CN108424474B - 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗，该去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小于等于70IU/mg，优选小于等于60IU/mg，优选抗小于等于50IU/mg，优选小于等于40IU/mg，优选小于等于30IU/mg，优选小于等于20IU/mg，优选小于等于10IU/mg，其抗IIa因子小于等于175IU/mg，优选小于等于170IU/mg，优选小于等于160IU/mg，优选小于等于150IU/mg，优选小于等于140IU/mg，优选小于等于130IU/mg，优选小于等于120IU/mg，优选小于等于110IU/mg，优选小于等于100IU/mg，优选小于等于90IU/mg，优选小于等于80IU/mg，优选小于等于70IU/mg，优选小于等于60IU/mg，优选小于等于50IU/mg，优选小于等于40IU/mg，优选小于等于30IU/mg，优选小于等于20IU/mg，优选小于等于10IU/mg。

Description

去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗
技术领域
本发明涉及制备去抗凝肝素衍生物，以及其用于预防和/或治疗炎症性 肠病的用途。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一组发病非常广泛、无 法治愈的慢性炎性病症，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩 病(Crohn'sdisease,CD)。据报道，在西方国家IBD患病率最高达到0.8％， 在亚洲地区IBD的发病率和患病率均呈持续增长趋势并且增速迅猛，成为全球广泛关注的疾病。预计在未来十年内很多国家的患病率增长幅度将超过 40％。IBD相关药物需求将有大幅度增长(Bernstein CN,et al.World Gastroenterology Organisation Global Guidelines InflammatoryBowel Disease:Update August 2015.Journal of Clinical Gastroenterology,2016,50(10):p. 803-818.)。在东方国家，IBD的发病以UC为主。在印度，UC/CD的发病率 比例是8-10:1(Bernstein,C.N.,et al.,World Gastroenterology Organization PracticeGuidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010.Inflamm Bowel Dis,2010.16(1):p.112-24.)。目前UC的病因和发病机制尚不明确且无法治愈(Kornbluth,A.and D.B.Sachar,Ulcerative colitis practice guidelines in adults:AmericanCollege Of Gastroenterology,Practice Parameters Committee.Am J Gastroenterol,2010.105(3):p.501-23；quiz 524.)。
UC的治疗药物在整体动物模型和临床实验中已研究了40多年时间。 UC患者的传统治疗，一般采用巯基嘌呤类免疫抑制剂，皮质类固醇消炎药 等(Chen,Y.,et al.,PHD3Stabilizes the Tight Junction Protein Occludin and Protects IntestinalEpithelial Barrier Function.J Biol Chem,2015.290(33):p. 20580-9.Ordas,I.,etal.,Ulcerative colitis.Lancet,2012.380(9853):p.1606-19.Zhang,M.,et al.,Theproinflammatory effect and molecular mechanism of IL-17 in the intestinalepithelial cell line HT-29.J BUON,2015.20(1):p.120-7.)。但是由于药物特异性较差，副作用较强，临床治疗仍然无 法得到令人满意的效果(Rosenberg,L.N.andM.A.Peppercorn,Efficacy and safety of drugs for ulcerative colitis.ExpertOpin Drug Saf,2010.9(4):p.573-92.)。在药物治疗无效，或炎症进一步发展的情况下，一般只有采用手 术治疗对病变部位进行切除(Akiho,H.,et al.,Promising biologicaltherapies for ulcerative colitis:A review of the literature.World JGastrointest Pathophysiol,2015.6(4):p.219-27.)。
UC病人本身具有高凝的风险，常用肝素或低分子量肝素(Low Molecular WeightHeparins,LMWHs)来进行预防及治疗。
肝素是一类硫酸化、多分散、线性的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans， GAGs)，是最重要的抗凝药物之一。在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾 病。此外，肝素及其衍生物具有广泛的生物学活性，包括协调细胞黏附、调 控细胞生长和增殖、发育过程、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、 新血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。
LMWHs的抗炎等生物学活性也发挥治疗UC的作用，很多临床UC患 者使用LMWHs后症状得到缓解(Lean,Q.Y.,et al.,Heparins in ulcerative colitis:proposedmechanisms of action and potential reasons for inconsistent clinicaloutcomes.Expert Rev Clin Pharmacol,2015.8(6):p.795-811.)。乙酰肝 素酶是肝素类药物的重要靶点，抑制乙酰肝素酶的活性，防止肠黏膜的进一 步损伤是其发挥治疗作用机制之一(Waterman,M.,et al.,Heparanase upregulation by colonic epithelium ininflammatory bowel disease.Mod Pathol, 2007.20(1):p.8-14.)。但目前LMWHs在治疗UC上，存在着构效关系尚不明确等问题。
探索利用LMWHs治疗溃疡性结肠炎(UC)已有20多年时间。一些病人 皮下注射LMWHs(如达肝素，那曲肝素)后症状得到明显缓解。另外一部分 研究考察了口服肝素对溃疡性结肠炎的治疗效果，70％-90％的临床病人得到 了完全缓解。然而，也有某些研究得到的结论是相矛盾的。例如，Elan在 2001年开发了Deligoparin(OP-2000)来作为UC的潜在治疗药物。虽然安全 性评价数据结果很好，但临床II期和III期实验结果却十分令人失望(Korzenik, J.,et al.,Multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlledtrial of deligoparin(ultra low molecular weight heparin)for active ulcerativecolitis.Gastroenterology,2003.124(4):p.A67.)。导致这些矛盾的可能原因有很 多，譬如给药剂量不同，病情进展和严重程度不一，临床终点不一致等。
发明内容
本发明的目的是要提供一类具有预防和/或治疗炎症性肠病的去抗凝肝 素衍生物类药物。肝素类药物在临床上常用于伴有高凝状态的炎症性肠病病 人，一方面发挥肝素本身的抗凝血功能，另外肝素也具有抗炎效果，但抗凝 血活性的保留始终存在出血的风险，这些副作用制约了肝素在与凝血相关性不强的炎症性疾病中的应用。
去抗凝肝素衍生物用于炎症性肠病的治疗还未见报道，目前主要有利用 高碘酸氧化法对肝素去抗凝的方法，还有利用硅烷化试剂、碱催化或溶剂解 等化学方法对肝素进行去硫酸化修饰达到去抗凝效果。
在本发明中，本发明人尝试对市场上购买的肝素、可商购的低分子量肝 素伊诺肝素等利用后述的几种不同的方法进行肝素的去抗凝处理，研究结果 发现去抗凝修饰对于提高炎症性肠病治疗效果十分关键。相对于具有抗凝活 性的各种肝素或(超)低分子量肝素而言，其各自经过处理后的去抗凝肝素衍 生物都显示出良好的IBD治疗效果。
具体来说，本发明涉及以下内容：
(1).一种去抗凝肝素衍生物，其抗Xa因子小于等于70IU/mg，优选抗 Xa因子小于等于60IU/mg，优选抗Xa因子小于等于50IU/mg，优选抗Xa 因子小于等于40IU/mg，优选抗Xa因子小于等于30IU/mg，优选抗Xa因子小于等于20IU/mg，优选抗Xa因子小于等于10IU/mg，并且
其抗IIa因子小于等于175IU/mg，优选抗IIa因子小于等于170IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于160IU/mg，优选抗IIa因子小于等于150IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于140IU/mg，优选抗IIa因子小于等于130IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于120IU/mg，优选抗IIa因子小于等于110IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于100IU/mg，优选抗IIa因子小于等于90IU/mg，优 选抗IIa因子小于等于80IU/mg，优选抗IIa因子小于等于70IU/mg，优选 抗IIa因子小于等于60IU/mg，优选抗IIa因子小于等于50IU/mg，优选抗IIa因子小于等于40IU/mg，优选抗IIa因子小于等于30IU/mg，优选抗IIa 因子小于等于20IU/mg，优选抗IIa因子小于等于10IU/mg。
(2).根据(1)所述的去抗凝肝素衍生物，其中，所述去抗凝肝素衍生物的 重均分子量为8000以上。
(3).根据(1)所述的去抗凝肝素，其中，所述去抗凝肝素衍生物的重均分 子量为小于8000。
(4).一种去抗凝肝素衍生物在用于制备治疗炎症性肠病，以及炎症性肠 病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途，其中，炎症性肠病相 关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他 肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄 膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
(5).根据(4)所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小 于等于70IU/mg，优选抗Xa因子小于等于60IU/mg，优选抗Xa因子小于 等于50IU/mg，优选抗Xa因子小于等于40IU/mg，优选抗Xa因子小于等 于30IU/mg，优选抗Xa因子小于等于20IU/mg，优选抗Xa因子小于等于 10IU/mg，并且
其抗IIa因子小于等于175IU/mg，优选抗IIa因子小于等于170IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于160IU/mg，优选抗IIa因子小于等于150IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于140IU/mg，优选抗IIa因子小于等于130IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于120IU/mg，优选抗IIa因子小于等于110IU/mg， 优选抗IIa因子小于等于100IU/mg，优选抗IIa因子小于等于90IU/mg，优 选抗IIa因子小于等于80IU/mg，优选抗IIa因子小于等于70IU/mg，优选 抗IIa因子小于等于60IU/mg，优选抗IIa因子小于等于50IU/mg，优选抗IIa因子小于等于40IU/mg，优选抗IIa因子小于等于30IU/mg，优选抗IIa 因子小于等于20IU/mg，优选抗IIa因子小于等于10IU/mg。
(6).根据(4)或(5)所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的重均分子 量为8000以上。
(7).根据(4)或(5)所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的重均分子 量为小于8000。
附图说明
图1各组试验中结直肠组织病理切片HE染色。
图2各组试验中的全段结直肠长度结果，其中(a)是结直肠的照片，(b) 是显示各组结直肠长度的柱状图。
图3各组试验的脾脏指数。
图4各组试验中的ZO-1蛋白表达水平。
图5各组试验的细胞凋亡水平
具体实施方式
以下，对本文的实施方式进行具体说明。
<本发明的去抗凝肝素衍生物(以下也称为去抗凝肝素)>
本发明涉及的去抗凝肝素衍生物是对肝素或(超)低分子量肝素进行去抗 凝处理后得到的物质。
通常来说肝素、低分子量肝素、戊糖都是通过加快抗凝血酶Ⅲ灭活凝血 因子的速度而起到抗凝作用，该类药物的主要作用是抗Xa和抗IIa因子活性。 通过对肝素类药物抗Xa活性与抗IIa活性的研究发现，抗Xa活性对分子质 量不敏感，抗IIa活性则依赖分子质量的大小。分子质量越大，抗IIa活性越强。肝素对IIa因子灭活有赖于肝素-抗凝血酶-IIa因子三联复合物的形成， 此时肝素同时结合于抗凝血酶和因子IIa，要实现这种连接肝素至少要含有 18个糖单位，其中起“桥梁”作用需要13个单糖，另需5个单糖作为识别片 段。每个单糖平均分子质量为300Da，因此分子质量一定要达到5400Da以 上才具有抗IIa活性。普通肝素平均分子质量15000-19000Da，绝大多数分 子在5400Da以上，其抗Xa与抗IIa活性比值约为1。低分子肝素平均分子 质量为4000-5000Da，分子质量在5400Da以上的分子片段所占比例较小，一般情况下其抗Xa:抗IIa活性约1.5:1～5:1。
在本发明的去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，优选抗Xa因 子小于等于60IU/mg，优选抗Xa因子小于等于50IU/mg，优选抗Xa因子 小于等于40IU/mg，优选抗Xa因子小于等于30IU/mg，优选抗Xa因子小 于等于20IU/mg，优选抗Xa因子小于等于10IU/mg。
在本发明的去抗凝肝素的抗IIa因子小于等于175IU/mg，优选抗IIa因 子小于等于170IU/mg，优选抗IIa因子小于等于160IU/mg，优选抗IIa因 子小于等于150IU/mg，优选抗IIa因子小于等于140IU/mg，优选抗IIa因 子小于等于130IU/mg，优选抗IIa因子小于等于120IU/mg，优选抗IIa因 子小于等于110IU/mg，优选抗IIa因子小于等于100IU/mg，优选抗IIa因 子小于等于90IU/mg，优选抗IIa因子小于等于80IU/mg，优选抗IIa因子 小于等于70IU/mg，优选抗IIa因子小于等于60IU/mg，优选抗IIa因子小 于等于50IU/mg，优选抗IIa因子小于等于40IU/mg，优选抗IIa因子小于 等于30IU/mg，优选抗IIa因子小于等于20IU/mg，优选抗IIa因子小于等 于10IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于175IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等 于20IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素 的抗Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于175IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于170IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于170IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于170IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于170 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于170IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于170IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于170IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于160IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于160IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于160IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于160 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于160IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于160IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于160IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于150IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于150IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于150IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于150 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于150IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于150IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于150IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于140IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于140IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于140IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于140 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa 因子小于等于140IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于140IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于140IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于130IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于130IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于130IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于130 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于130IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于130IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于130IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于120IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于120IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于120IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于120 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于120IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于120IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于120IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于110IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于110IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于110IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于110 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于110IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于110IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于110IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于100IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于100IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于100IU/mg。本发明的一 种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于100 IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于100IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于 20IU/mg，且抗IIa因子小于等于100IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗 Xa因子小于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于100IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于90IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于90IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于90IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于90IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于90IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于90IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于90IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于80IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于80IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于80IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于80IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于80IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于80IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于80IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于70IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于70IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于70IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于70IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于70IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于70IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于70IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于60IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于60IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于60IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于60IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于60IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于60IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于60IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于50IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于50IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于50IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于50IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于50IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于50IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于50IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于40IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于40IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于40IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于40IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小 于等于40IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于40IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于40IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于30IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于30IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于30IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于30IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于30IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于30IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于30IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于20IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于20IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于20IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于20IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于20IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于20IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于20IU/mg。
本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于70IU/mg，且抗IIa因 子小于等于10IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于60 IU/mg，且抗IIa因子小于等于10IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa 因子小于等于50IU/mg，且抗IIa因子小于等于10IU/mg。本发明的一种去 抗凝肝素的抗Xa因子小于等于40IU/mg，且抗IIa因子小于等于10IU/mg。 本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于30IU/mg，且抗IIa因子小于等于10IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小于等于20IU/mg， 且抗IIa因子小于等于10IU/mg。本发明的一种去抗凝肝素的抗Xa因子小 于等于10IU/mg，且抗IIa因子小于等于10IU/mg。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为5.8IU/mg，抗IIa因子为5.8IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重均 分子量为15158Da，数均分子量为13224Da，其重均分子量分布为，大于 24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为8.57％，16k～24k Da 的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为28％，8k～16k的肝素分子 所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为53.8％，小于8k Da的肝素分子所占整 个去抗凝肝素衍生物的比例为9.63％。该去抗凝肝素衍生物是通过对市场上购买的普通肝素进行去抗凝处理之后得到的。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为3.5IU/mg，抗IIa因子为5.1IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重均 分子量为4326Da，数均分子量为3254Da，其重均分子量分布为，小于3k Da 的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为35.55％，3k～5k Da的肝素 分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为31.94％，5k～8k的肝素分子所占整 个去抗凝肝素衍生物的比例为24.07％，大于8k Da的肝素分子所占整个去抗 凝肝素衍生物的比例为8.44％。该去抗凝肝素衍生物是通过对市场上购买的低分子肝素，即伊诺肝素进行去抗凝处理之后得到的。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为20.3IU/mg，抗IIa因子为33.1IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重 均分子量为16427Da，数均分子量为13117Da，其重均分子量分布为，大于 24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为20.62％，16k～24k Da 的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为20.00％，8k～16k的肝素分 子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为36.71％，小于8k Da的肝素分子所占 整个去抗凝肝素衍生物的比例为22.67％。该去抗凝肝素衍生物是通过对市场上购买的普通肝素进行去抗凝处理之后得到的。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为60.6IU/mg，抗IIa因子为170.8IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重 均分子量为15793Da，数均分子量为13223Da，其重均分子量分布为，大 于24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为13.44％，16k～24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为26.04％，8k～16k的肝素 分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为44.20％，小于8k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为16.32％。该去抗凝肝素衍生物是通过对 市场上购买的普通肝素进行去抗凝处理之后得到的。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为39IU/mg，抗IIa因子为124.9IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重均 分子量为15212Da，数均分子量为12791Da，其重均分子量分布为，大于 24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为10.91％，16k～24k Da 的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为24.46％，8k～16k的肝素分 子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为46.95％，小于8k Da的肝素分子所占 整个去抗凝肝素衍生物的比例为17.68％。该去抗凝肝素衍生物是通过对市场上购买的普通肝素进行去抗凝处理之后得到的。
在本发明的一个具体的实施方式中，一种去抗凝肝素衍生物的抗Xa因 子为1.2IU/mg，抗IIa因子为7.5IU/mg，并且该去抗凝肝素衍生物的重均 分子量为16706Da，数均分子量为13915Da，其重均分子量分布为，大于 24k Da的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为17.10％，16k～24k Da 的肝素分子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为28.55％，8k～16k的肝素分 子所占整个去抗凝肝素衍生物的比例为40.67％，小于8k Da的肝素分子所占 整个去抗凝肝素衍生物的比例为13.68％。该去抗凝肝素衍生物是通过对市场上购买的普通肝素进行去抗凝处理之后得到的。
用于生产本发明的去抗凝肝素衍生物的原料肝素可以是普通肝素，也可 以是(超)低分子肝素，既可以是重均分子量大于8000Da的肝素，也可以是 重均分子量在8000Da以下的肝素。
<本发明中使用的生产去抗凝肝素衍生物的方法>
通过高碘酸氧化法能得到去除抗凝活性的肝素分子，并且其他生物学活 性能很大程度保留，硫酸化程度与形式基本保持不变。高碘酸可以选择性的 氧化含有未取代羟基或氨基的邻位碳原子，使得无硫酸化的糖醛酸C(2)-C(3) 键断裂，肝素分子内的抗凝血酶结合五糖中的葡萄糖醛酸因而遭到破坏，失去抗凝活性；高碘酸氧化得到的聚醛类氧化肝素通过硼氢化物的还原以保持 稳定(Islam,T.,et al.,Further evidence thatperiodate cleavage of heparin occurs primarily through the antithrombinbinding site.Carbohydrate Research,2002. 337(21–23):p.2239-2243.)。经过过去二三十年的研究发现，不同去抗凝程度 和不同分子量大小的氧化去抗凝肝素具有抗肿瘤转移、抗炎、抗疟等多种生物学活性，已被应用于急性心肌梗死、肿瘤转移、血管生成等领域的研究之 中(Cassinelli,G.and A.Naggi,Old and new applications of non-anticoagulant heparin.International Journal of Cardiology,2016.212,Supplement1:p.S14-S21.)。部分药物已进入临床研究阶段，如分子量与肝素相近的 SST0001(Cassinelli,G.,et al.,Antitumor efficacy of the heparanase inhibitorSST0001alone and in combination with antiangiogenic agents in the treatmentof human pediatric sarcoma models.Biochemical Pharmacology,2013.85(10):p.1424-1432.)，还有低分子量的Vasoflux，M402等(Zhou,H.,et al.,M402,a novelheparan sulfate mimetic,targets multiple pathways implicated in tumorprogression and metastasis.PloS one,2011.6(6):p.e21106.Weitz,J.I.,et al.,Vasoflux,a new anticoagulant with a novel mechanism of action.Circulation,1999.99(5):p.682-689.)。
利用硅烷化试剂如N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(BTSA)或N-甲基-N-(三 甲基硅基)-三氟乙酰胺(MTSTFA)与肝素吡啶盐反应可以选择性地去除肝素 的6-O-硫酸基，BTSA在温和条件下能部分去除肝素的6-O-硫酸基，而剧烈 条件下往往有N-去硫酸化的副反应产生。MTSTFA可以完全去除肝素的6-O- 硫酸基并且副反应很少，仅有少量的2-O-硫酸基会被影响(Kariya,Y.,et al., Preparation of completely 6-O-desulfated heparin andits ability to enhance activity of basic fibroblast growth factor.Journal ofBiological Chemistry,2000. 275(34):p.25949-25958.)。
碱催化法是去除肝素部分O-硫酸基的常用修饰手段。当肝素在碱性条 件下冻干(pH为11-14)，2-O-硫酸-α-L-艾杜糖醛酸残基发生去硫酸化形成2,3- 环氧化合物中间体，进一步水解形成去硫酸化的α-L-艾杜糖醛酸，得到2-O 去硫酸化的肝素。肝素链中D-葡萄糖胺残基上较为罕见的3-O硫酸基也会 受到影响部分脱落，而其余硫酸基则保持完整。不同的碱性条件(如在不同浓度的氢氧化钠溶液中)可能会导致2-O去硫酸化程度不一。反应过程也可 以添加还原剂如硼氢化钠以保护肝素链不会降解片段化(Fryer,A.,et al.,Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparin that retainspharmacological activity in the lung.Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics,1997.282(1):p.208-219.)。
肝素葡萄糖胺残基上N-硫酸基的去除常采用溶剂解法。水解去N位硫 酸基可能伴随糖苷键的断裂和O-硫酸基的去除，而肝素吡啶盐在含少量水 的DMSO中能实现N-硫酸基的去除并且无糖苷键断裂(Inoue,Y.,&Nagasawa,K.Selective N-desulfation ofheparin with dimethyl sulfoxide containing water or methanol.Carbohydrateresearch,1976.46(1):p.87-95.)。 随后利用乙酰化试剂如乙酸酐可以实现N-再乙酰化(Purkerson M L,Tollefsen D M,Klahr S.N-desulfated/acetylated heparinameliorates the progression of renal disease in rats with subtotal renalablation.Journal of Clinical Investigation,1988,81(1):p.69.)。
在本发明中，分别采用上述四种方法获得了不同的去抗凝肝素衍生物。 下述实施例1、2、4和5中采用高碘酸氧化法破坏五糖结构从而去除抗凝活 性。下述实施例3采用硅烷化试剂法去除6-O硫酸基从而去除抗凝活性。下 述实施例6采用溶剂解法去除N-硫酸基从而去除抗凝活性。
<本发明中去抗凝肝素衍生物的用途>
在本发明涉及的去抗凝肝素衍生物可用于治疗炎症性肠病，例如可以用 于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病。
利用本发明的去抗凝肝素衍生物给药诱导了结肠炎的小鼠模型之后，其 可以有效地缓解结肠炎发病过程中肠痉挛引发的结肠缩短，并且小鼠的结肠 上皮组织与发病组相比较为完整，腺体结构清晰，炎性细胞浸润有所减少， 并且能够有效减弱炎症引起的脾脏增大。给药治疗组的肠道炎症明显减轻。 利用本发明的去抗凝肝素衍生物能够有效地修复结肠炎发生时肠上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1表达降低，起到了对DSS诱导的细胞膜通透性增加的 缓解作用，从而达到保护肠上皮细胞结构完整性，改善肠上皮屏障功能的效果。如上所述，由于本发明的去抗凝肝素衍生物能够有效地减少炎性细胞浸 润，并且能够有效减弱炎症引起的脾脏增大、结肠缩短，对于肠道炎症明显减轻。因此本发明的去抗凝肝素衍生物除了可以治疗炎症性肠病之外，还可 以用于治疗与炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病，其中，炎症性 肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎 和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、 葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
此外，由于去抗凝肝素衍生物可以降低蛋白ZO-1表达，因此本发明的 去抗凝肝素衍生物还可以用于治疗与蛋白ZO-1异常表达相关的疾病。此外， 本发明涉及的去抗凝肝素衍生物可以显著降低利用DSS诱导的溃疡性结肠 炎小鼠肠上皮细胞的凋亡率，表明其DSS诱导的结肠上皮细胞凋亡的缓解 效果，显示其可以用于治疗炎症性肠病。
实施例
1.抗Xa、IIa因子活性检测
肝素的抗凝活性需要通过体外试验测定其加速抗凝血酶(以下简称ATIII) 抑制Xa因子(以下简称抗Xa因子)和IIa因子(以下简称抗IIa因子)的活性来 决定。本发明中采用的抗Xa和抗IIa因子活性检测方法可参照欧洲药典。抗 Xa和抗IIa的国际单位(International Unit，IU)是指确定量的肝素或低分子肝 素国际标准品所含的活性。待测肝素供试品的抗凝活性是通过与国际标准品 相应活性进行对比计算得到的。
(1)溶液配制：
Tris-HCl缓冲液(pH7.4)：取Tris 6.08g和NaCl 8.77g，加水500mL使 之溶解，加牛血清蛋白10g，用HCl调节pH值至7.4，加水稀释至1000mL。 Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)：取Tris 3.03g、NaCl 5.12g和EDTA·2Na1.4g， 加水250mL使之溶解，用HCl调节pH值至8.4，加水稀释至500mL。 肝素标准品及供试样品溶液：肝素活性标准品购自EDQM(EuropeanDirectorate for the Quality of Medicines)的heparin low-molecular-mass forassay BRP(Biological Reference Preparation)(H0185000,for detection of anti-factor Xa activity and anti-factor IIa activity)。用Tris-HCl缓冲液(pH7.4) 分别将标准品(S)和供试品(T)稀释成4个不同浓度的溶液，各剂量间的剂距 比控制在1:0.7～1:0.6。该浓度应在剂量对数～反应的线性范围内，检测抗Xa 因子时一般为每毫升0.025IU～0.2IU，检测抗IIa因子时一般为每毫升0.015 IU～0.075IU。
ATIII溶液：ATIII购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗Xa因子时 以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成1IU/mL的溶液；检测抗IIa因子时以 Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成0.5IU/mL的溶液。
发色底物溶液：检测抗Xa因子时用发色底物 S-2765(N-α-benzyloxycarbonyl -D-arginyl-L-glycyl-L-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)，购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗IIa因子时用发色底物S-2238(H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)， 购自Chromogenix公司(Sweden)。两种发色底物均用去离子水制成0.003M 的溶液储存，临用前用Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)稀释至0.0005M。
抗Xa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制，调试浓度，使之在用 0.9％NaCl替代(超)低分子量肝素的抗Xa实验中，在405nm处的吸光度值 处于0.6～0.7之间。
抗IIa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解并稀释成5IU/mL的溶 液。
测定方法：
取1.5mL离心管16支，分别标记T1，T2，T3，T4及S1，S2，S3，S4。 各浓度平行做两管。每管分别加入4种浓度的供试品(T)或标准品(S)稀释液 50μl，以及50μl ATIII溶液，混匀，注意不要有气泡。按S1，S2，S3，S4， T1，T2，T3，T4，T1，T2，T3，T4，S1，S2，S3，S4顺序排列，37℃水浴平衡1分钟后每管中加入100μl抗Xa(或抗IIa)因子溶液，37℃准确孵育1min 后加入发色底物溶液250μl，混合，37℃水浴保温4分钟立即各加30％的 醋酸溶液375μl终止反应。用1cm光程的半微量比色皿，以Tris-HCl缓冲 液(pH7.4)为空白，测定405nm处的吸光度。以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)代替 供试品溶液(平行做两管)同法操作作为空白对照管，在16管开始和结尾时， 分别测定空白对照管的吸光度。两者吸光度不得有显著性差异。以吸光度为 纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)为浓度对数值为横坐标做线性回归，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误 差。平均信限率(FL％)不得大于15％。
2.分子量及其分布测定方法。
采用凝胶排阻高效液相色谱法测定低分子量肝素的重均分子量(Mw)，数 均分子量(Mn)和分布系数(P)。色谱柱为TSK-GEL G2000SWXL(TOSOH，日 本)，控制流速为0.5mL/min，柱温35℃，进样体积为25μL。采用 WATERS(1525，美国)色谱系统，紫外检测器和示差检测器以先后次序串联 连接于色谱柱的出口，紫外检测器波长为234nm。分子量及其分布测定方法 可以参考Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weightheparins by combinations of heparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法。
实施例1
将20g精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠) 溶于0.6L去离子水，在0.6L精品肝素(33g/L)中添加同等体积的0.2M高 碘酸钠溶液(现配)，300rpm、4℃避光反应22小时。加入80mL乙二醇中和 过量高碘酸钠，再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。用HCl调节pH 至7.0。经0.22μm滤膜抽滤，收集过滤样品。再利用透析袋除盐或者通过 Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐，直至滤出液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中 冻干，然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存，得到去抗凝肝素(命名为 NAHP)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗Xa 为5.8IU/mg，抗IIa为5.8IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素的分子量 及其分布，结果如下表1或2所示。
实施例2
将20g依诺肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：依诺肝 素钠)溶于0.6L去离子水，在0.6L依诺肝素(33g/L)中添加同等体积的0.2M 高碘酸钠溶液(现配)，300rpm、4℃避光反应22小时。加入80mL乙二醇中 和过量高碘酸钠，再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。用HCl调节pH 至7.0。经0.22μm滤膜抽滤，收集过滤样品。再利用透析袋除盐或者通过 Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐，直至滤出液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中 冻干，然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存，得到去抗凝依诺肝素(命 名为：NAEno)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显 示抗Xa为3.5IU/mg，抗IIa为5.1IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素的 分子量及其分布，结果如下表1或2所示。
实施例3
将精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠)配成 浓度为5mg/ml的水溶液，在4℃预冷后上001x7型阳离子交换树脂柱(H+ form)2.5*40cm(购自廊坊南大树脂有限公司)。利用水洗收集流出物，立即用 过量的吡啶中和，调pH值至6～8之间，然后冻干得到肝素吡啶盐。将6g 肝素吡啶盐加入10倍(w/w)N-甲基-N-(三甲基硅基)-三氟乙酰胺(MTSTFA)和100倍体积(v/w)的无水吡啶中。室温下搅拌直至完全溶解，反应混合物于 110℃加热2.5h(根据反应体系大小可调整反应时间)。反应液冰浴终止反应， 利用旋转蒸发仪蒸发至原体积的1/10，加入2体积v/v的蒸馏水降解MTSTFA， 随后35℃减压15min使反应液白色浑浊物消失。
产物纯化方法：将反应产物用蒸馏水透析3天，透析液上蒸馏水平衡过 的阳离子交换树脂(H+form,3*13cm)，用水洗脱。酸性洗脱液合并在一起后 用1N NaOH调节pH至9.5，之后蒸馏水透析过夜。最后的透析液冻干，从 而得到去除了6-O-硫酸基的去抗凝肝素，将其命名为6-OdeS。利用上述方 法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗Xa为20.3IU/mg，抗IIa 为33.1IU/mg。
实施例4
将20g精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠) 溶于0.6L去离子水，在0.6L精品肝素(33g/L)中添加同等体积的0.2M高 碘酸钠溶液(现配)，300rpm、4℃避光反应1小时。加入80mL乙二醇中和 过量高碘酸钠，再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。用HCl调节pH 至7.0。经0.22μm滤膜抽滤，收集过滤样品。再利用透析袋除盐或者通过Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐，直至滤出液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中 冻干，然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存，得到去抗凝肝素(命名为 NAHP-60)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗 Xa为60.6IU/mg，抗IIa为170.8IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素的分 子量及其分布，结果如下表1或2所示。
实施例5
将20g精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠) 溶于0.6L去离子水，在0.6L精品肝素(33g/L)中添加同等体积的0.2M高 碘酸钠溶液(现配)，300rpm、4℃避光反应4小时。加入80mL乙二醇中和 过量高碘酸钠，再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。用HCl调节pH 至7.0。经0.22μm滤膜抽滤，收集过滤样品。再利用透析袋除盐或者通过Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐，直至滤出液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中 冻干，然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存，得到去抗凝肝素(命名为 NAHP-39)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗 Xa为39IU/mg，抗IIa为124.9IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素的分 子量及其分布，结果如下表1或2所示。
实施例6
将精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠)配成 浓度为5mg/ml的水溶液，在4℃预冷后上001x7型阳离子交换树脂柱(H+ form)2.5*40cm(购自廊坊南大树脂有限公司)。利用水洗收集流出物，立即用 过量的吡啶中和，调pH值至6～8之间，然后冻干得到肝素吡啶盐。
2g肝素吡啶盐加入25ml含5％水的DMSO，50℃水浴3h后25ml水稀 释。用NaOH调pH至9，透析至去离子水中，冻干得到N-去硫酸化产物。 1.2g N-去硫酸化产物加入12ml饱和NaHCO3(5g NaHCO3加入50ml ddH2O， 4℃预冷)置于冰上，加入1.2ml醋酐pH下降，加入NaOH调至8左右,每 30min-1h重复此步骤，共反应3h，4℃透析至去离子水中，冻干即可得到 N-再乙酰化去抗凝肝素衍生物(命名为N-ace)，利用上述方法检测得到的去 抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗Xa为1.2IU/mg，抗IIa为7.5IU/mg。并 利用上述方法测定了该肝素的分子量及其分布，结果如下表1或2所示。
对比例1
从河北常山生化购买精品肝素，该肝素的重均分子量Mw为17223(命名 为HP)。利用上述方法检测抗凝活性，结果显示抗Xa为187.3IU/mg，抗IIa 为197.2IU/mg。
对比例2
从河北常山生化药业购买依诺肝素，该肝素的数均分子量为3275，重均 分子量为4620(命名为Eno)。利用上述方法检测抗凝活性，结果显示抗Xa 为109IU/mg，抗IIa为32.7IU/mg。
表1实施例和对比例中的肝素及去抗凝肝素的分子量分布
表2实施例和对比例中的低分子肝素及去抗凝低分子肝素的分子量分布
表3实施例和比较例中的肝素分子量及去抗凝肝素的抗Xa和抗IIa结果
实施例 样品 抗Xa(IU/mg) 抗IIa(IU/mg)
实施例1 NAHP 5.8 5.8
实施例2 NAEno 3.5 5.1
实施例3 6-OdeS 20.3 33.1
实施例4 NAHP-60 60.6 170.8
实施例5 NAHP-39 39 124.9
实施例6 N-ace 1.2 7.5
对比例1 HP 187.3 197.2
对比例2 Eno 109 32.7
对比例4 2-OdeS 75.6 99.6
对比例3
从药店购买美沙拉秦缓释颗粒(5-Amino Salicylic Acid，5-ASA)。适应症 为：溃疡性结肠炎，用于溃疡性结肠炎的急性发作，防止复发；克罗恩病， 用于频繁发病的克罗恩病病人，预防急性发作。
对比例4
将2g精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司，产品名称：肝素钠) 加入到100ml 0.4N氢氧化钠溶液中，可同时添加0.2-1g硼氢化钠(NaBH4) 防止肝素糖链在碱性条件下断裂，将反应液冻干。然后将带黄色的冻干产物 溶解于50ml水中，用20％醋酸溶液中和至pH 7，并彻底透析至超纯水中然 后冻干，得到去除糖醛酸残基上2-O-硫酸基的去抗凝肝素，将其命名为2-OdeS。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性，结果显示抗Xa为75.6IU/mg，抗IIa为99.6IU/mg。
实验例1硫酸葡聚糖钠诱导小鼠结肠炎的试验数据
3％硫酸葡聚糖钠盐(DSS，Mw:36,000-50,000,MP biomedicals,LLC) 溶于C57BL/6J品系小鼠的饮用水中，同时设置DSS造模组、健康对照组以及药物治疗组。药物治疗组采用实施例1和2得到的去抗凝肝素，以及对比 例1～3的物质用生理盐水溶解，从第一天起给予灌胃给药，给药剂量为30 mg/kg，持续7天。
在诱导第三天开始模型组出现体重下降、稀便和脓血便等症状。第七天 结束实验，处死小鼠后眼眶取血，取脾脏称重，从盲肠端到肛门处剪取全段 结直肠拍照测量长度，留近端1/3-1/2冻存，另外部分剪开，PBS洗净并卷好置于石蜡包埋用塑料夹中，浸没入4％多聚甲醛中固定。
结直肠组织病理切片HE染色如图1所示，结果表明经过DSS诱导之后 结肠上皮糜烂，腺体结构严重破坏，黏膜和黏膜下炎性细胞浸润增多。在给 予去抗凝肝素治疗后，结肠上皮得到一定程度保护，腺体结构相对完整。
结肠病理组织切片：
(一)常规石蜡切片的制备：
(1)取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，将结肠组织用剪刀剖 开，用灭菌的PBS溶液洗净，截取约1.5-2.0cm远端结肠并从肛门侧向近端卷好放入蜡块包埋夹。结直肠组织块用10％福尔马林溶液固定24～48h。
(2)包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蜡中浸透 每次30min，共3次；再包埋。
(3)切片：包埋好的石蜡块即可进行切片；切片的厚度为5μm左右。
(二)苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色方法：
(1)脱蜡：主要用二甲苯脱蜡。
(2)梯度乙醇水化。
(3)自来水冲洗。
(4)苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5～20min，染细胞核。 自来水冲洗3～5min。
(5)1％盐酸乙醇分化5～30s。自来水冲洗1～3min。
(6)弱碱性水溶液返蓝30s～1min。自来水充分冲洗5～10分钟。
(7)伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质 5～15min左右。
(8)梯度乙醇脱水。
(9)二甲苯透明。
(10)中性树胶封片。显微镜下观察组织结构的变化。
结直肠HE染色组织学变化。NC组(正常组)：结肠上皮组织完整，结构 清晰，上皮细胞排列整齐，腺体完整；DSS造模组：结肠粘膜上皮细胞萎缩、 坏死、脱落，腺体异常，腺体杯状细胞消失，炎症细胞广泛浸润，基底膜断裂或消失，腺上皮与粘膜肌层间隙增大，粘膜下层毛细血管增生，并扩张出 血；HP治疗组：结肠粘膜上皮细胞萎缩、坏死、脱落，腺体不完整，可见 炎症细胞浸润，基底膜增厚，未见断裂，腺上皮与粘膜肌层间隙增大，粘膜 下层毛细血管增生，并扩张出血；NAHP治疗组：结肠粘膜上皮见部分脱落，腺体轻度增生，少数腺体结构不完整，可见少量炎症细胞浸润，粘膜下层未 见异常；Eno治疗组：结肠粘膜上皮细胞部分萎缩、坏死、脱落，腺体异常， 杯状细胞增生，伴有炎症细胞浸润，病变未累及粘膜下层；NAEno治疗组： 结肠上皮组织较完整，上皮细胞可见部分脱落，腺体增生，排列不整齐，可见缺失，伴有炎症细胞浸润，病变未累及粘膜下层；5-ASA(美沙拉秦)治疗 组(阳性对照治疗组)：结肠粘膜上皮细胞坏死、脱落，腺体异常，排列不整齐，杯状细胞增生或坏死，炎症细胞浸润，病变未累及粘膜下层。
溃疡性结肠炎诱导成功后，小鼠肠道肌肉痉挛收缩，导致全结直肠长度 缩短。连续7天给予小鼠3％DSS或同时给予药物治疗后，颈椎脱臼法处死 动物，取全结直肠，测量长度。各组全段结肠长度如图2(a)和(b)所示，除未分级肝素外，其余肝素类药物都能一定程度缓解结肠缩短。其中，NAHP治 疗组较5-ASA治疗组效果更佳。去抗凝依诺肝素的效果较依诺肝素更优。
脾脏是重要的外周免疫器官之一。炎性细胞的浸润和异常的免疫反应可 导致脾肿大。连续7天给予小鼠3％DSS或同时给予药物治疗后，颈椎脱臼 法处死动物，取脾脏，称重并计算脾脏指数。各组脾脏指数如图3所示，脾 脏指数＝脾重(mg)/体重(g)x10。给予去抗凝肝素能有效减弱炎症引起的脾脏 增大，NAHP的效果明显优于未分级肝素，去抗凝依诺肝素优于依诺肝素。
实验例2肝素衍生物缓解硫酸葡聚糖钠诱导的人正常结肠上皮细胞NCM460 细胞膜通透性异常的试验数据。
上皮细胞间紧密连接是维持粘膜上皮机械屏障和通透性的重要结构。 ZO-1蛋白是细胞紧密连接蛋白的重要组成蛋白之一，不但参与维持和调节 上皮屏障功能，还参与细胞物质转运和维持上皮极性等重要过程。在本实验 中应用3％硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导人正常结肠上皮细胞NCM460(购自 ATCC(Rockefeller,MD,USA))的细胞膜通透性增大，来模拟DSS诱导的溃 疡性结肠炎小鼠肠上皮细胞通透性增大的细胞破坏作用。在给予细胞2mg/ml的实施例1、3的去抗凝肝素衍生物、以及对比例1、对比例3和4的 物质处理48小时后，通过蛋白质印迹法检测NCM460细胞中ZO-1蛋白的 表达情况，探讨和评估各肝素衍生物对通透性增大的结肠上皮细胞的保护作 用。如图4所示，除未分级肝素和2-OdeS衍生物外，其他肝素衍生物治疗 组中ZO-1蛋白表达水平均高于DSS诱导组细胞ZO-1蛋白的表达水平，有 效证明了这些肝素衍生物对DSS诱导的细胞膜通透性异常的缓解效果。
实验例3肝素衍生物缓解硫酸葡聚糖钠诱导的人正常结肠上皮细胞NCM460 细胞凋亡的试验数据。
细胞凋亡在UC的发生发展中起到重要作用。在结肠炎病理条件下，上 皮细胞沿隐窝绒毛轴增殖一分化一凋亡的正常顺序可能被破坏。UC炎症活 动区域的粘膜上皮细胞凋亡速率明显增加，可能是UC上皮屏障功能的破坏 的另一大重要原因。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面 的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在 细胞膜外表面。Annexin V作为一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高 度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种 细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在 其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此结合碘化丙啶(PI)染细胞核可以 区分凋亡细胞和坏死细胞。
在本实验中应用3％硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导人正常结肠上皮细胞 NCM460(购自ATCC(Rockefeller,MD,USA))凋亡，来模拟DSS诱导的溃疡 性结肠炎小鼠肠上皮细胞凋亡过程。在给予细胞2mg/ml的实施例1、2、4、 5和6的去抗凝肝素衍生物、和对比例1和3的物质处理48小时后，通过 FITC-Annexin/PI染色并进行流式细胞仪分选检测NCM460细胞凋亡情况， 探讨和评估各肝素衍生物缓解结肠上皮细胞凋亡效果。图5(a)中，Annexin V 阴性-PI阴性代表正常细胞；Annexin V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞； Annexin V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞。经过流式细胞图像分析，可得到各细胞群所占总细胞数的比例。经过统计分析凋亡早期的细 胞群比例得到图5(b)结果。如图5(a)、(b)所示，去抗凝肝素衍生物治疗组 (NAHP组和N-ace组)中的肠上皮细胞凋亡水平明显低于DSS诱导凋亡组， 有效证明了其对DSS诱导的细胞凋亡作用的缓解效果。

Claims (7)

1.一种去抗凝肝素衍生物在用于制备治疗炎症性肠病的药物中的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小于等于30IU/mg，而其抗IIa因子小于等于40IU/mg。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小于等于20IU/mg。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小于等于10IU/mg。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗IIa因子小于等于30IU/mg。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗IIa因子小于等于20IU/mg。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的抗IIa因子小于等于10IU/mg。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中，所述去抗凝肝素衍生物的重均分子量为8000以上。
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