NO170940B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av en terapeutisk virksom blanding av hepariner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av en blanding av terapeutisk virksomme hepariner med lav molekylvekt og regelmessig struktur.

Mer spesielt angår oppfinnelsen fremstilling av en blanding av hepariner med lav molekylvekt som viser en aktivitet når det gjelder regulering av visse fysiologiske systemer mens de nesten fullstendig mangler den antikoagulerende aktiviteten som manifisterer seg gjennom antitrombin III (ATIII).

Det er kjent at heparin er i besittelse av en antikoagulerende aktivitet som manifesterer seg hovedsakelig gjennom antitrombin III (ATIII).

Arbeidet som er utført på heparin når det gjelder struktur/- aktivitet har vist at denne type antikoagulerende aktivitet er forbundet spesielt med de såkalte uregelmessige regionene i heparin, mer spesielt med regionen tilsvarende penta-sakkaridet med strukturen DEFGH, beskrevet i FR patent 2.535.324, med formelen:

Det er også kjent at visse aktiviteter hos heparin eller fragmenter av heparin kan preserveres i en viss grad i fravær av bindingssetet for ATIII eller når dette sistnevnte er modifisert, men strukturene som er ansvarlige for slike aktiviteter, er ukjent.

Således har Folkman et al. (Science vol. 221 - 1983 - sidene 719-725) rapportert en inhiberende aktivitet overfor angio- genese for blandinger av heksasakkarider som mangler antikoagulerende aktivitet og benyttet i kombinasjon med korti-koider.

Castellot, Beeler, Rosenberg og Karnowsky, har i J. Cell Physiol. 120, s.315-320 (1984) rapportert forsøk med 0-desulfaterte og N-desulfaterte hepariner og har vist at de også i en viss utstrekning er i besittelse av de inhiberende aktivitetene til standard heparin på proliferasjonen av glatte muskelceller.

I tillegg har en anti-komplementaktivitet til heparin, uavhengig av den antikoagulerende aktiviteten, blitt demonstrert.

Andre arbeider har vist at den antikoagulerende aktiviteten til heparin kan modifiseres ved å utføre spaltinger mellom karbonatomene C2-C3i de ikke-sulfaterte uronsyrene ved hjelp av natriumperjodat.

Således har Fransson og Lewis beskrevet i Febs. Letters, vol. 97, nr. 1, sidene 119-123, 1979, forsøk som omfatter underkastelse av heparin for innvirkningen av perjodat ved enten pH 3 ved 4°C eller pH 7 ved 37°C. De oppnådde heparinkjedene oksyderes selektivt ved setet for D-glukuronsyrene i første tilfellet, mens en oksydasjon ved setet for alle de ikke-sulfaterte uronsyrerestene tilveiebringes under en annen type betingelser.

De resulterende kjedene reduseres med NaBH4eller fragmente-res i alkalisk medium ifølge en p<->elimineringsprosess.

Forfatterne konkluderer med at oksydasjonen og spaltingen av D-glukuronsyrerestene resulterer i en svak nedsettelse av molekylvekten, men bibeholdelse av den antikoagulerende aktiviteten.

På den annen side leder spaltingen ved pH 7 og 37°C av de ikke-sulfaterte D-glukuron- og L-iduronsyrene til opp-hevelsen den antikoagulerende aktivitet og til en mer betydelig fragmentering av molekylet.

I en artikkel publisert i Carbohydrate Research 36, sidene 339-348, 1974, beskriver Fransson perjod-oksydasjonen av uronsyrerestene i dermatansulfat ved forskjellige pH-verdier ved 4°C eller 37°C.

Forfatteren påpeker at ved pH 5 oppnås spaltingen ved nivået for glukuronsyrene bare i et omfang av mindre enn 5 #, og at ved pH 3 foregår disse spaltingene ikke i det hele tatt. Disse resultatene synes å stå i motsetning til dem som oppnås med heparin hvor spaltinger forekommer selektivt ved nivået for D-glukuronsyrene ved pH 3.

Virkningen av perjodat har også blitt rapportert av Casu et al. i Arzneim. Forsch./Drug. Res. 36 (1) nr. 4, sidene 637-642, 1986.

Ifølge denne artikkelen blir forskjellige preparater av heparin underkastet perjod-oksydasjon (pH 5,3 ved 4°C i 24 timer) hvilket leder til spalting mellom karbonatomene ved stillingene 2 og 3 i alle de ikke-sulfaterte uronsyrene. For referanse underkastes et preparat et etterfølgende trinn med partiell syrehydrolyse, og de oppnådde fragmenter dialyseres. Dette trinnet med partiell syrehydrolyse leder til en betydelig fragmentering av kjedene og til en i det minste delvis ødeleggelse av de funksjonelle gruppe, som påpekt av Fransson i Carbohydr. Res. 80, 131-145 (1980).

Videre leder denne metoden uunngåelig til en blanding av kjeder med molekylvekt som varierer oppover et bredt område og gir spesielt flere di-, tetra- og heksasakkarider.

Man har nå demonstrert at for fremstilling av stabile farmasøytiske preparater som kan anvendes i terapi for regulering av visse fysiologiske systemer, så er en kombinasjon av følgende egenskaper vesentlig: lengde på fragmentene; ladningsgrad; fravær av bindingssete for ATIII, for å unngå de uønskede effektene som er forbundet med en antikoagulerende aktivitet.

Studiet av spaltningsprosessene ved hjelp av perjodsyre og ved hjelp av fragmentering har ledet til den observasjon at ved utførelse av perjod-oksydasjonen under spesielle forsøks-betingelser, men også ved anvendelse av en kombinasjon av spesielle trinn, er det mulig å oppnå en sammensetning av fragmenter av heparin med lav molekylvekt i et gunstig område, og som mangler bindingssete for ATIII, mens i det minste størstedelen av deres funksjonelle grupper bevares.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er således å fremstille blandinger av heparin som ved aktive doser er i besittelse av farmakologiske egenskaper av stor verdi, omtrent ekvivalent med dem for heparin uten å vise ulempene med antikoagulerende egenskaper. For dette formål anvendes en fragmenteringsmetode for heparin som muliggjør oppnåelse av fragmenter av en gitt molekylvekt, som imidlertid mangler bindingssete for ATIII, og hvis ladningsgrad tilsvarer omtrent den for de tilsvarende sekvenser i kjedene i naturlig heparin.

Den nye terapetisk virksomme blanding av hepariner med lav molekylvekt som fremstilles ifølge oppfinnelsen mangler fullstendig antikoagulerende aktivitet, og blandingen består vesentlig av fragmenter som mangler gjentagende disakkaridsekvenser av typen ikke-sulfatert uronsyre-glukosamin-N-sulfat, hvor disse fragmentene tilsvarer følgende generelle formel:

hvor X representerer enten en sulfatert iduronsyrerest med formelen: eller, når det er minst en rest pr. to kjeder, en ikke-sulfatert uronsyrerest (D-glukuron- eller L-iduronsyre) ringåpnet mellom karbonatomene ved stillingene 2 og 3, med formelen:

Y representerer en D-glukosaminrest med formelen:

hvor Ri er et hydrogenatom eller en -S03~-gruppe, R2er en

—S03~-gruppe eller en —CO—CH3-gruppe, idet andelen av —S03~-gruppene er minst 90 %, og hvor R3er en -S03~-gruppe eller et hydrogenatom, idet andelen av —S03~-gruppene er minst 70

R representerer et hydrogenatom eller en rest med formelen:

hvor E1-R3har de ovenfor angitte betydninger, og R4er et hydrogenatom eller en uronsyrerest,

R' representerer enten et hydrogenatom eller en umodifisert uronsyrerest, eller en uronsyrerest som er modifisert ved perjod-oksydasjon og hvis aldehydfunksjoner har blitt redusert til alkoholer, med 7 < n < 15 for hovedelementene, hvilket tilsvarer kjeder med molekylvekt fra 4.800 til 9.000, og deres farmasøytisk akseptable salter, hvilken blanding i gjennomsnitt fortrinnsvis har 3,3 ladninger pr. disakkaridenhet.

Det skal påpekes at de åpne X-restene er rester som har blitt værende i glukosamino-glykan-kjeden under 3-elimineringstrinnet ved alkalisk pE. De representerer enten en ikke-sulfatert D-glukoronsyre eller en ikke-sulfatert L-iduronsyre, hvis bånd mellom karbonatomene ved stillingene 2 og 3 har blitt spaltet.

Blandingen som fremstilles ifølge oppfinnelsen slik som de som erkarakterisert vedHPLC utført med en TSK 2000 SW-kolonne koblet til en fotometrisk detektor ved 205 nm, ved bruk av 0,5 M NagSC^som oppløsningsmiddel ved en strømnings-hastighet på 1 ml/min., har: en midlere molekylvekt på 6.000-7.000 Da, mer spesielt 5.800-7.000 Da, og spesielt 6.000 Da, idet 70 # av forbindelsene har en molekylvekt mellom 4.800 og 9.000 Da og 90 % mellom 3.600 og 11.000 Da,

en molekylvekt ved det høyeste topp-punktet på 6.000-6.500 Da, mer spesielt 5.500-6.500 D, og særlig 5.500-6.000 Da,

mindre enn 5 % av kjedene er mindre enn dodeca-sakkarider,

mindre enn 5 56 av kjedene er større enn 11.000.

Blandingene av heparin er en slik som er oppnådd ved fraksjonering ved hjelp av alkohol i nærvær av et mineralsalt av en blanding resulterende fra depolymerisasjonen av heparin ved innvirkning av en sterk base på heparinkjeder på forhånd utsatt for virkningen av perjodat, idet depolymerisasjonen følges av en reduksjon av aldehydgruppene dannet under perj od-oksydasj onen.

Den fremstilte blanding har fortrinnsvis et forhold mellom sulfatgrupper SO3" og karboksylgrupper C00<->pr. molekyl på mellom 2,2 og 2,8. Dette forholdet er mer spesielt 2,4. Dette høye forhold sammenlignet med middelverdier for heparinkjedene resulterer fra strukturen til heparinkjedene med lav molekylvekt som er fremstilt ifølge oppfinnelsen og som består vesentlig av trisulfaterte disakkaridenheter. Disse hepariner med lav molekylvekt er angitt å ha regelmesig struktur p.g.a. tilstedeværelsen av disse disakkaridenhetene, og det vises til vitenskapelig litteratur (PERLIN A.S., CASU, B. SANDERSON, G. R. "220 MHz spectra of heparin, chondroitins and other mucopolysaccarides". Can. J. Chem. 1970; 48: 2260-8).

Oppfinnelsen omfatter også fremstilling av saltene av nevnte fragmenter av heparin spesielt natrium-, kalium-, kalsium-og magnesiumsaltene, samt saltene av fysiologisk akseptable, organiske kationer.

Blandingen av hepariner med lav molekylvekt fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at: a) en vandig oppløsning av heparin ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-5 % (vekt/vol) behandles med perjodsyre ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-4 # (vekt/vol.), ved en pH-verdi mellom 4,5 og 6,5 og ved en temperatur mellom 0 og 10°C; b) de således oppnådde heparinkjeder behandles med en sterk base ved en sluttmolaritet for basen på 0,1-0,3 N; c) de således oppnådde depolymerisasjonsfragmentene behandles ved et reduksjonsmiddel; d) etter fjerning av overskudd reduksjonsmiddel, dersom dette er nødvendig, blir de reduserte fragmentene utfelt ved hjelp av et alkoholisk oppløsningsmiddel etter tilsetning av et mineralsalt; e) en vandig oppløsning av det således oppnådde bunnfall inneholdende et tilsatt mineralsalt behandles med alkohol for derved å fjerne fragmentene med meget liten molekylvekt; f) det således dannede utfelte produkt utvinnes og saltet tilsvarende den benyttede sterke base omdannes, om nød-vendig, til et annet farmasøytisk akseptabelt salt.

Det skal påpekes at trinn e) tilsvarer en fraksjonering for å fjerne visse kjeder og ikke en omfattende utfelling.

Mer spesielt består denne analogifremgangsmåte av en kombinasjon av følgende trinn: Den regulerte oksydasjon av heparin utført ved om setning av heparin i vandig oppløsning ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-5 # (vekt/vol.) med et salt av perjodsyre ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-4 %

(vekt/vol.) ved en pH-verdi varierende mellom 4,5 og 6,5, og fortrinnsvis ved en pH-verdi på 5, og ved en temperatur fra 0 til 10°C, i fra 15 til 48 timer i fravær av lys;

depolymerisasjonen av de oppnådde heparinkjedene ved tilsetning av en sterk base slik som natriumhydroksyd

ved en pH-verdi høyere enn 11, spesielt mellom 11 og 12, fordelaktig mellom 11,2 og 11,6, og fortrinnsvis i nærheten av 11,5;

reduksjonen av fragmentene fra depolymerisasjonen ved hjelp av et reduksjonsmiddel og om nødvendig fjerning av det ureagerte reduksjonsmiddelet;

utvinningen av de reduserte fragmentene av heparin ved utfelling ved hjelp av et oppløsningsmiddel hvori de er uoppløselige;

isoleringen av de ønskede fragmenter ved fraksjonering ved hjelp av alkohol i nærvær av et mineralsalt av en vandig oppløsning oppnådd ved gjenoppløsning i vann av det tidligere isolerte bunnfall og ved utvinning av det dannede bunnfall.

Utførelsen av depolymerisasjonen ifølge en spesifikk metode kombinert med bruken av foreliggende fremgangsmåte med et fraksjoneringstrinn gjør det mulig å isolere en forbindelse av fragmenter tilsvarende en spesifikk terapeutisk profil og som spesielt er i besittelse av et tilfredsstillende terapeutisk indeks.

I perjod-oksydasjonstrinnet blir heparin og saltet av perjodsyre fortrinnsvis benyttet i mengder som leder til slutt-konsentrasjoner på 1,5-5 % og 1,5-2,5 % (vekt/vol.), respektivt .

Saltet av perjodsyre utgjøres fordelaktig av natriummetaperjodat.

For å fjerne resterende perjodat utføres en dialyse ved bruk av dialyserør med en porøsitet på 3-4.000 Da i ca. 15 timer. Det anvendes også kromatografi på en anionutvekslingsharpiks, f.eks. en harpiks slik som markedsføres under betegnelsen Amberlite IRA 400, hvor denne harpiksen benyttes i en mengde som er tilstrekkelig til å holde tilbake det resterende perjodat og derivatene av perjodat dannet under reaksjonen, dvs. f.eks. fra 1/6 til 1/8 av reakjonsvolumet. Denne metoden som er hurtigere enn dialyse og meget reproduserbar, gjør det mulig å utføre p<->elimineringen ved å utgå fra betingelser som er lette å standardisere.

Ifølge en utførelse av oppfinnelsen oppløses heparin i vann, mer spesielt demineralisert vann, ved 4°C og ved en konsentrasjon på ca. 5 % (vekt/vol.), et salt av perjodsyre slik som natriummetaperjodat tilsettes for å oppnå en sluttkonsentrasjon på ca. 2 # (vekt/vol.). Oppløsningens pH-verdi blir umiddelbart justert til 5 ved hjelp av fortynnet saltsyre eller fortynnet natriumhydroksyd. Oppløsningen hensettes i mørket ved +4"C, fortrinnsvis i 24 timer.

For å fjerne resterende perjodat utføres en dialyse ved bruk av dialyserør som har en porøsitet på 3-4.000 Da i ca. 15 timer mot rennende demineralisert vann.

Heparinkjedene som oppnås underkastes et depolymerisasjons-trinn i et basisk medium.

For dette formål tilsettes en sterk base, mer spesielt en konsentrert oppløsning av natriumhydroksyd, for oppnåelse av en sluttmolaritet for basen på 0,2 N.

Den oppnådde basiske oppløsning omrøres i 2 timer ved romtemperatur .

Depolymerisasjonsfragmentene av heparin utsettes deretter for et reduksjonstrinn for å omdanne aldehydgruppene som resulterer fra spaltingen av bindingen mellom karbonatomene C2og C3i uronsyrerestene.

Et reduksjonsmiddel slik som natriumborhydrid anvendes i en mengde på 50 mg pr. gram benyttet heparin, og omrøring opprettholdes i 6 timer ved romtemperatur.

Det uomsatte reduksjonsmiddelet ødelegges ved å senke pH-verdien til 4 ved hjelp av syre, f.eks. saltsyre, og fordelaktig under kraftig omrøring i ca. 15 min.

De reduserte fragmentene av heparin utvinnes ved utfelling.

Fordelaktig justeres pH-verdien til 7 ved hjelp av en base, spesielt konsentrert natriumhydroksyd, deretter tilsettes 20 g/liter av mineralsalt og en utfelling foretas ved hjelp av 1,5 volumdeler alkohol. Mineralsaltet som benyttes, er fortrinnsvis natriumklorid. For den alkoholiske utfelling anvendes fortrinnsvis etanol.

Det dannede bunnfall utvinnes ved sentrifugering, vaskes med et oppløsningsmiddel hvori det er uoppløselig, slik som etanol, og tørkes ved 40°C i et vakuum.

For å isolere fragmentene ifølge oppfinnelsen fra dette bunnfallet benyttes et fraksjoneringstrinn. En alkoholisk fraksjonering utføres fortrinnsvis som følger: Bunnfallet av heparinfragmenter gjenoppløses i vann, mer spesielt demineralisert vann, ved romtemperatur, dvs. fra ca. 18 til 20°C for oppnåelse av en konsentrasjon på 5 % (vekt/- vol.).

Et mineralsalt slik som natriumklorid tilsettes i en mengde som er tilstrekkelig til å gi en sluttkonsentrasjon på 1 H>. Oppløsningens pH-verdi justeres til 3,5 med en syre, f.eks. fortynnet saltsyre.

0,85 volumdeler av et oppløsningsmiddel hvori de ønskede

fragmentene er uoppløselige, slik som etanol, tilsettes deretter under moderat omrøring.

Blandingen hensettes i ca. 10 timer ved 18-20°C.

Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering, vaskes med et oppløsningsmiddel slik som etanol og tørkes i vakuum ved 40°C i 24 timer.

Om nødvendig kan dette bunnfallet underkastes et ytterligere rensetrinn etter å ha blitt oppløst i demineralisert vann, bestående av kromatografi på en anionutvekslet harpiks slik som en Amberlite IRA 400-harpiks, 0H~, som har et volum av størrelsesorden 1/10 av reaksjonsvolumet, for å fjerne mulige urenheter.

Det består av en blanding av heparinfragmenter hvorav størstedelen har en molekylvekt varierende mellom 4.800 og 9.000 Da. Om nødvendig kan det således oppnådde produkt omdannes til et annet farmasøytisk akseptabelt salt slik som et kalsiumsalt, et kaliumsalt eller et magnesiumsalt ifølge kjente metoder.

Blandingene av hepariner som fremstilles ifølge oppfinnelsen, bestående vesentlig av fragmenter med en molekylvekt mellom 4.800 og 9.000, og manglende bindingssete for ATIII, gjør det mulig å dra fordel av farmakologiske egenskaper av stor verdi som er forbundet med de regelmessige regionene i heparin. Ved aktive doser har disse blandingene bare meget lav antikoagulerende aktivitet.

Studiet av deres farmakologiske egenskaper har således vist at disse forbindelser utøver en inhiberende virkning på veksten av glatte muskelceller omtrent ekvivalent med den til heparin.

Forskjellige forsøk har gjort det mulig å demonstrere andre inhiberende effekter, spesielt med hensyn til aktiveringen av komplement og mot inflammatoriske reaksjoner av den for-sinkede hypersensitivitetstypen samt mot den enzymatiske aktiviteten til heparanase.

De er også i stand til å utøve en potensierende og stabilise-rende virkning på visse faktorer for cellevekst.

I tillegg er disse blandingene helt uskadelige, og er særlig stabile.

De er således spesielt egnet til å utgjøre aktive bestand-deler i legemidler.

Farmasøytiske preparater kan inneholde en effektiv mengde av en forbindelse bestående vesentlig av fragmenter av heparin slik som de som er definert ovenfor i forbindelse med en farmasøytisk bærer.

I betraktning av deres egenskaper er slike legemidler særlig nyttige i følgende terapeutiske indikasjoner: hindring av proliferasjonen av glatte muskelceller

ved angioplastier,

akselerasjon av vevsheling, spesielt i forbindelse

med hudsykdommer,

hindring av utviklingen av progressive aterogene lesjoner og av de fenomener som angår arteriosklero-tisk degenerering,

hindring av sjokktilstander,

hindring av utvikling av visse metastaser.

De farmasøytiske preparatene kan administreres i forskjellige former.

For administrasjonen ad oral vei benyttes spesielt kapsler, pastiller, tabletter, piller, glykosomer. Disse preparatene inneholder fordelaktig fra 50 mg til 5 g pr. enhetsdose, og fortrinnsvis 20-250 mg for kapsler, pastiller og piller.

Som en følge av dette avhenger administråsjonsformene vesentlig av den dose som skal administreres. Kapslene, pastillene og pillene er praktiske midler for administrasjon av smådoser. For administrasjon av høyere doser vil det være mer praktisk å benytte oppløsninger som kan drikkes.

Andre administrasjonsformer er sprayer, aerosoler, salver og kremer.

Det er også aktuelt med sterile eller steriliserbare, injiserbare farmasøytiske preparater for administrasjon både ad intravenøs vei og intramuskulært eller subkutant.

Disse oppløsningene inneholder fordelaktig fra 10 til 150 mg/ml av den aktive bestanddel når de skal injiseres subkutant og fra 10 til 100 mg/ml når de er ment for intravenøs injeksjon eller perfusjon.

Som illustrasjon gis følgende eksempel for dosen som kan benyttes for mennesker: Denne dose omfatter f.eks. administrasjon til pasienten av ca. 500 mg/enhetsdose subkutant 2-3 ganger pr. dag. Omkring1.000 mg/dag administreres intravenøst mens mengdene som injiseres ved perfusjon kan være opptil flere titalls ml. Disse administrasjonene foretas på diskontinuerlig måte ved regelmessige intervaller, eller ved kontinuerlig perfusjon. Det kan tilberedes biologiske reagenser hvis aktive bestand-deler utgjøres av forbindelsene av heparinfragmenter som definert ovenfor. Disse biologiske reagensene kan benyttes som referanser eller standarder i sammenligningsstudier i forskjellige fysiologiske systemer for hvis regulering GAH'ene er involvert.

Andre egenskaper og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra følgende eksempler og under henvisning til figurene 1-5 hvor: figurene 1 og 3 på den ene siden og 2 og 4 på den annen representerer HPLC-kurvene for en redusert depolymerisasjonsblanding og en forbindelse ifølge oppfinnelsen, respektivt, og

fig. 5 er<13>C NMR-spekteret av en forbindelse ifølge

oppf innelsen.

Eksempel 1

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse av heparinfragmenter

1) - Spalting av heparink. iedene med per. lodsvre

10 g injiserbar heparin fra slim fra gris i form av dens natriumsalt, som titrerte ved 157 ul/mg i Codex-bestemmelsen og ved 155 u/mg i anti-faktor Xa-bestemmelsen ifølge Yin et al.; oppløses i 250 ml demineralisert vann ved 4°C. Opp-løsningens pH-verdi justeres til 5,0 med konsentrert saltsyre. 10 g natriummetaperjodat (NaI04, molekylvekt 213,89) oppløst i 2250 ml demineralisert vann ved 4°C, tilsettes under moderat omrøring. Blandingens pH-verdi justeres til 5,0 med konsentrert saltsyre. Oppløsningen hensettes i mørket i 24 timer i et kaldt rom ved +4°C. 2) - Fjerning av det resterende per. iodat

Reaksjonsoppløsningen fordeles deretter mellom 3 NOJAX 40R<->dialyserør (porøsitet fra 3 til 4.000 Da) og underkastes dialyse i 15 timer mot rennende demineralisert vann.

3) - Depolvmerisas. lon i basisk medium

Til 780 ml av oppløsningen oppnådd etter dialyse tilsettes 16 ml av 10 N natriumhydroksyd, og blandingen omrøres i 3 timer ved romtemperatur (18-21'C).

4) - Reduksjon

500 mg natriumborhydrid (NaBH4, molekylvekt 37,83) tilsettes deretter, oppløsningen omrøres igjen i 4 timer ved romtemperatur. pH-verdien bringes deretter til 4 med konsentrert saltsyre. Etter omrøring i 15 min. justeres pH-verdien til 7 med konsentrert natriumhydroksyd.

Til 820 ml av den således oppnådde oppløsning tilsettes 16,4 g NaCl, fulgt av 1270 ml etanol. Blandingen hensettes i 3 timer og sentrifugeres deretter ved 2.500 omdr./min. i 20 min.

Bunnfallet oppsamles, resuspenderes i 200 ml ren etanol, males med en Ultra-Turrax<®>og utvinnes til slutt ved filtrering på en frittet Biichner-trakt. Deretter tørkes det i et vakuum ved 40°C i 5 timer.

Dette gir en innvinning på 8,9 g mellomprodukt med følgende egenskaper:

Codex-bestemmelse: 8 ul/mg

APTT-bestemmelse: 7ul/mg

Anti-Xa-bestemmelse: 8 u/mg

Den molekylære fordeling av forbindelsen er angitt i fig. 1 som tilsvarer HPLC-kurven registrert under de betingelser som er omtalt ovenfor.

5) - Alkoholisk fraksjonering

Nevnte 8,9 g oppløses i ca. 120 ml demineralisert vann ved romtemperatur. 1,78 g NaCl tilsettes, og oppløsningens pH-verdi senkes til 3,5 med saltsyre. Oppløsningens volum justeres til 178 ml med demineralisert vann. 151 ml ren etanol tilsettes under omrøring. Omrøringen opprettholdes i 15 min. etter at tilsetningen er fullført, og deretter hensettes blandingen i 10 timer ved romtemperatur.

Det dannede bunnfall oppsamles ved sentrifugering i 20 min. ved 2.500 omdr./min. Det resuspenderes i 150 ml ren etanol, males med en Ultra-Turrax, utvinnes ved filtrering på en frittet Biichner-trakt, vaskes med 300 ml ren etanol og blir til slutt tørket i et vakuum ved 40°C i 24 timer.

Dette leder til utvinning av 5,0 g i form av et hvitt pulver, idet 5,0 g av produktet IC 1772 (dvs. det ifølge eksempel 1 fremstilte produkt) har følgende egenskaper:

Codex-bestemmelse: 11 ul/mg

APTT-bestemmelse: 9 ul/mg

Anti-Xa-bestemmelse: 12 u/mg

Molekylfordelingen for den oppnådde forbindelse fremgår fra fig. 2 som tilsvarer HPLC-kurven registrert under de ovenfor angitte betingelser.

13^NMR- analyse

Karbon 13 NMR-spekteret er vist på fig. 5. Dette spekteret ble bestemt for en oppløsning av forbindelsen oppløst i deuteriumoksyd ved 25 MHz vd 35°C. De kjemiske skiftene er målt i forhold til metanol (51,6 ppm).

Undersøkelse av dette spekteret viser at det viser de karakteristiske signalene for en disakkaridkjede av 2-0-sulfo-a-L-iduronsyre (1 4) 6-0-sulfo-N-sulfo-a-D-glukosamin (1 -» 4)-typen.

Tilstedeværelsen av segmentene til de anomere karbonene observeres spesielt ved 101,7 ppm (2-0-sulfo—a-L-iduronsyre) mens signalene som er karakteristiske for de ikke-sulfaterte D-glukuron- og L-iduronsyrene (104,5 ppm) ikke er til stede, i motsetning til spekteret av et preparat av heparin hvor de kan representere opptil 30-40 % av de totale signalene for uronsyrene.

I regionen for C-2-glukosaminet er bare signalet ved 60,5 ppm (C-2 i N-sulfoglukosamin) til stede. Signalet som er karakteristisk for N-acetylglukosamin (56,4 ppm) er nesten ikke detekterbart mens det er til stede i utgangsheparinet.

I regionen for C-6-glukosaminet (62,5 for C-6-0H og 69 for C-6-OS), observeres tilstedeværelsen av de to signalene for forbindelsene som er ikke-sulfatert og sulfatert.

Det er viktig å bemerke at forholdet for intensiteten av signalene ved 99,4 ppm og 101,7 ppm er lik 1, hvilket bekrefter 2-0-sulfo-L-iduronsyre som eneste tilstedeværende.

Tilstedeværelsen av flere rester av N-acetylglukosamin kan detekteres. Likeledes er signalet for NHAc (24,6 ppm) tydelig.

Konduktometrisk analyse

Graden av sulfatering som bestemt ved konduktometrl er 2,3. Antall ladninger pr. disakkaridenhet er 3,3.

Eksempel 2

1) - 200 g injiserbar heparin, natriumsalt, som titrerer ved 154 ul/mg i Codex-bestemmelsen og ved 158 u/mg i anti-faktor Xa-bestemmelsen, oppløses i 5 liter demineralisert vann ved +4°C.

Oppløsningens pH-verdi justeres til 5,0 ved konsentrert HC1. Under moderat omrøring tilsettes deretter: 200 g natriummetaperjodat oppløst i 5 liter demineralisert vann ved +4°C. Blandingens pH-verdi justeres igjen til 5,0 med konsentrert HC1.

Den oppnådde oppløsning hensettes i mørket i 24 timer i et kaldt rom ved +4°C under moderat omrøring. 2) - Den fordeles deretter mellom 50 dialysesrør og dialyseres i 14 timer mot rennende, demineralisert vann ved romtemperatur . 3) - Når denne dialysen er fullført, utvinnes 14,5 liter oppløsning, til hvilken tilsettes 116 g rent natriumhydroksyd i form av pellets. Den således oppnådde oppløsning omrøres i 3 timer ved romtemperatur. 4) - 10 g natriumborhydrid tilsettes deretter, omrøring fortsettes i 4 timer.

Oppløsningens pH-verdi senkes til 4 med konsentrert HC1 i 15 min. og bringes deretter igjen til 7 med konsentrert natriumhydroksyd.

Volumet på den således oppnådde oppløsning er 15,2 liter. 304 g NaCl tilsettes fulgt av 22,8 liter etanol. Blandingen hensettes i 48 timer ved romtemperatur. Den klare super-natanten fjernes ved bruk av hevert, bunnfallet oppsamles, resuspenderes i 3 liter ren etanol, males med en Ultra-Turrax, og utvinnes ved filtrering på et glass-fritte-materiale.

Til slutt tørkes det i vakuum ved 40°C i 15 timer.

Det utvinnes 181 g fragmenter av heparin med følgende egenskaper:

Codex-bestemmelse: 10 ul/mg

ÅPTT-bestemmelse 9 ul/mg

Anti-Xa-bestemmelse: 9 ul/mg

Molekylfordeling: se fig. 3

5) - Disse 181 g oppløses i ca. 3 liter demineralisert vann ved romtemperatur. 36,2 g NaCl tilsettes, og oppløsnin-gens pH-verdi justeres til 3,5 med konsentrert EC1.

Oppløsningens volum justeres til 3,62 1 med demineralisert vann. 3,077 1 ren alkohol tilsettes under moderat omrøring. Omrøringen opprettholdes i 15 min. etter at tilsetningen er fullført, og blandingen hensettes i 10 timer ved romtemperatur. Bunnfallet som dannes, oppsamles ved sentrifugering i 20 min. ved 2.500 omdr./min. Det resuspenderes i 2 liter ren alkohol, males med en Ultra-Turrax, utvinnes ved filtrering på et fritte-materiale, vaskes med 3 liter ren etanol og tørkes til slutt i et vakuum ved 40°C i 24 timer. 104 g hvitt pulver oppnås til slutt, og har følgende egenskaper:

Eksempel 3

1) - Spalting av hepar inkj edene med perjodsyre

45 g injiserhar heparin fra griselim i form av dets natriumsalt oppløses i 600 ml demineralisert vann. 8 g natriummetaperjodat oppløst i 200 ml demineralisert vann ved 5°C tilsettes under moderat omrøring. pH-verdien justeres til 5 ved tilsetning av konsentrert HC1, og reaksjonsvolumet bringes til 900 ml med destillert vann. Oppløsningen holdes i mørket i 24-26 timer i et kaldt rom (0-10°C). Det dannede bunnfall fjernes ved filtrering.

2) - F. ierning av det resterende perjodat

De 900 ml av oksydasjonsreaksjonsproduktet av heparin filtreres gjennom en ioneutvekslerharpiks Amberlite IRA 400, Cl~ (Rohm and Haas Company, USA) med et volum på 1/8 av reaksjonsvolumet (110 ml) i løpet av 2 timer.

Kolonnen skylles med 225 liter demineralisert vann. Skylle-oppløsningene kombineres med den filtrerte oppløsningen. Dette gir 1.125 ml oppløsning som er fri for perjodat og jodat. Fraværet av perjodat kontrolleres ved titrering. Titreringskurven for 5 ml av oksyheparinoppløsningen med 2,5 ml 1 N natriumhydroksyd viser fraværet av perjodat. Perjodat i oppløsning ville ha resultert i en karakteristisk inflek-sjon for en pKa-verdi på ca. 7,8.

3) - Depolymerisas. ion i basisk medium

p-eliminering initieres ved tilsetning av 10 N natriumhydroksyd trinnsvis inntil en pH på 11,5 er oppnådd. Reaksjonen får fortsette i 1 time ved romtemperatur (18-23°C) under omrøring.

4 ) - Reduksjon

10 g natriumborhydrid tilsettes deretter for hver 100 g av benyttet utgangsmateriale. Denne reduksjonen utføres i minst 3 timer under omrøring. Overskudd reduksjonsmiddel fjernes deretter ved tilsetning av 25g/l NaCl, og deretter justeres oppløsningens pH-verdi til 4 med konsentrert HC1. Opp-løsningen justeres deretter til en nøytral pH-verdi med konsentrert NaOH.

Produktet utfelles ved tilsetning av 1,5 volumdeler ren etanol. Bunnfallet får sedimentere i løpet av 48-72 timer, dehydratiseres deretter med etanol og tørkes i et vakuum ved 40°C i 12 timer.

5 ) - Alkoholisk fraksjonering

Produktet opptas i demineralisert vann (180 ml for 10 g benyttet heparin). 2 g NaCl tilsettes for 10 g. pH-verdien justeres til 3,5, og oppløsningen bringes til et volum på 200 ml for 10 g benyttet, med demineralisert vann.

0,85 volumdeler ren etanol tilsettes under forsiktig om-røring. Bunnfallet får sedimentere i løpet av 48-72 timer. Bunnfallet opptas, dehydratiseres med ren etanol, males med en Ultra-Turrax® og tørkes ved 40°C. Produktet oppnås i form av et hvitt pulver. Produktet som er oppløselig i alkohol,

"ble analysert i HPLC. En gjennomsnittlig molekylvekt av størrelsesorden 33.500 har blitt målt for oligosakkaridene.

6) - Rensing

Produktet oppnådd i foregående trinnOppløses for oppnåelse av en 5 % oppløsning i demineralisert vann og renses på en ioneutvekslerkolonne av Amberlite IRA 400, OE<T>(1/10 av reaksjonsvolumet).

Produktet testes deretter med hensyn til dets egenskaper.

Sulfoneringsgrad (bestemt ifølge Helbert J. R. og Marini M. A., Biochemistry, 1963), 2, 1101-1106).

S03/C00" forholdet varierer fra 2,2 til 2,4.

Anti-IIA og anti-Xa aktiviteter:

Referansene til de benyttede systemer for utførelse av målingene er følgende: (1) R. R. Proctor og S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219

(2) XXIst American Pharmacopoeia

(3) Målt ved forlengelse av trombintiden.

(4) E. T. Yin, S. Wessler, J. V. Butler - J. Lab. Clin. Med. , 1973, 81, 298-310.

Demonstrasjon av uronsyrerester ringåpnet mellom C2 og C3

Smith's nedbrytning ved pH 3 og 100°C i løpet av 1 time av en oppløsning ved 5 % av IC 1772 resulterer i den spesifikke spalting av ol igosakkaridkjedene ved nivået for uronsyrene åpnet ved C og C3. Som et resultat blir den gjennomsnittlige molekylvekten av produktet nedsatt som vist ved gelfiltre-ring på TSK 2000 med refraktometrisk detektering.

Resultatene uttrykkes som følger:

Mna representerer den antallsmidlere molekylvekten slik som definert av W. W. Yau, J. J. Kirkland og D. D. Bly (i Modern size-exclusion liquid chromatography, Wiley Interscience Publication) til produktet testet som sådant;

Mnb representerer den antallsmidlere molekylvekten etter at Smith-nedbrytningen som angitt ovenfor, er utført;

Mna/Mnb - 1 gir antallet av seter som er sensitive for Smith-nedbrytning av oligosakkaridkjeden, hvilket tilsvarer antallet av uronsyrer åpnet mellom C2og C3.

Testen ble utført på to satser av IC 1772.

Det fremgår at under analysebetingelsene inneholder IC 1772 minst en åpen uronsyre for to kjeder.

Antikoagulerende effekt av IC 1772 i humanplasma:

I det nedenstående rapporteres resultatene oppnådd for:

1. In vitro anti-IIa- og anti-Xa-aktivitetene i forskjellige systemer.

2. Trombin-koaguleringstidene (TCT).

1) - In vitro anti- IIa- og anti- Xa- aktiviteter

Referansene til de benyttede systemer for utførelse av målingene er følgende: (1) R. R. Proctor og S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219.

(2) XXIst American Pharmacopoeia

(3) Målt ved forlengelse av trombintiden

(4) E. T. Yin, S. Wessler, J. V. Butler - J. Lab. Clin. Med., 1973, 81, 298-310.

2) - TCT

I nedenstående tabell 1 er resultatene angitt i form av koaguleringstider uttrykt i sekunder for tre analyser utført ved tre typer av plasma benyttet for studium av APTT-aktiviteten. Kontrollen er utført på normalplasma. Resultatene tilsvarer middelet for to uavhengige analyser.

En forlengelse av trombintiden observeres ved doser på 5 og spesielt ved 10 jjg/ml hvilket synes å avhenge av HCII.

Inhibering av proliferasjonen av glatte muskelceller (SMC) in vitro

Forsøksmodell

De glatte muskelcellene (SMC) oppnås fra et bukhulesegment av aorta hos en Sprague Dawley-rotte. Små stykker av medier anbringes i kultur i EPMI-1640 medium supplert med 20 %-kalvefosterserum (FCS). Ved slutten av 1-2 uker migrerer SMC ut av vevene og begynner å formere seg.

5-8.10<3>SMC anbringes i kultur i flerbrønnplater. Etter 24 timer stoppes deres vekst ved vasking fulgt av tilsetning av RPMI-medium + 2 S6 blodplatefritt plasma (eller RPMI + 0,4 % FCS) i 72 timer.

Cellene anbringes deretter igjen i 5-7 dager i RPMI-medium supplert med 20 # FCS med eller uten den forbindelse som skal testes, idet den sistnevnte anvendes i forskjellige kon-sentrasjoner .

Nettoveksten av SMC i kontrollanalysene og de som er supplert med produktene som skal testes, oppnås ved å subtrahere antall celler ved begynnelsen fra antall celler ved slutten av forsøket (måling i duplikat med en Coulter-teller).

Den prosentvise inhibering er gitt ved følgende formel:

Se Castellot et al., J. Cell. Biol., 102, 11986, 979-1984).

De oppnådde resultater avhengig av konsentrasjonen av IC 1772 er følgende (for sammenligningsformål er verdiene for inhibe-ringen oppnådd med heparin angitt).

En aktivitet meget nær den for standard heparin observeres i denne forsøksmodellen.

Inhibering av proliferasjsonen av glatte muskelceller (SMC)in vivo: Ballkateter-modell

Forsøksmodell

Forsøket utføres på Sprague Dawley-hannrotter av en alder på 5 mndr., og med en vekt på ca. 500 g.

Dyrene bedøves og endotelet i venstre halspulsåre blott-legges ved intraluminal passasje av et ballkateter for embolektomi innført i den utvendige forgrening av pulsåren.

Produktet som skal testes, eller en steril kontroll-oppløsning administreres ved kontinuerlig infusjon i laktose tilsatt Ringer-oppløsning i venstre halsåre (bruk av en osmo-tisk infusjonspumpe (Alzet) plassert på dyrets rygg). Behandlingen fortsettes i 4 uker i et omfang av 2,5 pl/time. Den administrerte dosen var 1 mg/kg/ time.

Etter 28 dager bedøves dyrene, og halspulsårene fjernes. Ved 17, 9 og 1 time før bedøvelse mottok dyrene en intra-peritoneal injeksjon av tritiert tymidin.

Resultatene er uttrykt ved Innholdet av DNA i de skadede høyre halspulsårene (RC) og de uskadede venstre halspulsårene (LC) ifølge nedenstående beregning:

(se A. W. Clowes og M. M. Clowes, Labor. Investi., 1985, 52(6), 612-616).

Resultater

I en første analyse som omfatter 10 dyr observeres en inhibering på ca. 50 56, nær den til heparin, med det testede IC 1772-produktet.

Inhibering av komplementsystemet

Heparin inhiberer dannelsen av vekslende amplifiserende C3-konvertase til komplementet ved inhibering av dannelsen av det bimolekylære komplekset mellom proteinene C3b og B.

Effekten av heparin og produktet IC 1772 på Csb-B-bindingen ble studert ved bruk av B-proteiner merket med 125I(<12>5i_b) og saue-erytrocytter som bærere for protein C3b (E<s>C3b).

Konsentrasjonen av testet heparin eller oligosakkarid som skal til for å bevirke ca. 50 % inhibering av dannelsen av Csb-B-komplekset, betegnes IC50.

Denne måling foretas in vitro i et system av rensede proteiner.

Forsøkssvstem

E<s>C3b (0,75-2,5 x IO<7>) inkuberes i forskjellige konsentra-sjoner av<125>I-B i veronal-buffer inneholdende 0,1 % gelatin og 5 mM Mg<2+>i 30 min. ved 30°C.

Duplikatprøver på 70 jil for hver reaksjon avsettes på 30 jjI av en blanding av dibutylftalat (Merck-Clevenot, Frankrike) og dinonylf talat (Coger, Paris) (7:3 v/v) i 0,5 ml poly-propylenrør.

Rørene sentrifugeres i 1 min. ved 8.000 g i en Beckman-mikrosentrifuge (Beckman, Paris), og deretter kuttes de like over bunnfallene. Radioaktiviteten til den bundede liganden telles.

Produktet IC 1772 ble bestemt sammenlignet med heparin. Resultatene uttrykt som IC 50 er følgende:

Blødningstid

Produktet administreres til kanin ad intravenøs vei ved en dose på 5 mg/kg 15 min. og 1 time før forsøket.

Forsøksmodellen er den ifølge Cade som beskrevet av Cade et al. i Thromb. Res. 35, 613-625, 1986.

De foretatte analyser viser at produktet ikke leder til noen økning i blødningstiden ved dosen på 5 mg/kg ad intravenøs vei.

Studium av den antitrombotiske aktivitet for IC 1772

Følgende modell benyttes:

Dyrene bedøves med 70 mg/kg Ketaset® (Bristol Lab., Syracuse, NY) ad intramuskulær vei. Ved hjelp av en kirurgisk teknikk isoleres en lengde på 2 cm langs høyre og venstre halsårer. Produktet som skal testes, injiseres intravenøst i randåren i øret nøyaktig 5 min. etter injeksjon av en trombogen substans slik som en blanding av konsentrert protrombinkompleks og huggormgift (PCC/RVV). Etter 20 sek. underbindes halsåren, og etter 10 min. stase blir åresegmentene fjernet og anbragt i fysiologisk serum, hvoretter graden av dannelse av blod-levring vurderes ifølge en skala fra 0 til 4 (4 representerer en enkelt klump uten frie erytrocytter) (Fareed, J., Walenga, J. M., Kiumar, 2 og Rock, Å. "Å modified stasis thrombosis model to study the antithrombotic actions of heparin and its fractions". Sem. Thromb. Hemost. 11 (2), 155-175, 1985).

IC 1772 administrert intravenøst ved en dose på 1 mg/kg til en gruppe på 10 kaniner viste meget god antitrombotisk aktivitet i alle dyrene.

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk virksom blanding av hepariner med lav molekylvekt, som nesten fullstendig mangler antikoagulerende aktivitet, hvor blandingen vesentlig består av fragmenter som mangler gjentagende disakkaridsekvenser av typen ikke-sulfatert uronsyre-glukosamin-N-sulfat, hvor disse fragmentene tilsvarer følgende generelle formel:

hvor X representerer enten en sulfatert iduronsyrerest med formelen:

eller, når det er minst 1 rest pr. 2 kjeder, en ikke-sulfatert uronsyrerest (D-glukuron- eller L-iduronsyre), ringåpnet mellom karbonatomene ved stillinger 2 og 3 i formelen:

Y representerer en D-glukosaminrest med formelen:

Ri er et hydrogenatom eller en —S03~-gruppe, R2er en -S03~-gruppe eller en -CO-CE3-gruppe, idet andelen av -S03~-gruppene er minst 90 %, og R3er en —S03~-gruppe eller et hydrogenatom, idet andelen av —SO3<->-gruppene er minst 70 %, R representerer et hydrogenatom eller en rest:

hvor R1-R3har de ovenfor angitte betydninger, og R4er et hydrogenatom eller en uronsyrerest, R' representerer enten et hydrogenatom eller en umodifisert uronsyrerest, eller en uronsyrerest som er modifisert ved perjod-oksydasjon, og hvis aldehydfunksjoner er redusert til alkoholer, med 7 < n < 15 for hovedelementene, hvilket tilsvarer kjeder med molekylvekt fra 4.800 til 9.000, og farmasøytisk akseptable salter derav, hvilken blanding i gjennomsnitt fortrinnsvis har 3,3 ladninger pr. disakkaridenhet,karakterisert vedat a) en vandig oppløsning av heparin ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-4 % (vekt/vol.) behandles med perjodsyre ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-4 % (vekt/vol) ved en pH-verdi mellom 4,5 og 6,5 ved en temperatur mellom 0 og 10"C; b) de således oppnådde heparinkjeder behandles med en sterk base ved en sluttmolaritet for basen på 0,1-0,3 N; c) de således oppnådde depolymerisasjonsfragmenter behandles med et reduksjonsmiddel; d) etter fjerning av overskudd reduksjonsmiddel, om nødvendig, blir de reduserte fragmentene utfelt med et alkoholisk oppløsningsmiddel etter tilsetningen av et mineralsalt, e) en vandig oppløsning av det således oppnådde bunnfall og til hvilket et mineralsalt er tilsatt, behandles med alkohol og f) det således dannede, utfelte produkt utvinnes og, om nødvendig, omdannes saltet som tilsvarer den benyttede sterke basen til et annet farmasøytisk akseptabelt salt.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den består av en kombinasjon av følgende trinn: regulert oksydasjon av heparin utført ved omsetning av heparin i en vandig oppløsning ved en sluttkonsentrasjon på0,5-5 # (vekt/vol.) fortrinnsvis 1,5-5 % (vekt/vol.), med et salt av perjodsyre ved en sluttkonsentrasjon på 0,5-4 # (vekt/vol.), fortrinnsvis 1,5-2,5 # (vekt/vol.), ved en pH-verdi mellom 4,5 og 6,5, fortrinnsvis ved en pH-verdi på 5, ved en temperatur mellom 0 og 10° C, fortrinnsvis 4°C, i fra15 til 48 timer, og beskyttet fra lys, idet saltet av perjodsyre fortrinnsvis er natriummetaperjodat, depolymerisasjon av de oppnådde heparinkjedene ved tilsetning av en sterk base slik som natriumhydroksyd i en mengde som er tilstrekkelig til å gi en sluttmolaritet for basen fra 0,1 til 0.3 N, ved en pH-verdi over 11, spesielt mellom 11 og 12, fordelaktig mellom 11,2 og 11,6, og fortinnsvis 11,5, reduksjon av depolymerisasjonsfragmentene med et reduksjonsmiddel og deretter, om nødvendig, fjerning av uomsatt reduksjonsmiddel, spesielt ved dialyse utført med dialyserør som har en porøsitet på 3-4.000 Da i ca. 15 timer, utvinning av de reduserte heparinfragmentene ved utfelling ved hjelp av et oppløsningsmiddel hvori de er uoppløselige, isolering av de ønskede fragmentene ved fraksjonering med alkohol i nærvær av et mineralsalt av en vandig oppløs-ning oppnådd ved gjenoppløsning i vann av bunnfallet som på forhånd er isolert og ved utvinning av det dannede bunnfall, idet utvinningen av de reduserte fragmentene av heparin ut-føres fortrinnsvis ved å justere pH-verdien til 7 og deretter, etter tilsetning av et mineralsalt slik som NaCl, ved tilsetning av 1-1,5 volumdeler av et oppløsningsmiddel slik som etanol.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat de reduserte utfelte heparinfragmentene oppløses til dannelse av en 5 $ (vekt/vol.) oppløsning i vann hvortil et mineralsalt er tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 %, idet oppløsningens pE-verdi justeres til 3,5 og 0,85 volumdeler av et alkoholisk oppløsningsmiddel slik som etanol tilsettes.