JP4633233B2 - クラミジア感染症処置剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、構成糖として、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基との二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩を有効成分とするクラミジア感染症処置剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジアは偏性細胞内寄生性細菌であり、抗原性、封入体の性状、ＤＮＡホモロジーから、Chlamydia trachomatis、 Chlamydia psittaci、Chlamydia pneumoniaeの３種に分類され、Chlamydia trachomatisは、更に、Ａ，Ｂ，Ｂａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３という１５の血清型に分かれている。
【０００３】
Chlamydia trachomatisはヒトの眼や泌尿生殖器粘膜に感染し、種々の疾患を引き起こすことが知られている。 例えば、血清型Ａ〜Ｃは、トラコーマを、ＢおよびＤ〜Ｋは尿道炎、精巣上体炎、前立腺炎、子宮頚管炎、卵管炎、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、肝周囲炎（Fitz-Hugh-Curtis症候群）、卵管不妊、子宮外妊娠、封入体結膜炎を、Ｌ１〜Ｌ３は、性病性リンパ肉芽腫症（ＬＧＶ）を起こす。Chlamydia psittaciは鳥類や哺乳類に感染し、特に、感染鳥類からヒトに感染するオウム病が知られている。また、Chlamydia pneumoniaeは肺炎を起こすクラミジアである。
【０００４】
このようなクラミジア感染症の治療には、通常、抗生物質等の抗菌剤が使用されている。ところが、クラミジアの増殖時間は一般細菌に比してはるかに長いため、長期の連続投与が必要となるが、抗生物質等の抗菌剤の長期間連続投与は好ましくないとされている。また、クラミジア感染を予防する物質としてはヘパリン（The Journal of Biological Chemistry, Vol.271, No.19, pp.11134-11140, 1996）や硫酸化多糖（特表平８−５０６５７０）が知られているが、天然物から抽出した通常のヘパリンには強い抗凝固活性や出血活性があり、抗血液凝固剤以外の医薬品としての適用には問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クラミジア感染症の予防および治療に用いることが可能で、人体に適用するに際し、安全で副作用などの問題がほとんどない薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基を除去する処理を行った物質が、優れたクラミジア感染阻害効果を示すことを見いだした。本発明者らは更に、上記物質が、出血等の副作用をほとんど示さないことを見いだした。これらの知見に基づき、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基が除去された硫酸化グリコサミノグリカンがクラミジア感染症のための処置剤として有用であることを知得し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
本発明は、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩を有効成分とするクラミジア感染症処置剤（以下、「本発明の処置剤」という。）に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩をクラミジアに接触させることを特徴とするクラミジアの生育阻害方法にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明の処置剤の有効成分である、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカン（以下、場合によりその塩も含めて「２ＯＤＳＧ」という。）は、天然物から抽出、精製等を行って得られるヘパリン、ヘパラン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンを原料として製造することができる。
【００１０】
出発物質としての硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基が交互に結合した二糖の繰り返し構造を持つ硫酸化グリコサミノグリカンであり、具体的にはヘパリン、ヘパラン硫酸が例示されるが、上記基本構造を有する限り、これには限定されない。
【００１１】
２ＯＤＳＧを構成するヘキスロン酸としては、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸を挙げることができ、好ましくはＤ−グルクロン酸および／またはＬ−イズロン酸である。
【００１２】
２ＯＤＳＧを構成するヘキソサミンとしては、グルコサミンおよびガラクトサミンを挙げることができ、好ましくはグルコサミンである。グルコサミンおよびガラクトサミンは通常それぞれ、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−ガラクトサミンであり、通常、２位がスルホアミノ基ではない場合はアセチルアミノ基である。
【００１３】
なお、２ＯＤＳＧにおいて、ヘキソサミンがＤ−グルコサミンである場合、ヘパリン又はヘパラン硫酸の基本骨格を有する硫酸化グリコサミノグリカンであり、本発明においては、これを２ＯＤＳＨと略称する。
また、２ＯＤＳＧは構成ヘキスロン酸の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しないという特徴を有するものであるが、この特徴は以下の分析法で分析することにより特定される。
【００１４】
すなわち、ヘパリンまたはヘパラン硫酸等の２ＯＤＳＨを後述の参考例１記載のグリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）による分析を組み合わせた方法により二糖組成分析した場合、構成ヘキスロンの２位の水酸基に硫酸基を有する不飽和二糖が、通常の硫酸化グリコサミノグリカンと比べて明らかに減少しており、その不飽和二糖組成は、通常、ΔＤｉＨＳ−ＵＳが０〜０．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓが０〜６．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓが０〜０．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが０〜１５．０モル％程度であることが好ましく、これらの合計は０〜２１モル％であることが好ましい。また、上記以外の不飽和二糖組成は、通常の硫酸化グリコサミノグリカンと比べて増加しており、ΔＤｉＨＳ−０Ｓが０〜８．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−６Ｓが０〜５．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ＮＳが８．０〜２５．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓが４０．０〜９２．０モル％程度である。
【００１５】
二糖組成分析における２ＯＤＳＨの不飽和二糖組成は、２ＯＤＳＨを酵素処理して得た下記一般式で表される不飽和二糖組成の溶出位置を、標準不飽和二糖の溶出位置と比較することにより分析することができる。ＨＰＬＣの溶出位置を、通常紫外部（例えば波長２３２nm）の吸収によりモニターし、２ＯＤＳＨ中の不飽和二糖の含量は、その溶出パターンの積分値（面積）を濃度既知の標準不飽和二糖の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めることができる。下記一般式中の各置換基は表１の通りである。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【表１】
【００１８】
また、上記略号の示す構造は以下の通り表記されることもある。
ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＡｃ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）。
【００１９】
上記式中、ΔＨｅｘは不飽和ヘキスロン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＳはＮ−スルホグルコサミン、カッコ内は硫酸基の結合位置を示す。
【００２０】
２ＯＤＳＧの重量平均分子量は、クラミジア感染阻害効果を示す限り、特に限定されないが、３，０００Da以上が好ましく、より好ましくは、３０００〜５０，０００Daであり、３，０００〜１４，０００Daであることが更に好ましい。
また、２ＯＤＳＧは、クラミジア感染阻害効果の点では１２〜２００糖（二糖単位で６〜１００単位）からなるオリゴ糖または多糖であることが好ましいが、抗凝固活性を考慮すると、より低分子であることが好ましい。
尚、オリゴ糖類および多糖類は、通常、種々の重合度の糖鎖の集合体であるため、上記の２ＯＤＳＧの構成糖の重合度の好ましい数は、厳密にその数である必要はなく、統計的にその数の重合度のオリゴ糖または多糖が、他の重合度のものより多い場合も包含する。
【００２１】
また、２ＯＤＳＧは、その塩の形で使用することが可能であり、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリブチルアミン塩等が挙げられるが、アルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
【００２２】
２ＯＤＳＧにおいて、ヘキソサミン残基が、グルコサミン残基である２ＯＤＳＨ（いわゆるヘパリン骨格を有する物質）は、ブタ、ウシ等の哺乳動物の臓器（腸、肺、肝、腎、血管等）から抽出、精製されたヘパリン、ヘパラン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンを原料とし、その構成ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に結合している硫酸基を除去する脱硫酸化処理を行って得ることができるが、脱硫酸化処理方法は、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に結合している硫酸基を選択的又は優先的に脱硫酸化することができる処理であれば、特に限定されない。
【００２３】
例えば、Jasejaらの方法（Jaseja et al., Can. J. Chem., 67, 1449(1989)）など、公知の方法に準拠して行うことができ、具体的には、硫酸化グリコサミノグリカンのアルカリ性水溶液を調製し、これを凍結乾燥する方法が挙げられる。更に、脱硫酸化処理後、適当な溶媒を用いた溶媒沈殿、限外濾過、カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等、または、これらの組み合わせによって容易に濃縮・精製することができる。具体的には、前記脱硫酸化処理により得られた凍結乾燥パウダーを、蒸留水に溶解し、pH７に調整し、透析処理後、凍結乾燥処理に順次付する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明者らは、硫酸化グリコサミノグリカンのクラミジア感染阻害効果を検討するため、ヒト子宮頸癌細胞由来のヒーラ２２９細胞（ＨｅＬａ２２９）を用いて、実施例１記載の方法により２ＯＤＳＨ及びヘパリンの構成糖であるヘキスロン酸、グルコサミンの水酸基およびアミノ基に結合している全ての硫酸基を脱硫酸化した後、グルコサミンの２位のアミノ基を再硫酸化したヘパリン（以下、「ＣＤＳＮＳＨ」という。）のクラミジア感染阻害効果を調べた。その結果、ヘパリンにおいては、１０μｇ／mlの濃度では、約３％の細胞が感染を示したが、１００μｇ／mlでは約１％であり、ほぼ完全に感染を阻害した。２ＯＤＳＨに関しては、ヘパリンと比較すると感染阻害活性はやや弱まるものの、１００μg／mlではヘパリンと同様に、ほぼ完全に感染を阻害した。一方、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
【００２５】
上記の様にヘパリンはクラミジア感染阻害活性を有するが、出血等の副作用があり、医薬品としての適用には好ましくない。一方、２ＯＤＳＨはヘパリンと同等のクラミジア感染阻害活性を有し、かつ、出血等の副作用は極めて弱い。
【００２６】
ヘパリンおよび２ＯＤＳＨについて、出血活性の指標となるＴＴ活性およびＡＰＴＴ活性を後述する試験法３および４に従って測定した。結果を表２に示す。なお、ＴＴまたはＡＰＴＴにおける測定時間の上限はそれぞれ１００秒までとした。ヘパリンのＴＴ活性またはＡＰＴＴ活性を１００としたとき、対応する各被検サンプルのＴＴ活性またはＡＰＴＴ活性をその相対値で示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
これにより、２ＯＤＳＨはＡＰＴＴ、ＴＴ活性共にヘパリンと比較して極めて低く、安全性が高いことが判明した。
【００２９】
本発明の処置剤は、クラミジアに感染した対象の生体、すなわち、ヒトを含む哺乳動物、鳥類、その他脊椎動物の治療、予防、症状の緩和等の処置を目的として、非経口的または経口的に投与される薬剤である。
【００３０】
本発明の処置剤を生体に投与する際の剤型および投与経路としては、対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、それらをそのまま、または他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤等と共に製剤化し、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、液剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤等経口的または非経口的に安全に投与することができる。特に、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤として非経口的に投与することが好ましい。
【００３１】
本発明の２ＯＤＳＧの配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重などに応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、臨床投与量として１日当たり概ね１０μg／Kg〜１０mg／Kg程度を例示することができる。また、上記処置剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、１日１〜３回、またはそれ以上の回数に分けて投与することもできる。
また、本発明の処置剤を性交渉時におけるクラミジア感染を防止するために膣内投与する場合、その投与量は１回概ね０．１mg〜１０mg程度が好ましい。
【００３２】
また、本発明は、２ＯＤＳＧをクラミジア、特にその感染性粒子（Elementary Body；ＥＢ）と接触させ、生体細胞におけるクラジミアの生育を阻害する方法にも関する。本方法は、例えば、粘膜、避妊具等にクラミジア感染を阻害するのに十分な量の２ＯＤＳＧを予め塗布、コーティング又は結合させ、生体へのクラミジアの感染を防止する方法等も包含する。さらに、動物細胞を培養する際に培地中に、２ＯＤＳＧを存在させて、該細胞にクラミジアが感染することを防止する方法も包含する。
【００３３】
尚、本発明におけるクラジミア感染阻害のメカニズムは、生体細胞のヘパリン様またはヘパラン硫酸様プロテオグリカンであるレセプターもしくはアクセプターへのクラミジア感染性粒子（ＥＢ）の吸着を防止することによるものと考えられるので、以上説明した通り、ＥＢが生体細胞の上記レセプターもしくはアクセプターに吸着する段階を、２ＯＤＳＧによって競合的に阻害する方法のみならず、生体細胞における上記レセプターもしくはアクセプターに存在するヘパリン様またはヘパラン硫酸様の糖鎖を、該糖鎖を分解するグリコサミノグリカン分解酵素で除去することによっても阻害することができる。この様な酵素としては、例えばヘパリナーゼＩが例示される。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を更に具体的に説明するが、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
なお、本実施例における試験法は以下の通りである。
【００３５】
参考例１
後述する本発明の実施例で使用した各種の硫酸化グリコサミノグリカンの分析は、以下の試験法１〜４に示す方法によって行った。
試験法１
〔酵素消化による二糖分析〕
硫酸化グリコサミノグリカン（２ＯＤＳＨ、ヘパリン）における硫酸基の置換位置の分析方法は、次のようにして行った。すなわち、対象とする各硫酸化グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素を用いて酵素消化し、精製した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II（東京化学同人刊、１９９１年）ｐ４９〜６２参照〕。各不飽和二糖のピーク面積を計算し、全ピーク面積の和に対する各ピーク面積の割合（％）を各不飽和二糖の組成割合とした。
この割合は、酵素消化物中の各不飽和二糖のモル％に相当し、ひいては、分析対象の硫酸化グリコサミノグリカンにおける種々の位置に硫酸基を有する二糖単位のモル％を反映するものである。
【００３６】
（１）ヘパリン、２ＯＤＳＨの分解酵素による消化
新生化学実験講座３、糖質II（東京化学同人刊、１９９１年）ｐ４９〜６２に記載の方法により、２mM酢酸カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）２２０μlに、ヘパリン、２ＯＤＳＨ２ロット（参考例２参照；以下、それぞれ、「２ＯＤＳＨ−１」、「２ＯＤＳＨ−２」という。）各１．０mgを溶解して、２０mUのヘパリナーゼ、２０mUのヘパリチナーゼIおよびIIを加えて、３７℃で２時間反応させた。
【００３７】
（２）ＨＰＬＣによる分析
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を上記（１）に従い分解酵素により消化を行った後の溶液５０μlを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル852型）を用いて分析した。イオン交換樹脂カラム（ダイオネックス社、CarboPac PA-1カラム４．０mm×２５０mm）を使用し、２３２nmでの吸光度を測定した。不飽和二糖（４〜１２糖）スタンダードを基準とし（Yamada, et al., J. Biol. Chem., 270, 8696-8706, (1995)）、流速１ml／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０mM→２．５M）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al., Comp.Biochem.Physiol., 103B, 473, (1992)）。
【００３８】
６種の不飽和二糖標品（８nmol each/shot）の溶出順は、ΔDiHS-0S（保持時間2.6分）、ΔDiHS-NS（保持時間 10.9分）、ΔDiHS-6S（保持時間 12.0分）、ΔDiHS-di(6,N)S（保持時間 15.2分）、ΔDiHS-di(U,N)S（保持時間 16.3分）、ΔDiHS-tri(U,6,N)S（保持時間21.9分）であった。
【００３９】
試験法２
〔分子量測定〕
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の３％溶液１０μlをＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。使用カラムは４，０００、３，０００および２，５００Ｇタイプの TSKgel-PWXLカラム（東ソー、7.8mm × 300mm）を用い、溶出液に０．２M塩化ナトリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の検出には示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用いた。本発明における重量平均分子量（Mw）はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda, et al., Biochem. Biophys. Res. Com.,220,108-112(1996)）。その計算式は、ＭＷ＝１０(10.17-0.19xRT)、〔RT:ピーク頂点の保持時間（分）〕である。
【００４０】
試験法３
〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）活性の測定〕
ＡＰＴＴの測定のため、ラット（ＳＤ系雄性ラット（１９４〜２２４ｇ）、チャールスリバー）の下大動脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採血し、血液を１０００×ｇで１０分間遠心分離して得た血漿１００μlと、様々な濃度のヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を各１００μlずつ測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、あらかじめ３７℃に保温しておいたアクチン（商品名：ウェルファイド（株））１００μlを添加し、さらに２分間保温した。次いで、３７℃の保温しておいた０．２MＣａＣｌ2溶液１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社）で測定した。なお、ＡＰＴＴにおける測定時間の上限は１００秒までとした。
【００４１】
試験法４
〔トロンビン時間（TT）の測定〕
上記試験法３で得た血漿１００μlと、様々な濃度のヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を各１００μlずつ測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、３７℃に保温しておいたトロンビン（商品名：ウェルファイド（株）、１０U／ml）１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社）で測定した。
【００４２】
〔本明細書におけるヘパリン〕
以下に示す物性を有するブタ小腸由来ヘパリンのナトリウム塩（サイエンティフィックプロテインラボラトリー社製 LotNo.40210910）を、上記試験法１〜４の分析における対照物質および下記参考例２における２ＯＤＳＨの合成原料として用いた。
ヘパリンの物性
（１）上記試験法１記載の二糖組成分析法による測定値から算出した不飽和二糖組成はΔDiHS-0S：３．７％、ΔDiHS-NS：３．２％、ΔDiHS-6S：４．７％、ΔDiHS-US：１．５％、ΔDiHS-di(6,N)S：１４．７％、ΔDiHS-di(U,N)S：６．８％、ΔDiHS-di(U,6)S：０．０％、ΔDiHS-tri(U,6,N)S：６１．３％であり、未同定ピーク：４．１％である。（％は全てモル％を表す）。
（２）日本薬局方に具体的に収載された測定法で測定された抗血液凝固活性が１７０〜１９０IU/mgである。
（３）重量平均分子量が１１，０００〜１４，０００Daである（参考例２参照）。
【００４３】
参考例２
〔２ＯＤＳＨの合成〕
ヘパリンを原料とし、その２−Ｏ−脱硫酸化反応をJasejaらの方法（Jaseja et al.,Can. J. Chem.,67,1449(1989)）を部分的に改変した以下の方法により実施した。すなわち、２００mgのヘパリンナトリウム塩を２０mlの０．４規定の水酸化ナトリウムに溶解し、直ちに凍結乾燥処理を行った。得られた凍結乾燥パウダーを２０mlの蒸留水に溶解した後、１規定の酢酸を添加することによりpH７に調整した。次いで、この溶液を透析処理、凍結乾燥処理に順次付した。その結果、１６５mgの２ＯＤＳＨをナトリウム塩として得た。この標品を２ＯＤＳＨ−１とした。
又、上記凍結乾燥処理を２回行うことにより、より完全に２−Ｏ−脱硫酸化した２ＯＤＳＨをナトリウム塩として１５０mg得た。この標品を２ＯＤＳＨ−２とした。
【００４４】
〔ゲル濾過ＨＰＬＣによる分子量測定〕
各５０μg／５μlのヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を、０．２規定のＮａＣｌで平衡化した４，０００、３，０００および２，５００Ｇタイプの TSKgel-PWXLカラム（東ソー、7.8mm × 300mm）を上流から順に各一本ずつ連結した東ソー社製ＣＣＰＭ型ＨＰＬＣに付し、溶出液に０．２M塩化ナトリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開し、ゲル濾過（GPC-）ＨＰＬＣ分析を行った。なお、被検物質の検出には示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用い、カラムオーヴン中４０℃、０．６ml／mlの定流速下で、示差屈折（RI）を指標とした。その結果、ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１の保持時間は、それぞれ３３．５０および３３．６０分であった。得られた結果を基に算出した分子量を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
〔二糖組成分析〕
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の不飽和二糖組成の二糖組成分析は、参考例１の試験法１に記載の方法に従って実施した。結果を表３に示す。
【００４７】
参考例３
〔低分子化２ＯＤＳＨ画分の調製〕
１００mgの２ＯＤＳＨ−１を含有する２mM酢酸含有カルシウム含有２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）１０mlに０．1単位のヘパリチナーゼＩ（生化学工業社製）を添加し、３７℃で一晩、部分消化した。５分間煮沸して酵素を失活させた後、Superdex 30pg（２．６×６０cm，ファルマシア社製）ゲル濾過カラムで分画した。平衡化および展開溶液には０．２M酢酸アンモニウムを用いた。上記カラムから溶出した１２糖以上の画分を集め、凍結乾燥して１８mgの標品（低分子化２ＯＤＳＨ画分）を得た。分子量範囲は約３，０００〜８，０００Daであった。
又、上記と同様の方法で、それぞれ、２ＯＤＳＨの４，６，８，１０、１２糖に相当する画分を得た。
【００４８】
参考例４
〔血液凝固系に対するヘパリン、２ＯＤＳＨの影響〕
血液凝固系に対するヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の影響を前記試験法３および４にしたがって分析した。ヘパリン等何も添加しない状態で測定したＡＰＴＴおよびＴＴの値（以下、正常値と言う）の２倍の凝固時間を示すヘパリンの濃度はそれぞれ、０．５４μg／mlと０．１３μg／mlであった。同様に、正常値を２倍に延長させる２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の濃度を求め、ヘパリンのＡＰＴＴ活性およびＴＴ活性それぞれを１００とし、２ＯＤＳＨ−１、２ＯＤＳＨ−２のＡＰＴＴ活性およびＴＴ活性それぞれをその相対値で示した。
【００４９】
実施例１
〔ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、ＣＤＳＮＳのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
【００５０】
３×１０5cells／mlのヒト子宮頸癌細胞由来ＨｅＬａ２２９細胞を２４穴プレートの各ウェルに１mlずつ分注し、２４時間前培養した。クラミジア感染性粒子（elementary body：ＥＢ）液に、予めHank's balanced salt solution（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）に溶解したヘパリン、２ＯＤＳＨ−２及びＣＤＳＮＳＨ（生化学工業社製）を各濃度となるように添加して懸濁した。このＥＢ懸濁液を前培養した単層ＨｅＬａ２２９細胞に２００μlずつ分注し、室温で１時間培養した。単層ＨｅＬａ２２９細胞をＨＢＳＳにて３回洗浄し、１０μg／mlシクロヘキサミドを加えた１０％牛胎児血清、０．５％グルコース含有イーグルＭＥＭ培地（ＣＭＧＡ培地，ＩＣＮ Biochem社製）にて３７℃で４８時間培養した。培養後トリプシン／ＥＤＴＡ液にて細胞を回収し、細胞を１００％エタノールで５分間固定、親水化し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を添加したＰＢＳにて２回洗浄した。フルオレセンイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識抗クラミジア抗体（マイクロトラック クラミジアトラコマチスダイレクト テスト；ＳＹＶＡ社製）で固定細胞を染色し、フローサートメトリーにて感染陽性細胞率を測定した。結果を図１に示す。
その結果、ヘパリンおよび２ＯＤＳＨ−２は１００μg／mlにおいてほぼ完全にクラミジア感染を阻害したが、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
【００５１】
実施例２
〔低分子化２ＯＤＳＨ画分のＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
実施例１と同様の方法で、ＥＢ液に、予めＨＢＳＳに溶解したヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、参考例３で調製した低分子化２ＯＤＳＨ画分をそれぞれ１００μg／mlとなるよう添加し懸濁後、このＥＢ懸濁液をＨｅＬａ２２９細胞に感染させ、これらの被検物質によるクラミジア感染の阻害効果を調べた。対照としては、参考例３で調製した２ＯＤＳＨのオリゴ糖画分（４，６，８，１０，１２糖）を用いた。
その結果、低分子化２ＯＤＳＨ画分においては１０％程度までクラミジア感染を抑制したが、１２糖以下の上記各オリゴ糖画分は感染阻害効果は示さなかった。従って、クラミジア感染阻害効果を示す２ＯＤＳＨは、１２糖以上の糖鎖が必要なことが判明した。結果を図２に示す。
【００５２】
実施例３
〔ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２及びＣＤＳＮＳＨ前処理ＥＢのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
１００μｇ／mlのヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、ＣＤＳＮＳＨをそれぞれ添加したクラミジア感染性粒子（elementary body：ＥＢ）液を調製し、３７℃で６０分保温した。保温後、ＥＢ液をHank's balanced salt Solution（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、８０００Ｇで３０分間の遠心を行った。ペレットをＨＢＳＳに再懸濁し、１分間の超音波処理をし、更に８０００Ｇで３０分間の遠心を行い、ペレットを少量のＨＢＳＳに再懸濁することによりＥＢ懸濁を調製した。この前処理ＥＢ懸濁液のＨｅＬａ細胞への感染率を実施例１と同様の方法で測定した。その結果、ヘパリン及び２ＯＤＳＨ−２でＥＢを前処理することによりクラミジア感染を阻害したが、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
結果を図３に示す。
【００５３】
実施例４
〔ヘパリナーゼＩのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
実施例１と同様の方法に従って、ヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ社製）についても同様に、クラミジア感染陽性細胞率を測定した。
その結果、１IU／mlの濃度において、細胞の感染は約９．２％であり、ヘパリナーゼＩはクラミジア感染を阻害することが分かった。結果を図４に示す。
【００５４】
実施例５
〔ヘパリナーゼＩ前処理Ｈｅｌａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
単層ＨｅＬａ２２９細胞に、ＨＢＳＳに懸濁したヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、３７℃で６０分保温した。保温後、温ＨＢＳＳにで３回洗浄を行った。上記前処理を行った単層ＨｅＬａ２２９細胞にＥＢ懸濁液を２００μlずつ分注して、室温で１時間培養した。単層ＨｅＬａ２２９細胞をＨＢＳＳにて３回洗浄し、１０μg／mlシクロヘキサミドを添加した１０％牛胎児血清、０．５％グルコース含有イーグルＭＥＭ培地（ＣＭＧＡ培地，ＩＣＮ Biochem社製）にて３７℃で４８時間培養した。培養後トリプシン／ＥＤＴＡ液にて細胞を回収し、細胞を１００％エタノールで５分間固定し、親水化して、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳにて２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識抗クラミジア抗体で固定細胞を染色し、フローサイトメトリーにて感染陽性細胞率を測定した。
その結果、１IU／mlの濃度において、ヘパリナーゼＩで前処理したＨｅＬａ２２９細胞の感染は、約４．７％であり、ヘパリナーゼＩでＨｅＬａ２２９細胞を前処理することでクラミジア感染を阻害することが分かった。結果を図５に示す。
【００５５】
製剤例
（１）錠剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに乳糖６７０mg、馬鈴薯デンプン１５０mg、結晶セルロース６０mg、および軽質無水ケイ酸５０mgを添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース３０mgをメタノールに溶解した溶液（１０％（w／w））を添加して練合造粒した。次に、これを径０．８mmのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５mgを添加して圧縮成型し、１００mgの錠剤を製造した。
【００５６】
（２）カプセル剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに乳糖７６５mg、馬鈴薯デンプン１５０mg、ステアリン酸マグネシウム１０mgおよび軽質無水ケイ酸５０mgを添加して均一に混合し、これを１００mgずつ硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００５７】
（３）軟膏剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに鉱油４ｇ、石油ゼリー８ｇ、混合メチル／プロピルパラバン６０mg、非イオン性界面活性剤１ｇおよび精製水３０ｇを添加して均一に混合し、これを容器に充填し、軟膏剤を製造した。
【００５８】
膣用座剤
実施例１で調整した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、マクロゴール４００を３０００mgとともに６０℃で加温溶融して均一に混合した後、プラスチックの型に注いで冷却し、膣用座剤を製造した。
【発明の効果】
ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基を除去することにより安全で副作用のないクラミジア感染症処置剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２およびＣＤＳＮＳＨのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図２】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２および低分子化２ＯＤＳＨ画分のＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図３】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２およびＣＤＳＮＳＨ処理ＥＢのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図４】ヘパリナーゼＩのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図５】ヘパリナーゼＩ前処理ＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、構成糖として、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基との二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩を有効成分とするクラミジア感染症処置剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジアは偏性細胞内寄生性細菌であり、抗原性、封入体の性状、ＤＮＡホモロジーから、Chlamydia trachomatis、 Chlamydia psittaci、Chlamydia pneumoniaeの３種に分類され、Chlamydia trachomatisは、更に、Ａ，Ｂ，Ｂａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３という１５の血清型に分かれている。
【０００３】
Chlamydia trachomatisはヒトの眼や泌尿生殖器粘膜に感染し、種々の疾患を引き起こすことが知られている。 例えば、血清型Ａ〜Ｃは、トラコーマを、ＢおよびＤ〜Ｋは尿道炎、精巣上体炎、前立腺炎、子宮頚管炎、卵管炎、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、肝周囲炎（Fitz-Hugh-Curtis症候群）、卵管不妊、子宮外妊娠、封入体結膜炎を、Ｌ１〜Ｌ３は、性病性リンパ肉芽腫症（ＬＧＶ）を起こす。Chlamydia psittaciは鳥類や哺乳類に感染し、特に、感染鳥類からヒトに感染するオウム病が知られている。また、Chlamydia pneumoniaeは肺炎を起こすクラミジアである。
【０００４】
このようなクラミジア感染症の治療には、通常、抗生物質等の抗菌剤が使用されている。ところが、クラミジアの増殖時間は一般細菌に比してはるかに長いため、長期の連続投与が必要となるが、抗生物質等の抗菌剤の長期間連続投与は好ましくないとされている。また、クラミジア感染を予防する物質としてはヘパリン（The Journal of Biological Chemistry, Vol.271, No.19, pp.11134-11140, 1996）や硫酸化多糖（特表平８−５０６５７０）が知られているが、天然物から抽出した通常のヘパリンには強い抗凝固活性や出血活性があり、抗血液凝固剤以外の医薬品としての適用には問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クラミジア感染症の予防および治療に用いることが可能で、人体に適用するに際し、安全で副作用などの問題がほとんどない薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基を除去する処理を行った物質が、優れたクラミジア感染阻害効果を示すことを見いだした。本発明者らは更に、上記物質が、出血等の副作用をほとんど示さないことを見いだした。これらの知見に基づき、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基が除去された硫酸化グリコサミノグリカンがクラミジア感染症のための処置剤として有用であることを知得し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
本発明は、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩を有効成分とするクラミジア感染症処置剤（以下、「本発明の処置剤」という。）に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカンまたはその塩をクラミジアに接触させることを特徴とするクラミジアの生育阻害方法にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明の処置剤の有効成分である、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しない硫酸化グリコサミノグリカン（以下、場合によりその塩も含めて「２ＯＤＳＧ」という。）は、天然物から抽出、精製等を行って得られるヘパリン、ヘパラン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンを原料として製造することができる。
【００１０】
出発物質としての硫酸化グリコサミノグリカンは、ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基が交互に結合した二糖の繰り返し構造を持つ硫酸化グリコサミノグリカンであり、具体的にはヘパリン、ヘパラン硫酸が例示されるが、上記基本構造を有する限り、これには限定されない。
【００１１】
２ＯＤＳＧを構成するヘキスロン酸としては、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸を挙げることができ、好ましくはＤ−グルクロン酸および／またはＬ−イズロン酸である。
【００１２】
２ＯＤＳＧを構成するヘキソサミンとしては、グルコサミンおよびガラクトサミンを挙げることができ、好ましくはグルコサミンである。グルコサミンおよびガラクトサミンは通常それぞれ、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−ガラクトサミンであり、通常、２位がスルホアミノ基ではない場合はアセチルアミノ基である。
【００１３】
なお、２ＯＤＳＧにおいて、ヘキソサミンがＤ−グルコサミンである場合、ヘパリン又はヘパラン硫酸の基本骨格を有する硫酸化グリコサミノグリカンであり、本発明においては、これを２ＯＤＳＨと略称する。
また、２ＯＤＳＧは構成ヘキスロン酸の全てまたは一部の２位の水酸基に硫酸基を有しないという特徴を有するものであるが、この特徴は以下の分析法で分析することにより特定される。
【００１４】
すなわち、ヘパリンまたはヘパラン硫酸等の２ＯＤＳＨを後述の参考例１記載のグリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）による分析を組み合わせた方法により二糖組成分析した場合、構成ヘキスロンの２位の水酸基に硫酸基を有する不飽和二糖が、通常の硫酸化グリコサミノグリカンと比べて明らかに減少しており、その不飽和二糖組成は、通常、ΔＤｉＨＳ−ＵＳが０〜０．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓが０〜６．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓが０〜０．５モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが０〜１５．０モル％程度であることが好ましく、これらの合計は０〜２１モル％であることが好ましい。また、上記以外の不飽和二糖組成は、通常の硫酸化グリコサミノグリカンと比べて増加しており、ΔＤｉＨＳ−０Ｓが０〜８．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−６Ｓが０〜５．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ＮＳが８．０〜２５．０モル％程度、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓが４０．０〜９２．０モル％程度である。
【００１５】
二糖組成分析における２ＯＤＳＨの不飽和二糖組成は、２ＯＤＳＨを酵素処理して得た下記一般式で表される不飽和二糖組成の溶出位置を、標準不飽和二糖の溶出位置と比較することにより分析することができる。ＨＰＬＣの溶出位置を、通常紫外部（例えば波長２３２nm）の吸収によりモニターし、２ＯＤＳＨ中の不飽和二糖の含量は、その溶出パターンの積分値（面積）を濃度既知の標準不飽和二糖の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めることができる。下記一般式中の各置換基は表１の通りである。
【００１６】
【化１】
【表１】
また、上記略号の示す構造は以下の通り表記されることもある。
ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＡｃ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ１→４ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１→４ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）。
【００１９】
上記式中、ΔＨｅｘは不飽和ヘキスロン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＳはＮ−スルホグルコサミン、カッコ内は硫酸基の結合位置を示す。
【００２０】
２ＯＤＳＧの重量平均分子量は、クラミジア感染阻害効果を示す限り、特に限定されないが、３，０００Da以上が好ましく、より好ましくは、３０００〜５０，０００Daであり、３，０００〜１４，０００Daであることが更に好ましい。
また、２ＯＤＳＧは、クラミジア感染阻害効果の点では１２〜２００糖（二糖単位で６〜１００単位）からなるオリゴ糖または多糖であることが好ましいが、抗凝固活性を考慮すると、より低分子であることが好ましい。
尚、オリゴ糖類および多糖類は、通常、種々の重合度の糖鎖の集合体であるため、上記の２ＯＤＳＧの構成糖の重合度の好ましい数は、厳密にその数である必要はなく、統計的にその数の重合度のオリゴ糖または多糖が、他の重合度のものより多い場合も包含する。
【００２１】
また、２ＯＤＳＧは、その塩の形で使用することが可能であり、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリブチルアミン塩等が挙げられるが、アルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
【００２２】
２ＯＤＳＧにおいて、ヘキソサミン残基が、グルコサミン残基である２ＯＤＳＨ（いわゆるヘパリン骨格を有する物質）は、ブタ、ウシ等の哺乳動物の臓器（腸、肺、肝、腎、血管等）から抽出、精製されたヘパリン、ヘパラン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンを原料とし、その構成ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に結合している硫酸基を除去する脱硫酸化処理を行って得ることができるが、脱硫酸化処理方法は、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に結合している硫酸基を選択的又は優先的に脱硫酸化することができる処理であれば、特に限定されない。
【００２３】
例えば、Jasejaらの方法（Jaseja et al., Can. J. Chem., 67, 1449(1989)）など、公知の方法に準拠して行うことができ、具体的には、硫酸化グリコサミノグリカンのアルカリ性水溶液を調製し、これを凍結乾燥する方法が挙げられる。更に、脱硫酸化処理後、適当な溶媒を用いた溶媒沈殿、限外濾過、カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等、または、これらの組み合わせによって容易に濃縮・精製することができる。具体的には、前記脱硫酸化処理により得られた凍結乾燥パウダーを、蒸留水に溶解し、pH７に調整し、透析処理後、凍結乾燥処理に順次付する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明者らは、硫酸化グリコサミノグリカンのクラミジア感染阻害効果を検討するため、ヒト子宮頸癌細胞由来のヒーラ２２９細胞（ＨｅＬａ２２９）を用いて、実施例１記載の方法により２ＯＤＳＨ及びヘパリンの構成糖であるヘキスロン酸、グルコサミンの水酸基およびアミノ基に結合している全ての硫酸基を脱硫酸化した後、グルコサミンの２位のアミノ基を再硫酸化したヘパリン（以下、「ＣＤＳＮＳＨ」という。）のクラミジア感染阻害効果を調べた。その結果、ヘパリンにおいては、１０μｇ／mlの濃度では、約３％の細胞が感染を示したが、１００μｇ／mlでは約１％であり、ほぼ完全に感染を阻害した。２ＯＤＳＨに関しては、ヘパリンと比較すると感染阻害活性はやや弱まるものの、１００μg／mlではヘパリンと同様に、ほぼ完全に感染を阻害した。一方、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
【００２５】
上記の様にヘパリンはクラミジア感染阻害活性を有するが、出血等の副作用があり、医薬品としての適用には好ましくない。一方、２ＯＤＳＨはヘパリンと同等のクラミジア感染阻害活性を有し、かつ、出血等の副作用は極めて弱い。
【００２６】
ヘパリンおよび２ＯＤＳＨについて、出血活性の指標となるＴＴ活性およびＡＰＴＴ活性を後述する試験法３および４に従って測定した。結果を表２に示す。なお、ＴＴまたはＡＰＴＴにおける測定時間の上限はそれぞれ１００秒までとした。ヘパリンのＴＴ活性またはＡＰＴＴ活性を１００としたとき、対応する各被検サンプルのＴＴ活性またはＡＰＴＴ活性をその相対値で示した。
【００２７】
【表２】
これにより、２ＯＤＳＨはＡＰＴＴ、ＴＴ活性共にヘパリンと比較して極めて低く、安全性が高いことが判明した。
【００２９】
本発明の処置剤は、クラミジアに感染した対象の生体、すなわち、ヒトを含む哺乳動物、鳥類、その他脊椎動物の治療、予防、症状の緩和等の処置を目的として、非経口的または経口的に投与される薬剤である。
【００３０】
本発明の処置剤を生体に投与する際の剤型および投与経路としては、対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、それらをそのまま、または他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤等と共に製剤化し、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、液剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤等経口的または非経口的に安全に投与することができる。特に、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤として非経口的に投与することが好ましい。
【００３１】
本発明の２ＯＤＳＧの配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重などに応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、臨床投与量として１日当たり概ね１０μg／Kg〜１０mg／Kg程度を例示することができる。また、上記処置剤の投与間隔は１日１回程度でも可能であり、１日１〜３回、またはそれ以上の回数に分けて投与することもできる。
また、本発明の処置剤を性交渉時におけるクラミジア感染を防止するために膣内投与する場合、その投与量は１回概ね０．１mg〜１０mg程度が好ましい。
【００３２】
また、本発明は、２ＯＤＳＧをクラミジア、特にその感染性粒子（Elementary Body；ＥＢ）と接触させ、生体細胞におけるクラジミアの生育を阻害する方法にも関する。本方法は、例えば、粘膜、避妊具等にクラミジア感染を阻害するのに十分な量の２ＯＤＳＧを予め塗布、コーティング又は結合させ、生体へのクラミジアの感染を防止する方法等も包含する。さらに、動物細胞を培養する際に培地中に、２ＯＤＳＧを存在させて、該細胞にクラミジアが感染することを防止する方法も包含する。
【００３３】
尚、本発明におけるクラジミア感染阻害のメカニズムは、生体細胞のヘパリン様またはヘパラン硫酸様プロテオグリカンであるレセプターもしくはアクセプターへのクラミジア感染性粒子（ＥＢ）の吸着を防止することによるものと考えられるので、以上説明した通り、ＥＢが生体細胞の上記レセプターもしくはアクセプターに吸着する段階を、２ＯＤＳＧによって競合的に阻害する方法のみならず、生体細胞における上記レセプターもしくはアクセプターに存在するヘパリン様またはヘパラン硫酸様の糖鎖を、該糖鎖を分解するグリコサミノグリカン分解酵素で除去することによっても阻害することができる。この様な酵素としては、例えばヘパリナーゼＩが例示される。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を更に具体的に説明するが、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
なお、本実施例における試験法は以下の通りである。
【００３５】
参考例１
後述する本発明の実施例で使用した各種の硫酸化グリコサミノグリカンの分析は、以下の試験法１〜４に示す方法によって行った。
試験法１
〔酵素消化による二糖分析〕
硫酸化グリコサミノグリカン（２ＯＤＳＨ、ヘパリン）における硫酸基の置換位置の分析方法は、次のようにして行った。すなわち、対象とする各硫酸化グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素を用いて酵素消化し、精製した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II（東京化学同人刊、１９９１年）ｐ４９〜６２参照〕。各不飽和二糖のピーク面積を計算し、全ピーク面積の和に対する各ピーク面積の割合（％）を各不飽和二糖の組成割合とした。
この割合は、酵素消化物中の各不飽和二糖のモル％に相当し、ひいては、分析対象の硫酸化グリコサミノグリカンにおける種々の位置に硫酸基を有する二糖単位のモル％を反映するものである。
【００３６】
（１）ヘパリン、２ＯＤＳＨの分解酵素による消化
新生化学実験講座３、糖質II（東京化学同人刊、１９９１年）ｐ４９〜６２に記載の方法により、２mM酢酸カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）２２０μlに、ヘパリン、２ＯＤＳＨ２ロット（参考例２参照；以下、それぞれ、「２ＯＤＳＨ−１」、「２ＯＤＳＨ−２」という。）各１．０mgを溶解して、２０mUのヘパリナーゼ、２０mUのヘパリチナーゼIおよびIIを加えて、３７℃で２時間反応させた。
【００３７】
（２）ＨＰＬＣによる分析
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を上記（１）に従い分解酵素により消化を行った後の溶液５０μlを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル852型）を用いて分析した。イオン交換樹脂カラム（ダイオネックス社、CarboPac PA-1カラム４．０mm×２５０mm）を使用し、２３２nmでの吸光度を測定した。不飽和二糖（４〜１２糖）スタンダードを基準とし（Yamada, et al., J. Biol. Chem., 270, 8696-8706, (1995)）、流速１ml／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０mM→２．５M）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al., Comp.Biochem.Physiol., 103B, 473, (1992)）。
【００３８】
６種の不飽和二糖標品（８nmol each/shot）の溶出順は、ΔDiHS-0S（保持時間2.6分）、ΔDiHS-NS（保持時間 10.9分）、ΔDiHS-6S（保持時間 12.0分）、ΔDiHS-di(6,N)S（保持時間 15.2分）、ΔDiHS-di(U,N)S（保持時間 16.3分）、ΔDiHS-tri(U,6,N)S（保持時間21.9分）であった。
【００３９】
試験法２
〔分子量測定〕
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の３％溶液１０μlをＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。使用カラムは４，０００、３，０００および２，５００Ｇタイプの TSKgel-PWXLカラム（東ソー、7.8mm × 300mm）を用い、溶出液に０．２M塩化ナトリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の検出には示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用いた。本発明における重量平均分子量（Mw）はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda, et al., Biochem. Biophys. Res. Com.,220,108-112(1996)）。その計算式は、ＭＷ＝１０(10.17-0.19xRT)、〔RT:ピーク頂点の保持時間（分）〕である。
【００４０】
試験法３
〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）活性の測定〕
ＡＰＴＴの測定のため、ラット（ＳＤ系雄性ラット（１９４〜２２４ｇ）、チャールスリバー）の下大動脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採血し、血液を１０００×ｇで１０分間遠心分離して得た血漿１００μlと、様々な濃度のヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を各１００μlずつ測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、あらかじめ３７℃に保温しておいたアクチン（商品名：ウェルファイド（株））１００μlを添加し、さらに２分間保温した。次いで、３７℃の保温しておいた０．２MＣａＣｌ2溶液１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社）で測定した。なお、ＡＰＴＴにおける測定時間の上限は１００秒までとした。
【００４１】
試験法４
〔トロンビン時間（TT）の測定〕
上記試験法３で得た血漿１００μlと、様々な濃度のヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を各１００μlずつ測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温した。その後、３７℃に保温しておいたトロンビン（商品名：ウェルファイド（株）、１０U／ml）１００μlを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（KC-10A：アメルング社）で測定した。
【００４２】
〔本明細書におけるヘパリン〕
以下に示す物性を有するブタ小腸由来ヘパリンのナトリウム塩（サイエンティフィックプロテインラボラトリー社製 LotNo.40210910）を、上記試験法１〜４の分析における対照物質および下記参考例２における２ＯＤＳＨの合成原料として用いた。
ヘパリンの物性
（１）上記試験法１記載の二糖組成分析法による測定値から算出した不飽和二糖組成はΔDiHS-0S：３．７％、ΔDiHS-NS：３．２％、ΔDiHS-6S：４．７％、ΔDiHS-US：１．５％、ΔDiHS-di(6,N)S：１４．７％、ΔDiHS-di(U,N)S：６．８％、ΔDiHS-di(U,6)S：０．０％、ΔDiHS-tri(U,6,N)S：６１．３％であり、未同定ピーク：４．１％である。（％は全てモル％を表す）。
（２）日本薬局方に具体的に収載された測定法で測定された抗血液凝固活性が１７０〜１９０IU/mgである。
（３）重量平均分子量が１１，０００〜１４，０００Daである（参考例２参照）。
【００４３】
参考例２
〔２ＯＤＳＨの合成〕
ヘパリンを原料とし、その２−Ｏ−脱硫酸化反応をJasejaらの方法（Jaseja et al.,Can. J. Chem.,67,1449(1989)）を部分的に改変した以下の方法により実施した。すなわち、２００mgのヘパリンナトリウム塩を２０mlの０．４規定の水酸化ナトリウムに溶解し、直ちに凍結乾燥処理を行った。得られた凍結乾燥パウダーを２０mlの蒸留水に溶解した後、１規定の酢酸を添加することによりpH７に調整した。次いで、この溶液を透析処理、凍結乾燥処理に順次付した。その結果、１６５mgの２ＯＤＳＨをナトリウム塩として得た。この標品を２ＯＤＳＨ−１とした。
又、上記凍結乾燥処理を２回行うことにより、より完全に２−Ｏ−脱硫酸化した２ＯＤＳＨをナトリウム塩として１５０mg得た。この標品を２ＯＤＳＨ−２とした。
【００４４】
〔ゲル濾過ＨＰＬＣによる分子量測定〕
各５０μg／５μlのヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２を、０．２規定のＮａＣｌで平衡化した４，０００、３，０００および２，５００Ｇタイプの TSKgel-PWXLカラム（東ソー、7.8mm × 300mm）を上流から順に各一本ずつ連結した東ソー社製ＣＣＰＭ型ＨＰＬＣに付し、溶出液に０．２M塩化ナトリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開し、ゲル濾過（GPC-）ＨＰＬＣ分析を行った。なお、被検物質の検出には示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用い、カラムオーヴン中４０℃、０．６ml／mlの定流速下で、示差屈折（RI）を指標とした。その結果、ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１の保持時間は、それぞれ３３．５０および３３．６０分であった。得られた結果を基に算出した分子量を表３に示す。
【００４５】
【表３】
〔二糖組成分析〕
ヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の不飽和二糖組成の二糖組成分析は、参考例１の試験法１に記載の方法に従って実施した。結果を表３に示す。
【００４７】
参考例３
〔低分子化２ＯＤＳＨ画分の調製〕
１００mgの２ＯＤＳＨ−１を含有する２mM酢酸含有カルシウム含有２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）１０mlに０．1単位のヘパリチナーゼＩ（生化学工業社製）を添加し、３７℃で一晩、部分消化した。５分間煮沸して酵素を失活させた後、Superdex 30pg（２．６×６０cm，ファルマシア社製）ゲル濾過カラムで分画した。平衡化および展開溶液には０．２M酢酸アンモニウムを用いた。上記カラムから溶出した１２糖以上の画分を集め、凍結乾燥して１８mgの標品（低分子化２ＯＤＳＨ画分）を得た。分子量範囲は約３，０００〜８，０００Daであった。
又、上記と同様の方法で、それぞれ、２ＯＤＳＨの４，６，８，１０、１２糖に相当する画分を得た。
【００４８】
参考例４
〔血液凝固系に対するヘパリン、２ＯＤＳＨの影響〕
血液凝固系に対するヘパリン、２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の影響を前記試験法３および４にしたがって分析した。ヘパリン等何も添加しない状態で測定したＡＰＴＴおよびＴＴの値（以下、正常値と言う）の２倍の凝固時間を示すヘパリンの濃度はそれぞれ、０．５４μg／mlと０．１３μg／mlであった。同様に、正常値を２倍に延長させる２ＯＤＳＨ−１および２ＯＤＳＨ−２の濃度を求め、ヘパリンのＡＰＴＴ活性およびＴＴ活性それぞれを１００とし、２ＯＤＳＨ−１、２ＯＤＳＨ−２のＡＰＴＴ活性およびＴＴ活性それぞれをその相対値で示した。
【００４９】
実施例１
〔ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、ＣＤＳＮＳのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
【００５０】
３×１０5cells／mlのヒト子宮頸癌細胞由来ＨｅＬａ２２９細胞を２４穴プレートの各ウェルに１mlずつ分注し、２４時間前培養した。クラミジア感染性粒子（elementary body：ＥＢ）液に、予めHank's balanced salt solution（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）に溶解したヘパリン、２ＯＤＳＨ−２及びＣＤＳＮＳＨ（生化学工業社製）を各濃度となるように添加して懸濁した。このＥＢ懸濁液を前培養した単層ＨｅＬａ２２９細胞に２００μlずつ分注し、室温で１時間培養した。単層ＨｅＬａ２２９細胞をＨＢＳＳにて３回洗浄し、１０μg／mlシクロヘキサミドを加えた１０％牛胎児血清、０．５％グルコース含有イーグルＭＥＭ培地（ＣＭＧＡ培地，ＩＣＮ Biochem社製）にて３７℃で４８時間培養した。培養後トリプシン／ＥＤＴＡ液にて細胞を回収し、細胞を１００％エタノールで５分間固定、親水化し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を添加したＰＢＳにて２回洗浄した。フルオレセンイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識抗クラミジア抗体（マイクロトラック クラミジアトラコマチスダイレクト テスト；ＳＹＶＡ社製）で固定細胞を染色し、フローサートメトリーにて感染陽性細胞率を測定した。結果を図１に示す。
その結果、ヘパリンおよび２ＯＤＳＨ−２は１００μg／mlにおいてほぼ完全にクラミジア感染を阻害したが、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
【００５１】
実施例２
〔低分子化２ＯＤＳＨ画分のＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
実施例１と同様の方法で、ＥＢ液に、予めＨＢＳＳに溶解したヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、参考例３で調製した低分子化２ＯＤＳＨ画分をそれぞれ１００μg／mlとなるよう添加し懸濁後、このＥＢ懸濁液をＨｅＬａ２２９細胞に感染させ、これらの被検物質によるクラミジア感染の阻害効果を調べた。対照としては、参考例３で調製した２ＯＤＳＨのオリゴ糖画分（４，６，８，１０，１２糖）を用いた。
その結果、低分子化２ＯＤＳＨ画分においては１０％程度までクラミジア感染を抑制したが、１２糖以下の上記各オリゴ糖画分は感染阻害効果は示さなかった。従って、クラミジア感染阻害効果を示す２ＯＤＳＨは、１２糖以上の糖鎖が必要なことが判明した。結果を図２に示す。
【００５２】
実施例３
〔ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２及びＣＤＳＮＳＨ前処理ＥＢのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
１００μｇ／mlのヘパリン、２ＯＤＳＨ−２、ＣＤＳＮＳＨをそれぞれ添加したクラミジア感染性粒子（elementary body：ＥＢ）液を調製し、３７℃で６０分保温した。保温後、ＥＢ液をHank's balanced salt Solution（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、８０００Ｇで３０分間の遠心を行った。ペレットをＨＢＳＳに再懸濁し、１分間の超音波処理をし、更に８０００Ｇで３０分間の遠心を行い、ペレットを少量のＨＢＳＳに再懸濁することによりＥＢ懸濁を調製した。この前処理ＥＢ懸濁液のＨｅＬａ細胞への感染率を実施例１と同様の方法で測定した。その結果、ヘパリン及び２ＯＤＳＨ−２でＥＢを前処理することによりクラミジア感染を阻害したが、ＣＤＳＮＳＨは感染阻害効果を示さなかった。
結果を図３に示す。
【００５３】
実施例４
〔ヘパリナーゼＩのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
実施例１と同様の方法に従って、ヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ社製）についても同様に、クラミジア感染陽性細胞率を測定した。
その結果、１IU／mlの濃度において、細胞の感染は約９．２％であり、ヘパリナーゼＩはクラミジア感染を阻害することが分かった。結果を図４に示す。
【００５４】
実施例５
〔ヘパリナーゼＩ前処理Ｈｅｌａ２２９細胞へのクラミジア感染に対する影響〕
単層ＨｅＬａ２２９細胞に、ＨＢＳＳに懸濁したヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、３７℃で６０分保温した。保温後、温ＨＢＳＳにで３回洗浄を行った。上記前処理を行った単層ＨｅＬａ２２９細胞にＥＢ懸濁液を２００μlずつ分注して、室温で１時間培養した。単層ＨｅＬａ２２９細胞をＨＢＳＳにて３回洗浄し、１０μg／mlシクロヘキサミドを添加した１０％牛胎児血清、０．５％グルコース含有イーグルＭＥＭ培地（ＣＭＧＡ培地，ＩＣＮ Biochem社製）にて３７℃で４８時間培養した。培養後トリプシン／ＥＤＴＡ液にて細胞を回収し、細胞を１００％エタノールで５分間固定し、親水化して、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳにて２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識抗クラミジア抗体で固定細胞を染色し、フローサイトメトリーにて感染陽性細胞率を測定した。
その結果、１IU／mlの濃度において、ヘパリナーゼＩで前処理したＨｅＬａ２２９細胞の感染は、約４．７％であり、ヘパリナーゼＩでＨｅＬａ２２９細胞を前処理することでクラミジア感染を阻害することが分かった。結果を図５に示す。
【００５５】
製剤例
（１）錠剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに乳糖６７０mg、馬鈴薯デンプン１５０mg、結晶セルロース６０mg、および軽質無水ケイ酸５０mgを添加して混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース３０mgをメタノールに溶解した溶液（１０％（w／w））を添加して練合造粒した。次に、これを径０．８mmのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５mgを添加して圧縮成型し、１００mgの錠剤を製造した。
【００５６】
（２）カプセル剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに乳糖７６５mg、馬鈴薯デンプン１５０mg、ステアリン酸マグネシウム１０mgおよび軽質無水ケイ酸５０mgを添加して均一に混合し、これを１００mgずつ硬カプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００５７】
（３）軟膏剤
実施例１で調製した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、これに鉱油４ｇ、石油ゼリー８ｇ、混合メチル／プロピルパラバン６０mg、非イオン性界面活性剤１ｇおよび精製水３０ｇを添加して均一に混合し、これを容器に充填し、軟膏剤を製造した。
【００５８】
膣用座剤
実施例１で調整した２ＯＤＳＨ−２を１００mg秤量し、マクロゴール４００を３０００mgとともに６０℃で加温溶融して均一に混合した後、プラスチックの型に注いで冷却し、膣用座剤を製造した。
【発明の効果】
ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンにおいて、構成ヘキスロン酸残基の２位の硫酸基を除去することにより安全で副作用のないクラミジア感染症処置剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２およびＣＤＳＮＳＨのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図２】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２および低分子化２ＯＤＳＨ画分のＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図３】ヘパリン、２ＯＤＳＨ−２およびＣＤＳＮＳＨ処理ＥＢのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図４】ヘパリナーゼＩのＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
【図５】ヘパリナーゼＩ前処理ＨｅＬａ２２９細胞へのクラミジア感染阻害を示すグラフである。
Claims (2)
- ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とするヘパリンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全ての２位の水酸基に硫酸基を有しないヘパリンまたはその塩を有効成分とすることを特徴とするクラミジア感染症処置剤。
- ヘキスロン酸残基とヘキソサミン残基から成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格とするヘパリンにおいて、該ヘキスロン酸残基の全ての２位の水酸基に硫酸基を有しないヘパリンまたはその塩を有効成分とすることを特徴とするクラミジア感染症防止剤。
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