PT87261B

PT87261B - Processo de preparacao de heparinas de baixo peso molecular com estrutura regular e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT87261B
Application number: PT87261A
Authority: PT
Inventors: Maurice Petitou; Jean Choay; Jean-Claude Lormeau
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1987-04-16
Filing date: 1988-04-15
Publication date: 1992-08-31
Also published as: IE64884B1; FI88046B; JPS63278901A; IL86091A0; KR880012644A; NO170940C; US4990502A; EP0287477B1; DE3851973T2; FR2614026A1; ATE113611T1; CA1327968C; DK210388D0; ZA882662B; FI88046C; DK210388A; FI881783L; NO170940B; DK173982B1; FI881783A0

Description

invento tem por objecto o processo de preparação e as aplicações biológicas das heparinas de baixo PM com estrutura regular.

invento visa em particular as heparinas de baixo PM que apresentam uma actividade no domínio da regulação de certos sistemas fisiológicos sendo, simultaneamente, quase totalmente desprovidas da actividade anti-coagulante que se exerce por via da antitrombina III (ATIII),

E conhecido que a heparina possui uma actividade anticoa. gulante que se exerce principalmente por via da antitrombina III (ATIII).

Os trabalhos efectuados sobre as relações estrutura/actX vidade da heparina mostraram que este tipo de actividade anticoagulante se encontra muito particularmente correlacionada com as regiões ditas irregulares da heparina, mais especialmente com a região correspondente ao pentassacárido de estrutura

DEFGH, descrito no pedido FR 2 535 324

de fórmula:

Sabe-se igualmente que certas actividade da heparina, ou de fragmentos de heparina, podem ser mantidas até certo ponto, na ausência do sítio de ligação à AT III quando este é modificado, não se conhecendo no entanto as estruturas responsáveis por essas actividades.

Assim, Folkman e col. (Science Vol. 221 - 1983 - págs. 719-725) referiram uma acção inibidora da angiogénese, por mis. turas de hexassacáridos desprovidos de actividade anticoagulan

5(?θ

10912 0 < < É¹

-4te, utilizadas em associação com corticóides.

Karnou/sky e col. efectuaram experiências com heparinas O-dessulfatadas e N-dessulfatadas e mostraram que elas possuí am sempre uma certa proporção, mas em menor grau, as activida des inibidoras da heparina padrão, sobre a proliferação das células do músculo liso.

P_or outro lado foi evidenciada uma actividade anti-complemento da heparina, independente da actividade anticoagulari te.

Outros trabalhos mostraram que a actividade anticoagulajn te da heparina podia ser modificada, efectuando cortes ao nível dos carbonos dos ácidos urónicos não sulfatadas, com o auxílio do per-iodato de sódio.

Assim, Fransson e Leuiis descreveram, em Febs, Letters. vol. 97, na. 1, pág. 119-123, 1979, condições operatórias que consistem em submeter a heparina à acção do per-iodato, quer a pH3e49C, quer a pH 7 e 379C. As cadeias de heparina obtidas são oxidadas selectivamente ao nivel dos ácidos D-glucurónicos no primeiro caso, enquanto que se obtém uma oxidação ao nível de todos os motivos ácidos urónicos não sulfatados, com o segundo tipo de condiçães.

As cadeias resultantes são reduzidas por NaBH^ ou fragme_n tadas de acordo com um procedimento de β eliminação em meio a.1 calino.

Os autores concluem que a oxidação e a clivagem dos moti vos ácido D-glucurónico se traduzem por uma ligeira diminuição dos pesos moleculares mas com retenção da actividade anticoagu, lante.

Pelo contrário, o corte dos ácidos D-glucurónico e L—idu rónico não sulfatados, a pH 7 e a 379C, provoca a supressão da actividade anticoagulante e uma maior fragmentação da molécula.

Num artigo publicado em Carbohydrate Research 36, págs. 339-348, 1974, Fransson referiu a oxidação per-iódica dos moti vos urónicos no sulfato de dermatano a vários pH, a 4SC ou 37°C.

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-50 autor indica que trabalhando a pH 5, os cortes ao nível dos ácidos glucurónicos não se efectuam senão numa proporção inferior a 5% e que trabalhando a pH 3 estes cortes não se efectuam de todo. Estes resultados surgem pois em contradição com os obtidos com a heparina, para a qual a pH 3 cs cortes se efectuam preferivelmente ao nível dos ácidos D-glucurónico.

A acção do per-iodato foi igualmente referida por Casu e col. em Arzneim. Forsch./Drug Res. 36 (1) n9. 4, pág, 637-642, 1986.

De acordo com esse artigo, submetem-se diferentes preparações de heparina a uma oxidação per-iódica (pH 5,3 a 49C durante 24 h) que provoca a clivagem entre os átomos de carbono nas posições 2 e 3 de todos os ácidos urónicos não sulfatados. A título de referência, submete-se uma preparação a uma etapa posterior de hidrólise ácida parcial e os fragmentos obtidos são sujeitos a diálise.

Esta etapa de hidrólise ácida parcial conduz a uma fragme.n tação importante das cadeias e a uma destruição, pelo menos par. ciai, de grupos funcionais como indica Fransson em Carbohidr. Res. 80, 131-145 (1980).

Além disso, de acordo com este método, obtém-se obrigatoriamente uma mistura de cadeias de PH variado, num intervalo largo, em particular numerosos di, tetra e hexassecáridos.

Os autores do invento puseram em evidência que para a obtenção de composições farmacêuticas estáveis, utilizáveis em terapêutica para a regulação de certos sistemas fisiológicos, são essenciais as seguintes características, combinadas: comprimento dos fragmentos; taxas de carga; ausência do sítio de ligação à AT III, a fim de evitar os efeitos indesejáveis ligados a uma activida. de anticoagulante.

estudo dos processos de corte com o auxílio de ácido per-iódico e dos meios de fragmentação, levaram os autores do invento a constatar que realizando a oxidação per-iódica em

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condições operatórias específicas, mas pondo igualmente em prática uma combinação de etapas particulares é possíuel obter uma composição de fragmentas de heparina de baixo PR, mas num intervalo favorável, desprovidos do sítio de ligação à AT III, conservando pelo menos a maior parte dos seus grupos funcionais .

invento tem portanto por objectivo proporcionar composições de heparina que, nas doses activas, sejam dotadas de propriedades farmacológicas de grande interesse, sensivelmente equivalentes às da heparina, sem apresentarem os inconvenientes de serem dotadas de propriedades anticoagulantes.

invento visa igualmente proporcionar um processo de fragmentação da heparina que permita obter fragmentos de dado PM, desprovidos no entanto do sítio de ligação à AT III, e cujas taxas de carga correspondem sensivelmente às das sequências correspondentes nas cadeias de heparina natural.

invento visa igualmente as aplicações destas composições na elaboração de medicamentos activos, ncmeadamente para a regulação de certos sistemas fisiológicos.

As composições do invento são caracterizadas pelo facto de serem essencialmente formadas por fragmentos desprovidos de cadeias dissacarídicas do tipo ácido urónico não sulfatado-^-sulfato de glucosamina, correspondendo esses fragmentos à fór, mula geral I, seguinte:

R - (X-Y) -R ^{v 1} n

na qual

X representa quer um motivo ácido idurónico sulfatado de fórmula II:

coc

OH (II)

.67 56Θ

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quer à razão de 1 motivo por 2 cadeias, pelo menos, um motivo áci do urónico (D-glucurónico ou L-idurónico) não sulfatado, aberto entre os carbonos nas posiçSes 2 e 3, de fórmula III:

(III)

Y representa um motivo D-glucosamina de fórmula IU:

(IV) . sendo, R^ um átomo de hidrogénio ou um grupo -30^ . R£, um grupo -S0^ ou -CO-CH^, sendo a proporção dos grupos -S0^“ de cerca de pelo menos 90/, e . R^ um grupo -30^” ou um átomo de hidrogénio, sendo a proporção dos grupos -30^“ de cerca de pelo menos 70/,

R representa um átomo de hidrogénio ou um motivo:

(V) sendo R·^ e Rj definidos como acima, e

5^8

0912 0 ' .....

-8. representando R^ um átomo de hidrogénio ou um resíduo de ácido urónico,

- R' representa quer um átomo de hidrogénio, quer um motivo ácido urónico natural, quer um resíduo de ácido urónico modifi cado no decurso da oxidação per-iódica e cujas funções aldeído tenham sido reduzidas a álcoois, com 7^n%15 para as espécies maioritárias, o que corresponde a cadeias de PM de cerca de 4800 a 9000, e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Notar-se-á que os motivos X abertos são os motivos que, no decurso da etapa de beta-eliminação a pH alcalino, permaneceram integrados na cadeia glicosaminc-glicânico. Trata-se, quer de um ácido D-glucurónico não sulfatado, quer do ácido L-idurónico não sulfatado, cujas ligações entre os carbonos nas posições 2 e 3 tenham sido cortadas.

As composições do invento tais como caracterizadas em HPLC determinado com uma coluna TSK 20C0 SW acoplada a um detector fotométrico a 205 nm, utilizando Na^SO^ 0,5M como solvente, com um débito de 1 ml/min, apresentam:

um peso molecular médio da ordem dos 6000-7000 Da, mais pre cisamente de 5800 a 7000 Da, nomeadamente da ordem dos 6000 Da, estando 70% das espécies compreendidas entre 4800 e 9000 dalton e 90% entre 3600 e 11000 Da, um peso molecular do topo do pico, da ordem dos 6000 a 6500 Da, mais precisamente de 5500 a 6500 Da, nomeadamente da ordem de 5500 a 6000 Da, menos de 5% de cadeias inferiores às dosdodecassacáridos. menos de 5% de cadeias acima de 11000.

De acordo com um outro aspecto, as composições de hepari. na do invento são obtidas por fraccionamento, com o auxílio de álcool, em presença de um sal mineral, duma mistura resultante da despolimerização da heparina, por acção duma base forte sobre as cadeias de heparina submetidas previamente à acçõo de per-iodato, sendo a despolimerização seguida duma redução dos grupos aldeído formados no decurso da oxidação per-iódica.

G7 568 ,09120

-9Duma maneira vantajosa, as composições do invento apresentam uma relação entre as taxas de grupos sulfato SO^^- e de grupos carboxilo COO por mole, compreendida entre 2,2 e 2,8. Esta relação é especialmente de 2,4. Esta taxa elevada em relação aos valores médios das cadeias de heparina, resulta da estrutura das cadeias de heparinas de baixo peso molecular de acordo com o invento, que são constituídas essencialmente por unidades dissacarídicas trissulfatadas. Estas heparinas de bai. xo PM dizem-se de estrutura regular, tendo em conta a presença destas unidades dissacarídicas e em referência à literatura ci entífica (PERLIN A.S., CASU, S. SANDER50N, GR. 220 MHz spectra of heparin, chondroitins and other mucopolysaccharides. Can. 0. Chem. 1970; 48:2260-8).

invento visa igualmente os sais destas composições, em particular os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio, bem como os sais de catiões orgânicos fisiologicamente aceitáveis.

invento tem igualmente por objecto um processo de prede composições de fragmentos de heparina, tal como deacima, compreendendo a oxidação controlada da heparina paração finidas com o auxílio de per-iodato processo do presente invento é caracterizado por:

a) se tratar uma solução aquosa de heparina com uma con centração final de 0,5 a 5% (p/v) com ácido per-iôdico a uma concentração final de 0,5 a 4% (p/v), a um pH de 4,5 a 6,5, a uma temperatura de 0 a 109C;

b) se tratarem as cadeias de heparina assim obtidas com uma base forte, a um pH superior a cerca de 11;

c) se tratarem os fragmentos de despolimerização assim obtidos com um agente redutor;

d) após eliminação eventual dc agente redutor em excesso, se precipitarem os fragmentos reduzidos, após adição dum sal mineral, com o auxílio dum solvente alcoólico;

e) se tratar uma solução aquosa do precipitado assim obtido adicionado de um sal mineral, com álcool para eliminar os fragmentos de peso molecular muito baixo;

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.....-5»***

f) se recuperar o produto precipitado assim formado se transformar, eventualmente, o sal correspondente à base te utilizada, num outro sal farmaceuticamente aceitável.

for

Notar-se-á que a etapa e. corresponde a um fraccionamento, destinado a eliminar certas cadeias, e não a uma precipitação global.

Mais particularmente, este processo compreende em combinação as etapas seguintes:

oxidação controlada da heparina realizada pela reacção da heparina, em solução aquosa com uma concentração final de 0,5 a 5% (p/v) com um sal do ácido per-iódico a uma concentração final de 0,5 a 4% (p/v), a um pH situado entre 4,5 e 6,5, de preferência a um pH te cerca de 15 a 48 de 5, a uma temperatura h, ao abrigo da luz, de 0 a 1090, durajn das cadeias de heparina despolimerização ção de uma base forte tal como a soda, a um

11, especialmente compreendido entre 11 e 12, de 11,2 a 11,6, de preferência próximo de 11,5 de te obtidas, por adipH superior a cerca vantajosamenum de redução dos fragmentos de despolimerização com agente redutor e, em seguida, eliminação, caso agente redutor que não tenha reagido;

recuperação dos fragmentos de heparina reduzidos pitação com o s, por preci auxílio de um solvente no qual sejam insolúveis,

- isolamento com o auxílio solução aquosa obtida por dissolução em água do precipitado anteriormente isolado, e recuperação do precipitado formado.

dos fragmentos pretendidos por fraccionamento de álcool, em presença de um sal mineral, de uma

A realização da despolimerização segundo um procedimento dc invento, composição e possuindo particular, combinada com a utilização no processo de uma etapa de fraccionamento, permite isolar uma de fragmentos com um perfil terapêutico particular especialmente um índice terapêutico satisfatório.

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-11ducentes a concentrações finais respectivas de 1,5 a 5/ o de 1,5% a 2,5% (p/v).

sal do ácido per-iódico é constituído vantajosamente por metaper-iodato de sódio.

Para eliminar o per-iodato residual efoctua-se uma diáli se com canais de diálise possuidores de uma porosidade de 3 a 4000 Da, durante cerca de 15 h.

Pode igualmente proceder-se por cromatografia sobre res_i na permutadora de aniões por exemplo sobre uma resina como a comercializada sob a marca Amberlite IRA 400, sendo esta resina utilizada em quantidade suficiente para reter o per-iodato residual e os derivados do per-iodato formados no decurso da reacção, por exemplo 1/6 a 1/8 do volume reaccional. Este pro cedimento mais rápido que a diálise, de grande reprodutibilida. de, permite proceder à beta-eliminação a partir de condições facilmente padronizáveis.

De acordo com um modo de realização preferido do processo do invento, coloca-se a heparina em solução em água, mais esp.e cialmente água desmineralizada, a 49C, numa concentração de cerca de 5% (p/v), adiciona-se um sal do ácido per-iódico tal como o metaper-iodato de sódio de maneira a obter uma concentração final de cerca do 2,. (p/v). 0 pH da solução é imediata mente ajustado a 5 com o auxílio de ácido clorídrico diluído ou de soda diluída.

A solução ê deixada na obscuridade, a +420, de preferência durante 24 horas.

A fim de eliminar o per-iodato residual, efectua-se uma diálise com canais do diálise possuindo uma porosidade de 3 a 4000 Da, durante cerca de 15 horas, contra água desmineralizada corrente.

As cadeias de heparina obtidas, são submetidas a um passo de despolimerização em meio básico.

Para este efeito, adiciona-se uma base forte, mais especialmente, uma lexívia concentrada de soda, de maneira a obter

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-12uma molaridade final em base,

A solução básica obtida horas à temperatura ambiente.

é submetida a agitação durante 2

Submetem-se então os fragmentos de de redução, a fim de da quebra da ligação motivos urónicos.

despolimerização da transformar os grupos entre os átomos de agente redutor como o boro-hidreto de sóe ma_n heparina a um passo aldeído resultantes carbono C? ^e ^3 dos

Utiliza-se um dio, à razão de 50 mg por grama de heparina introduzida, tém-se a agitação durante 6 horas à temperatura ambiente.

do pH drico, tos.

agente redutor não reagido é destruído por abaixamento a 4, com o auxílio de um ácido, por exemplo ácido clorívantajosamente sob agitação, durante cerca de 15 minuOs fragmentos reduzidos de heparina são recuperados por precipitação.

Vantajosamente, ajusta-se 0 pH a 7 com 0 auxí base, especialmente hidróxido de sódio concentrado, adicionam-se 20 g/litro de sal mineral e efectua-se tação com 0 auxílio de 1,5 volumes de álcool.

sal mineral utilizado é vantajosamente constituído por cloreto de sódio. Para a precipitação alcoólica recorre-se preferivelmente ao etanol.

□ etanol, e precipitado formado é recuperado por centrifugação, la vado com um solvente no qual seja insolúvel, como seco a 409C, sob vácuo.

Para isolar deste precipitado os fragmentos recorre-se a um passo de fraccionamento,

Realiza-se vantajosamente um fraccionamento procedendo como se segue:

o precipitado de fragmentos de heparina é r lução em água, mais especial mente água desmineral peratura ambiente, da ordem de 18 a 20°C, de form concentração de 5% (p/v).

dc invento, alcoólico,

56,8

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-13Adiciona-se um sal mineral, como o cloreto de sódio, em quantidade suficiente para obter uma concentração final de 1’·. 0 pH da solução è ajustado a 3,5 com ácido, por exemplo ácido clorídrico diluído.

Adiciona-se então sob agitação moderada, 0,85 volumes de um solvente no qual os fragmentos pretendidos sejam insolúveis, como etanol.

A mistura é deixada em repouso durante cerca de 10 horas a 18-2030.

precipitado á recolhido por centrifugação, lavado com um solvente como o etanol e seco sob vácuo a 4030 durante 24 horas.

Este precipitado pode eventualmente ser submetido a um passo de purificação suplementar, após reposição em solução em água desmineralizada, por cromatografia sobre uma resina permu tadora de aniães, tal como uma resina Amberlite I8A 400, OH com um volume da ordem de 1/10 do vclume reaccional, a fim de eliminar as impurezas eventuais.

precipitado á constituído por uma mistura de fragmentos de heparina em que a maioria das espécies possui um ρ^ν compreendido entre cerca de 4800 e 9000 Da.

produto assim obtido pode, caso se deseje, ser transformado noutro sal farmaceuticamente aceitável, tal como um sal de cálcio, um sal de potássio ou um sal de magnósio, de acordo com os processos conhecidos.

As composiçães de heparina do invento, essencialmente formadas por fragmentos de peso molecular de cerca de 48CC a 9C00, desprovidos do sítio de ligação à AT ΪΙΪ, permitem pôr em relevo propriedades farmacológicas de grande interesse, que es. tão ligadas às regiães reguladoras da heparina. Estas composi. çães em doses activas apresentam apenas uma actividade anticca gulante muito fraca.

estudo das suas propriedades farmacológicas revelou que estas composiçães exercem um efeito inibidor, sensivelmen67 568

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-14te equivalente ao da heparina, sobre o crescimento das células musculares lisas.

Diversas experiências permitiram por em evidência outros efeitos inibidores, em particular face à activação do complemento e a reacções inflamatórias de hipersensibilidade do tipo retardado, bem como face à actividade enzimática da heparinase.

As composições podem exercer igualmente uma acção potencializadora e estabilizadora face a certcs factores de crescimento celular.

Estas composições são, por outro lado, dotadas duma grande inocuidade e são particularmente estáveis.

As composições são assim particularmente apropriadas para constituir princípios activos de medicamentos.

invento tem pois por objecto preparações farmacêuticas caracterizadas por conterem uma quantidade eficaz duma composi. ção formada essencialmente por fragmentos de heparina, tal como acima definidos, em associação com um veículo farmacêutico.

Tendo em conta as suas propriedades, os medicamentos do invento sõo utilizáveis muito especialmente nas indicações terapêuticas seguintes:

prevenção da proliferação das células musculares lisas no decurso das angioplastias, aceleração da reparação tissular, especialmente no caso de enfermidades cutâneas, prevenção da extensão de lesões aterogéneas evolutivas e dos fenómenos de degenerescência arteriosclerótica,

- prevenção dos estados de choque, prevenção de certos desenvolvimentos metastásicos.

As preparações farmacêuticas do invento são administráveis sob diversas formas.

Para a administração por via oral, recorre-se em particjj lar a gelulas, tabletes, comprimidos, pílulas e lipossomas. Es tas preparações compreendem, vantajosamente, de 50 mg a 5 g

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por unidade de dosagem, de preferência 200 a 250 mg para as gélu· las, tabletes e pílulas.

Consequentemente, as formas de administração dependem es, sencialmente da dose a administrar. As gélulas, tabletes e pílu las serão de utilização prática para a administração de doses fracas. Para a administração de doses mais elevadas, os solutos bebíveis poderão ser de utilização mais prática.

Outras formas de administração das composições do invento são constituídas pelos sprays, aerosóis, pomadas ou cremes.

invento compreende igualmente as composiçães farmacêuti cas injectáveis, estéreis ou esterilizáveis para administração tanto por via intravenosa, como intramuscular ou sub-cutânea.

Estas soluções compreendem vantajosamente cerca de 10 a 150 mg/ml de princípio activo quando se destinam a injecção por via subcutânea, ou cerca de 10 a 10C mg/ml, quando se destinam a injecção intravenosa ou a perfusão.

A título indicativo, a fim de ilustrar o invento, indica -se em seguida um exemplo de posologia utilizável no homem: es ta posologia compreende, por exemplo, a administração ao paciente de cerca de 500 mg/dose por via sub-cutânea, duas a três vezes por dia. Por via intravenosa, administram-se cerca de 1000 mg/dia, sabendo que, por perfusão as quantidades injectadas podem ser de várias dezenas de ml. Estas administrações são efectuadas de maneira descontínua a intervalos regulares □u contínuas por perfusão.

invento compreende ainda os reagentes biológicos cujos princípios activos sejam constituídos pelas composições de fragmentos de heparina, tais como definidos anteriormente. Estes reagentes biológicos podem ser utilizados como referências ou modelos em estudos comparativos em diferentes sistemas fisi ológicos, na regulação dos quais estejam implicados os GAGs.

Outras características e vantagens do invento surgirão nos exemplos que se seguem, com referência às figuras 1 a 5,

- as figuras 1 e 3 por um lado e 2 e 4 por outro, representam as curvas HPLC, respectivamente duma mistura de despolimerização

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-16reduzida e duma composição de acordo com o invento, a figura 5 representa o espectro RMN do C duma composição de acordo com □ invento.

EXEMPLO li Processo de obtenção duma composição de fragmentos de heparina.

1/ - Quebra das cadeias de heparina com o auxílio de ácido per-iódico g de heparina injectável de muco de porco, sob a forma de sal de sódio, titulando 157 μΐ/mg na dosagem Codex e 155 μ/mg na dosagem antifactor Xa de Yin e col., são postos em solução em 250 ml de água desmineralizada a 49C. 0 pH da solu ção é ajustado a 5,0 com ácido clorídrico concentrado. Adicio nam-se, sob agitação moderada, 10 g de metaper-iodato de sódio (NalO^, PM : 213,89) em solução em 250 ml de água desmineralizada a 490. 0 pH da mistura é ajustado a 5,0 com ácido clorídrico concentrado. A solução á deixada durante 24 horas, na obscuridade, numa câmara arrefecida a +490.

2/ - Eliminação do per-iodato residual

Reparte-se em seguida a solução reaccional por 3 tubos de diálise N03AX 40 (porosidade de 3 a 4000 Da) e submete-se a solução a 15 horas de diálise contra água desmineralizada corrente.

3/ - Despolimerização em meio básico

Aos 780 ml de solução obtidos após a diálise, adicionam-se 16 ml de soda 10N, e a mistura é submetida a agitação durante 3 horas à temperatura ambiente (da ordem de 18-219C).

4/ - Redução

Adicionam-se agora 500 mg de boro-hidreto de sódio (NaBH^, PM : 37,83) e a solução é novamente agitada, durante 4 horas à temperatura ambiente. 0 seu pH é em seguida levado a 4 com □ auxílio de ácido clorídrico concentrado. Após 15 minutos de agitação, o pH é ajustado a 7 com o auxílio de soda concentrada.

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-17Aos 820 ml de solução assim obtidas adicionam-se 16,4 g de NaCl e em seguida 127C ml de etanol.

A mistura é deixada em repouso durante 3 horas e em seguida centrifugada a 2500 R/minuto durante 20 minutos.

precipitado è recolhido, reposto em suspensão om 203 ml de etanol puro, triturado num Ultra-Turrax e finalmente recuperado por filtração num buchner de frita.

precipitado é então seco sob vácuo a 4090, durante 5 horas.

Recuperam-se assim 8,9 g de produto intermediário possuindo as propriedades seguintes:

- dosagem Codex

- dosagem APTT

- dosagem Anti-Xa ul/mg ul/mg u/mg

A repartição molecular da composição é apresentada na fi^ gura 1 que corresponde à curva HPLC determinada nas condiçães evocadas na página 7.

5/ - Fraccionamento alcoólico

Estes 8,9 g são dissolvidos em cerca de 120 ml de água desmineralizada, à temperatura ambiente. Adicionam-se 1,78 gramas de NaCl e 0 pH da solução é abaixado a 3,5 com c auxílio de ácido clorídrico. 0 volume da solução é ajustado a 178 ml com 0 auxílio de água desmineralizada. Adicionam-se, com agitação, 151 ml de etanol puro. A agitação é mantida durante 15 minutos, após 0 fim da adição e depois a mistura é deixada em repouso durante 10 horas à temperatura ambiente.

precipitado formado é recolhido por centrifugação durari te 20 minutos a 2500 R/min. 0 precipitado é reposto em suspejn são em 150 ml de etanol puro, triturado no Ultra-Turrax, recuperado por filtração sobre buchner de frita, lavado com 3C0 ml de etanol puro e finalmente seco sob vácuo a 409C, durante 24 horas.

5ζθ

09120

ÍJ*·

-18Recuperam-se assim, sob a forma de pó branco, 5,0 g do produto IC 1772 possuindo as características seguintes:

- título Codex

- título APTT título Anti-Xa ul/mg ul/mg u/mg

A distribuição molecular da composição obtida, ê apresen tada na figura 2 que corresponde à curva HPLC determinada nas condições anteriormente referidas.

Análise em RMN do espectro RMN para o carbono 13 está representado na fi gura 5. Este espectro foi realizado sobre uma solução do composto dissolvido em óxido de deutério, a 25 MHz a 352C. Os des locamentos químicos são medidos em referência ao metanol (51,6 ppm).

exame deste espectro mostra que ele apresenta os sinais característicos duma cadeia de dissacáridos do tipo ácido 2-0-sulfo-cx-L-idurónico (1 —>4) 6-0-sulfo- <K -D-glucosamina (1 —>4).

Constata-se em particular, a presença dos segmentos dos carbonos anómeros, a 101,7 ppm (ácido 2-0-sulfo- X-L-idurónico) enquanto que os sinais característicos dos ácidos D-glucurónico e L-idurónico (104,5 ppm) não sulfatados, não se encontram pre sentes, contrariamente ao espectro duma, preparação de heparina na qual eles podem representar até 30 a 40% do total dos sinais dos ácidos urónicos.

Na região dos C-2 da glucosamina, apenas se encontra pre sente o sinal a 60,5 ppm (C-2 da N-sulfo-glucosamina). 0 sinal característico da N-acetil-glucosamina (56,4 ppm) é à custo detectável, enquanto que figura na heparina de partida.

Na região dos C-6 da glucosamina (62,5 para C-6-0H e 69 para C-6-0S) constata-se a presença de dois sinais das espécies não sulfatada e sulfatada.

ff

E importante notar, que a relação de intensidade dos sinais a 99,4 ppm e 101,7 ppm é igual alo que confirma a presença, apenas, do ácido 2-0-sulfo-L-idurónico.

‘‘ 67 568 €9120

-19Detecta-se a presença de alguns resíduos de N-acetil-glucosamina. Da mesma forma surge o sinal do NHAc (24,6 ppm).

Análise condutimÓtrica grau de sulfatação determinado por condutimetria é de

2,3. 0 número de cargas por unidade dissacarídica ê de 3,3.

EXEMPLO 2

1/ - 200 g de heparina injectável, na forma de sal de sódio, ti tulando 154 ul/mg da dosagem Codex e 158 u/mg na dosagem anti-factor Xa, são colocados em solução em 5 litros de água desmi neralizada, a +4SC.

pH da solução ê ajustado a 5,0 com HC1 concentrado. Adicionam-se então sob agitação moderada: 200 g de metaperiodato de sódio em solução em 5 litros de água desmineralizada a +420. 0 pH da mistura ê novamente ajustado a 5,0 com HC1 concentrado.

A solução obtida é deixada 24 horas na obscuridade, em câmara arrefecida a +42C, sob agitação moderada.

2/ - A solução é em seguida repartida por 50 tubos de diálise e submetida a diálise durante 14 horas contra água desmineralizada corrente, à temperatura ambiente.

3/ - Como resultado desta diálise, recuperam-se 14,5 litros de solução à qual se adicionam 116 g de soda pura em pastilhas. Agita-se a solução assim obtida, durante 3 horas à temperatura ambiente.

4/ - Adicionam-se em seguida 10 g de boro-hidreto de sódio e prossegue-se a agitação durante 4 horas.

pH da solução ê reduzido a 4 com o auxílio de HC1 concentrado durante 15 minutos e em seguida é novamente reajustado a 7 com soda concentrada;

volume da solução assim obtida é de 15,2 litros. Adicionam-se então 304 gramas de NaCl e em seguida 22,8 litros de etanol.

‘ 67 5$8

09120

-20A mistura é deixada em repouso durante 48 horas à tempera tura ambiente. 0 sobrenadante límpido é removido por sifonação, o precipitado é recolhido, reposto em suspensão em 3 litros de etanol puro, triturado no Ultra-Turrax e recuperado por filtrai ção sobre frita de vidro.

precipitado é finalmente seco sob vácuo, a 409C, duran te 15 horas.

Recuperam-se 181 gramas de fragmentos de heparina, possjj indo as características seguintes:

- dosagem Codex :

- dosagem APTT :

- dosagem Anti-Xa : repartição molecular:

ul/mg ul/mg u/mg veja-se figura 3

5/ - Estes 181 gramas são dissolvidos em cerca de 3 litros de água desmineralizada à temperatura ambiente.

Adicionam-se 36,2 gramas de NaCl e o pH da solução é ajustado a 3,5 com HC1 concentrado.

volume da solução é ajustado a 3,62 litros com o auxílio de água desmineralizada. Adicionam-se então sob agitação moderada 3,077 litros de etanol puro. A agitação é mantida durante 15 minutos após o fim da adição e a mistura é deixada em repouso durante 10 horas à temperatura ambiente. 0 precipitado formado 6 recolhido por centrifugação durante 20 minutos a 2500 R/min. 0 precipitado é reposto em solução em 2 litros de etanol puro, triturado no Ultra-Turrax, recuperado por filtração sobre frita, lavado com 3 litros de etanol puro e fi nalmente seco sob vácuo, a 403C, durante 24 horas.

Obtêm-se finalmente 104 gramas de pó branco, as características seguintes:

possuindo

- título Codex

- título APTT

- título Anti-Xa ui/mg ui/mg u/ mg repartição molecular: veja-se figura 4.

568 •09120 . .. ·ι/

-21EXEMPLO 3

1/- Quebra das cadeias de heparina com o auxílio de ácido per-iódico g de heparina injectável de muco de porco, sob a forma de sal de sódio, são colocados em solução em 600 ml de água desmineralizada. Adicionam-se, sob agitação moderada, 18 g de metaper-iodato de sódio, em solução em 200 ml de água desmi neralizada, a 59C. Ajusta-se o pH a 5 por adição de HC1 concentrado e o volume reaccional é levado a 900 ml com água destilada. A solução é mantida durante 24 a 26 horas na obscuridade, numa câmara fria (0-109C). 0 precipitado formado á eliminado por filtração.

2/ - Eli minação do per-iodato residual

Os 900 ml resultantes da reacção de oxidação da heparina são percolados sobre uma resina permutadora de iães Amberlite 400, Cl“ (Rohm and Haas Company, USA) possuindo um volume de 1/8 do volume reaccional (110 ml), em 2 horas.

A coluna é então lavada com 225 litros de água desminerja lizada. Esta água de lavagem é combinada com a solução percolada e obtêm-se assim 1125 ml de solução livre de per-iodato e de iodato. A ausência de per-iodato é controlada por títulometria. A curva de titulação de 5 ml da solução de oxi-hepari. na por 2,5 ml de soda IN, permite visualizar a ausência de pejç -iodato. 0 per-iodato em solução traduzir-se-ía por uma inflexão característica de um pKa de cerca de 7,8.

3/ - Despolimerização em meio básico

A beta-eliminação ê iniciada por adição de soda 10N, por etapas, até à obtenção de um pH de 11,5. A reacção é prossegúida durante 1 hora à temperatura ambiente (18-239C) sob agitação.

4/ - Redução

Adiciona-se então boro-hidreto de sódio, à razão de 10 g

568 ,09120

-22por 100 g de matéria prima.

Esta redução é realizada durante pelo menos 3 horas sob agitação. 0 agente redutor em excesso é em seguida eliminado por adição de 25 g/1 de NaCl e depois o pH da solução é ajusta do a 4 com o auxílio de HC1 concentrado. A solução é em segui da ajustada a um pH neutro, com o auxílio de NaOH concentrado.

Precipita-se o produto por adição de 1,5 volumes de etanol puro. 0 precipitado ê decantado durante 48 a 72 horas, em seguida desidratado com etanol e seco sob vácuo a 403C, durante 12 horas.

5/ - Fraccionamento alcoólico produto é retomado em água desmineralizada (180 ml por 10 g de heparina introduzidos). Adicionam-se 2 g de NaCl por 10 g. 0 pH é ajustado a 3,5 e a solução é completada com água desmineralizada até um volume de 200 ml, por 10 g introduzidos.

Adicionam-se 0,85 volumes de etanol puro sob agitação lenta. 0 precipitado é deixado a decantar durante 48 a 72 horas. 0 precipitado é retomado, desidratado com etanol puro, triturado no Ultra-Turrax ^k ' e seco a 403C. 0 produto apresenta-se sob a forma de um pó branco. 0 produto solúvel no ál_ cool foi analisado em HPLC. Constatou-se que os oligossacáridos têm um peso molecular médio da ordem de 3500.

6/ - Purificação produto obtido na etapa precedente é posto em solução a 5% em água desmineralizada e é purificado sobre uma coluna permutadora de anióes Amberlite IRA 400, OhT (1/10 do volume reaccional).

produto é em seguida testado em relação às suas características:

. Taxa de sulfatação (determinada segundo Helbert 3. R. e Marini Μ. A., Biochemistry, 1963, 2., 1101-1106).

A relação SO^/COO é de 2,2 a 2,4.

Actividade anti-IIa e anti-Xa:

568 ‘09120 φ '

Ϊ'.· a, ϊ»

- TCK (1) : 4 u/mg

- USP (2) : 13 u/mg

Actividade anti-IIa (3); 12 u/mg

- Actividade anti-Xa (4) (Yin e Wessler): 8 u/mg

- Actividade anti-Xa (sobre substrato cromogeno S 2222 em sistema purificado): 1 u/mg

As referências dos sistemas utilizados para efectuar as medições são as seguintes:

(1)	: R. R. Proctor e S, Rapaport - Am. 3.	Clin. Pathol.,
	1961, 36, 212-219.
(2)	a : XXI Farmacopeia americana.
(3)	: Medida pelo prolongamento do tempo de	trombina.
(A)	: E. T. Yin, Ξ. Wessler, 3. V. Butler -	3. Lab. Clin. Med
	1973, 81, 298-310.

EVIDENCIAÇãO DE CICLOS DE ÁCIDOS URONICOS ABORTOS ENTRE C2 E C3

A degradação de Smith, a pH 3 e a 1009C durante 1 hora, duma solução a 5% de IC 1772 provoca o corte específico das cadeias oligossacarídicas ao nível dos ácidos urónicos abertos entre C2 e C3. Resulta desta operação um abaixamento do peso molecular médio do produto, observado por filtração em gel sobre TSK 2000 com detecção refractométrica.

P 0s resultados são expressos da seguinte forma:

Mna representa o number average molecular iveight tal como definido por W. W. YAU, 3. 3. KIRKLAND et D. D. BLY (in Modern size-exclusion liquid chromatrography, Wiley Interscience Publi. cation) do produto testado, tal qual;

Mnb representa o number average molecular u/eight depois de se ter efectuado a degradação de Smith como se indicou acima;

(Mna/Mnb) - 1 dá o número de sítios sensíveis a esta degradação de Smith por cadeia oligossacarídica, o que equivale ao número de ácidos urónicos abertos entre C2 e C3.

ensaio foi realizado em dois lotes de produtos IC 1772:

67 5$8 09120	-24-		·^η·^ν·^;
	P 46 UH	P 55 VH
Mna	5503	5573
Mnb	3896	3745
(Mna/Mnb) - 1	0,4	0,5

Constata-se assim que nas condiçães de análise o IC 1772 contém pelo menos um ácido urénico aberto por cada duas cadeias.

EFEITO ANTICOAGULANTE 00 IC 1772 NO PLASMA HUMANO

Apresentam-se em seguida os resultados obtidos que se re ferem:

1. às actividades anti-IIa e anti-Xa, in uitro, em dife rentes sistemas.

2. aos tempos de coagulação pela trombina (TCT).

1/ - Actividades anti-IIa e anti-Xa, in vitro¹¹

		Heparina
ENSAIO	IC 1772	padrão
	u/ mg	u/mg
TCK¹	10	160
USP²	13 - 15	160
Actividade anti-IIa^	16	160
Actividade anti-IIa (sobre substrato
cromogénico S 2238 em sistema puri-
ficado)	36	160
Actividade anti-IIa (sobre substrato
cromogénico S 2238 em sistemas pla£
máticos)	1	160
ActividadB anti-Xa^ (Yin e Wessler)	12 - 15	160
Actividade anti-Xa (sobre substrato
cromogénico S 2222 em sistema puri-
ficado	2-3	160
Actividade anti-Xa (sobre substrato
cromogénico S 2222 em sistema pias-
mático	5-10	160

56Θ

09120

-25As referências dos sistemas utilizados para efectuar medições são as seguintes:

as

1/

R. R. Proctor e S, Rapaport - Am . 3, Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219,

2/

XXI§ Farmacopeia americana.

3/

Medida pelo prolongamento do tempo de trombina.

4/

Ε. T. Yin, S. Wessler, 3.

1973, Bl, 29B-310.

V. Butler, 3. Lab. Clin. Med. ,

2/ - TCT

Apresentam-se na tabela , seguinte, os resultados, sob a forma de tempos de coagulação expressos em segundos, de 3 eri saios efectuados com os 3 tipos de plasma utilizados para estu dar a actividade APTT. 0 controlo é efectuado em meio plasmático normal. Os resultados correspondem à média de dois ensai. os independentes.

TABELA 1 ^ug/ ml

Plasma normal

Plasmas depletados em

	ATIII	HC II	ATIII e
0	22	20	20	20
2,5	36	26	24	22
5	110	51	27	22
10	300	300	40	22

HCII

Constata-se para as doses de 5 e sobretudo âe 10 jug/ml um prolongamento do tempo de trombina que parece depender de HC II.

- INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS MUSCULARES LISAS (CML) IN VITRO

Modelo experimental:

As células musculares lisas (CML) sõo provenientes dum segmento abdominal da aorta de ratos Sprague Dawley. Colocam-se pequenos pedaços desse segmento em cultura, em meio RPMI67 568

09120

-26-1640, adicionado de 20% de soro de vitela fetal (SVF). Ao fim de 1 a 2 semanas, as CML migram para fora dos tecidos e começam a proliferar.

Colocam-se 5-8X10·⁵ CML em cultura em placas mui ti-depósitos. Após 24 horas, pára-se o seu crescimento par uma lavagem seguida de adição de meio RPMI + 2% de plasma desplaquetado (ou RPMI + 0,4% de SVF) durante 72 horas.

As células são então recolocadas durante 5 a 7 dias em meio RPMI adicionado de 20% de SVF, com ou sem o composto a testar, encontrando-se este último em diferentes concentrações.

crescimento bruto das CML, nos ensaios testemunha ou adicionados dos produtos a testar, é obtido por subtracção do número de células de partida do número de células no final da experiência (medição em duplicado por contador Coulter).

A % de inibição é dada pela fórmula seguinte:

% de inibição crescimento bruto das células testadas

X 10C crescimento bruto das células testemunha

(veja-se, Castellot e col., 3. Cell. Biol., 102, 1986, 1979-1984).

0s resultados obtidos em função da concentração de IC 1772 em cultura, são os seguintes (a título comparativo, apresentam-se os valores de inibição obtidos com a heparina).

Quantidade de produto inibição yMg/ml cultura ^g/ml ”

100 ^g/ml

IC 1772 Heparina

25% 20%

45% 60%

70% 80%

Constata-se uma actividade neste modelo experimental, mui. to próxima da da heparina padrão.

568 .09120

-27- INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS MUSCULARES LISAS (CML)

IN UIVO: MODELO DO CATETER DE BALÃO

Modelo experimental:

A experiência é efectuada em ratos macho Sprague Dawley com a idade de 5 meses e pesando cerca de 500 g.

Os animais são anestesiados e o endotélio da artéria carótida esquerda é desnudado pela passagem intralumen de um catéter de balão de embolectomia introduzido no ramo externo da carótida.

produto a testar ou uma solução testemunha estéril, é administrada em infusão contínua na solução lactosada de Rijn ger na veia jugular esquerda (utilização duma bomba osmótica de infusão (Alzet) colocada sobre o dorso do animal). 0 tratamento é prosseguido durante 4 semanas à razão de 2,5 jul/hora. A dose administrada foi de 1 mg/kg/hora.

Ao fim de 28 dias os animais são anestesiados e as artérias carótidas removidas. 17, 9 e 1 hora antes da anestesia, os animais recebem uma injecção intraperitoneal de timidina tritiada.

Os resultados são expressos pelo conteúdo em ADN nas carótidas direita (CD) lesionadas e esquerda (CE) não lesionadas de acordo com o processo de cálculo seguinte:

Inibição (%) =

ADN animais tratados ADN* animais controlo

X 100

ADN* adn_ce - adn_cd

(veja-se A. W. Clowes e Μ. M. Clou/es, Labor. Investig., 1985, 52 (6), 612-616).

Resultados:

Num primeiro ensaio efectuado sobre 10 animais, constata

568 >09120

-28-se com o produto testado IC 1772 uma inibição próxima da da heparina, de cerca de 50%.

- INIBIÇÃO DO SISTEMA DO COMPLEMENTO

A heparina inibe a geração da C^ convertase, amplificadora alternativa do complemento, por inibição da formação do complexo bimolecular entre as proteínas C^b e B.

efeito da heparina e do produto IC 1772 sobre a ligação C,b-B foi estudado utilizando proteínas B marcadas com 125 z125 x

I ( I-B) e eritrócitos de carneiro, portadores da proteX na C^b (E^SC₃b).

Chama-se IC50 à concentração de heparina ou do oligossacárido testado, necessária para inibir 50% da formação do complexo C-jb-B.

Esta medição 6 feita in vitro, num sistema de proteínas purificadas.

- Sistema experimental

Incubam-se os E°C,b (0,75-2,5 x 10 ) a diferentes conceri 1 9 ζ traçães de ⁷I-B num tampão veronal contendo 0,1% de gelatina e 5 mM Mg^⁺ durante 30 minutos a 303C.

Colocam-se amostras de 70 jul, em duplicado para cada reacção, sobre 300 juuL de uma mistura de dibutilftalato (Merck-Clevenot, França) e dinonilftalato (Coger, Paris) (7:3 v/v) em tubos de polipropileno de 0,5 ml.

Os tubos são centrifugados durante um minuto a 8000 g num rcicroeontrlfuga Beckman (Beckman, Paris) e em seguida cortados, justamente acima do precipitado. Mede-se a radioactividade do ligando, ligado.

produto IC 1772 foi doseado comparativamente à heparina. 0s resultados expressos em IC 50 são os seguintes:

IC 1772 ; 0,4 y*g/ml

Heparina padrão: 0,5 ug/ml

5(58

09120

,._k —29—

- Tempos de sanqramento produto é administrado em coelhos por via intravenosa na dose de 5 mg/kg, 15 minutos e uma hora antes da experiência.

modelo experimental seguido é o de Cade, tal como descrito por Cade e col. em Thromb. Res. 35., 613-625, 1986.

Os ensaios efectuados mostram que o produto não provoca nenhum aumento no tempo de sangramento na dose de 5 mg/kg, por via intravenosa.

- Estudo da actividade anti-trombótica do IC 1772 modelo utilizado é o seguinte:

Os animais são anestesiados com 70 mg/kg de Ketaset (Bristol Lab, Syracuse, NY) por via intramuscular. Por uma técnica cirúrgica isola-se um comprimento de 2 cm sobre as vei. as jugulares direita e esquerda. Injecta-se por via intraveno sa na veia marginal da orelha o produto a testar, exactamente 5 minutos antes da injecção de uma substância trombogénica, por exemplo uma mistura de complexo concentrado prótrombótico e veneno de víbora venum (PCC/RVV). Ao fim de 20 segundos efectua-se a ligação da veia jugular e após 10 minutos de está sb, retiram-se os segmentos de vexa que se colocam em soro fisiológico, avaliando-se em seguida o grau de formação de coágii los segundo uma escala de 0 a 4 (4 representa um coágulo único sem eritrócitos livres) (FAREED, 3. WALENGA, 3. M., KIUMAR, 2. e ROCK, A. A modified stasis thrombosis model to study the ajn tithrombotic actions of heparin and its fractions”. Sem. Thromb. Hemost. 11(2), 155-175, 1985).

IC 1772, administrado por via intravenosa, na dose de 1 mg/kg a um grupo de 10 coelhos, mostrou uma actividade antitrombótica muito boa em todos os animais.

67 568 09120				x^,f'· r
			-30-	....
	R e :	[ V I N D I C A Ç Ώ E S

Claims

1 - Processo de preparação de heparinas de baixo peso mo lecular, quase totalmente desprovidas de actividade anticoagulante, sendo as referidas heparinas essencialmente formadas por fragmentos desprovidos de cadeias dissacarídicas do tipo ácido urónico não sulfatado-N-sulfato de glucosamina, correspondendo esses fragmentos à fórmula geral I, seguinte:

R-(X-Y)_n-R’ (I) na qual

- X representa, quer um grupo ácido idurónico sulfatado de .fórmula II:

(II) quer, à razão de 1 grupo, por pelo menos cada 2 cadeias, um gru po ácido urónico (D-glucorónico ou L-idurónico) não sulfatado, aberto entre os átomos de carbono nas posiçães 2 e 3, de fórmu la III:

(III)

- Y representa um grupo D-glucosamina de fórmula IV:

(IV)

67 56Θ

09120 sendo R^ um átomo de hidrogénio ou um grupo -S0^~ sendo R₂ um grupo -SO^ ou -CO-CH^, e sendo a proporção dos -SO-j** de cerca de pelo menos 90%, e sendo Rj um grupo -S0^“ ou um átomo de hidrogénio, sendo a proporção dos grupos -SO^” de pelo menos cerca de 70%,

- R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo:

definidos como acima, e (V) sendo R^ e Rj representando ácido urónico,

R^ um átomo de hidrogénio ou um resíduo de

- R* representa quer um átomo de hidrogénio, quer um gru po ácido urónico natural, quer um resíduo de ácido urónico modificado no decurso da oxidação per-iódica, cujas funções aldeí. do tenham sido reduzidas a álcoois, com 7<.n^l5, para os tipos maioritários o que corresponde a cadeias com PM de cerca de 4800 a 9000; b dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por:

a) se tratar uma solução aquosa de heparina a uma concentração final de 0,5 a 5% (p/v) com ácido per-iódico a uma concentração final de 0,5 a 4% (p/v), a um pH de 4,5 a 6,5 e a uma temperatura de 0 a 109C;

b) se com uma base tratarem as forte a uma cadeias de molaridade heparina, assim obtidas, final em base de 0,1 a 0,3 N;

c) se tratarem os fragmentos obtidos com um agente redutor;

de despolimerização assim

d) apôs a eliminação eventual do agente redutor em excesso, se precipitarem os fragmentos reduzidos, após adição de um sal mineral com o auxílio de um solvente álcoolico;

67 5.68

-09120

-32θ) se tratar com álcool uma solução aquosa do precipita do assim obtido, adicionado com um sal mineral;

f) se recuperar o produto precipitado assim formado e se transformar, eventualmente, o sal correspondente à base for. te utilizada, num outro sal farmaceuticamente aceitável.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por compreender, em combinação, os passos seguintes:

- oxidação controlada da heparina, que é realizada fazeri do reagir a heparina, em solução aquosa a uma concentração final de 0,5 a 5% (p/v) com um sal do ácido per-iódico a uma cori centração final de 0,5 a 4% (p/v), a um pH situado entre 4,5 e 6,5 e a uma temperatura de 0 a 102C durante cerca de 15 a 48 h, ao abrigo da luz,

- despolimerização das cadeias de heparina obtidas por adição de uma base forte, como a soda cáustica, numa quantidade conducente a uma molaridade final em base de cerca de 0,1 a 0,3 N, a um pH superior a cerca de 11, nomeadamente compreendi, do entre 11 e 12, vantajosamente de 11,2 a 11,6, de preferência de 11,5,

- redução dos fragmentos de despolimerização com o auxílio de um agente redutor e, após eliminação, caso necessário, do agente redutor não reagido,

- recuperação dos fragmentos de heparina reduzidos, por precipitação, com o auxílio de um meio solvente no qual sejam insolúveis,

- isolamento dos fragmentos pretendidos por fraccionamen. do com o auxílio de álcool, em presença de um sal mineral, de uma solução aquosa obtida por redissolução em água do precipitado anteriormente isolado, e recuperação do precipitado forma do.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caraç. terizado por no passo de oxidação per-iódica, se utilizar a he parina e o sal do ácido per-iódico em quantidades conducentes a concentrações finais respectivas de 1,5% a 5% e de 1,5% a

67 568 .09120

-332,5% (ρ/ν).

4 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se realizar □ passo de oxidação per-iódica a pH 5 e 49C.

5 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o sal do ácido per-iódico ser o metaper-iodato de sódio.

6 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, para a eliminação do per-iodato residual se efectuar uma diâlise com canais de diálise possuidores de uma porosidade de 3 a 4000 Da, durante cerca de 15h.

7 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a recuperação dos fragmentos de heparina reduzidos, ser realizada por ajustamento do pH a 7 se guido, após adição de um sal mineral como o NaCl, da adição de 1 a 1,5 volumes de um solvente como o etanol.

8 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se dissolverem, à razão de 5% (p/v), os fragmentos precipitados, reduzidos, de heparina em água adicionada de um sal mineral, a fim de obter uma concentração final de 1%, tendo o pH desta solução sido ajustado a 3,5 e por se adicionarem 0,85 volumes de um solvente alcoólico como o etanol.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição apresentar em média 3,3 cargas por unidji des dissacarídicas.

10 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 9, caracterizado por a composição apresentar em HPLC determinada com uma coluna TSK 2000 SW acoplada a um detector fotométrico 205 nm, utilizando Ν8250^ 0,5M como solvente, com um débito de 1 ml/mn:

- um peso molecular médio da ordem de 6000-7000 Da, mais

67 568 ‘09120

Ίϊ

-34precisamente de 5800 a 7000 Da, nomeadamente da ordem de 6000 Da, encontrando-se 70% dos tipos entre 4800 e 9000 Daltons, e 90% entre 3600 e 11000 Da,

- um peso molecular no topo do pico da ordem de 6000 a 6500 Da, mais precisamente de 5500 a 6500 Da, nomeadamente da ordem de 5500 a 6000 Da,

- menos de 5% de cadeias inferiores às dos dodecassacáridos,

- menos de 5% de cadeias superiores a 11000 Da.

11 - Processo de preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 9 e 10, caracterizado por o seguinte espectro de RMN ser o da composição:

12 - Processo de preparação de uma composição formada por fragmentos de heparina tais como os obtidos por fraccionamento, com o auxílio de álcool na presença de um sal mineral, de uma mistura resultante da despolimerização da heparina por acção de uma base forte sobre as cadeias de heparina submetidas à acção prévia de per-iodato, seguida duma redução dos aldeídos formados aquando da oxidação per-iódica.

67 5.68 •09120

13 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 9 a 12, caracterizado por os fragmentos contidos na composição se apresentarem na forma de sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésio.

14 - Processo de preparação de uma composição farmacêuti. ca, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de uma composição preparada de acordo com as reivindicações anteriores com um veículo farmacêutico.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a composição se apresentar sob a forma de uma solução concentrada, injectável, estéril, contendo cerca de 10 a 150 mg/ml se se destinar a injecção sub-cutânea ou cerca de 10 a 100 mg/ml se se destinar a injecção intra-venosa ou a perfusão.