載の製
   造方法。 １１）過沃素酸塩がメタ過沃素酸ナトリウムである請求
   項７−１０のいずれか１に記載の製造方法。 １２）多孔率（透過性）が３−４０００Ｄａの透析ガッ
   トを用いて約１５時間残留過沃素酸塩を除去するための
   透析を行なうことを特徴とする請求項７−１１のいずれ
   か１に記載の製造方法。 １３）ｐＨを７に調節した後、鉱物塩、例えば、ＮａＣ
   ｌを添加し、次に１−１．５容量の溶剤、例えば、エタ
   ノールを添加して、還元ヘパリンフラグメントを回収す
   ることを特徴とする請求項７−１２のいずれか１に記載
   の製造方法。 １４）最終的な濃度が１％となるように、鉱物塩を添加
   した水に、還元されたヘパリンの沈殿フラグメントを５
   容積％の割合で溶解させ、この溶液のｐＨを予め３．５
   に調節し、アルコール系溶剤、例えば、エタノール０．
   ６５容量を添加することを特徴とする請求項７−１３の
   いずれか１に記載の製造方法。 １５）請求項１−１６のいずれか１に記載の組成物の有
   効量を薬理学的な賦形剤と共に含有することを特徴とす
   る医薬組成物。 １６）皮下注射の場合には約１０−１５０ｍｇ／ｍｌ静
   脈内注射又は潅流の場合には約１０−１００ｍｇ／ｍｌ
   をそれぞれ含有する注射可能な無菌の濃溶液の形で存在
   させることを特徴とする請求項１５記載の医薬組成物。 １７）請求項１−６のいずれか１に記載の組成物によっ
   て形成された生物学的反応物質。