JP4462826B2 - 骨疾患治療剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする、代謝性骨疾患や炎症性骨疾患等の予防と治療に好適な骨疾患治療剤及び破骨細胞形成抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
骨組織は、骨吸収と骨形成から成る骨代謝が繰り返されている動的組織である。骨吸収と骨形成の均衡は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の両者により厳密に調節されており（非特許文献１）、この均衡が崩れると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈する。
【０００３】
骨吸収と骨形成の異常により引き起こされる疾患の一例としては、骨粗鬆症が挙げられる（非特許文献２）。他にも、炎症性骨破壊を伴う慢性関節リウマチや歯周炎が挙げられる。これら骨疾患は、特に破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じると考えられており、この様な背景の下、破骨細胞の形成と破骨細胞による骨吸収の調節に関する研究が盛んに行われており、破骨細胞による骨吸収過程や破骨細胞の形成を特異的に抑制する物質は、これら骨疾患の有効な治療薬として期待され、研究されてきている（非特許文献３）。
【０００４】
これまでに、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の酸性化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化グリコサミノグリカンのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化グリコサミノグリカンナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びグリコサミノグリカンから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填材からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告があるが、いずれもカルシウムや骨補填材の様な骨の修復に効果があると見なされている物質が併用されており、硫酸化グリコサミノグリカン単独での効果ではない。更に、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の投与によるカルシウム吸収率や骨強度の増強作用に基づく経口用骨粗鬆症予防及び治療剤（特許文献４）等の報告もされているが、いずれも血液幹細胞から破骨細胞へ向かう分化過程に作用して、破骨細胞の形成を阻止することに関する示唆は無い。
【０００５】
また、破骨細胞分化誘導のメカニズムは、活性化ビタミンD（1α、25(OH)2D3）、副甲状腺ホルモン（PTH）、インターロイキン１１（IL11）、インターロイキン６（IL6）、ＴＮＦα、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）等の骨吸収促進因子による骨芽細胞への作用により骨芽細胞表面上に破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）が発現し（非特許文献４）、一方、破骨細胞の表面にはＯＤＦの受容体であるReceptor activator of NF−Κb（ＲＡＮＫ）が発現しており、ＯＤＦとＲＡＮＫとが結合することが破骨細胞の形成に必要であることが報告されている（非特許文献５）。抑制系としては、種々の細胞より可溶性の骨吸収抑制因子（ＯＣＩＦ）が産生されており、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を競合的に阻害する事により破骨細胞の形成を抑制させることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
更に、慢性関節リウマチや歯周病における骨破壊のメカニズムも明らかにされつつあり、特に、これら骨疾患は、免疫系の関与が大きいことが示唆されており、活性化T細胞によるＯＤＦ発現とそれに伴う破骨細胞形成亢進に起因することが指摘されている（非特許文献７）。また、この様な骨疾患に対しては、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を遮断する物質が有効な治療薬となる可能性があると示唆されている（非特許文献８）。しかし、ＯＤＦのＲＡＮＫへのシグナルを遮断するOsteoprotegerin（ＯＰＧ）は未だ治療剤として上市に至っていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開平６−８０５４６
【特許文献２】
特開平７−５３３８８
【特許文献３】
特開昭６２−２０１８２５
【特許文献４】
特開平７―１０９２２２
【非特許文献１】
Chambers et al (1991) Vitamins Hormones 46,41-86
【非特許文献２】
Suda et alＸ (1992) Endocr. Rev., 13, 66-80 ; Suda et al (1996) In "Principles of Bone Biology (Bilezikian et al.eds)" pp.87-102
【非特許文献３】
Moreland et al (1993) Am.J.Med.Sci., 305(1) 40-51 ; Mebio., 11(2), p.24 (1994)
【非特許文献４】
Yasuda et al(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,3597-3602 ; Lacey et al (1998) Cell 93,165-176
【非特許文献５】
Nakagawa et al(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun, 253,395-400
【非特許文献６】
Tsuda et al. (1996) 生化学 68, 683 ; Tsuda et al. (1997) Biochem Biophys. Res. Commun 234, 137-142 ; Yasuda et al(1998) Endcrinology 139,1329-1337
【非特許文献７】
Teng et al. (2000) J.Clin.Invest,106(6),R59-R67 ; Kong et al(1999) Nature, 402(6759), 304-309
【非特許文献８】
Simonet et al (1997), Cell, 89, 309-319
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、慢性関節リウマチや歯周病等の炎症性骨破壊に起因する疾患や骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防や治療に用いることが出来、安全性の高い、骨疾患治療剤及び破骨細胞形成抑制剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物に、破骨細胞の形成を抑制する作用を見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。本発明の要旨は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有する骨疾患治療剤であり、具体的には、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合して構成するポリ硫酸化フコース及び／又はそれらの薬理学的に許容されうる塩又は硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカン及び／又はそれらの薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有する骨疾患治療剤である。中でも、硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンとしてはウロン酸とヘキソサミンからなる構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上の硫酸化フコビオシル基を有する硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンが挙げられ、更にはＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合した構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上のフコビオシル基を有する硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンなどが好ましく挙げられる。また本発明は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤を要旨とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物（以下、本発明物質ともいう）とは、該糖化合物の構造中に硫酸化フコース（以下、Fucと記載する場合もある）が化学的に結合したものであり、糖化合物の構造中に硫酸化フコース分子を２つ以上有する糖化合物がより好ましい。また、別の観点から述べると、本発明物質は好ましくは破骨細胞の形成抑制作用を示す、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物であり、当該破骨細胞の形成抑制効果は、例えば、マウス骨髄細胞を用いＰＧＥ２等の骨吸収促進因子を添加することにより破骨細胞の形成を惹起させた実験系を用い、この実験系に被検物質を共存させて、破骨細胞数を計測することで確認する事が出来るが、特にこの実験系でのみ確認される効果では無く、他の破骨細胞分化誘導モデルの実験等においても確認する事は可能である。
【００１２】
本発明物質としては、例えば、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合しているポリ硫酸化フコースや硫酸化フコース２分子からなる硫酸化フコビオシル基を側鎖として有するグリコサミノグリカン等が挙げられる。尚、本発明物質の構造中に存在する全フコース分子のうち少なくとも１つ以上が硫酸化されたフコースであれば良く、本発明物質中に存在するフコースの中には硫酸基を持たないフコースが存在している場合もある。
【００１３】
本明細書における「ポリ硫酸化フコース」とは、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合し直鎖構造をなしていても、また、分岐構造をなしていても良い。つまり、本発明物質として用いられるポリ硫酸化フコースは、硫酸化フコース分子同士がα１→３結合（Fucα１→３Fuc）によりグリコシド結合し直鎖状に伸長していることが好ましい。また、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による鎖状構造を主鎖として更に硫酸化フコースからなる側鎖を持つことにより分岐構造をなしていても良く、当該分岐構造における主鎖の硫酸化フコースと側鎖の硫酸化フコースはα１→４結合（Fucα１→４Fuc）によりグリコシド結合していることが好ましい。尚、本発明物質のポリ硫酸化フコースは、側鎖を必ずしも規則的に結合している必要はなく、部分的に側鎖を有するポリ硫酸化フコースも含まれる。
【００１４】
また、ポリ硫酸化フコース中の硫酸化されうる部位としては、結合に関与していないヒドロキシル基が挙げられる。例えば、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による直鎖構造からなるポリ硫酸化フコースにおいては、構成している各硫酸化フコースのＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基が硫酸化されうる部位として考えられ、また、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による主鎖にα１→４結合により側鎖として硫酸化フコースが結合し分岐構造をなしているポリ硫酸化フコースにおいては、主鎖を構成する各硫酸化フコースのＯ−２位のヒドロキシル基や、側鎖である硫酸化フコース分子におけるＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基が硫酸化されうる部位として考えられる。しかし、前述の様に、当該部位の全てが必ずしも硫酸化されているわけではなく、また、必ずしも規則的に硫酸化されているわけでもない。
【００１５】
ポリ硫酸化フコースの分子量は限定されるものでは無いが、その平均分子量は、３,０００〜６０,０００が好ましく、５,０００〜４０,０００がより好ましく、更には７,０００〜３５,０００がより好ましい。また、フコース１分子に対する硫酸基の割合は、平均０．４〜１．０分子が好ましく、より好ましくは平均０．６〜０．８５分子である。
【００１６】
また、硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンとは、Ｌ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸から選択されるウロン酸残基とＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン又はＮ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンから選択されるヘキソサミン残基から成る二糖単位（以下、構成二糖単位とも言う）の繰り返し構造を主鎖の基本骨格とし、側鎖として硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンを示す（以下、ＳＣ―ＧＡＧという）。
【００１７】
尚、本発明における硫酸化フコビオシル基とは、フコースのＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基（−ＯＨ）の硫酸（−ＯＳＯ3 ―）化の違いによりフコース１分子中に０〜２個硫酸基を有するフコース残基２残基分がα１→３結合しているフコビオース基であり、下記式（１）で表される。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【表１】
【００２０】
つまり、本発明物質として用いられるＳＣ−ＧＡＧとしては、公知のグリコサミノグリカンに側鎖として硫酸化フコビオシル基が結合したものが挙げられる。中でも特に、Ｄ-グルクロン酸（以下、GlcAとも言う）のＯ-１位とN-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン（以下、GalNAcとも言う）のＯ-３位とがβ-グリコシド結合したコンドロイチン硫酸タイプの二糖単位の繰り返し構造を主鎖の基本骨格とし、主鎖を構成するGalNAcのＯ-４位、Ｏ-６位及びGlcAのＯ-３位から選択される位置のヒドロキシル基と硫酸化フコビオシル基のＯ-１位のヒドロキシル基とでグリコシド結合することにより、硫酸化フコビオシル基を側鎖として有する分岐構造を持ったコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカン（以下、ＳＣ−ＣＳとも言う）が好ましく挙げられる。
【００２１】
ＳＣ−ＧＡＧは、１つの硫酸化フコビオシル基側鎖を有する構成二糖単位でほぼ構成されていても、または、硫酸化フコビオシル基側鎖を持たない構成二糖単位と１つ以上の硫酸化フコビオシル基側鎖を有する構成二糖単位が混在して構成されていても良い。つまり、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有するグリコサミノグリカンでも構わない。
【００２２】
例えば、ＳＣ−ＣＳにおいては、主鎖の構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上のフコビオシル基を含有しているのが好ましく、更には平均０．２分子以上含有しているとより好ましく、更には平均０．４分子以上含有しているとより好ましく、平均０．８分子以上含有していると最も好ましい。（尚、本明細書においては、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有するコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカンを部分的ＳＣ−ＣＳと言い、構成二糖単位１残基に硫酸化フコビオシル基側鎖をほぼ１分子有する構成二糖単位から成るコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカンをＮＳＣ−ＣＳとも言う。）
【００２３】
ＳＣ―ＧＡＧの平均分子量は、２,０００〜５０,０００であることが好ましく、平均分子量３,０００〜３０,０００がより好ましい。尚、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明物質においても、上記平均分子量の範囲に厳密に限定されるべきものではない。
【００２４】
本発明のＳＣ−ＧＡＧは、通常のグリコサミノグリカンと同様にグリコサミノグリカン部分にも硫酸基を有している。例えば、ＳＣ−ＣＳにおいては、主鎖の構成二糖単位１残基に対する硫酸基の割合は側鎖の硫酸化フコビオシル基の硫酸含量と合わせて平均１．０〜４．０分子が好ましく、更には平均１．３〜３．８分子であるとより好ましい。
【００２５】
また、部分的ＳＣ−ＣＳは後述の試験例に記載のコンドロイチナーゼＡＢＣ（以下、Ｃ−ＡＢＣとも言う）による分解とイオン交換高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）による分析を組み合わせた二糖組成分析において硫酸化フコビオシル基の結合量に反比例してウロン酸１分子とヘキソサミン１分子から成る不飽和二糖が検出されるが、この分析法における不飽和二糖の生成率が０〜７５％が好ましく、０〜５０％であるとより好ましい。尚、ＮＳＣ−ＣＳはこの分析方法にて不飽和二糖生成率０％である。つまり、本発明物質はＣ−ＡＢＣで分解されにくい硫酸化ＧＡＧであることがより好ましい。
【００２６】
本発明物質は、その起源、由来、製法によって特に限定されるものでは無く、本発明物質が有する特性を満たすものであれば、天然資源から抽出、精製したものでも、また、天然資源から抽出され精製して得られた物質を原料として化学的手法等により改変したもの、また、人工的に化学合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。
【００２７】
例えば、ＳＣ−ＧＡＧは、天然資源から得られる硫酸化フコビオシル基を側鎖として有するグリコサミノグリカンでも、天然資源（主として生物体）から得られる硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として部分的に硫酸化フコビオシル基を除去するなどの化学的手法等により改変したもの、及び、天然資源から得られるグリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧともいう）を原料として化学的手法等により硫酸化フコビオシル基側鎖を導入したもの等、若しくは、人工的に化学合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。ＳＣ−ＧＡＧを天然資源から単離精製する場合や天然資源から単離精製された硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として製造する場合に用いる天然資源としては、種、属など特に限定されないが、例えば、棘皮動物が挙げられる。棘皮動物の中でも、好ましくはナマコ類が挙げられ、特に、マナマコ（Sea Cucumber Stichopus japonicus）、クロナマコ（Holthuria atra）、ニセクロナマコ（Holothuria leurospilota）などが挙げられる。
【００２８】
また、本発明物質として用いられるポリ硫酸化フコースを天然資源から単離精製する場合に用いる原料としても、一例として上記と同様のナマコ類が挙げられる。尚、現在、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
【００２９】
上記の天然資源から硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカン等のＧＡＧ類やポリ硫酸化フコースを単離・精製する方法は、例えば、Carbohydr. Res., 297, 273-279 (1997)や特公平６−７００８５や後述の参考例に記載の方法を用いることが可能であるが、ＧＡＧ類等を生体組織から単離・精製する際に通常用いられる公知の方法を用いる事も可能である。
【００３０】
また、側鎖である硫酸化フコビオシル基の部分的脱離方法としては、本発明物質が有する特性を満たすＳＣ−ＧＡＧが生成する条件での緩和な酸加水分解反応、アルカリ加水分解反応や酵素消化反応が挙げられるが、目的とする部分的ＳＣ−ＧＡＧが得られれば、これらに特に限定はされない。例えば、マナマコより単離・精製した硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として、硫酸化フコビオシル基の部分的脱離を行う場合は、０．０５〜０．２Ｎ程度の硫酸、塩酸等の無機酸を用いて、７５〜８５℃程度の条件下で約２〜６時間、酸加水分解を行い、反応後、中和し、分離・精製する方法が挙げられる。
【００３１】
本発明物質の薬理学的に許容されうる塩としては、本発明物質の有する破骨細胞形成を抑制する作用を失うこと無く、また、薬理学的に許容されうる塩であれば、特に限定されない。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などのうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、特にナトリウム塩が好ましい。
また、本発明物質の塩としては、本発明物質の有する破骨細胞の形成を抑制する作用を失わせることの無い塩であれば、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。特にナトリウム塩が好ましい。
【００３２】
本発明物質は、後述の実施例に記載の通り、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成の実験系において、破骨細胞の形成を有意に抑制する。これより、本発明物質は骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患やリウマチ、歯周病の様な炎症性骨疾患等、特に破骨細胞の機能が異常に亢進することにより引き起こされる疾患の予防と治療に用いることが出来る。
【００３３】
本発明物質を上記疾患の予防や治療に用いる場合には、本発明物質の有する作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。本発明物質を含有する骨疾患治療剤の剤型及び投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、軟膏剤等に製剤化して、経口、注射、塗布等の投与方法が考えられるが、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能である。
【００３４】
尚、本発明物質を含有する骨疾患治療剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、投与対象患者の体重や具体的症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、本発明物質として１日当たり概ね０．１mg/kg〜３００mg/kg程度を、１日１回〜数回に分けて投与する事が考えられる。
更に、上述の本発明物質は、破骨細胞形成抑制剤としてin vivo及びin vitroの系でも用いる事が出来る。
【００３５】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
参考例１ ＮＳＣ−ＣＳの製造
マナマコ（Stichopus japonius）の体壁部より、GAG類を生体組織から単離・精製するために用いられる公知の方法（Kariya et al. (1990) J.Biol.Chem.,265, 5081-5085）にて、硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカン（ＮＳＣ−ＣＳ）の凍結乾燥粉体２１０ｍｇを得た。
【００３７】
具体的には、原料のマナマコ（Stichopus japonius）の体壁背部をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１,V/V）で不要の脂溶性画分を抽出除去した。抽出残渣を乾燥後、１２０℃、３０分間のオートクレーブ処理に付し、５０ｍmol/lリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し懸濁液とした。この懸濁液に対し、蛋白質１ｇあたり５０ｍｇのアクチナーゼ（科研製薬（株）製）を加え、５５℃にて８時間攪拌し、コラーゲンやコアプロテイン等の共存蛋白質を消化した。酵素消化物を０．４mol/l水酸化ナトリウム、次いで１０％トリクロロ酢酸で順次処理した後、遠心分離（5,000xｇ、１５分）に付し、上清を回収し、流水透析を行った。透析内液に２．５％酢酸ナトリウムを含む冷エタノールを透析内液量の３倍量を添加する事により目的物質を沈殿させ、遠心分離（5,000xｇ、１５分）により沈殿を回収した。回収した沈殿を冷エタノールで洗浄し、得られたペレットを減圧乾燥することにより粗精製物を得た。
【００３８】
得られた粗精製物１．０ｇを少量の５０ｍmol/l炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、その半分量を同溶媒で平衡化したSephadex G-100（Amersham Bioscience社製）を詰めたカラム（直径３．４ｃｍ×長さ１００ｃｍ）に付し、同溶媒にて溶出させ、溶出液を１０ｍＬ毎に回収した。得られた各フラクションにつき紫外部（ＵＶ）２１０ｎｍにおける吸光度の測定、カルバゾール法（Bitter&Muir (1962) Anal. Biochem., 4, 330-334）によるウロン酸含量の測定及びアンスロン法（Dimler, R. L et al. (1952) Anal. Chem., 24, 1411-1414）による中性糖含量の測定を行った。その結果、高分子画分にグリコサミノグリカンと目されるカルバゾール反応陽性の画分を見出したので、これを合一回収し、凍結乾燥により粉末（２２４ｍｇ）を得た。得られた粗精製物の溶液の残り半分量についても同様の操作を行い、合わせて５７４ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物のうち５００ｍｇを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２、Whatmann社製）を詰めたカラム（内径１．８ｃｍ×長さ１８ｃｍ）に付し、同緩衝液中０→１．２Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出した。
【００３９】
８ｍｌ毎に分画回収した各フラクションにつきカルバゾール法によりウロン酸含量の測定およびアンスロン法による中性糖含量の測定を行った。その結果、塩化ナトリウムの０．６mol/l濃度付近に目的物質と目されるピークを見出したので、このピークに該当する画分を合一回収し、流水透析、次いで、凍結乾燥を行い、ＮＳＣ―ＣＳである粉体（２１０ｍｇ）を得た。
【００４０】
ここで得られたＮＳＣ−ＣＳにつき、化学組成分析法による分析を行った。即ち、ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を測定し、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定した。
【００４１】
測定結果より、得られたＮＳＣ−ＣＳ構成成分の重量存在比を算出したところ、公知のナマコ由来グリコサミノグリカン（Kariya et al. (1990) J.Biol.Chem.,265, 5081-5085）とほぼ同等の組成を示した。この公知のナマコ由来グリコサミノグリカンの構造は、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合したコンドロイチンの基本骨格を有するものであり、Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンのＯ-４位かつ／またはＯ-６位、更にはD-グルクロン酸のＯ-３位に硫酸化フコース２残基よりなるフコース側鎖（硫酸化フコビオシル基）がグリコシド結合した構造を有していることが明らかにされており（Kariya et al.(1997) Carbohydr.res.,297,273-279）、本参考例で製造したＮＳＣ−ＣＳも同様の構造であると推測される。
【００４２】
参考例２ 部分的ＳＣ−ＣＳの製造
上記で得られたＮＳＣ−ＣＳを原料として、側鎖である硫酸化フコビオシル基の部分的除去を行い、部分的ＳＣ−ＣＳを製造した。つまり、上記で得られたＮＳＣ−ＣＳ４０ｍｇを０．０５Ｍ硫酸４ｍＬに溶解し、８０℃にて３時間あるいは６時間の加水分解反応にそれぞれ付した。反応は反応混液を室温まで冷却することによって停止させ、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して中和した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセルロファインＧＣＬ−９０ｍカラム（内径３．４×１１０ｃｍ；生化学工業（株）製）に付し、溶出液を１０ｍＬ毎に分取した。また、上記方法で得られたＮＳＣ−ＣＳも同様にカラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を１０ｍＬづつ分取した（以下、３時間の加水分解により得られたものを３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ、６時間の加水分解により得られたものを６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳとも言う）。
【００４３】
各カラム溶出液の各フラクションにつき、ウロン酸含量並びに中性糖含量を測定し、溶出液の挙動を比較した（図１）。各カラム溶出液毎、図１に基づき、グリコサミノグリカン画分であるフラクションを合一濃縮し、更に、蒸留水で平衡化したセルロファインＧＣＬ-２５カラム（内径２．０×長さ２５ｃｍ、生化学工業（株）販売）に付し脱塩した後、凍結乾燥処理によって乾燥・回収した。収量は、ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳで、各３４．７ｍｇ、１８．１ｍｇおよび１５ｍｇであった。
【００４４】
ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの各ゲル濾過溶出パターン（図１ａ、図１ｂ、図１ｃ）を分析すると、加水分解を行わないＮＳＣ−ＣＳについては、高分子画分領域にウロン酸及び中性糖のピークがほぼ一致した位置に等しい形状でシングルピークとして観察された。しかし、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは、ＮＳＣ−ＣＳのパターンの中性糖ピークと対応する高分子画分領域の中性糖ピークは大幅に減少し、低分子画分域に中性糖の新しいピークが検出され、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳにおいては、この中性糖の新しいピークは更に顕著に検出されている。
【００４５】
これより、加水分解反応の進行に伴い、ＮＳＣ−ＣＳから側鎖である硫酸化フコビオシル基が加水分解反応時間依存的に脱離している事が示唆される。
【００４６】
参考例１と同様に、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳについて、化学組成分析法を行った。ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定し、各構成成分の重量存在比を算出した（表２）。更に、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出し、ヘキソサミンを１として各成分のモル比を算出し、表３に示した。
【００４７】
【表２】
表２ 各試料の構成成分の重量存在比（Ｗ／Ｗ, ％）
【００４８】
【表３】
表３ 各試料の構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）
（カッコ内の数値はヘキソサミンのモル存在量を１とした場合の各成分のモル比を示す）
【００４９】
３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳいずれもヘキソサミンとウロン酸のモル比がほぼ一定であり、硫酸化フコビオシル基を脱離させる加水分解反応においてもＧＡＧの直鎖基本構造部分は保持されていると推測される。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは構成二糖単位１残基あたりフコビオシル基及び硫酸基が各々０．２９分子及び１．７０分子存在するのに対し、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは構成二糖単位１残基あたりフコビオシル基及び硫酸基が各々０．１８分子及び１．０６分子であり、加水分解反応時間依存的に減少しており、上述のゲル濾過溶出パターンの結果を裏付けている。
【００５０】
参考例３ コンドロイチナーゼＡＢＣによる分解
ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ各々についてＣ−ＡＢＣによる消化の度合いをゲル濾過を分離要因とするＨＰＬＣ（以下、ＧＣＰ−ＨＰＬＣとも言う）により測定した。即ち、ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ各々を１０ｍｇ／ｍＬとなる様に蒸留水に溶解し、そのうち２０μＬを０．５ＵのＣ−ＡＢＣ（生化学工業（株）製）を含む酵素溶液１０μＬ（０．４Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．４Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加し、３７℃で１８時間、酵素消化反応を行った。反応混液に蒸留水５０μＬを添加し、沸騰水中で１分間加熱後、遠心分離することにより上清を得た。
【００５１】
このＣ−ＡＢＣ酵素消化物を含む上清を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷＸＬおよびＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬカラム（いずれも内径４．０×２５ｃｍ、Tosoh社製）を上流から順に連結して装着したＧＰＣ−ＨＰＬＣに付し、０．２mol/l塩化ナトリウム溶液のアイソクラティック条件で溶出し、Refractive Indexを指標として検出し、ＨＰＬＣチャートを得た。（図２）
得られたＨＰＬＣチャートのピーク面積から以下の式を用いて各被験物のＣ−ＡＢＣ消化度（不飽和二糖生成率）の見積もりを算出した。下記不飽和二糖生成率の計算式において、全ピーク面積とは、図２のＡ２、Ｂ２、Ｃ２のＣ−ＡＢＣ酵素消化後の各チャートにおける、△Oligo、△Ｄｉ−ｄｉＳ、△Ｄｉ−ｍｏｎｏＳ及び△Ｄｉ−ｚｅｒｏＳの合計ピーク面積を示し、不飽和二糖ピーク面積の和とは、各不飽和二糖ピークの面積の総和（△Ｄｉ−diＳ、△Ｄｉ−monoＳ及び△zeroＳの合計ピーク面積）である。尚、△Oligoとは、Ｃ−ＡＢＣ消化にて二糖単位構造にまで分解されず四糖以上の構造である不飽和オリゴ糖を示す。また、△Ｄｉ−diＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を二つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ−monoＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を一つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ−zeroＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を持たない不飽和二糖を示す（Anal. Biochem., 177, 327-332 (1989) p.328 Fig.1参照）。
【００５２】
不飽和二糖生成率（％）＝不飽和二糖ピーク面積の和／全ピーク面積 × １００
ＮＳＣ−ＣＳは不飽和二糖成分は検出されず、Ｃ−ＡＢＣにより分解されていないことが確認された。これは、ナマコ由来グリコサミノグリカンに関する公知文献の記載と同様である。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳは不飽和二糖及び不飽和オリゴ糖のピークが観察され、上記式に従い算出される不飽和二糖生成率（％）は各々４６．５％及び６６．３％であった。
【００５３】
参考例４ ポリ硫酸化フコースの製造
ナマコ体壁背部（１０ｋｇ）をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）抽出により脂溶性画分を得た。この画分をロータリーエバポレーターを用い減圧下で濃縮・乾固させた。得られた乾固物に蒸留水（３００ｍＬ）を加えて水溶液とした後、４℃にて一晩放置した。次いで、表層に浮遊した脂肪を除去した水溶液に対し冷却下にて３倍量のエタノールを添加し、遠心分離にかけ沈殿物を得た。この沈殿物を少量の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥を行い、低極性と目される多糖類の粗画分（２．４６ｇ）を得た。
【００５４】
この粗画分から１ｇを取り、０．２mol/l塩化ナトリウム水溶液７ｍＬに溶解し、０．２mol/l塩化ナトリウム水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（内径３．４×１１０ｃｍ、Amersham Biosciences社製）に付した。０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて溶出を行い、１２ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍで測定）及び２１０ｎｍ、２８０ｎｍの両波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描いた（図３）。
【００５５】
アンスロン法が陽性であった画分番号４２〜６９を合一した後、ロータリーエバポレーターにて１０ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液を蒸留水で平衡化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ ＧＣＬ−２５カラム（内径３．３×３６ｃｍ、生化学工業（株）販売）に付し、蒸留水による溶出にて１０ｍＬ毎に分画した。得られた４０画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍの波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描いた。溶出曲線より脱塩が達成している事を確認し、目的物質を含む画分である画分番号１１〜２０を合一して凍結乾燥を行い、中性糖を含む多糖と目される乾燥物を得た（収量１３５．４ｍｇ）。
【００５６】
更に精製する為、得られた乾燥物１００ｍｇを０．１mol/lの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＤＥ５２、Whatmann社製）カラム（内径２．３×１８ｃｍ）に付し、同緩衝液５０ｍｌでカラムを洗浄後、同緩衝液３００ｍＬと１．２Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３００ｍＬを用いた塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出を行い７ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を描いた（図４）。その結果、画分番号７５〜８１と画分番号８２〜９４にピーク（各々ピーク１、ピーク２と言う）が出現した。各々のピーク毎に合一し、ピーク１に由来する画分（以下、ポリ硫酸化フコースIとも言う、収量１４．２ｍｇ）とピーク２に由来する画分（以下、ポリ硫酸化フコースIIとも言う、収量３３．６ｍｇ）を得た。
【００５７】
参考例５ ポリ硫酸化フコースの物理化学的性状解析
参考例４で製造したポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIにつき、参考例１、２と同様に、ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定し、各構成成分の重量存在比を算出した（表４）。また、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出し、中性糖を１として各成分のモル比を算出した（表５）。
次いで、ゲル濾過―高速液体クロマトグラフィーにより分子量の測定を行った。その結果、ポリ硫酸化フコースIの分子量は９,０００、ポリ硫酸化フコースIIの分子量は３２,０００であった。
【００５８】
【表４】
表４ 各構成成分の重量存在比（重量％）
【００５９】
【表５】
表５ 各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）
（カッコ内の数値は中性糖含量のモル存在量を１とした場合の各構成成分のモル比を示す）
【００６０】
この結果、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースII共に、硫酸基と中性糖は含有しているが、ヘキソサミンを含有せず、また、ウロン酸も痕跡量のみであり実質的には含有していないと推測され、中性糖を側鎖として有するグリコサミノグリカンでは無いことが確認された。また、ポリ硫酸化フコースI及びIIの中性糖に対する硫酸基の割合は各々０．６９及び０．７９であり、硫酸化の割合は高いことが判明した。
【００６１】
更に、Yasuno,S. et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,1353-1359に記載された方法に従い、中性糖の同定を行った。すなわち、１０ｍｇ／ｍＬに調製したポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIの各水溶液から各々５０μＬを取り、８mol／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０μＬを各々に添加し封管した。反応混液を１００℃にて３時間加熱することにより、グリコシド結合ならびに硫酸エステル結合を開裂させた。冷却後、遠心分離により反応混液を反応管底部に集め、開管した。ドライエアーを吹き付け溶媒を除去し、２-プロパノール４０μＬをそれぞれに添加し攪拌した。更に、ドライエアーを吹きつけ溶媒を除去することにより、単糖試料を得た。得られた単糖試料につき、２０μＬの蒸留水及び８０μＬの４-アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）試薬を添加した後、封管し、８０℃にて１時間加温し還元アミノ化反応を進行させ、還元末端がＡＢＥＥにて標識された単糖誘導体を作成した。反応終了後、開管し２００μＬの蒸留水並びに２００μＬの塩化メチレンを添加し、激しく攪拌した後、遠心分離を行い上澄み中に還元末端がＡＢＥＥにて標識された上記単糖誘導体を得た。７％アセトニトリルを含む０．２mol/lホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラム（内径４．６ × ７５ｍｍ、Honen社製）を装着した高速液体クロマトグラフィーに、得られたＡＢＥＥ標識化単糖試料を付し、同溶媒のアイソクラティック溶出条件により分析を実施した。尚、用いた単糖標品は、ガラクトース（Gal）、マンノース（Man）、グルコース（Glu）、アラビノース（Ara）、リボース（Rib）、Ｎ-アセチルマンノサミン（ManNAc）、キシロース（Xyl）、Ｎ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、フコース（Fuc）、ラムノース（Rha）、及び、Ｎ-アセチルガラクトサミン（GalNAc）（溶出順）である（図５）。この結果、参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI、ポリ硫酸化フコースII共に含有する単糖はフコースであることが判明した。尚、精製当初、硫酸化ポリフコースI及びIIが脂溶性画分であった理由としては、硫酸化されてはいるが、低極性のメチル基を有するフコース残基を構成成分とする為と考えられる。
【００６２】
参考例６ ポリ硫酸化フコースの構造解析
参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIから各５ｍｇをとり、それぞれを蒸留水で平衡化したAmberlite IR-120カラム（オルガノ（株）社販売、内径１．５×１２ｃｍ）に供した。得られた溶出画分のうちの酸性画分につき、適量のピリジンを添加して中和した後、凍結乾燥に伏してポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIのピリジン塩を得た。それぞれにつき、１ｍｌの１０％蒸留水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、９０℃にて６日間ソルボリシス反応を進行させた。反応は、室温まで冷却することにより停止させ、３倍量の蒸留水を添加した後、２mol/l水酸化ナトリウム水溶液を適量添加してｐＨを９〜９．５に調整した。これを流水に対し一晩透析した後、凍結乾燥することにより、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIの脱硫酸化物をそれぞれ３．０ｍｇ及び３．３ｍｇ得た。
【００６３】
ポリ硫酸化フコースI及びその脱硫酸化物、さらにポリ硫酸化フコースII及びその脱硫酸化物の計４画分から、それぞれ１ｍｇをとりHakomoriの方法（Hakomori, S.(1964) J. Biochem. (Tokyo),55, 205-208）を一部改変したSanfordとConradの方法（Sanford, P.A. & Conrad, H.E.(1966) Biochemistry, 5, 1508-1517）に従ってメチル化誘導体を合成した。得られたメチル化誘導体は、Waegheらの方法（Waeghe et al.(1983) Carbohydr. Res., 123, 281-304）に従って脱塩した。さらに、これらを２モル／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い１２１℃で加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）を用いて還元した。最後に、還元処理により出現した水酸基をアセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト（ＰＭＡＡ）を合成した。得られたＰＭＡＡを５０μＬのアセトンに溶解し、そのうち１μＬをＧＣ−ＭＳに付した。ガスクロマトグラフィー−質量スペクトル（ＧＣ−ＭＳ）分析は、Supelco社製ＳＰ２３３０キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ）を装着したJEOL社製HX110A型マススペクトロメーターを用いて、スプリットレスモードで行った。カラムオーブンは、５０℃に２分間保ち、次いで３０℃／分の勾配で１７０℃まで昇温、さらに４℃／分の勾配で２３５℃まで昇温させ、この温度に１５分間保った。
【００６４】
ポリ硫酸化フコースIのクロマトグラムに於いては、８種類のＰＭＡＡが全て観察された（表６）。それらは、2,3,4-tri-O-methyl-fucitol（T-Fuc）、3,4-di-O-methyl-fucitol（2-Fuc）、2,4-di-O-methyl-fucitol（3-Fuc）、2,3-di-O-methyl-fucitol（4-Fuc）、4-O-methyl-fucitol（2,3-Fuc）、3-O-methyl-fucitol（2,4-Fuc）、2-O-methyl-fucitol（3,4-Fuc）、fucitol（2,3,4-fucitol）である。以下の記載に於いては、上記（）内に示したPMAAの略称を用いて説明を進める。
【００６５】
【表６】
表６
【００６６】
ポリ硫酸化フコースIの脱硫酸化物のクロマトグラムはポリ硫酸化フコースIのクロマトグラムとは異なり、ほぼ等量のT-Fuc、3-Fuc及び3,4-Fucの三種類が検出された。従って、ポリ硫酸化フコースIの構造は、Fucα１→３Fucの主鎖から部分的にFucα１→４Fucが枝分かれしていると考えられる（図６）。また、硫酸基が図示したような部位（主鎖においてはＯ−２位、側鎖においてはＯ−２位且つ／又はＯ−４位）に配位しているものと考えられた。
【００６７】
ポリ硫酸化フコースIIのクロマトグラムに於いては、表６に記載の通り、５種類のPMAA（T-Fuc、3-Fuc、2,3-Fuc、3,4-Fuc及び2,3,4-Fuc）が観察された。ポリ硫酸化フコースIIの脱硫酸化物のクロマトグラムはポリ硫酸化フコースIIのクロマトグラムとは異なり、少量のT-Fucと著量の3-Fucのみから成っていた、この結果より、ポリ硫酸化フコースIIの構造は、Fucα１→３Fucの直鎖構造をとり、部分的にＯ−２位且つ／又はＯ−４位の水酸基が硫酸化されていると思われる。
【００６８】
実施例１ ＳＣ−ＣＳの破骨細胞形成抑制実験
ｄｄＹマウス（六週齢雌）の頸骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞／穴となるように播種し、１０―６モル／ＬプロスタグランジンＥ2（以下、ＰＧＥ２という。SIGMA社製）刺激下において、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬの濃度になる様に、参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳを添加し、１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳという。べーリンガー社製）含有Minimum Essential Medium Alpha Medium（GIBCO社製、以下、αＭＥＭという。）培地中で７日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養中２、３日おきにＰＧＥ２と上記各濃度のＮＳＣ−ＣＳを新たに添加した１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて培地交換を行った。７日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びfast garnet ＧＢＣ saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase, Leukocyte」（商品名：SIGMA社製、以下、Acid Phosphatase, Leukocyteと言う）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。（図７）
図７の結果より、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成実験系において、ＮＳＣ−ＣＳが用量依存的に破骨細胞の形成を抑制した。１μｇ／ｍＬのＮＳＣ−ＧＡＧ濃度で破骨細胞の形成５０％阻害した。
【００６９】
実施例２ ＮＳＣ−ＣＳ並びに部分的ＳＣ−ＣＳの破骨細胞形成抑制実験
５０μｇ／ｍＬ濃度となるように、参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳ、参考例２で得られた３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳを用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。（図８）
図８の結果より、ＮＳＣ−ＣＳについては、有意な破骨細胞形成抑制効果が確認された。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳにおいても、破骨細胞形成抑制効果が認められた。これに比べて、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの効果は弱かった。
【００７０】
硫酸化フコビオシル基側鎖を多く有するものほど、破骨細胞形成抑制効果は強く発揮された為、同効果の発現には、側鎖である硫酸化フコビオシル基を有する事が重要であると推察される。
【００７１】
実施例３ 硫酸化ポリフコースの破骨細胞形成抑制実験
５０μｇ／ｍＬ濃度となるように参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳ、参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIを用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。結果を図９に示す。尚、結果は各穴内における破骨細胞の数によって示し、また、コントロールは被験物質の代わりに１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加した。
【００７２】
図９の結果より、ＮＳＣ−ＣＳと同様に、ポリ硫酸化フコースI、ポリ硫酸化フコースIIにおいても有意な破骨細胞形成抑制効果が確認された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物を、骨粗鬆症などの代謝性骨疾患や炎症性骨破壊に起因するＲＡ、歯周病などの疾患に対する治療に有効な破骨細胞形成抑制効果を有する骨疾患治療剤として提供することができる。また、本発明はin vivo及びin vitroにおいて破骨細胞形成抑制効果を有する破骨細胞形成抑制剤を提供する。
【００７４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのセルロファインＧＣＬ−９０ｍカラム溶出液の各フラクションにおけるウロン酸含量並びに中性糖含量を測定したグラフであり、縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、各々ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの結果である。
【図２】 ＮＳＣ―ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳに於ける、コンドロイチナーゼＡＢＣ消化前後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、縦軸は示差屈折率、横軸は保持時間（分）を示す。Ａ１は、ＮＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ａ２はＮＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は０％である。Ｂ１は３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ｂ２は３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は４６．５％である。Ｃ１は６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ｃ２は６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は６６．３％である。
【図３】 多糖類の粗画分のセファロースＣＬ−６Ｂカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度を測定したグラフである。縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。
【図４】 ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定したグラフである。縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。
【図５】 ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸フコースIIから得られた還元末端が４−アミノ安息香酸エチルエステルにて標識された単糖誘導体のＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーに付し、得られたチャートである。
尚、Ｅ１は、ポリ硫酸化フコースIから得られたプロファイル、Ｅ２はポリ硫酸化フコースIIから得られたプロファイルである。
Ｓｔｄ．は単糖標品を付した結果であり、各ピークは溶出順にガラクトース（Gal）、マンノース（Man）、グルコース（Glu）、アラビノース（Ara）、リボース（Rib）、Ｎ-アセチルマンノサミン（ManNAc）、キシロース（Xyl）、Ｎ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、フコース（Fuc）、ラムノース（Rha）、及び、Ｎ-アセチルガラクトサミン（GalNAc）である。
【図６】 ポリ硫酸化フコースI（ピーク１由来の画分）の推定構造と、ポリ硫酸化フコースII（ピーク２由来の画分）の推定構造を示す。
【図７】 ＮＳＣ−ＣＳの用量依存的な破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数、横軸はＮＳＣ−ＣＳの添加濃度である。（−）はコントロールの結果を示す。
【図８】 ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳによる破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数である。（−）はコントロールの結果を示す。
【図９】 ＮＳＣ−ＣＳ、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIによる破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数である。（−）はコントロールの結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分とする、代謝性骨疾患や炎症性骨疾患等の予防と治療に好適な骨疾患治療剤及び破骨細胞形成抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
骨組織は、骨吸収と骨形成から成る骨代謝が繰り返されている動的組織である。骨吸収と骨形成の均衡は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の両者により厳密に調節されており（非特許文献１）、この均衡が崩れると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈する。
【０００３】
骨吸収と骨形成の異常により引き起こされる疾患の一例としては、骨粗鬆症が挙げられる（非特許文献２）。他にも、炎症性骨破壊を伴う慢性関節リウマチや歯周炎が挙げられる。これら骨疾患は、特に破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じると考えられており、この様な背景の下、破骨細胞の形成と破骨細胞による骨吸収の調節に関する研究が盛んに行われており、破骨細胞による骨吸収過程や破骨細胞の形成を特異的に抑制する物質は、これら骨疾患の有効な治療薬として期待され、研究されてきている（非特許文献３）。
【０００４】
これまでに、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の酸性化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化グリコサミノグリカンのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化グリコサミノグリカンナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びグリコサミノグリカンから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填材からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告があるが、いずれもカルシウムや骨補填材の様な骨の修復に効果があると見なされている物質が併用されており、硫酸化グリコサミノグリカン単独での効果ではない。更に、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の投与によるカルシウム吸収率や骨強度の増強作用に基づく経口用骨粗鬆症予防及び治療剤（特許文献４）等の報告もされているが、いずれも血液幹細胞から破骨細胞へ向かう分化過程に作用して、破骨細胞の形成を阻止することに関する示唆は無い。
【０００５】
また、破骨細胞分化誘導のメカニズムは、活性化ビタミンD（1α、25(OH)2D3）、副甲状腺ホルモン（PTH）、インターロイキン１１（IL11）、インターロイキン６（IL6）、ＴＮＦα、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）等の骨吸収促進因子による骨芽細胞への作用により骨芽細胞表面上に破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）が発現し（非特許文献４）、一方、破骨細胞の表面にはＯＤＦの受容体であるReceptor activator of NF−Κb（ＲＡＮＫ）が発現しており、ＯＤＦとＲＡＮＫとが結合することが破骨細胞の形成に必要であることが報告されている（非特許文献５）。抑制系としては、種々の細胞より可溶性の骨吸収抑制因子（ＯＣＩＦ）が産生されており、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を競合的に阻害する事により破骨細胞の形成を抑制させることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
更に、慢性関節リウマチや歯周病における骨破壊のメカニズムも明らかにされつつあり、特に、これら骨疾患は、免疫系の関与が大きいことが示唆されており、活性化T細胞によるＯＤＦ発現とそれに伴う破骨細胞形成亢進に起因することが指摘されている（非特許文献７）。また、この様な骨疾患に対しては、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を遮断する物質が有効な治療薬となる可能性があると示唆されている（非特許文献８）。しかし、ＯＤＦのＲＡＮＫへのシグナルを遮断するOsteoprotegerin（ＯＰＧ）は未だ治療剤として上市に至っていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開平６−８０５４６
【特許文献２】
特開平７−５３３８８
【特許文献３】
特開昭６２−２０１８２５
【特許文献４】
特開平７―１０９２２２
【非特許文献１】
Chambers et al (1991) Vitamins Hormones 46,41-86
【非特許文献２】
Suda et alＸ (1992) Endocr. Rev., 13, 66-80 ; Suda et al (1996) In "Principles of Bone Biology (Bilezikian et al.eds)" pp.87-102
【非特許文献３】
Moreland et al (1993) Am.J.Med.Sci., 305(1) 40-51 ; Mebio., 11(2), p.24 (1994)
【非特許文献４】
Yasuda et al(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,3597-3602 ; Lacey et al (1998) Cell 93,165-176
【非特許文献５】
Nakagawa et al(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun, 253,395-400
【非特許文献６】
Tsuda et al. (1996) 生化学 68, 683 ; Tsuda et al. (1997) Biochem Biophys. Res. Commun 234, 137-142 ; Yasuda et al(1998) Endcrinology 139,1329-1337
【非特許文献７】
Teng et al. (2000) J.Clin.Invest,106(6),R59-R67 ; Kong et al(1999) Nature, 402(6759), 304-309
【非特許文献８】
Simonet et al (1997), Cell, 89, 309-319
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、慢性関節リウマチや歯周病等の炎症性骨破壊に起因する疾患や骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防や治療に用いることが出来、安全性の高い、骨疾患治療剤及び破骨細胞形成抑制剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物に、破骨細胞の形成を抑制する作用を見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。本発明の要旨は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有する骨疾患治療剤であり、具体的には、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合して構成するポリ硫酸化フコース及び／又はそれらの薬理学的に許容されうる塩又は硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカン及び／又はそれらの薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有する骨疾患治療剤である。中でも、硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンとしてはウロン酸とヘキソサミンからなる構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上の硫酸化フコビオシル基を有する硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンが挙げられ、更にはＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合した構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上のフコビオシル基を有する硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンなどが好ましく挙げられる。また本発明は、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤を要旨とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物（以下、本発明物質ともいう）とは、該糖化合物の構造中に硫酸化フコース（以下、Fucと記載する場合もある）が化学的に結合したものであり、糖化合物の構造中に硫酸化フコース分子を２つ以上有する糖化合物がより好ましい。また、別の観点から述べると、本発明物質は好ましくは破骨細胞の形成抑制作用を示す、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物であり、当該破骨細胞の形成抑制効果は、例えば、マウス骨髄細胞を用いＰＧＥ２等の骨吸収促進因子を添加することにより破骨細胞の形成を惹起させた実験系を用い、この実験系に被検物質を共存させて、破骨細胞数を計測することで確認する事が出来るが、特にこの実験系でのみ確認される効果では無く、他の破骨細胞分化誘導モデルの実験等においても確認する事は可能である。
【００１２】
本発明物質としては、例えば、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合しているポリ硫酸化フコースや硫酸化フコース２分子からなる硫酸化フコビオシル基を側鎖として有するグリコサミノグリカン等が挙げられる。尚、本発明物質の構造中に存在する全フコース分子のうち少なくとも１つ以上が硫酸化されたフコースであれば良く、本発明物質中に存在するフコースの中には硫酸基を持たないフコースが存在している場合もある。
【００１３】
本明細書における「ポリ硫酸化フコース」とは、硫酸化フコース分子同士が化学的に結合し直鎖構造をなしていても、また、分岐構造をなしていても良い。つまり、本発明物質として用いられるポリ硫酸化フコースは、硫酸化フコース分子同士がα１→３結合（Fucα１→３Fuc）によりグリコシド結合し直鎖状に伸長していることが好ましい。また、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による鎖状構造を主鎖として更に硫酸化フコースからなる側鎖を持つことにより分岐構造をなしていても良く、当該分岐構造における主鎖の硫酸化フコースと側鎖の硫酸化フコースはα１→４結合（Fucα１→４Fuc）によりグリコシド結合していることが好ましい。尚、本発明物質のポリ硫酸化フコースは、側鎖を必ずしも規則的に結合している必要はなく、部分的に側鎖を有するポリ硫酸化フコースも含まれる。
【００１４】
また、ポリ硫酸化フコース中の硫酸化されうる部位としては、結合に関与していないヒドロキシル基が挙げられる。例えば、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による直鎖構造からなるポリ硫酸化フコースにおいては、構成している各硫酸化フコースのＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基が硫酸化されうる部位として考えられ、また、硫酸化フコース分子同士のα１→３結合による主鎖にα１→４結合により側鎖として硫酸化フコースが結合し分岐構造をなしているポリ硫酸化フコースにおいては、主鎖を構成する各硫酸化フコースのＯ−２位のヒドロキシル基や、側鎖である硫酸化フコース分子におけるＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基が硫酸化されうる部位として考えられる。しかし、前述の様に、当該部位の全てが必ずしも硫酸化されているわけではなく、また、必ずしも規則的に硫酸化されているわけでもない。
【００１５】
ポリ硫酸化フコースの分子量は限定されるものでは無いが、その平均分子量は、３,０００〜６０,０００が好ましく、５,０００〜４０,０００がより好ましく、更には７,０００〜３５,０００がより好ましい。また、フコース１分子に対する硫酸基の割合は、平均０．４〜１．０分子が好ましく、より好ましくは平均０．６〜０．８５分子である。
【００１６】
また、硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンとは、Ｌ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸から選択されるウロン酸残基とＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン又はＮ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンから選択されるヘキソサミン残基から成る二糖単位（以下、構成二糖単位とも言う）の繰り返し構造を主鎖の基本骨格とし、側鎖として硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンを示す（以下、ＳＣ―ＧＡＧという）。
【００１７】
尚、本発明における硫酸化フコビオシル基とは、フコースのＯ−２位及びＯ−４位のヒドロキシル基（−ＯＨ）の硫酸（−ＯＳＯ3 ―）化の違いによりフコース１分子中に０〜２個硫酸基を有するフコース残基２残基分がα１→３結合しているフコビオース基であり、下記式（１）で表される。
【００１８】
【化１】
【表１】
つまり、本発明物質として用いられるＳＣ−ＧＡＧとしては、公知のグリコサミノグリカンに側鎖として硫酸化フコビオシル基が結合したものが挙げられる。中でも特に、Ｄ-グルクロン酸（以下、GlcAとも言う）のＯ-１位とN-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン（以下、GalNAcとも言う）のＯ-３位とがβ-グリコシド結合したコンドロイチン硫酸タイプの二糖単位の繰り返し構造を主鎖の基本骨格とし、主鎖を構成するGalNAcのＯ-４位、Ｏ-６位及びGlcAのＯ-３位から選択される位置のヒドロキシル基と硫酸化フコビオシル基のＯ-１位のヒドロキシル基とでグリコシド結合することにより、硫酸化フコビオシル基を側鎖として有する分岐構造を持ったコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカン（以下、ＳＣ−ＣＳとも言う）が好ましく挙げられる。
【００２１】
ＳＣ−ＧＡＧは、１つの硫酸化フコビオシル基側鎖を有する構成二糖単位でほぼ構成されていても、または、硫酸化フコビオシル基側鎖を持たない構成二糖単位と１つ以上の硫酸化フコビオシル基側鎖を有する構成二糖単位が混在して構成されていても良い。つまり、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有するグリコサミノグリカンでも構わない。
【００２２】
例えば、ＳＣ−ＣＳにおいては、主鎖の構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上のフコビオシル基を含有しているのが好ましく、更には平均０．２分子以上含有しているとより好ましく、更には平均０．４分子以上含有しているとより好ましく、平均０．８分子以上含有していると最も好ましい。（尚、本明細書においては、部分的に硫酸化フコビオシル基側鎖を有するコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカンを部分的ＳＣ−ＣＳと言い、構成二糖単位１残基に硫酸化フコビオシル基側鎖をほぼ１分子有する構成二糖単位から成るコンドロイチン硫酸タイプのグリコサミノグリカンをＮＳＣ−ＣＳとも言う。）
【００２３】
ＳＣ―ＧＡＧの平均分子量は、２,０００〜５０,０００であることが好ましく、平均分子量３,０００〜３０,０００がより好ましい。尚、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明物質においても、上記平均分子量の範囲に厳密に限定されるべきものではない。
【００２４】
本発明のＳＣ−ＧＡＧは、通常のグリコサミノグリカンと同様にグリコサミノグリカン部分にも硫酸基を有している。例えば、ＳＣ−ＣＳにおいては、主鎖の構成二糖単位１残基に対する硫酸基の割合は側鎖の硫酸化フコビオシル基の硫酸含量と合わせて平均１．０〜４．０分子が好ましく、更には平均１．３〜３．８分子であるとより好ましい。
【００２５】
また、部分的ＳＣ−ＣＳは後述の試験例に記載のコンドロイチナーゼＡＢＣ（以下、Ｃ−ＡＢＣとも言う）による分解とイオン交換高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）による分析を組み合わせた二糖組成分析において硫酸化フコビオシル基の結合量に反比例してウロン酸１分子とヘキソサミン１分子から成る不飽和二糖が検出されるが、この分析法における不飽和二糖の生成率が０〜７５％が好ましく、０〜５０％であるとより好ましい。尚、ＮＳＣ−ＣＳはこの分析方法にて不飽和二糖生成率０％である。つまり、本発明物質はＣ−ＡＢＣで分解されにくい硫酸化ＧＡＧであることがより好ましい。
【００２６】
本発明物質は、その起源、由来、製法によって特に限定されるものでは無く、本発明物質が有する特性を満たすものであれば、天然資源から抽出、精製したものでも、また、天然資源から抽出され精製して得られた物質を原料として化学的手法等により改変したもの、また、人工的に化学合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。
【００２７】
例えば、ＳＣ−ＧＡＧは、天然資源から得られる硫酸化フコビオシル基を側鎖として有するグリコサミノグリカンでも、天然資源（主として生物体）から得られる硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として部分的に硫酸化フコビオシル基を除去するなどの化学的手法等により改変したもの、及び、天然資源から得られるグリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧともいう）を原料として化学的手法等により硫酸化フコビオシル基側鎖を導入したもの等、若しくは、人工的に化学合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。ＳＣ−ＧＡＧを天然資源から単離精製する場合や天然資源から単離精製された硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として製造する場合に用いる天然資源としては、種、属など特に限定されないが、例えば、棘皮動物が挙げられる。棘皮動物の中でも、好ましくはナマコ類が挙げられ、特に、マナマコ（Sea Cucumber Stichopus japonicus）、クロナマコ（Holthuria atra）、ニセクロナマコ（Holothuria leurospilota）などが挙げられる。
【００２８】
また、本発明物質として用いられるポリ硫酸化フコースを天然資源から単離精製する場合に用いる原料としても、一例として上記と同様のナマコ類が挙げられる。尚、現在、これらナマコ類動物は、ごく一部が食用に供されてはいるが、殆ど利用されていない未利用資源である。
【００２９】
上記の天然資源から硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカン等のＧＡＧ類やポリ硫酸化フコースを単離・精製する方法は、例えば、Carbohydr. Res., 297, 273-279 (1997)や特公平６−７００８５や後述の参考例に記載の方法を用いることが可能であるが、ＧＡＧ類等を生体組織から単離・精製する際に通常用いられる公知の方法を用いる事も可能である。
【００３０】
また、側鎖である硫酸化フコビオシル基の部分的脱離方法としては、本発明物質が有する特性を満たすＳＣ−ＧＡＧが生成する条件での緩和な酸加水分解反応、アルカリ加水分解反応や酵素消化反応が挙げられるが、目的とする部分的ＳＣ−ＧＡＧが得られれば、これらに特に限定はされない。例えば、マナマコより単離・精製した硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカンを原料として、硫酸化フコビオシル基の部分的脱離を行う場合は、０．０５〜０．２Ｎ程度の硫酸、塩酸等の無機酸を用いて、７５〜８５℃程度の条件下で約２〜６時間、酸加水分解を行い、反応後、中和し、分離・精製する方法が挙げられる。
【００３１】
本発明物質の薬理学的に許容されうる塩としては、本発明物質の有する破骨細胞形成を抑制する作用を失うこと無く、また、薬理学的に許容されうる塩であれば、特に限定されない。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などのうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、特にナトリウム塩が好ましい。
また、本発明物質の塩としては、本発明物質の有する破骨細胞の形成を抑制する作用を失わせることの無い塩であれば、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。特にナトリウム塩が好ましい。
【００３２】
本発明物質は、後述の実施例に記載の通り、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成の実験系において、破骨細胞の形成を有意に抑制する。これより、本発明物質は骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患やリウマチ、歯周病の様な炎症性骨疾患等、特に破骨細胞の機能が異常に亢進することにより引き起こされる疾患の予防と治療に用いることが出来る。
【００３３】
本発明物質を上記疾患の予防や治療に用いる場合には、本発明物質の有する作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。本発明物質を含有する骨疾患治療剤の剤型及び投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、液剤、リポ化剤、ゲル化剤、軟膏剤等に製剤化して、経口、注射、塗布等の投与方法が考えられるが、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することが可能である。
【００３４】
尚、本発明物質を含有する骨疾患治療剤の投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、投与対象患者の体重や具体的症状等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、本発明物質として１日当たり概ね０．１mg/kg〜３００mg/kg程度を、１日１回〜数回に分けて投与する事が考えられる。
更に、上述の本発明物質は、破骨細胞形成抑制剤としてin vivo及びin vitroの系でも用いる事が出来る。
【００３５】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
参考例１ ＮＳＣ−ＣＳの製造
マナマコ（Stichopus japonius）の体壁部より、GAG類を生体組織から単離・精製するために用いられる公知の方法（Kariya et al. (1990) J.Biol.Chem.,265, 5081-5085）にて、硫酸化フコビオシルグリコサミノグリカン（ＮＳＣ−ＣＳ）の凍結乾燥粉体２１０ｍｇを得た。
【００３７】
具体的には、原料のマナマコ（Stichopus japonius）の体壁背部をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１,V/V）で不要の脂溶性画分を抽出除去した。抽出残渣を乾燥後、１２０℃、３０分間のオートクレーブ処理に付し、５０ｍmol/lリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し懸濁液とした。この懸濁液に対し、蛋白質１ｇあたり５０ｍｇのアクチナーゼ（科研製薬（株）製）を加え、５５℃にて８時間攪拌し、コラーゲンやコアプロテイン等の共存蛋白質を消化した。酵素消化物を０．４mol/l水酸化ナトリウム、次いで１０％トリクロロ酢酸で順次処理した後、遠心分離（5,000xｇ、１５分）に付し、上清を回収し、流水透析を行った。透析内液に２．５％酢酸ナトリウムを含む冷エタノールを透析内液量の３倍量を添加する事により目的物質を沈殿させ、遠心分離（5,000xｇ、１５分）により沈殿を回収した。回収した沈殿を冷エタノールで洗浄し、得られたペレットを減圧乾燥することにより粗精製物を得た。
【００３８】
得られた粗精製物１．０ｇを少量の５０ｍmol/l炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、その半分量を同溶媒で平衡化したSephadex G-100（Amersham Bioscience社製）を詰めたカラム（直径３．４ｃｍ×長さ１００ｃｍ）に付し、同溶媒にて溶出させ、溶出液を１０ｍＬ毎に回収した。得られた各フラクションにつき紫外部（ＵＶ）２１０ｎｍにおける吸光度の測定、カルバゾール法（Bitter&Muir (1962) Anal. Biochem., 4, 330-334）によるウロン酸含量の測定及びアンスロン法（Dimler, R. L et al. (1952) Anal. Chem., 24, 1411-1414）による中性糖含量の測定を行った。その結果、高分子画分にグリコサミノグリカンと目されるカルバゾール反応陽性の画分を見出したので、これを合一回収し、凍結乾燥により粉末（２２４ｍｇ）を得た。得られた粗精製物の溶液の残り半分量についても同様の操作を行い、合わせて５７４ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物のうち５００ｍｇを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２、Whatmann社製）を詰めたカラム（内径１．８ｃｍ×長さ１８ｃｍ）に付し、同緩衝液中０→１．２Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出した。
【００３９】
８ｍｌ毎に分画回収した各フラクションにつきカルバゾール法によりウロン酸含量の測定およびアンスロン法による中性糖含量の測定を行った。その結果、塩化ナトリウムの０．６mol/l濃度付近に目的物質と目されるピークを見出したので、このピークに該当する画分を合一回収し、流水透析、次いで、凍結乾燥を行い、ＮＳＣ―ＣＳである粉体（２１０ｍｇ）を得た。
【００４０】
ここで得られたＮＳＣ−ＣＳにつき、化学組成分析法による分析を行った。即ち、ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を測定し、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定した。
【００４１】
測定結果より、得られたＮＳＣ−ＣＳ構成成分の重量存在比を算出したところ、公知のナマコ由来グリコサミノグリカン（Kariya et al. (1990) J.Biol.Chem.,265, 5081-5085）とほぼ同等の組成を示した。この公知のナマコ由来グリコサミノグリカンの構造は、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合したコンドロイチンの基本骨格を有するものであり、Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンのＯ-４位かつ／またはＯ-６位、更にはD-グルクロン酸のＯ-３位に硫酸化フコース２残基よりなるフコース側鎖（硫酸化フコビオシル基）がグリコシド結合した構造を有していることが明らかにされており（Kariya et al.(1997) Carbohydr.res.,297,273-279）、本参考例で製造したＮＳＣ−ＣＳも同様の構造であると推測される。
【００４２】
参考例２ 部分的ＳＣ−ＣＳの製造
上記で得られたＮＳＣ−ＣＳを原料として、側鎖である硫酸化フコビオシル基の部分的除去を行い、部分的ＳＣ−ＣＳを製造した。つまり、上記で得られたＮＳＣ−ＣＳ４０ｍｇを０．０５Ｍ硫酸４ｍＬに溶解し、８０℃にて３時間あるいは６時間の加水分解反応にそれぞれ付した。反応は反応混液を室温まで冷却することによって停止させ、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して中和した後、０．２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセルロファインＧＣＬ−９０ｍカラム（内径３．４×１１０ｃｍ；生化学工業（株）製）に付し、溶出液を１０ｍＬ毎に分取した。また、上記方法で得られたＮＳＣ−ＣＳも同様にカラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を１０ｍＬづつ分取した（以下、３時間の加水分解により得られたものを３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ、６時間の加水分解により得られたものを６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳとも言う）。
【００４３】
各カラム溶出液の各フラクションにつき、ウロン酸含量並びに中性糖含量を測定し、溶出液の挙動を比較した（図１）。各カラム溶出液毎、図１に基づき、グリコサミノグリカン画分であるフラクションを合一濃縮し、更に、蒸留水で平衡化したセルロファインＧＣＬ-２５カラム（内径２．０×長さ２５ｃｍ、生化学工業（株）販売）に付し脱塩した後、凍結乾燥処理によって乾燥・回収した。収量は、ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳで、各３４．７ｍｇ、１８．１ｍｇおよび１５ｍｇであった。
【００４４】
ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの各ゲル濾過溶出パターン（図１ａ、図１ｂ、図１ｃ）を分析すると、加水分解を行わないＮＳＣ−ＣＳについては、高分子画分領域にウロン酸及び中性糖のピークがほぼ一致した位置に等しい形状でシングルピークとして観察された。しかし、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは、ＮＳＣ−ＣＳのパターンの中性糖ピークと対応する高分子画分領域の中性糖ピークは大幅に減少し、低分子画分域に中性糖の新しいピークが検出され、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳにおいては、この中性糖の新しいピークは更に顕著に検出されている。
【００４５】
これより、加水分解反応の進行に伴い、ＮＳＣ−ＣＳから側鎖である硫酸化フコビオシル基が加水分解反応時間依存的に脱離している事が示唆される。
【００４６】
参考例１と同様に、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳについて、化学組成分析法を行った。ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定し、各構成成分の重量存在比を算出した（表２）。更に、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出し、ヘキソサミンを１として各成分のモル比を算出し、表３に示した。
【００４７】
【表２】
表２ 各試料の構成成分の重量存在比（Ｗ／Ｗ, ％）
【表３】
表３ 各試料の構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）
（カッコ内の数値はヘキソサミンのモル存在量を１とした場合の各成分のモル比を示す）
３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳいずれもヘキソサミンとウロン酸のモル比がほぼ一定であり、硫酸化フコビオシル基を脱離させる加水分解反応においてもＧＡＧの直鎖基本構造部分は保持されていると推測される。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは構成二糖単位１残基あたりフコビオシル基及び硫酸基が各々０．２９分子及び１．７０分子存在するのに対し、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳでは構成二糖単位１残基あたりフコビオシル基及び硫酸基が各々０．１８分子及び１．０６分子であり、加水分解反応時間依存的に減少しており、上述のゲル濾過溶出パターンの結果を裏付けている。
【００５０】
参考例３ コンドロイチナーゼＡＢＣによる分解
ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ各々についてＣ−ＡＢＣによる消化の度合いをゲル濾過を分離要因とするＨＰＬＣ（以下、ＧＣＰ−ＨＰＬＣとも言う）により測定した。即ち、ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ各々を１０ｍｇ／ｍＬとなる様に蒸留水に溶解し、そのうち２０μＬを０．５ＵのＣ−ＡＢＣ（生化学工業（株）製）を含む酵素溶液１０μＬ（０．４Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．４Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加し、３７℃で１８時間、酵素消化反応を行った。反応混液に蒸留水５０μＬを添加し、沸騰水中で１分間加熱後、遠心分離することにより上清を得た。
【００５１】
このＣ−ＡＢＣ酵素消化物を含む上清を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷＸＬおよびＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬカラム（いずれも内径４．０×２５ｃｍ、Tosoh社製）を上流から順に連結して装着したＧＰＣ−ＨＰＬＣに付し、０．２mol/l塩化ナトリウム溶液のアイソクラティック条件で溶出し、Refractive Indexを指標として検出し、ＨＰＬＣチャートを得た。（図２）
得られたＨＰＬＣチャートのピーク面積から以下の式を用いて各被験物のＣ−ＡＢＣ消化度（不飽和二糖生成率）の見積もりを算出した。下記不飽和二糖生成率の計算式において、全ピーク面積とは、図２のＡ２、Ｂ２、Ｃ２のＣ−ＡＢＣ酵素消化後の各チャートにおける、△Oligo、△Ｄｉ−ｄｉＳ、△Ｄｉ−ｍｏｎｏＳ及び△Ｄｉ−ｚｅｒｏＳの合計ピーク面積を示し、不飽和二糖ピーク面積の和とは、各不飽和二糖ピークの面積の総和（△Ｄｉ−diＳ、△Ｄｉ−monoＳ及び△zeroＳの合計ピーク面積）である。尚、△Oligoとは、Ｃ−ＡＢＣ消化にて二糖単位構造にまで分解されず四糖以上の構造である不飽和オリゴ糖を示す。また、△Ｄｉ−diＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を二つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ−monoＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を一つ有する不飽和二糖を、△Ｄｉ−zeroＳは不飽和二糖単位構造中に硫酸基を持たない不飽和二糖を示す（Anal. Biochem., 177, 327-332 (1989) p.328 Fig.1参照）。
【００５２】
不飽和二糖生成率（％）＝不飽和二糖ピーク面積の和／全ピーク面積 × １００
ＮＳＣ−ＣＳは不飽和二糖成分は検出されず、Ｃ−ＡＢＣにより分解されていないことが確認された。これは、ナマコ由来グリコサミノグリカンに関する公知文献の記載と同様である。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳは不飽和二糖及び不飽和オリゴ糖のピークが観察され、上記式に従い算出される不飽和二糖生成率（％）は各々４６．５％及び６６．３％であった。
【００５３】
参考例４ ポリ硫酸化フコースの製造
ナマコ体壁背部（１０ｋｇ）をミンチ状に処理した後、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）抽出により脂溶性画分を得た。この画分をロータリーエバポレーターを用い減圧下で濃縮・乾固させた。得られた乾固物に蒸留水（３００ｍＬ）を加えて水溶液とした後、４℃にて一晩放置した。次いで、表層に浮遊した脂肪を除去した水溶液に対し冷却下にて３倍量のエタノールを添加し、遠心分離にかけ沈殿物を得た。この沈殿物を少量の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥を行い、低極性と目される多糖類の粗画分（２．４６ｇ）を得た。
【００５４】
この粗画分から１ｇを取り、０．２mol/l塩化ナトリウム水溶液７ｍＬに溶解し、０．２mol/l塩化ナトリウム水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（内径３．４×１１０ｃｍ、Amersham Biosciences社製）に付した。０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて溶出を行い、１２ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍで測定）及び２１０ｎｍ、２８０ｎｍの両波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描いた（図３）。
【００５５】
アンスロン法が陽性であった画分番号４２〜６９を合一した後、ロータリーエバポレーターにて１０ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液を蒸留水で平衡化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ ＧＣＬ−２５カラム（内径３．３×３６ｃｍ、生化学工業（株）販売）に付し、蒸留水による溶出にて１０ｍＬ毎に分画した。得られた４０画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍの波長における吸光度の測定を行い、溶出曲線を描いた。溶出曲線より脱塩が達成している事を確認し、目的物質を含む画分である画分番号１１〜２０を合一して凍結乾燥を行い、中性糖を含む多糖と目される乾燥物を得た（収量１３５．４ｍｇ）。
【００５６】
更に精製する為、得られた乾燥物１００ｍｇを０．１mol/lの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＤＥ５２、Whatmann社製）カラム（内径２．３×１８ｃｍ）に付し、同緩衝液５０ｍｌでカラムを洗浄後、同緩衝液３００ｍＬと１．２Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液３００ｍＬを用いた塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出を行い７ｍＬ毎に分画した。得られた１００画分につき、アンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を描いた（図４）。その結果、画分番号７５〜８１と画分番号８２〜９４にピーク（各々ピーク１、ピーク２と言う）が出現した。各々のピーク毎に合一し、ピーク１に由来する画分（以下、ポリ硫酸化フコースIとも言う、収量１４．２ｍｇ）とピーク２に由来する画分（以下、ポリ硫酸化フコースIIとも言う、収量３３．６ｍｇ）を得た。
【００５７】
参考例５ ポリ硫酸化フコースの物理化学的性状解析
参考例４で製造したポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIにつき、参考例１、２と同様に、ＭＢＴＨ法（Hurst & Settine(1981) Anal.Biochem.,115,88-92）にてヘキソサミン含量を、カルバゾール法（Bitter&Muir(1962) Anal.Biochem.,4,330-334）、イオンクロマトグラフィー並びにアンスロン法（Dimler,R.L et al.(1952) Anal.Cehm.,24,1411-1414）にて各々ウロン酸含量、硫酸イオン含量並びに中性糖含量を測定し、各構成成分の重量存在比を算出した（表４）。また、各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）を算出し、中性糖を１として各成分のモル比を算出した（表５）。
次いで、ゲル濾過―高速液体クロマトグラフィーにより分子量の測定を行った。その結果、ポリ硫酸化フコースIの分子量は９,０００、ポリ硫酸化フコースIIの分子量は３２,０００であった。
【００５８】
【表４】
表４ 各構成成分の重量存在比（重量％）
【表５】
表５ 各構成成分のモル存在量（ｍｍｏｌ／ｇ）
（カッコ内の数値は中性糖含量のモル存在量を１とした場合の各構成成分のモル比を示す）
この結果、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースII共に、硫酸基と中性糖は含有しているが、ヘキソサミンを含有せず、また、ウロン酸も痕跡量のみであり実質的には含有していないと推測され、中性糖を側鎖として有するグリコサミノグリカンでは無いことが確認された。また、ポリ硫酸化フコースI及びIIの中性糖に対する硫酸基の割合は各々０．６９及び０．７９であり、硫酸化の割合は高いことが判明した。
【００６１】
更に、Yasuno,S. et al.(1999)Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,1353-1359に記載された方法に従い、中性糖の同定を行った。すなわち、１０ｍｇ／ｍＬに調製したポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIの各水溶液から各々５０μＬを取り、８mol／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０μＬを各々に添加し封管した。反応混液を１００℃にて３時間加熱することにより、グリコシド結合ならびに硫酸エステル結合を開裂させた。冷却後、遠心分離により反応混液を反応管底部に集め、開管した。ドライエアーを吹き付け溶媒を除去し、２-プロパノール４０μＬをそれぞれに添加し攪拌した。更に、ドライエアーを吹きつけ溶媒を除去することにより、単糖試料を得た。得られた単糖試料につき、２０μＬの蒸留水及び８０μＬの４-アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）試薬を添加した後、封管し、８０℃にて１時間加温し還元アミノ化反応を進行させ、還元末端がＡＢＥＥにて標識された単糖誘導体を作成した。反応終了後、開管し２００μＬの蒸留水並びに２００μＬの塩化メチレンを添加し、激しく攪拌した後、遠心分離を行い上澄み中に還元末端がＡＢＥＥにて標識された上記単糖誘導体を得た。７％アセトニトリルを含む０．２mol/lホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラム（内径４．６ × ７５ｍｍ、Honen社製）を装着した高速液体クロマトグラフィーに、得られたＡＢＥＥ標識化単糖試料を付し、同溶媒のアイソクラティック溶出条件により分析を実施した。尚、用いた単糖標品は、ガラクトース（Gal）、マンノース（Man）、グルコース（Glu）、アラビノース（Ara）、リボース（Rib）、Ｎ-アセチルマンノサミン（ManNAc）、キシロース（Xyl）、Ｎ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、フコース（Fuc）、ラムノース（Rha）、及び、Ｎ-アセチルガラクトサミン（GalNAc）（溶出順）である（図５）。この結果、参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI、ポリ硫酸化フコースII共に含有する単糖はフコースであることが判明した。尚、精製当初、硫酸化ポリフコースI及びIIが脂溶性画分であった理由としては、硫酸化されてはいるが、低極性のメチル基を有するフコース残基を構成成分とする為と考えられる。
【００６２】
参考例６ ポリ硫酸化フコースの構造解析
参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIから各５ｍｇをとり、それぞれを蒸留水で平衡化したAmberlite IR-120カラム（オルガノ（株）社販売、内径１．５×１２ｃｍ）に供した。得られた溶出画分のうちの酸性画分につき、適量のピリジンを添加して中和した後、凍結乾燥に伏してポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIのピリジン塩を得た。それぞれにつき、１ｍｌの１０％蒸留水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、９０℃にて６日間ソルボリシス反応を進行させた。反応は、室温まで冷却することにより停止させ、３倍量の蒸留水を添加した後、２mol/l水酸化ナトリウム水溶液を適量添加してｐＨを９〜９．５に調整した。これを流水に対し一晩透析した後、凍結乾燥することにより、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIの脱硫酸化物をそれぞれ３．０ｍｇ及び３．３ｍｇ得た。
【００６３】
ポリ硫酸化フコースI及びその脱硫酸化物、さらにポリ硫酸化フコースII及びその脱硫酸化物の計４画分から、それぞれ１ｍｇをとりHakomoriの方法（Hakomori, S.(1964) J. Biochem. (Tokyo),55, 205-208）を一部改変したSanfordとConradの方法（Sanford, P.A. & Conrad, H.E.(1966) Biochemistry, 5, 1508-1517）に従ってメチル化誘導体を合成した。得られたメチル化誘導体は、Waegheらの方法（Waeghe et al.(1983) Carbohydr. Res., 123, 281-304）に従って脱塩した。さらに、これらを２モル／Ｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用い１２１℃で加水分解した後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）を用いて還元した。最後に、還元処理により出現した水酸基をアセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテイト（ＰＭＡＡ）を合成した。得られたＰＭＡＡを５０μＬのアセトンに溶解し、そのうち１μＬをＧＣ−ＭＳに付した。ガスクロマトグラフィー−質量スペクトル（ＧＣ−ＭＳ）分析は、Supelco社製ＳＰ２３３０キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ）を装着したJEOL社製HX110A型マススペクトロメーターを用いて、スプリットレスモードで行った。カラムオーブンは、５０℃に２分間保ち、次いで３０℃／分の勾配で１７０℃まで昇温、さらに４℃／分の勾配で２３５℃まで昇温させ、この温度に１５分間保った。
【００６４】
ポリ硫酸化フコースIのクロマトグラムに於いては、８種類のＰＭＡＡが全て観察された（表６）。それらは、2,3,4-tri-O-methyl-fucitol（T-Fuc）、3,4-di-O-methyl-fucitol（2-Fuc）、2,4-di-O-methyl-fucitol（3-Fuc）、2,3-di-O-methyl-fucitol（4-Fuc）、4-O-methyl-fucitol（2,3-Fuc）、3-O-methyl-fucitol（2,4-Fuc）、2-O-methyl-fucitol（3,4-Fuc）、fucitol（2,3,4-fucitol）である。以下の記載に於いては、上記（）内に示したPMAAの略称を用いて説明を進める。
【００６５】
【表６】
表６
ポリ硫酸化フコースIの脱硫酸化物のクロマトグラムはポリ硫酸化フコースIのクロマトグラムとは異なり、ほぼ等量のT-Fuc、3-Fuc及び3,4-Fucの三種類が検出された。従って、ポリ硫酸化フコースIの構造は、Fucα１→３Fucの主鎖から部分的にFucα１→４Fucが枝分かれしていると考えられる（図６）。また、硫酸基が図示したような部位（主鎖においてはＯ−２位、側鎖においてはＯ−２位且つ／又はＯ−４位）に配位しているものと考えられた。
【００６７】
ポリ硫酸化フコースIIのクロマトグラムに於いては、表６に記載の通り、５種類のPMAA（T-Fuc、3-Fuc、2,3-Fuc、3,4-Fuc及び2,3,4-Fuc）が観察された。ポリ硫酸化フコースIIの脱硫酸化物のクロマトグラムはポリ硫酸化フコースIIのクロマトグラムとは異なり、少量のT-Fucと著量の3-Fucのみから成っていた、この結果より、ポリ硫酸化フコースIIの構造は、Fucα１→３Fucの直鎖構造をとり、部分的にＯ−２位且つ／又はＯ−４位の水酸基が硫酸化されていると思われる。
【００６８】
実施例１ ＳＣ−ＣＳの破骨細胞形成抑制実験
ｄｄＹマウス（六週齢雌）の頸骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞／穴となるように播種し、１０―６モル／ＬプロスタグランジンＥ2（以下、ＰＧＥ２という。SIGMA社製）刺激下において、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍＬの濃度になる様に、参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳを添加し、１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳという。べーリンガー社製）含有Minimum Essential Medium Alpha Medium（GIBCO社製、以下、αＭＥＭという。）培地中で７日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養中２、３日おきにＰＧＥ２と上記各濃度のＮＳＣ−ＣＳを新たに添加した１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて培地交換を行った。７日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びfast garnet ＧＢＣ saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase, Leukocyte」（商品名：SIGMA社製、以下、Acid Phosphatase, Leukocyteと言う）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。（図７）
図７の結果より、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成実験系において、ＮＳＣ−ＣＳが用量依存的に破骨細胞の形成を抑制した。１μｇ／ｍＬのＮＳＣ−ＧＡＧ濃度で破骨細胞の形成５０％阻害した。
【００６９】
実施例２ ＮＳＣ−ＣＳ並びに部分的ＳＣ−ＣＳの破骨細胞形成抑制実験
５０μｇ／ｍＬ濃度となるように、参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳ、参考例２で得られた３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳを用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。（図８）
図８の結果より、ＮＳＣ−ＣＳについては、有意な破骨細胞形成抑制効果が確認された。また、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳにおいても、破骨細胞形成抑制効果が認められた。これに比べて、６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの効果は弱かった。
【００７０】
硫酸化フコビオシル基側鎖を多く有するものほど、破骨細胞形成抑制効果は強く発揮された為、同効果の発現には、側鎖である硫酸化フコビオシル基を有する事が重要であると推察される。
【００７１】
実施例３ 硫酸化ポリフコースの破骨細胞形成抑制実験
５０μｇ／ｍＬ濃度となるように参考例１で得られたＮＳＣ−ＣＳ、参考例４で得られたポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIを用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。結果を図９に示す。尚、結果は各穴内における破骨細胞の数によって示し、また、コントロールは被験物質の代わりに１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加した。
【００７２】
図９の結果より、ＮＳＣ−ＣＳと同様に、ポリ硫酸化フコースI、ポリ硫酸化フコースIIにおいても有意な破骨細胞形成抑制効果が確認された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、硫酸化フコースを構造中に有する糖化合物を、骨粗鬆症などの代謝性骨疾患や炎症性骨破壊に起因するＲＡ、歯周病などの疾患に対する治療に有効な破骨細胞形成抑制効果を有する骨疾患治療剤として提供することができる。また、本発明はin vivo及びin vitroにおいて破骨細胞形成抑制効果を有する破骨細胞形成抑制剤を提供する。
【００７４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのセルロファインＧＣＬ−９０ｍカラム溶出液の各フラクションにおけるウロン酸含量並びに中性糖含量を測定したグラフであり、縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、各々ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳの結果である。
【図２】 ＮＳＣ―ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳに於ける、コンドロイチナーゼＡＢＣ消化前後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、縦軸は示差屈折率、横軸は保持時間（分）を示す。Ａ１は、ＮＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ａ２はＮＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は０％である。Ｂ１は３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ｂ２は３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は４６．５％である。Ｃ１は６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化前のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、Ｃ２は６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳのＣ−ＡＢＣ消化後のＧＰＣ−ＨＰＬＣチャートであり、二糖組成率は６６．３％である。
【図３】 多糖類の粗画分のセファロースＣＬ−６Ｂカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２１０ｎｍ、２８０ｎｍにおける吸光度を測定したグラフである。縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。
【図４】 ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム溶出液の各フラクションにおけるアンスロン法による比色定量（６２０ｎｍ）及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定したグラフである。縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号である。
【図５】 ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸フコースIIから得られた還元末端が４−アミノ安息香酸エチルエステルにて標識された単糖誘導体のＨｏｎｅｎｐａｋ−Ｃ１８カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーに付し、得られたチャートである。
尚、Ｅ１は、ポリ硫酸化フコースIから得られたプロファイル、Ｅ２はポリ硫酸化フコースIIから得られたプロファイルである。
Ｓｔｄ．は単糖標品を付した結果であり、各ピークは溶出順にガラクトース（Gal）、マンノース（Man）、グルコース（Glu）、アラビノース（Ara）、リボース（Rib）、Ｎ-アセチルマンノサミン（ManNAc）、キシロース（Xyl）、Ｎ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、フコース（Fuc）、ラムノース（Rha）、及び、Ｎ-アセチルガラクトサミン（GalNAc）である。
【図６】 ポリ硫酸化フコースI（ピーク１由来の画分）の推定構造と、ポリ硫酸化フコースII（ピーク２由来の画分）の推定構造を示す。
【図７】 ＮＳＣ−ＣＳの用量依存的な破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数、横軸はＮＳＣ−ＣＳの添加濃度である。（−）はコントロールの結果を示す。
【図８】 ＮＳＣ−ＣＳ、３時間水解部分的ＳＣ−ＣＳ及び６時間水解部分的ＳＣ−ＣＳによる破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数である。（−）はコントロールの結果を示す。
【図９】 ＮＳＣ−ＣＳ、ポリ硫酸化フコースI及びポリ硫酸化フコースIIによる破骨細胞形成抑制作用を示すグラフである。縦軸はマイクロプレートの１穴における破骨細胞の数である。（−）はコントロールの結果を示す。
Claims (8)
- 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカン及び／又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有する骨疾患治療剤。
- 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンが、ウロン酸とヘキソサミンからなる構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上の硫酸化フコビオシル基を有するものである、請求項１記載の骨疾患治療剤。
- 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンが、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがβ１→３グリコシド結合した構成二糖単位１残基あたり平均０．１分子以上のフコビオシル基を有するものである、請求項２記載の骨疾患治療剤。
- 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンが、以下の（１）及び（２）の特徴を有するものである、請求項３に記載の骨疾患治療剤；
（１）Ｄ−グルクロン酸のＯ−１位とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−３位とがβ−グリコシド結合した二糖単位の繰り返し構造を主鎖の基本骨格としており、かつ、
（２）当該Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−４位及びＯ−６位、並びにＤ−グルクロン酸のＯ−３位から選択される位置のヒドロキシル基と、硫酸化フコビオシル基のＯ−１位のヒドロキシル基とがグリコシド結合することにより、硫酸化フコビオシル基を側鎖とする分岐構造を持つ。 - 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンが、主鎖の構成二糖単位１残基あたり平均０．４分子以上のフコビオシル基を含有するものである、請求項４記載の骨疾患治療剤。
- 硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカンが、主鎖の構成二糖単位１残基あたり平均０．８分子以上のフコビオシル基を含有するものである、請求項４記載の骨疾患治療剤。
- 破骨細胞の形成抑制作用を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨疾患治療剤。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の硫酸化フコビオシル基を有するグリコサミノグリカン及び／又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤。
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