MX2013013325A - Sulfato de controitina similar al de tiburon y proceso para la preparacion del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburón y a un proceso para la preparación del mismo. En particular, la presente invención se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburón, que muestra una cantidad muy baja de 4-sulfato, una densidad de carga alta y una actividad biológica comparable a los sulfatos de condroitina naturales; la invención también se refiere a un proceso para la preparación del sulfato de condroitina similar al de tiburón, proporcionando productividades sustancialmente más altas y mejor reproducibilidad de la calidad del producto. El sulfato de condroitina similar al de tiburón de la invención muestra una alta masa molecular y densidad de carga; su efectividad biológica y anti-inflamatoria in vitro, comparable a aquellas de los productos naturales hacen a este polisacárido potencialmente útil como un fármaco en preparaciones farmacéuticas y productos nutracéuticos.

Description

SULFATO DE CONDROITINA SIMILAR AL DE TIBURON Y PROCESO PARA LA PREPARACION DEL MISMO DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburón y un proceso para la preparación del mismo. En particular, la presente invención se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburón, que muestra una cantidad muy baja de 4-sulfato, una alta densidad de carga y una actividad biológica comparable a los sulfatos de condroitina naturales; la invención también se refiere a un proceso para la preparación del sulfato de condroitina similar al de tiburón.

El sulfato de condroitina (de aquí en adelante CS) , que pertenece a la clase de polisacáridos complejos naturales llamados glucosaminoglucanos (GAGs) , está compuesto de secuencias disacárídas alternadas de residuos diferentemente sulfatados de ácido D-glucurónico (GlcA) y de N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) enlazados por enlaces beta(l —» 3) .

Dependiendo de la naturaleza del disacárido, los CS con diferentes cadenas principales de carbohidratos conocidos. De hecho, incluso si los CS naturales y sintéticos conocidos están principalmente compuestos de diversos porcentajes de dos tipos de unidades disacáridas, es decir, sulfatadas en la posición 4 ó 6 de GalNAc, los REF.244935 disacáridos con un número de posición diferente de grupos sulfato pueden estar localizados, en diversos porcentajes dentro de las cadenas polisacáridas . Por ejemplo, el disacárido no sulfatado está presente, en general en bajas cantidades, en la cadena principal de CS, mientras que los disacáridos disulfatados que tienen dos grupos sulfato 0- en diversas posiciones, tales como 2 de GlcA y 6 de GalNAc (disacárido D) , o en la posición 4 y 6 de GalNAc (disacárido E) , pueden estar presentes en la cadena principal de CS en diversos porcentajes en relación a las fuentes animales específicas [Volpi N. , J Pharm Pharmacol 61 , 1271 , 2009. Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007].

El CS muestra una unidad repetida disacárida que tiene la siguiente fórmula estructural : en donde R2, R4 y R6 son independientemente ya sea H 3-° so El significado de algunos de los acrónimos más recurrentes, actualmente utilizados para identificar brevemente los residuos sulfatados de manera diferente de las secuencias disacáridas alternadas que constituyen CS, se reportan en seguida.

Di-OS (R2=H; R4=H; R6=H) DÍ-6S (C) (R2=H; R4=H; R6=S03~) DÍ-4S (A) (R2=H; R4=S03"; R6=H) Di-4,6diS (E) (R2=H; R=S03~; R6=S03-) 5 Di-2,6diS (D) (R2= S03-; R4=H; R5=S03-) Di-2,4diS (B) (R2= S03-; R4=S03-; R6=H) Di-2,4,6triS (R2= S03-; R4=S03-; R6=S03-) Las muestras de CS naturales y sintéticas pueden ser caracterizadas y diferenciadas por medio de 10 procedimientos analíticos sensitivos, específicos, validados y publicados, capaces de dar la caracterización estructural y los parámetros de CS (por ejemplo, grupos sulfatados específicos, densidad de carga, masa molecular, y pureza) así como las actividades biológicas. 15 Las muestras de CS extractivas naturales pueden ser caracterizadas para la estructura y las propiedades [Volpi N . , J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi . , J Pharm Sci 96, 3168, 2007; Mucci A. et al., Carbohydr Polymers 41, 37, 2000; Volpi N. , Analyt Biochem 277, 19, 2000] . 2Q Respecto a las formas tri- y tetra-sulfatadas de CS ("triS" y "tetraS", respectivamente) , se puede hacer notar que éstas son inusualmente detectadas en muestras de CS extractivas naturales, mientras que éstas típicamente caracterizan el CS sintético; Di-2, , 6-triS es tomado cómo un j¡- estándar con el fin de evaluar la presencia de tris CS en productos de CS sintéticos ya que las otras formas de tris teóricamente posibles no están presentes en los productos naturalmente derivados .

La siguiente Tabla 1 ilustra los principales disacáridos identificados en las muestras naturales de CS i extraídas y purificadas de diversos órganos y tejidos, principalmente cartílagos.

Tabla 1 Mn = peso molecular promedio en número; Mw = peso molecular promedio en peso; índice de Polidispersión = Mw/Mn; la densidad de carga es el número de grupos sulfato per unidades disacáridas) ; ND = No Detectado La Tabla 1 ilustra los parámetros estructúrales principales para la caracterización de las muestras principales de CS natural purificadas de diversas fuentes.

En particular, los parámetros de masa molecular son muy similares para las muestras de CS terrestres (muestras bovinas, porcinas y de pollo) , mientras que son muy diferentes de las muestras de peces (muestras de tiburón, 5 raya y calamar) , teniendo las últimas, valores de masas moleculares mayores que las primeras .

Además, las muestras de CS de peces tienen valores de densidad de carga peculiares, mayores de aproximadamente 1.0, debida a la presencia de disacáridos disulfatados y 10 diferentes de las muestras terrestres que tienen valores de densidad de carga menores de aproximadamente 1.0, debido a la ausencia de los disacáridos disulfatados.

Una peculiaridad adicional de todos los CS naturales es que cuando son digeridos con condroit inasa ABC, 15 una enzima hidrolítica específica ya sea para disacáridos sulfatados 4S o 6S, así como para los disacáridos no sulfatados, la cadena polisacárida es completamente digerida en unidades disacáridas. Esto puede ser fácilmente observado con el análisis de Electroforesis de Carbohidratos Asistida 2Q por Fluróforo (FACE, por sus siglas en Inglés) . La digestión completa de CS natural es debida a la ausencia de estructuras tri- y tetra-sulfatadas en la cadena polisacárida. Los disacáridos tri- y tetra-sulfatados , si están presentes, no son reconocidos por la condroitinasa ABC, no permitiendo una ye digestión completa del polisacárido, esto produce parcialmente cadenas oligosacáridas no digeridas fácilmente determinadas en el análisis FACE.

Finalmente, debido las vías biosintéticas , ¡todos los CS naturales conocidos muestran la presencia 5 contemporánea de disacaridos monosulfatados en la posición 4 y en la posición 6 de GalNAc (con el disacárido 4 -sulfatado nunca menor de 30%) , incluso si su proporción ¿ambia dependiendo de la fuente.

Como se ilustró anteriormente, CS es una 0 macromolécula heterogénea muy compleja que tiene estructura y propiedades variables, dependiendo de la fuente de extracción.

Además, como resultado de los pro icesos biosintéticos relacionados a los tejidos y a las especies, CS 5 con diferentes grados de polimerización pueden; ser biosintetizados produciendo macromoléculas que tienen diversas masas moleculares y polidispersión diversas. Debido a estas variaciones estructurales, y además de la posible presencia de secuencias oligosacáridas específicas, y la Q pureza de las preparaciones para aplicaciones en terapia o en productos nutracéuticos , los CS pueden tener diferentes propiedades y capacidades.

De hecho, han sido reportadas diferentes y peculiares actividades dependiendo de la estructura cié CS ¡- [Volpi . , Biomaterials 23, 3015, 2002; Volpi N. et: al., Biochimie 81, 955, 1999; Volpi N. , Bioraaterials 20, 1359, 1999; Suzuki S. et al . , J Biol Chem 243, 7, 1968].

El CS extractivo natural es actualmente recomendado por la Liga Europea Contra el Reumatismo (EULAR, por sus 5 siglas en Inglés) como Fármaco de Acción Lenta Sintomático para la Osteo Artritis (SYSADOA, por sus siglas en Inglés) en Europa en el tratamiento de OA de rodilla [Jordán KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1 145, 2003], cadera [Jordán KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1 145, 2003] y mano [Zhang W. et al., Ann Rheum 10 Dis 66, 377, 2007] con base en la evidencia de investigación y en el meta-análisis de numerosos estudios clínicos.

Además, CS solo o en combinación con otros ingredientes, es ampliamente utilizado como un producto nutracéutico, principalmente en Europa y en los Estados 15 Unidos [McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N. et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi M. et al., Separation Se 1, 22, 2009] .

La efectividad de CS está estrictamente relacionada a su actividad anti - inflamatoria, tal como su habilidad para 2Q inhibir la actividad de las enzimas degradativas como la elastasa leucocitaria humana (HLE, por sus siglas en Inglés) [Ronca F. et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998. Egea J. et al., Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 1, S24, 2010] . jr CS utilizado mundialmente en aplicaciones farmacéuticas o nutracéuticas es obtenido por la extracción de tejidos de diversos animales tales como bovinos y porcinos [Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998] > aves [Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002], peces 5 cartilaginosos [Sugahara K. et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003], etd .

Incluso, el origen animal de estos productos impone problemas potenciales de seguridad a los consumidores, asociados con la posible presencia de agentes infecciosos 0 transmisibles, tales como aquellos que provocan las encefalopatías espongiformes en bovinos, o una restricción de uso relacionada a asuntos religiosos.

Además, la naturaleza extractiva de estos productos hace su suministro potencialmente no confiable en vista de 5 una demanda creciente y volúmenes del mercado cada vez mayores .

Tales consideraciones . han promovido la investigación para fuentes alternativas, más dependientes de CS, un ejemplo de lo cual es la producción biotecnológica que Q comienza a partir del polisacárido capsular K4 de E. coli como se describe en la literatura científica y de patentes.

En este contexto, el término producción biotecnológica se refiere a un método de producción donde una porción sustancial de producto final es producida por un r microorganismo, o por células aisladas de un organismo superior, o un sistema de cultivo artificial, comúnmente y variadamente denominado como fermentación.

Básicamente, han sido utilizados tres procedimientos principales hasta ahora en la técnica.

El primero puede ser identificado con la producción de productos similares a CS utilizando como el material inicial el' polisacárido capsular K4 de E. coli 05:K4:H4, el cual es luego sometido a transformación química, mientras que el segundo procedimiento puede ser observado como la biosíntesis directa de compuestos similares a CS por microorganismos, y el tercer reconocido es la producción biosintética de condroitina no sulfatada, seguido por la sulfatación química o bioquímica.

La patente Europea EP-A-1304338 , que pertenece al primer procedimiento anteriormente mencionado, describe la producción de CS comenzando a partir del polisacárido K4 producidos en cultivos líquidos, que es primeramente extraído y purificado, y subsecuentemente re-disuelto y sometido a hidrólisis ácida, el efecto principal de lo cual es la eliminación de los residuos de fructosa enlazados a los residuos de GlcA presentes en el polímero lineal. Un efecto secundario es la hidrólisis parcial de la cadena polisacárida, lo que conduce a productos de menor, masa molecular. Subsecuentemente, el polímero des-fructosilado que es idéntico a la condroitina no sulfatada, es sulfatada de manera diversa en las posiciones C-4 o en las posiciones C-6 de los residuos de GalNAc por medios químicos utilizando grupos protectores apropiados en las posiciones 4 ó 6. También, un CS es descrito en la presente, al menos 70% de su 5 contenido que consiste de mono- y/o di-sulfatado en las posiciones 4 y 6 de la porción galactosamina, la posición 2 de la porción glucurónica que está no sulfatada, que tiene un Mw de 6-25 kDa y una proporción de grupo carboxilo/sulfato (es decir, densidad de carga) de 0.7-2.0. 0 El documento O 2009/149155, que ejemplifica el segundo procedimiento anteriormente mencionado, describe la producción directa de compuestos similares a CS por diversos microorganismos, tanto bacterias como hongos. Un compuesto similar a CS terrestre es también descrito en la presente, 15 las posiciones 4 y 6 de la porción galactosamina que están sulfatadas; se reporta que el compuesto muestra un peso molecular (Mw) de aproximadamente 300 Da hasta 35 kDa y una proporción de sulfato 4S/6S en el intervalo de desde mefios de 1 hasta más de 1. 2Q El tercero de los procedimientos anteriormente descrito incluye diversas estrategias diferentes paira la producción de la condroitina no sulfatada, las principales de las cuales son las síntesis enzimáticas del polímero en sistemas libres de células, como aquellos descritos por -,? ejemplo en las patentes Europeas EP-A-1950308 y EP-A-1964924, y la biosíntesis en células recombinantes obtenidas que se expresan en hospederos capaces de producir, a partir de UDP- GIcA, los genes kfoA y kfoC extraídos de E. coli K4 descrito, por ejemplo, en el documento WO 2008/133350. 5 Otro ejemplo más de la producción biosintética de condroitina no sulfatada es descrito por la solicitud de patente Italiana No. MI2010A001300 la cual, entre otras cosas, se refiere a un método para la producción biotecnológica de condroitina, que comprende cultivar en un 0 medio adecuado un microorganismo recombinante , preferentemente Escherichia coli DSM23644, recuperando y purificando la condroitina no sulfatada presente en el cultivo microbiano y sulfatando químicamente subsecuentemente la última. Una característica común para el proceso para la 5 producción de CS descrito hasta ahora es una reducción sustancial de la masa molecular del material original durante la eliminación catalizada por ácido de los residubs de fructosa y durante los pasos de síntesis químicas requeridas para la sulfatación de los residuos de GalNAc.

Q Como un ejemplo, la patente Europea EP-A-1304338 describe un CS de masa molecular de 6-25 kDa mientras que la masa molecular del polisacárido K4 , utilizado como el material inicial, se describe que es de 150-400 kDa.

Un primer aspecto de la presente invención es un ? sulfato de condroitina similar al de tiburón, libre de los disacáridos tri-, tetra- y 2 , 4-di-sulfatados, consistente de 60-99% de 6 -sulfato, 0.5-30% de 2 , 6-disulfato, 0.1-5% de 4,6- disulfato, 0.1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4- sulfato, siendo expresados todos los porcentajes con respecto 5 al contenido total de disacárido del sulfato de condroitina similar al de tiburón, mostrando el último un peso molecular promedio en número (Mn) de 40-85 kDa y un peso molecular promedio en peso (Mw) de 50-95 kDa.

Preferentemente, el sulfato de condroitina similar 10 al de tiburón de la presente invención consiste de 70-90% de 6-sulfato, 8,5-20% de 2 , 6-disulfato, 0.1-5% de 4 , 6-disulfato, 0.1-5% de condroitina no sulfatada y 0.1-1% de 4-sulfato, siendo expresados todos los porcentajes con respecto al contenido total de . disacárido del sulfato de condroitina 15 similar al de tiburón, mostrando el ultimo un peso molecular promedio en número (Mn) de 40-65 kDa y un peso molecular promedio en peso (Mw) de 50-70 kDa.

El objetivo CS de la presente invención es caracterizado por una alta masa molecular y por grupos 2Q sulfatados peculiares, principalmente en la posición 6, así como por una cantidad muy pequeña de disacárido 4 -sulfatado.

Examinando las características del CS de la presente invención y comparándolas con aquellas mostradas en la Tabla 1 anterior con relación a las muestras de CS yr extractivas naturales, se puede observar que el CS de la presente invención se asemeja aproximadamente al CS de tiburón.

También, el CS objeto de la presente invención no muestra polisacáridos polisulfatados , en particular no muestra ni disacáridos tri- ni tetra-sulfatados que caracterizan típicamente el CS obtenido por los métodos sintéticos descritos en la técnica anterior y detectables, después de la digestión con condroitinasa ABC, como un producto no degradado.

Además, el CS objeto de la presente invención resulta estar altamente purificado (con base en la cantidad del producto no degradado después de la digestión con condroitinasa ABC) y se distingue evidentemente del CS descrito en la patente Europea EP-A-1304338 que tiene una masa molecular de 6-25 kDa y una alta cantidad de condróitina no sulfatada (> 10%) y amplio intervalo de densidad de carga (0.7-2) mientras que los intervalos de la densidad de carga del CS de la invención son más estrechos y se remontan preferentemente hasta 1.05-1.30.

El Mn y el Mw pueden ser calculados de acuerdo a los métodos comunes conocidos por las personas expertas en la técnica; por ejemplo la Cromatografía de Exclusión de Tamaño de Alta Resolución (HPSEC, por sus siglas en Inglés) ; preferentemente, el Mn y el Mw pueden ser determinados por HPSEC, equipado con el software especializado integrado para la Cromatografía de Permeacion en Gel (GPC, por sus siglas en Inglés) .

Preferentemente, la suma de 2 , 6 -disulfato y 4,6- disulfato en el CS de la presente invención representa 10-25% 5 del contenido total de disacárido.

De acuerdo a otro aspecto más, la presente invención se refiere a una composición que comprende el sulfato de condroitina similar al de tiburón de la presente invención, y un portador farmacéutica o nutracéuticamente Q aceptable tal como, por ejemplo, celulosa microcristalina, dextrina, maltodextrina, ciclodextrina, sulfobutiléter de beta-ciclodextrina, lecitina de soya, ácido palmitoleico, liposomas, ésteres de sacarosa, y similares.

Como la persona experta entenderá con base en el 5 conocimiento general común del campo, la composición de la invención puede ser formulada en diversas formas, ya. sea sólida (es decir, tabletas, cápsulas duras, cápsulas de gel blandas) o líquidas (por ejemplo, soluciones o mezclas para beber en polvo) , preferentemente en la forma de una Q preparación farmacéutica y/o nutracéutica parenteral y/u oral, y puede comprender además otros ingredientes inactivos y/o activos.

Entre tales ingredientes adicionales, la composición de la invención puede también y preferentemente r comprende al menos una de las siguientes sustancias: clorhidrato de glucosamina, sulfato de glucosamina, N-acetil- glucosamina, ácido hialurónico, heparina, querátina, dermatina, metilsulfonilmetano, folatos o folatos reducidos, vitaminas del grupo B, S-adenosilmetionina (SAMe) , ¡ácido 5 ascórbico o ascorbato de manganeso, y pueden ser administrados en una cantidad efectiva a un sujeto en necesidad de los mismos, dependiendo de las necesidades y las circunstancias que el caso pueda requerir.

A manera meramente de ejemplo, el CS similar al de 10 tiburón y/o la composición de la presente invención pueden ser administrados en una cantidad de 100-3000 mg/día, preferentemente en una cantidad de 1000-2000 mg/día, más preferentemente en una cantidad de 1200-1800 mg/día, en general dividida en dos/tres dosis por día. 15 De acuerdo a otro aspecto más, la présente invención se refiere al sulfato de condroitina similar al de tiburón o la composición de la presente invención, para el uso en la prevención o tratamiento de la osteoartritis , o para el mantenimiento de la salud musculoesquéletica , por 2Q ejemplo, como un ingrediente activo ya sea como en un fármaco o en un aditivo alimenticio o en suplemento nutricional.

Meramente a manera de ejemplo, el CS similar al de tiburón o la composición de la presente invención, como se definió anteriormente, puede ser utilizado para la ¦ye preparación de un medicamento, un aditivo alimenticio o un suplemento nutricional, para la prevención y/o el tratamiento de la osteoartritis (OA) de cadera, mano y rodilla y sus síntomas principales tales como el dolor, hinchazón de las articulaciones, inflamación, enfermedad de Alzheimer, 5 infecciones microbianas, arterioesclerosis , osteoporosis y como un adyuvante en la terapia contra el cáncer y la regeneración de tejidos, incluyendo la regeneración del tejido nervioso.

De acuerdo a otro aspecto adicional, la presente 10 invención se refiere a un proceso para preparar la condroitina similar al de tiburón, anteriormente definida, que comprende : a) salificar la condroitina no sulfatada, como ácido libre, previamente disuelta en un ambiente acuoso, con una sal 15 seleccionada del grupo que consiste de tetramétil-, tetraetil- y tetrabutil-, amonio o piridinio; b) secar la condroitina no sulfatada salificada, que resulta del paso a) hasta 5-15% de contenido de agua; c) secar la condroitina no sulfatada salificada^ que 2Q resulta del paso b) , a una temperatura de 100°C-170°C, , hasta un contenido de agua de 0.1-3%; d) sulfatar selectivamente la posición 6 de la condroitina no sulfatada salificada resultante del paso c) , solubilizada en N-metil-pirrolidona dimetilformamida, a una temperatura de ye- 0°C-30°C, por la adición de 1-2 equivalentes del complejo de trióxido de azufre-piridina , o el complejo de trióxido de azufre-dimetilformaraida, a intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que es agregado un total de 2-15 equivalentes del complejo de trióxido de azufre-piridina o del complejo de 5 trióxido de azufre-dimetilformamida ; dejando la solución resultante bajo agitación por 2-24 horas; e) apagar la reacción llevada a cabo en el paso d) cón una solución acuosa de bicarbonato o carbonato de sodio, filtrando y concentrando hasta la sequedad la solución 0 resultante para obtener un sólido seco; f) disolver el sólido seco en una solución acuosa de cloruro de sodio, ultrafiltrando y dializando la solución resultante ; g) recuperar el producto de la solución resultante del paso 5 f); h) purificar el producto resultante del paso g) , y obtener el último ya sea en forma ácida o la sal de sodio del mismo; i) recuperar el producto resultante del paso h) .

La salificación de la condroitina no sulfatada en Q el paso a) es preferentemente llevada a cabo con una sal seleccionada del grupo que consiste de tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-amonio, lo más preferentemente con tetrabutil-amonio mientras que el caso de la condroitina no sulfatada en el paso b) puede ser llevada a cabo mediante ,- liofilización o secado por rocío.

El secado de la sal de condroitina no sulfatada en el paso c) es preferentemente llevada a cabo hasta 0.5^2% de agua, mientras que la solubilización de la sal de condroitina no sulfatada que resulta de dicho paso es preferentemente 5 llevada a cabo en dimetilformamida .

La sulfatación selectiva en el paso d) es preferentemente llevada a cabo agregando un total de 6-12, más preferentemente 6-9, equivalentes de complejo de trióxido de azufre-piridina . 10 Alternativamente, cuando la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo por el complejo del trióxido de azufre-dimetilformamida, se agregan un total de 1-9, preferentemente 2-4, equivalentes.

Además, la sulfatación selectiva en el paso d) es 15 preferentemente llevada a cabo a una temperatura de 10°C-20°C mientras que, al final del paso d) , la solución resultante es preferentemente dejada bajo agitación por 2-6 horas.

De acuerdo a otra modalidad preferida adicionál del proceso de la invención, el producto de la solución 2Q resultante del paso f) es recuperado mediante liofilizáción, secado por rocío o precipitación en un ambiente alcohólico.

El proceso de la invención permite el mantenimiento sin cambio del peso molecular del polisacárido nativo.

Sorprendentemente, el proceso de la invención ¦y¡- permite evitar llevar a cabo cualquier paso dirigido a proteger cualquiera de los grupos hidroxilo secundarios, probablemente debido a la reactivad de los grupos hidroxilo primarios en la posición 6 del GalNAc, lo que garantiza la selectividad de la reacción.

Además, el proceso de la invención permite obtener una productividad sustancialmente más alta y una mejor reproducibilidad de la calidad del producto en comparación con la técnica anterior; por ejemplo, con respecto a la patente Europea EP-A-1304388 , donde los pasos de sulfatación dan como resultado un intervalo más amplio de proporción de grupos carboxilo/sulfato, que se remontan hasta 0.7-2.0.

También, el proceso de la invención permite obtener un producto que muestra cantidades muy bajas de disacárido 4-sulfatado, sustancialmente libre de disacáridos polisulfatados ; en particular, éste permite obtener un producto libre ya sea de sacáridos tris o tetraS.

Típicamente, el proceso de la invención puede ser llevado a cabo mediante la disolución de la condroitina no sulfatada, como ácido libre o la sal de sodio, preparada por ejemplo mediante la desfructosilación del polímero capsular K4 obtenido mediante fermentación, como se describe por Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) y Rodríguez (Eur. J. of $iochem 177, 117-24, 1988), en un ambiente acuoso.

En el caso en que la condroitina no sulfatada esté bajo la forma de su sal de sodio, después de su disolución completa, la solución resultante es eluida, convenientemente a temperatura de 0°C-30°C, en una columna que contiene una resina de intercambio catiónico (tal como, por ejemplo, Amberjet 1200 H, Rohm y Haas y similares) recolectando las porciones eluidas convenientemente a un pH de 1.5-4.0, preferentemente 1.5^3.0, y recuperando las porciones ácidas acuosas.

Alternativamente, este paso puede ser llevado a cabo en lotes; después de la disolución de la sal de sodio de condroitina no sulfatada, en agua, la cual es preferentemente obtenida mediante agitación 20-60 minutos a 0°C-30°C, la resina catiónica (Amberjet 1200 H, Rohm y Haas y similares) es agregada a ésta, el pH de la solución después de la adición de la resina resulta que está entre 1 .5 y 3.0. La solución es luego filtrada y el filtrado ácido resultante es recolectado.

La solución ácida de la condroitina no sulfatada, obtenida ya sea directamente disolviendo la condroitina no sulfatada como ácido libre o purificando su solución de sal de sodio como se describió anteriormente, ya sea en forma continua o en lotes, es luego agregada con una solución acuosa de ion seleccionado del grupo que consiste de tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-, amonio o piridinio, convenientemente hasta un pH de 6.0-8.0, preferentemente 6.0-7.0, la solución es evaporada hasta sequedad, por ejemplo, mediante liofilización o secado por rocío, hasta un contenido de agua de 5-15%, para recuperar así la sal de condroitina correspondiente.

La sal de condroitina resultante es luego sometida a un segundo paso de secado, a una temperatura de 100°C 170°C, hasta un contenido de agua de 0.1-3%, para recuperar así finalmente la sal de condroitina no sulfatada, correspondiente. 5 La sal de condroitina no sulfatada, correspondiente, obtenida como se describió anteriormente, es luego selectivamente sulfata en la posición 6, sin la necesidad de proteger ninguna de las porciones funcionales, al solubilizar ésta en un solvente seleccionado de N-metilpirrolidona o dimetilformamida, a una temperatura de 0°C- 10 30°C, preferentemente 10°C-20°C, eluyendo convenientemente la sal de condroitina no sulfatada, completamente disuelta, en una columna que contiene una resina de intercambio catiónico (tal como, por ejemplo, Amberjet 1200 H, Rohm y Haas y similares) , por la adición de 1-2 equivalentes del complejo 15 de trióxido de azufre-piridina o del complejo de trióxido de azufre-dimetilformamida, a intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que es agregado un total de 2-15 equivalentes del complejo de trióxido de azufre-piridina o dimetilformamida, dejando la solución resultante bajo agitación por 2-24 horas, 2Q preferentemente 2-6 horas.

La masa de reacción resultante es después de esto apagada en una solución acuosa de bicarbonato o carbonato de sodio, y luego recuperada, por ejemplo mediante tratamiento con bicarbonato de sodio y filtración de las sales insolubles ->r resultantes, evaporada hasta sequedad y luego nuevamente disuelta en una solución acuosa de cloruro de sodio, recuperada y finalmente tratada, por ejemplo mediante ultrafiltración y diálisis, para eliminar así las sales remanentes y las impurezas de bajo peso molecular, y finalmente recuperando el producto, por ejemplo, mediante liofilización, secado por rocío o precipitación en un ambiente alcohólico.

El 6-sulfato de condroitina resultante obtenido como se ilustró anteriormente es luego purificado, por ejemplo mediante cromatografía en columna de resina de intercambio catiónico, para obtenerla así en su forma ácida, y posiblemente subsecuentemente obtenida como la sal de sodio del mismo por la adición, por ejemplo, de hidróxido de Sodio.

El 6-sulfato de condroitina obtenido así es finalmente recuperado, por ejemplo secándolo en un horno, a vacío, a 50°C-70°C o cromatográf icamente purificado, obteniendo un sulfato de condroitina similar al de tiburón, libre de disacáridos tri-, tetra- y 2 , 4 -di - sulfatados , que muestran un Mn de 40-85 kDa, un Mw de 50-95 kDa.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Salificación 20 g de sal de sodio de condroitina, preparada mediante la desfructosilación del polímero capsular K4 obtenido mediante fermentación como se describe por Mánzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) y Rodríguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998) fueron disueltos en 500 mi de agua desmineralizada. Después de la disolución completa, la solución resultante fue eluida a 5°C en una columna que contenía una resina de intercambio catiónico (160 mi de Amberjet 1200 H, Rohm y Haas) , previamente hidratada y preparada en forma acida. Las porciones eluidas fueron recuperadas a un pH de 1.9, recolectando las porciones ácidas acuosas y agregando a éstas una solución acuosa al 16% de tetrabutilamonio, hasta un pH de 7.0; la solución fue luego evaporada hasta sequedad mediante liofilización para recuperar así 20.8 g de condroitina como la sal de tetrabutilamonio.

La sal resultante fue luego sometida a un segundo tratamiento térmico en un secador estático a 105°C por 4 horas, a vacío, hasta una humedad residual de menos de 0.2%. Se obtuvieron así 18.5 g de condroitina como la sal de tetrabutilamonio .

Ejemplo 2 Salificación 12 g de la condroitina no sulfatada preparada mediante la desfructosilación del polímero capsular K4 obtenido mediante fermentación como es descrito por Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) y Rodríguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998) se disolvieron en 20 mi de agua desmineralizada y, después de haber acidificado hasta pH 2.5 por adición de HCl 1M y agregado 80 mi de etanol, la condroitina no sulfatada fue precipitada como el ácido libre.

Después de la filtración y lavado con etanol, se obtuvieron 10.3 g del producto como un sólido blanco que, después de haber sido secado a vacío a 50°C, mostró un título de ácido de 90%, calculado sobre el producto per se y contenía 8% de agua residual. El sólido resultante fue suspendido en 20 mi de agua y adicionado con 40% de solución acuosa p/p de hidróxido de tetrabutilamonio hasta pH 8,. La solución resultante fue luego liofilizada hasta un contenido de agua residual de 2.5%, para obtener así 15.9 g de condroitina sólida como la sal de tetrabutilamonio.

La sal resultante fue luego sometida a un Segundo tratamiento térmico en un secador estático a 105°C por 4 horas, a vacío, hasta una humedad residual de menos de 0.2%. Se obtuvieron de este modo, 15.4 g de la tetrabutil-condroitina .

Ejemplo 3 Sulfatación 1.4 g de tetrabutil-condroitina obtenida como se ilustra en el Ejemplo 1 y 84 mi de DMF se cargaron en un matraz de cuatro bocas de 250 mi, mantenido bajo una atmósfera inerte (N2) , agitación mecánica y en presencia de un sistema de enfriamiento por burbuja, trampa de cloruro de calcio y termómetro.

La suspensión resultante fue dejada bajo agitación hasta la disolución completa, ajustando subsecuentemente la temperatura a 23 °C.

Una vez que la temperatura fue ajustada, el complejo sólido de trióxido de azufre-piridina fue agregado en porciones (1.07 g, 3 equivalentes) a la solución, 5 manteniendo la reacción bajo agitación por 1 hora y luego agregando posteriormente el complejo de trióxido de aziufre- piridina sólido (1.07 g; 3 equivalentes). Después de 1 hora adicional a la misma temperatura, la mezcla de reacción se transfirió a un matraz de 500 mi, que contenía una solución 0 saturada de carbonato ácido de sodio y se enfrió a 10 °C.

Después de haber dejado que la temperatura se elevara hasta 20°C, la filtración sobre un embudo Buchner fue llevada a cabo, recuperando el filtrado y evaporando hasta sequedad a vacío. 5 El sólido seco resultante (2.3 g) fue finamente molido y re-disuelto en una solución de cloruro de sodio al 0.3M (130 mi), sometiendo la solución así obtenida a ultrafiltración utilizando una membrana de corte de 3 kDa y manteniendo el pH del retenido a 7.0. La solución Q ultrafiltrada fue luego dializada mediante eliminación de las sales, recuperando el producto mediante liofilización .

El producto resultante fue finalmente secado a 50°C y 10 mbar, hasta que se obtuvo 1 g de la sustancia, mostrando un título (calculado al determinar la Detección Amperométrica r pulsada por ácido glucurónico "PAD") de 95%, un Mn de 60 kDa y un Mw de 67.3 kDa, determinado mediante cromatografía de exclusión de tamaño de alta resolución (HPSEC) equipado con un software especializado integrado para GPC.

Ejemplo 4 Sulfatación 1.21 g de condroitina como la sal de tetrabutilamonio, obtenida como se ilustra en el Ejemplo 1, y 72 mi de DMF fueron cargados dentro de un matraz de cuatro bocas de 250 mi, mantenido bajo una atmósfera inerte (N2) , con agitación mecánica y en presencia de un sistema de enfriamiento por burbuja, trampa de cloruro de calcio y termómetro.

La solución resultante fue dejada bajo agitación hasta la disolución completa, ajustando subsecuentemente la temperatura a 10 °C.

Una vez que la temperatura fue ajustada, el complejo de trióxido de azufre-DMF sólido fue agregado (0.88 g, 3 equivalente) a la solución, manteniendo la reacción bajo agitación por 1 hora. Se agregó luego carbonato ácido de sodio (0.97 g, 6 equivalente) manteniendo la misma temperatura, y la agitación se continuó por 1 hora habiendo dejado que la temperatura se elevara a 20°C. La suspensión resultante fue filtrada sobre un embudo Buchner y el filtrado recuperado fue evaporado hasta sequedad a vacío.

El sólido seco resultante (2.05 g) fue finamente molido y re-disuelto en una solución de cloruro de sodio 0.3M (130 mi) , sometiendo la solución obtenida así a ultrafiltración utilizando una membrana de corte de 3 kDa y manteniendo el pH del retenido a 7.0. La solución ultrafiltrada fue luego dializada para eliminar las sales, recuperando el producto mediante liofilización .

El producto resultante fue finalmente secado a 50°C y 10 mbar, hasta que se obtuvieron 0.95 g de la sustancia, mostrando un titulo (calculado al determinar el ácido glucurónico-PAD) de 94%, un Mn de 62 kDa y un Mw de 68.3 kDa, determinado mediante cromatografía de exclusión de tamaño de alta resolución (HPSEC) equipada con el software especializado integrado para GPC.

Ejemplo 5 Análisis de 6-sulfato de condroitina La composición del CS obtenido en los Ejemplos 3 y 4, fue estudiada por HPLC de los productos de digestión del mismo mediante tratamiento de CS obtenido como se describe anteriormente con condroitinasa ABC, de acuerdo al método descrito por Joon-Soo Sim et al. (J. Chromatography B, ,2005 vol . 818, páginas 133-139).

El análisis fue llevado a cabo mediante el uso de una columna HPLC-SAX, de 250 x 4.6 mm, de 10 µ?t?, eluyendo con gradiente, comenzando desde HCl 3.5 mM (pH = 3.5) (100%) de fase inicial hasta una concentración igual a NaCl 1M en HCl 3.5 mM (pH = 3.5) (100%).

Los mismos productos que resultan de la digestión con condroitinasa ABC fueron analizados en el Análisis de Electroforesis de Carbohidrato Asistido por Fluoróforo (FACE, por sus siglas en inglés) con el fin de señalar la presencia del polisacárido no digerido. Los resultados muestran una tasa de digestión superior a 95%. La alta tasa de digestión indica la ausencia sustancial de disacáridos de tri- y/o tetra-sulfato en la estructura del CS obtenido.

La siguiente Tabla 2 muestra los disacáridos principales identificados para los productos preparados en los Ejemplos 3 y 4.

Tabla 2 Mn = peso molecular promedio en número; Mw = peso molecular promedio en peso; índice de Polidispersión = Mw/Mn; densidad de carga es el número de grupos sulfato per unidades disacáridas) ; ND = No Detectado Al comparar la tabla anterior con la Tabla 1, se puede observar que la composición del CS objetivo de la presente invención, muestra que está estrechamente relacionada a CS de tiburón, ya que el primero muestra cantidades muy bajas de Di -4S y está principalmente compuesto de Di-6S mientras que Di-OS, Di-2,6diS y Di-4,6diS resultaron ser aproximadamente superponibles con los valores reportados para CS de tiburón; además el CS de la presente invención mostró una densidad de carga mayor de 1.0. También, los productos obtenidos llevando a cabo los Ejemplos 3 y 4 no mostraron ni la forma tris ni la forma tetras del CS .

Además, el CS objetivo de la presente invención muestra un contenido de sulfato peculiar, cuando se comparó algunos de los productos de la técnica anterior como se ilustra en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3 Ejemplo 6 Ya que la efectividad de CS está estrictamente relacionada a su actividad anti-mflamatoria, tal como su habilidad para inhibir la actividad de las enzimas degradativas como la elastasa leucocitaria humana (HLE, por sus siglas en inglés) , el CS objetivo de la presente invención fue probado in vitro para su habilidad de inhibir tal actividad de HLE y se comparó a CS de bovino (Estándar de CS de la Ia Farmacopea Europea) y CS extraído de muestras de cartílago de tiburón. Los resultados comparativos se muestran en la Figura 1.

Una muestra de CS similar a tiburón de acuerdo a la presente invención, como se obtuvo de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 3, fue comparada con CS de bovino (Estándar de CS de la Ia Farmacopea Europea) vendida por Bioiberica y CS extraído de cartílagos de tiburón.

La actividad de elastasa fue determinada mediante el ensayo espectrofptométrico mediante el uso de un sustrato artificial cromogénico (N-Succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida) específico para HLE. Después de la pre-incubación de la enzima con cantidades cada vez mayores de CS, la actividad fue determinada mediante la incubación con el sustrato cromogénico (N-Succinil -Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida) . Después de detener la reacción, el producto resultante fue cuantitativamente determinado mediante evaluación espectrofotometrica .

Tabla 4 La Figura 1 ilustra los datos reportados én la Tabla 4 y muestra que el CS similar al de tiburón de la presente invención es capaz de inhibir significativamente la actividad de elastasa leucocitaria humana, de una manera efectiva, comparable a aquella mostrada por las muestras de CS naturales.

La actividad biológica y las propiedades anti- inflamatorias mostradas in vitro por el CS objetivo de la presente invención, hacen de éste último comparable á los productos naturales, y por lo tanto potencialmente útil como un fármaco en preparaciones farmacéuticas y productos nutracéuticos .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El sulfato de condroitina similar al de tiburón, libre de disacáridos tri-, tetra- y 2,4-di-disulfatados , caracterizado porque consiste de 60-99% de 6-sulfato, 0.5-30% de 2 , 6 -disulfato, 0.1-5% de 4 , 6-disulfato, 0.1-5% de condroitina no sulfatada y 0.1-1% de 4-sulfato, siendo expresados todos los porcentajes con respecto al contenido total de disacárido del sulfato de condroitina similar al de tiburón, mostrando el último un peso molecular promedio en número (Mn) de 40-85 kDa y un peso molecular promedio en peso (Mw) de 50-95 kDa.

2. El sulfato de condroitina similar al de tiburón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste de 70-90% de. 6-sulfato, 8,5-20% de ' 2,6-disulfato, 0.1-5% de 4 , 6-disulfato, 0.1-5% de condroitina no sulfatada y 0.1-1% de 4-sulfato, siendo expresados todos los porcentajes con respecto al contenido total de disacárido del sulfato de condroitina similar al de tiburón, mostrando el último número un peso molecular promedio en número (Mn) de 40-65 kDa y un peso molecular promedio en peso (Mw) de 50-70 kDa.

3. El sulfato de condroitina similar al de tiburón de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la suma 2 , 6 -disulfato y 4 , 6-disulfato, representa 10-25% del contenido total de disacárido.

4. El sulfato de condroitina similar al de 5 tiburón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usarse en la prevención o tratamiento de la os~teoartritis , o para el mantenimiento de la salud musculoesquelética .

5. Una composición, caracterizada porque Q comprende el sulfato de condroitina similar al de tiburón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un portador farmacéutica o nutracéuticamente aceptable.

6. La composición de conformidad con la reivindicación previa, para usarse en la prevención o 5 tratamiento de la osteoartrit is , o para el mantenimiento de la salud musculoesquelética.

7. Un proceso para preparar la condroitina similar al de tiburón de conformidad con cualquiera d las reivindicaciones previas, caracterizado porque comprende: Q a) salificar la condroitina no sulfatada, como ácido libre, previamente disuelta en un ambiente acuoso, con una sal seleccionada del grupo que consiste de tetramétil-, tetraetil- y tetrabutil-, amonio o piridinio; b) secar la condroitina no sulfatada salificada, como ácido r libre y/o sal de sodio, resultante del paso a) hasta 5-15% de contenido de agua; c) secar la condroitina no sulfatada salificada, resultante del paso b) , a una temperatura de 100oC-170°C, hasta un contenido de agua de 0.1-3% ; 5 d) sulfatar selectivamente la posición 6 de la condroitina no sulfatada, salificada resultante del paso c) , solubilizada en N-metilpirrolidona o dimetilformamida, a una temperatura de 0°C-30°C, mediante la adición de 1-2 equivalentes de complejo de trióxido de azufre-piridina o complejo de 10 trióxido de azufre-dimetilformamida, a intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que se agregan un total de 2-15 equivalentes del complejo de trióxido de azufre-piridina o el complejo de trióxido de azufre-dimetilformamida; ¦ dejar la solución resultante bajo agitación por 2-24 horas; 15 e) apagar la reacción llevada a cabo en el paso d) con una solución acuosa de bicarbonato de sodio o carbonato de sodio, filtrando y concentrando hasta sequedad la solución resultante para obtener un sólido seco; f) disolver el sólido seco en una solución acuosa de 2Q cloruro de sodio, ultrafiltrando y dializando la solución resultante; g) recuperar el producto de la solución resultante del paso f); h) purificar el producto resultante del paso g) y obtener ¦ye el último ya sea en forma ácida o como la sal de sodio del mismo; i) recuperar el producto resultante del paso h) .

8. El proceso de conformidad con la reivindicación previa, caracterizado porque la salificación 5 de la condroitina no sulfatada en el paso a) es llevada a cabo con una sal seleccionada del grupo que consiste de tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil -amonio .

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la salificación de 0 la condroitina no sulfatada en el paso a) es llevada a cabo con tetrabutil -amonio .

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el secado de la condroitina no sulfatada en el paso b) es llevado a 5 cabo mediante liofilización o secado por rocío.

11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque el secado de la sal de condroitina no sulfatada en el paso c) es llevado a cabo hasta 0.5-2% de agua.

Q 12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque la solubilización de la sal de condroitina no sulfatada resultante del paso c) es llevada a cabo en dimetilformamida .

13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo agregando un total de 6-12 equivalentes de complejo de trióxido de azufre-piridina .

14. El proceso de conformidad con cualquiera de 5 las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porqu la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo agregando un total de 6-9 equivalentes de complejo de trióxido de azufre-piridina .

15. El proceso de conformidad con cualquiera de Q las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo agregando un total de 1-9 equivalentes de complejo de trióxido de azufre de dimetilformamida .

16. El proceso de conformidad con la 5 reivindicación previa, caracterizado porque la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo agregando un total de 2-4 equivalentes del complejo de trióxido de azufre- dimetilformamida .

17. El proceso de conformidad con cualquiera de Q las reivindicaciones precedentes, caracterizado porqué la sulfatación selectiva en el paso d) es llevada a cabo a una temperatura de 10°C-20°C.

18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al final del paso d) la solución resultante es dejada bajo agitación por 2-6 horas.

19. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque én el paso g) el producto es recuperado mediante liofilización, secado por rocío o precipitación en un ambiente alcohólico.

20. Un método para el tratamiento o prevención de la osteoartritis, o para el mantenimiento de la salud musculoesquelética, caracterizado porque comprende administrarle a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un CS o de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5.