KR20140044826A

KR20140044826A - 상어유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20140044826A
Application number: KR1020137033869A
Authority: KR
Inventors: 에르만노 발로티; 니콜로 미라글리아; 다비데 비안키; 마르코 발레티; 파올라 바차
Original assignee: 그노시스 에스.피.에이.
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2014-04-15
Also published as: CA2835691C; JP2014513742A; MX2013013325A; BR112013029765A2; EP2710043A1; EP2710043B1; HUE030096T2; NZ617808A; WO2012159655A1; HRP20160673T1; BR112013029765B1; CY1117567T1; UA110717C2; SG194936A1; IL229432A; MX346787B; EA201391734A1; CA2835691A1; AU2011369262B2; ES2584038T3

Abstract

본 발명은 상어-유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 천연 콘드로이틴 설페이트에 필적하는 매우 소량의 4-설페이트, 높은 전하 밀도 및 생물학적 활성을 나타내는, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이며, 본 발명은 또한 실질적으로 더 높은 생산성 및 생성물 품질의 우수한 재현성을 제공하는 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는, 이 폴리사카라이드를 약제학적 제제 및 약효식품에서 약물로서 잠재적으로 유용하게 하는, 천연 생성물의 것들과 필적하는, 높은 분자 질량 및 전하 밀도; 이의 시험관내 생물학적 및 항염증성 유효성을 나타낸다.

Description

상어유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법{SHARK-LIKE CHONDROITIN SULPHATE AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 상어-유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 천연 콘드로이틴 설페이트에 필적하는 매우 소량의 4-설페이트, 높은 전하 밀도 및 생물학적 활성을 나타내는 상어-유사 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이며; 본 발명은 또한 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 제조방법에 관한 것이다.

글리코사미노글리칸(GAG)으로 칭명되는 천연 복합 폴리사카라이드 부류에 속하는 콘드로이틴 설페이트(이후, CS)는 D-글루쿠론산(GlcA) 및 베타(1→3)에 의해 연결된 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)의 상이하게 설페이트화된 잔기들의 교호 디사카라이드 서열들로 이루어진다.

디사카라이드 특성에 따라, 상이한 탄수화물 골격들을 갖는 CS들이 공지되어 있다. 사실, 공지된 천연 및 합성 CS 둘다가 주로 다양한 비율의 두 종류의 디사카라이드 단위, 즉 GalNAc의 4 또는 6 위치에서 설페이트화된 디사카라이드 단위로 이루어지더라도, 상이한 수 및 위치의 설페이트 그룹을 갖는 디사카라이드는 다양한 비율로 폴리사카라이드 쇄 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 설페이트화되지 않은 디사카라이드는 일반적으로 CS 골격에 적은 양으로 존재하는 반면, 다양한 위치, 예를 들면, GlcA의 2 위치 및 GalNAc의 6 위치(디사카라이드 D), 또는 GalNAc(디사카라이드 E)의 4 및 6 위치에서 O-결합된 두 개의 설페이트 그룹을 갖는 디설페이트화 디사카라이드는 특정 동물 공급원과 관련하여 다양한 비율로 CS 골격에 존재할 수 있다[참조: Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007].

CS는 다음 구조식을 갖는 디사카라이드 반복 단위를 나타낸다:

상기 화학식에서,

R₂, R₄ 및 R₆은 독립적으로 H 또는 SO3^-이다.

CS를 구성하는 교호 디사카라이드 서열들의 상이하게 설페이트화된 잔기들을 간략하게 식별하는데 현재 사용되는 대부분의 반복되는 약어들 중의 일부의 의미는 이하 기록된다.

디-0S (R₂=H; R₄=H; R₆=H)

디-6S (C) (R₂=H; R₄=H; R₆= SO3^-)

디-4S (A) (R₂=H; R₄= SO3^-; R₆=H)

디-4,6디S (E) (R₂=H; R₄= SO3^-; R₆= SO3^-)

디-2,6디S (D) (R₂= SO3^-; R₄=H; R₆= SO3^-)

디-2,4디S (B) (R₂= SO3^-; R₄= SO3^-; R₆=H)

디-2,4,6트리S (R₂= SO3^-; R₄= SO3^-; R₆= SO3^-)

천연 및 합성 CS 샘플 둘다는, CS 구조적 특성 확인 및 변수(예를 들면, 특정 설페이트화 그룹, 전하 밀도, 분자 질량 및 순도) 뿐만 아니라 생물학적 활성을 제공할 수 있는, 민감하고, 특정한 입증되고 공개된 분석 접근법에 의해 특성 확인되고 구별될 수 있다.

천연 추출성 CS 샘플은 구조 및 성질에 대해 특성 확인될 수 있다[참조: Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007; Mucci A. et al., Carbohydr Polymers 41, 37, 2000; Volpi N., Analyt Biochem 277, 19, 2000].

CS의 트리- 및 테트라-설페이트화 형태(각각, "트리S" 및 "테트라S")에 관하여, 이들은 천연 추출성 CS 샘플에서 이례적으로 검출되는 반면, 이들은 통상적으로 합성 CS를 특성 확인시키고; 디-2,4,6-트리S는, 기타 이론적으로 가능한 트리S 형태가 천연 유도 생성물에 존재하지 않기 때문에, 합성 CS 생성물에서 트리S CS의 존재를 평가하기 위한 표준물로서 간주된다는 것이 주지될 수 있다.

다음 표 1은 다양한 기관 및 조직, 주로 연골로부터 추출되어 정제된 천연 CS 샘플에서 동정된 주요 디사카라이드를 예시한다.

Mn= 수평균분자량; Mw= 중량평균분자량; 다분산 지수= Mw/Mn; 전하 밀도는 디사카라이드 단위당 설페이트 그룹의 수이다); ND= 검출되지 않음

표 1은 몇몇 공급원으로부터 정제된 주요 천연 CS 샘플의 특성 확인을 위한 주요 구조적 변수를 예시한다.

특히, 분자 질량 변수들은 육생 CS 샘플(소, 돼지 및 닭 샘플)의 경우 매우 유사하지만, 어류 샘플(상어, 가오리 및 오징어 샘플)과 매우 상이하고, 어류 샘플은 육생 샘플보다 큰 분자 질량 값을 갖는다.

또한, 어류 CS 샘플은 디설페이트화 디사카라이드의 존재로 인해 약 1.0을 초과하는 특이한 전하 밀도 값을 갖고, 디설페이트화 디사카라이드의 부재로 인해 약 1.0 미만의 전하 밀도 값을 갖는 육생 샘플과 상이하다.

모든 천연 CS의 추가의 독특함은, 4S 또는 6S 설페이트화 디사카라이드 뿐만 아니라 설페이트화되지 않은 디사카라이드에 대해 특이적인 가수분해 효소인 콘드로이티나제 ABC와 함께 소화되는 경우, 폴리사카라이드 쇄가 디사카라이드 단위로 완전히 소화된다는 점이다. 이는 FACE(형광단 보조 탄수화물 전기영동(Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis)) 분석으로 용이하게 관찰될 수 있다. 천연 CS의 완전한 소화는 폴리사카라이드 쇄 중의 트리- 및 테트라-설페이트화 구조물의 부재에 기인한다. 트리- 및 테트라-설페이트화 디사카라이드는, 존재할 경우, 콘드로이티나제 ABC에 의해 인지되지 않아서 완전한 폴리사카라이드 소화를 허용하지 않고, 이는 FACE 분석에서 용이하게 측정된 부분적으로 소화되지 않은 올리고사카라이드 쇄를 생성한다.

최종적으로, 생합성 경로로 인해, 모든 공지된 천연 CS는, GalNAc의 4 위치 및 6 위치에서 모노설페이트화된 디사카라이드의 비가 공급원에 따라 변할지라도, GalNAc의 4 위치 및 6 위치에서 모노설페이트화된 디사카라이드의 동시 존재를 보여준다(4-설페이트화 디사카라이드는 결코 30% 미만이 아니다).

상기 예시된 바와 같이, CS는 추출 공급원에 따라, 가변적인 구조 및 성질을 갖는 매우 복잡한 이종 거대분자이다.

또한, 특정 조직 및 종에 관련된 생합성 공정의 결과로서, 중합 등급이 상이한 CS는 생합성되어 다양한 분자 질량 및 다분산도를 갖는 거대 분자를 생성할 수 있다. 이러한 구조적 변형에 기인하여, 그리고 특이적 올리고사카라이드 서열의 가능한 존재, 및 치료 용도를 위한 제제 및 약효식품(nutraceutical)에서의 제제의 순도 이외에, CS는 상이한 성질 및 성능을 가질 수 있다.

사실, 상이하고 독특한 활성이 CS 구조에 따라 보고되었다[참조: Volpi N., Biomaterials 23, 3015, 2002; Volpi N. et al., Biochimie 81, 955, 1999; Volpi N., Biomaterials 20, 1359, 1999; Suzuki S. et al., J Biol Chem 243, 7, 1968].

천연 추출성 CS는 연구 증거 및 다수의 임상 연구의 메타-분석에 기초하여 무릎 OA[참조: Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003], 힙[참조: Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003] 및 손[참조: Zhang W. et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007]의 치료에서 유럽에서 골 관절염에 대한 증상적 지효성 약물(SYSADOA)로서 유럽 류마티스 학회(European League Against Rheumatism: EULAR)에 의해 현재 추천된다.

또한, CS는 단독으로 또는 기타 성분과 함께, 대부분 유럽 및 미국에서 약효식품로서 널리 사용된다[참조: McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N. et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N. et al., Separation Sc 1, 22, 2009].

CS 유효성은 이의 항-염증성 활성, 예를 들면, 사람 백혈구 엘라스타제(HLE)로서 분해 효소의 활성을 억제하는 이의 능력에 엄격하게 관련된다[참조: Ronca F. et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998. Egea J. et al., Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 1, S24, 2010].

약제 또는 약효식품 용도에 전세계적으로 사용되는 CS는 다수의 동물, 예를 들면, 소 및 돼지[참조: Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998], 조류[참조: Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002], 연골 어류[참조: Sugahara K. et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003] 등의 조직으로부터 추출함으로써 수득된다.

현재까지, 동물 기원의 이러한 생성물은, 예를 들면, 소에게 해면상 뇌병증을 유도하는 것과 같은 전염성 감염제의 가능한 존재와 관련된 잠재적인 소비자 안전 문제, 또는 종교적 논쟁에 관한 제한 사용 문제를 제기한다.

또한, 이러한 생성물의 추출 특성은 증대되는 요구 및 증가하는 시장 볼륨을 고려하여 이들의 공급을 잠재적으로 신뢰할 수 없게 한다.

이러한 고려사항은 대안의 보다 신뢰가능한 CS 공급원에 대한 연구를 촉진시켰고, 이의 예는 과학 및 특허 문헌에 기재된 바와 같은 이.콜리(E. coli)의 K4 캡슐 폴리사카라이드로부터 출발하는 생명공학적 생산이다.

이와 관련하여, 용어 생명공학적 생산은, 최종 생성물의 상당 부분이 통상적으로 그리고 막연히 발효로서 칭명되는 인공 배양 시스템에서 미생물에 의해 또는 고등 유기체의 분리 세포에 의해 생성되는 생산 방법을 나타낸다.

기본적으로, 3개의 주요 접근법이 당해 기술 분야에서 지금까지 사용되었다.

제1 접근법은 출발 물질로서 이. 콜리 O5:K4:H4의 K4 캡슐 폴리사카라이드를 사용하여 CS형 화합물을 생산하고, 이어서 이를 화학적 전환에 적용시켜 확인될 수 있는 반면, 제2 접근법은 미생물에 의한 CS형 화합물의 직접 생합성으로서 인식될 수 있고, 제3 접근법은 설페이트화되지 않은 콘드로이틴를 생합성적으로 생산하고 이어서 화학적으로 또는 생화학적으로 설페이트화하는 것으로 인지될 수 있다.

상기 제1 접근법에 속하는 EP-A 제1304338호는, 먼저 추출되어 정제되고, 이어서 재용해되고 산 가수분해가 적용되는, 액체 배양물에서 생성된 K4 폴리사카라이드로부터 출발하는 CS의 생산법을 기술하고, 이의 주된 실시는 선형 중합체에 존재하는 GlcA 잔기에 연결된 프럭토스 잔기의 제거이다. 2차적 실시는 저분자 질량 생성물을 유도하는 폴리사카라이드 쇄의 부분 가수분해이다. 후속적으로, 설페이트화되지 않은 콘드로이틴과 동일한 탈-프럭토실화(de-fructosylated) 중합체는 4 또는 6 위치에서 적합한 보호 그룹을 사용하는 화학적 수단에 의해 GalNAc 잔기의 C-4 또는 C-6 위치에서 다양하게 설페이화된다. 또한, 함량의 70% 이상이 갈락토사민 모이어티의 4 및 6 위치에서 모노- 및/또는 디-설페이트화된 것으로 이루어지고, 글루쿠론산 모이어티의 2 위치가 설페이트화되지 않고, 6 내지 25kDa의 Mw 및 0.7 내지 2.0의 카복실/설페이트 그룹 비(즉, 전하 밀도)를 갖는 CS가 본원에서 개시된다.

상기 제2 접근법을 예시하는 WO 제2009/149155호는 몇몇 미생물, 세균 및 진균 둘다에 의한 CS-유사 화합물의 직접 생산을 기술한다. 갈락토사민 모이어티의 4-위치 및 6-위치 둘다가 설페이트화된 CS 육생형 화합물도 또한 본원에서 개시되고; 상기 화합물은 약 300Da 내지 35kDa의 분자량(Mw) 및 1 미만 내지 1 초과 범위의 4S/6S 설페이트 비를 나타내는 것으로 보고된다.

상기 제3 접근법은 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 생산하기 위한 다수의 상이한 전략을 포함하고, 이의 주요점은, 예를 들면, EP-A 제1950308호 및 EP-A 제1964924호에 개시된 것들과 같이, 세포 비함유 시스템에서의 중합체의 효소 합성, 및, 예를 들면, WO 제2008/133350호에 기재된 이. 콜리 K4로부터 추출된 유전자 kfoA 및 kfoC를 UDP-GlcA로부터 생성할 수 있는 숙주 내에서 발현시키는 수득된 재조합 세포에서의 생합성이다.

설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 생합성 생산의 또 다른 예는, 특히, 적합한 배지에서 재조합 미생물, 바람직하게는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) DSM23644를 배양하고, 미생물 배양물에 존재하는 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 회수하고 정제시킨 후, 상기 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 화학적으로 설페이트화시킴을 포함하는 콘드로이틴의 생명공학적 생산 방법에 관한 이탈리아 특허 출원 제MI2010A001300호에 의해 개시된다. 지금까지 기술된 CS의 생산 방법들의 공통적인 특징은 프럭토스 잔기의 산 촉매 제거 동안 그리고 GalNAc 잔기의 설페이트화에 필요한 화학적 합성 단계 동안 둘다에서 원래 물질의 분자 질량의 상당한 감소이다.

일례로써, EP-A 제1304338호는 6 내지 25kDa 분자 질량의 CS를 기술한 반면, 출발 물질로서 사용된 K4 폴리사카라이드의 분자 질량은 150-400kDa인 것으로 개시된다.

본 발명의 제1 측면은, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트로서, 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 트리-, 테트라- 및 2,4디-설페이트화 디사카라이드를 함유하지 않고, 60 내지 99%의 6-설페이트, 0.5 내지 30%의 2,6-디설페이트, 0.1 내지 5%의 4,6 디설페이트, 0.1 내지 5%의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 및 0.1 내지 1%의 4-설페이트로 이루어지고(모든 백분율은 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 총 디사카라이드 함량을 기준으로 하여 나타낸 것이다), 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 40 내지 85kDa의 수평균분자량(Mn) 및 50 내지 95kDa의 중량평균분자량(Mw)을 나타내는, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 70 내지 90%의 6-설페이트, 8.5 내지 20%의 2,6-디설페이트, 0.1 내지 5%의 4,6 디설페이트, 0.1 내지 5%의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 및 0.1 내지 1%의 4-설페이트로 이루어지고(모든 백분율은 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 총 디사카라이드 함량을 기준으로 하여 나타낸 것이다), 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 40 내지 65kDa의 수평균분자량(Mn) 및 50 내지 70kDa의 중량평균분자량(Mw)을 나타낸다.

본 발명의 CS 목적물은 고분자 질량, 및 주로 6 위치에서의 특이한 설페이트화 그룹 뿐만 아니라 매우 적은 양의 4-설페이트화 디사카라이드를 특징으로 한다.

본 발명의 CS의 특징을 시험하고 이들을 천연 추출성 CS 샘플에 관한 상기 표 1에 제시된 것들과 비교하여, 본 발명의 CS는 상어 CS와 대략적으로 유사하다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 CS 목적물은 임의의 폴리설페이트화 디사카라이드를 나타내지 않고, 특히 이는 통상적으로 선행 기술 분야에 개시된 합성 방법에 의해 수득되고, 콘드로이티나제 ABC로 소화후 비분해 생성물로서 검출가능한 CS를 특징으로 하는 트리-설페이화 디사카라이드도 테트라-설페이트화 디사카라이드도 나타내지 않는다.

추가로, 본 발명의 CS 목적물은 (콘드로이티나제 ABC로 소화 후 비분해 생성물의 양을 기준으로 하여) 매우 정제되고, 6 내지 25kDa의 분자 질량 및 다량의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴(>10%) 및 광범위한 범위의 전하 밀도(0.7 내지 2)를 갖는 EP-A 제1304338호에 개시된 CS와 명백히 구별되는 반면, 본 발명의 CS의 전하 밀도의 범위는 보다 협소하고, 바람직하게는 1.05 내지 1.30에 달한다.

Mn 및 Mw 둘다 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 통상적 방법; 예를 들면, 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 따라 계산될 수 있고; 바람직하게는, Mn 및 Mw는 겔 침투 크로마토그래피(GPC)를 위한 통합된 전문 소프트웨어가 장착된 HPSEC에 의해 측정될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 CS 중의 2,6-디설페이트 및 4,6 디설페이트의 합은 총 디사카라이드 함량의 10 내지 25%에 달한다.

또 다른 측면에 따라서, 본 발명은 본 발명의 상어-유사 콘드로이틴 설페이트 및 약제학적으로 약효식품적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 미세결정성 셀룰로스, 덱스트린, 말도텍스트린, 사이클로덱스트린, 설포부틸에테르 베타-사이클로덱스트린, 대두 레시틴, 팔미톨레산, 리포솜, 수크르에스테르 등을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

숙련가는 그 분야의 통상적인 일반 지식에 기초하여 이해하기 때문에, 본 발명의 조성물은 고체(즉, 정제, 경질 캡슐제, 연질 겔 캡슐제) 또는 액체(즉, 용액 또는 분말화된 드링크 혼합물)의 다양한 형태로, 바람직하게는 비경구 및/또는 경구 약제학적 및/또는 약효식품 제제의 형태로 제형화될 수 있고, 추가로 기타 불활성 및/또는 활성 성분을 포함할 수 있다.

이러한 추가의 성분 중에, 본 발명의 조성물은 또한 바람직하게는 다음 물질들: 글루코사민 하이드로클로라이드, 글루코사민 설페이트, N-아세틸 글루코사민, 히알루론산, 헤파린, 케라틴, 더마틴, 메틸설포닐메탄, 폴레이트 또는 감소된 폴레이트, B-그룹 비타민, S-아데노실메티오닌(SAMe), 아스코르브산 또는 망간 아스코르베이트 중의 적어도 하나를 포함할 수 있고, 필요에 따라 그리고 그 경우가 필요할 수 있는 상황에 따라, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량으로 투여될 수 있다. 단순한 예로서, 본 발명의 상어-유사 CS 및/또는 조성물은 100-3000mg/일의 양, 바람직하게는 1000-2000mg/일의 양으로, 더욱 바람직하게는 1200-1800mg/일의 양으로, 일반적으로 1일당 2/3회 용량으로 분배된다.

또 다른 측면에 따라서, 본 발명은, 예를 들면, 약물 또는 식품 첨가제 또는 영양 보충제 중의 활성 성분으로서 골관절염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 또는 근골격 건강을 유지하기 위한 본 발명의 상어-유사 콘드로이틴 설페이트 또는 조성물에 관한 것이다.

단순한 예로서, 본 발명의 상어-유사 CS 또는 조성물은, 상기 정의된 바와 같이, 약제, 식품 첨가물 또는 영양 보충제 제조용, 힙, 손 및 무릎 골관절염(OA) 및 이의 주요 증상, 예를 들면, 통증, 관절 부종, 염증, 알츠하이머병, 미생물 감염, 아테롬성동맥경화증, 골다공증의 예방 및/또는 치료용 및 암 치료 및 신경 조직 재생을 포함하는 조직 재생에서 보조제로서 사용될 수 있다.

또 다른 측면에 따라서, 본 발명은,

a) 이미 수성 환경에 용해된, 유리 산으로서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-, 암모늄 또는 피리디늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 염을 사용하여 염화시키고;

b) 단계 a)에서 생성된 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 함수량이 5 내지 15%가 될 때까지 건조시키고;

c) 단계 b)에서 생성된 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 100 내지 170℃의 온도에서 함수량이 0.1 내지 3%가 될 때까지 건조시키고;

d) 0 내지 30℃의 온도에서 N-메틸 피롤리돈 또는 디메틸포름아미드에 용해된, 단계 c)에서 생성된 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 6-위치를, 1 내지 2당량의 삼산화황 피리딘 착물 또는 삼산화황 디메틸포름아미드 착물을 총 2 내지 15당량의 삼산화황 피리딘 착물 또는 삼산화황 디메틸포름아미드 착물이 첨가될 때까지 1 내지 3시간의 시간 간격으로 첨가하여, 선택적으로 설페이트화하고; 생성된 용액을 2 내지 24시간 동안 교반하에 정치시키고;

e) 단계 d)에서 수행된 반응을 중탄산나트륨 또는 탄산나트륨 수용액으로 켄칭시키고, 생성된 용액을 여과하고 농축 건조시켜 건조된 고체를 수득하고;

f) 건조된 고체를 염화나트륨 수용액에 용해시키고, 생성된 용액을 한외여과하고 투석하고;

g) 단계 f)로부터 생성된 용액으로부터 생성물을 회수하고;

h) 단계 g)로부터 생성된 생성물을 정제하고, 상기 생성물을 산성 형태로 또는 이의 나트륨 염으로 수득하고;

i) 단계 h)로부터 생성된 생성물을 회수함을 포함하는, 상기 정의된 상어-유사 콘드로이틴의 제조방법에 관한 것이다.

단계 a)에서 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 염화는 바람직하게는 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸- 암모늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염, 가장 바람직하게는 테트라부틸 암모늄을 사용하여 수행되는 반면, 단계 b)에서 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 건조는 동결 건조 또는 분무 건조로 수행될 수 있다.

단계 c)에서 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염의 건조는 바람직하게는 물이 0.5 내지 2%가 될 때까지 수행되는 반면, 상기 단계로부터 생성된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염의 가용화는 바람직하게는 디메틸포름아미드에서 수행된다.

단계 d)에서 선택적 설페이트화는 바람직하게는 총 6 내지 12당량, 더욱 바람직하게는 6 내지 9당량의 삼산화황 피리딘 착물을 첨가하여 수행된다.

또는, 단계 d)에서 선택적 설페이트화가 삼산화황 디메틸포름아미드 착물에 의해 수행되는 경우, 총 1 내지 9당량, 바람직하게는 2 내지 4당량을 첨가한다.

또한, 단계 d)에서 선택적 설페이트화는 바람직하게는 10 내지 20℃의 온도에서 수행되는 반면, 단계 d)의 말기에, 생성된 용액은 바람직하게는 2 내지 6시간 동안 교반하에 정치시킨다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 양태에 따라서, 단계 f)로부터 생성된 용액으로부터의 생성물을 동결 건조, 분무 건조 또는 알코올성 환경에서의 침전에 의해 회수한다.

본 발명의 방법은 원래의 폴리사카라이드의 분자량을 변하지 않게 유지시킨다.

놀랍게도, 본 발명의 방법은, 아마 GalNAc의 6-위치에서 제1 하이드록실 그룹의 반응성이 반응의 선택성을 보장하기 때문에, 임의의 제2 하이드록실 그룹의 보호를 목표로 하는 임의의 단계를 수행하는 것을 피하게 한다.

게다가, 본 발명의 방법은, 예를 들면, EP-A 제1304388호와 관련하여, 설페이트화 단계가 0.7 내지 2.0에 달하는 더 광범위한 범위의 카복실/설페이트 그룹 비를 유도하는 선행 기술과 비교하여 상당히 더 높은 생산성 및 생성물의 품질의 양호한 재현성을 갖도록 한다.

또한, 본 발명의 방법은 매우 적은 양의 4-설페이트화 디사카라이드를 나타내고, 실질적으로 폴리설페이트화 디사카라이드를 함유하지 않는 생성물을 수득하게 하고, 특히 이는 트리S 또는 테트라S 사카라이드를 함유하지 않는 생성물을 수득하게 한다.

통상적으로, 본 발명의 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) 및 Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1988)]에 기술된 바와 같이 발효에 의해 수득된 K4 캡슐 중합체를 탈프럭토실화하여 제조된, 유리 산 또는 나트륨 염으로서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 수성 환경에 용해시켜 수행될 수 있다.

설페이트화되지 않은 콘드로이틴이 이의 완전한 용해 후 이의 나트륨 염의 형태로 존재하는 경우, 생성된 용액을 편리하게는 0 내지 30℃의 온도에서 양이온 교환 수지(예를 들면, Amberjet 1200 H, Rohm and Haas 등)를 함유하는 컬럼에서 용출시켜 용출된 분획을 편리하게는 1.5 내지 4.0, 바람직하게는 1.5 내지 3.0의 pH에서 수집하고 수성 산 분획을 회수한다.

또는, 이 단계는 배치식으로 수행될 수 있고; 바람직하게는 0 내지 30℃에서 20 내지 60분 동안 교반시켜 수득된, 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 나트륨 염을 물에 용해시킨 후, 양이온 수지(Amberjet 1200 H, Rohm and Haas 등)를 여기에 첨가하고, 수지 첨가 후 용액의 pH는 1.5 내지 3.0이 된다. 이어서, 이 용액을 여과하고, 생성된 산성 여과물을 수집한다.

이어서, 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 유리 산으로서 직접 용해시키거나 상기한 바와 같은 이의 나트륨 염 용액을 연속 또는 배치식으로 정제함으로써 수득된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 산 용액에, 편리하게는 pH 6.0 내지 8.0, 바람직하게는 6. 내지 7.0까지 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-, 암모늄 또는 피리디늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이온의 수용액으로 첨가하고, 상기 용액을, 예를 들면, 5 내지 15%의 함수량이 될 때까지 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 증발 건조시켜 상응하는 콘드로이틴 염을 회수한다.

이어서, 생성된 콘드로이틴 염을 0.1 내지 3%의 함수량이 될 때까지 100 내지 170℃의 온도에서 제2 건조 단계에 적용하여 최종적으로 상응하는 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염을 회수한다.

이어서, 상기한 바와 같이 수득된 상응하는 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염은, 이를 0 내지 30℃, 바람직하게는 10 내지 20℃의 온도에서 N-메틸 피롤리돈 또는 디메틸포름아미드로부터 선택된 용매에 용해시키고, 편리하게는 양이온 교환 수지(예를 들면, Amberjet 1200 H, Rohm and Haas 등)를 함유하는 컬럼에서 1 내지 2당량의 삼산화황 피리딘 착물 또는 삼산화황 디메틸포름아미드 착물을 총 2 내지 15당량의 피리딘 또는 디메틸포름아미드 삼산화황 착물이 첨가될 때까지 1 내지 3시간의 간격으로 첨가하여 완전히 용해된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염을 용출시키고, 생성된 용액을 2 내지 24시간 동안, 바람직하게는 2 내지 6시간 동안 교반하에 정치하여 임의의 관능성 모이어티를 보호할 필요 없이 6-위치에서 선택적으로 설페이트화된다.

이후, 생성된 반응물 매스(mass)를 중탄산나트륨 또는 탄산나트륨 수용액에서 켄칭시킨 후, 예를 들면, 중탄산나트륨으로의 처리 및 생성된 불용성 염의 여과에 의해 회수하고, 증발 건조시키고, 다시 염화나트륨 수용액에 용해시키고, 회수하고, 최종적으로, 예를 들면, 한외여과 및 투석에 의해 처리하여 잔류하는 염 및 저분자량 불순물을 제거하고, 최종적으로 생성물을, 예를 들면, 동결 건조, 분무 건조 또는 알코올성 환경에서의 침전에 의해 회수한다.

이어서, 상기 예시된 바와 같이 수득된 생성된 콘드로이틴 6-설페이트를, 예를 들면, 양이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 이를 이의 산 형태로 수득하고, -가능하게는- 후속적으로, 예를 들면, 수산화나트륨을 첨가하여 이의 나트륨 염으로서 수득된다.

이렇게 수득된 콘드로이틴 6-설페이트를 최종적으로, 예를 들면, 이를 오븐에서 진공하에 50 내지 70℃에서 건조시켜 회수하거나 크로마토그래피 정제하여 트리-, 테트라- 및 2,4디-설페이트화 디사카라이드를 함유하지 않고 40-85kDa의 Mn, 50-95kDa의 Mw를 나타내는 상어-유사 콘드로이틴 설페이트를 수득한다.

다음 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예 1

염화

문헌[참조: Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) 및 Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998)]에 기술된 바와 같이 발효에 의해 수득된 K4 캡슐 중합체를 탈프럭토실화하여 제조된 20g의 콘드로이틴 나트륨 염을 탈이온수(500ml)에 용해시켰다. 완전 용해 후, 생성된 용액을 이미 수화되고 산 형태로 제조된, 양이온 교환 수지(160ml의 Amberjet 1200 H, Rohm and Haas)를 함유하는 컬럼에서 5℃에서 용출시켰다. 용출된 분획을 pH 1.9에서 회수하고, 수성 산 분획을 수집하고, 여기에 pH 7.0이 될 때까지 16% 테트라부틸 암모늄 수용액을 첨가하고; 이어서, 용액을 동결 건조로 증발 건조시켜 20.8g의 콘드로이틴을 테트라부틸 암모늄 염으로 회수했다.

이어서, 생성된 염을 잔류 습도가 0.2% 미만이 될 때까지 진공하에 4시간 동안 105℃에서의 정적 건조기에서 제2 열 처리에 적용했다. 따라서, 18.5g의 콘드로이틴을 테트라부틸 암모늄 염으로서 수득했다.

실시예 2

염화

문헌[참조: Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) 및 Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998)]에 기술된 바와 같이 발효에 의해 수득된 K4 캡슐 중합체를 탈프럭토실화하여 제조된 12g의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 20ml의 탈이온수에 용해시키고, 1M HCl에 의해 pH 2.5가 될 때까지 산성화시킨 후, 80ml의 에탄올을 첨가하고, 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 유리 산으로서 침전시켰다.

여과하고 에탄올로 세척한 후, 10.3g의 생성물을, 50℃에서 진공하에 건조시킨 후, 생성물 자체에 대해 계산된 90% 산 적정농도를 나타내고 8%의 잔류수를 함유하는 백색 고체로서 수득했다. 생성된 고체를 20ml의 물에 현탁시키고, pH 8이 될 때까지 테트라부틸 암모늄 하이드록사이드의 40% w/w 수용액으로 첨가했다. 이어서, 생성된 용액을 잔류수가 2.5%가 될 때까지 동결 건조시켜 15.9g의 고체 콘드로이틴을 테트라부틸 암모늄 염으로서 수득했다.

이어서, 생성된 염을 잔류 습도가 0.2% 미만이 될 때까지 진공하에 4시간 동안 105℃에서의 정적 건조기에서 제2 열 처리에 적용했다. 따라서, 15.4g의 테트라부틸 콘드로이틴을 수득했다.

실시예 3

설페이트화

실시예 1에서 예시된 바와 같이 수득된 1.4g의 테트라부틸 콘드로이틴 및 84ml의 DMF를 버블 냉각 시스템, 염화칼슘 트랩 및 온도계의 존재하에 불활성 대기(N₂), 기계적 교반하에 유지시킨 250ml 4구 플라스크에 충전했다.

생성된 현탁액을 완전히 용해시킬 때까지 교반하에 정치시킨 후, 온도를 23℃로 조정했다.

온도가 조정되면, 고체 삼산화황 피리딘 착물을 용액에 분획으로 첨가하고(1.07g, 3eq), 반응물을 1시간 동안 교반하에 유지시킨 다음, 추가의 고체 삼산화황 피리딘 착물(1.07g; 3eq)을 첨가한다. 동일한 온도에서 추가로 1시간 교반시킨 후, 반응 혼합물을 탄산수소나트륨의 포화 용액을 함유하는 500ml 플라스크에 옮기고 10℃에서 냉각시켰다.

온도를 20℃ 까지 상승시켜 유지시킨 후, 뷰흐너(Buchner) 상에서 여과를 수행하고, 여액을 회수하고, 이를 진공하에 증발 건조시켰다.

생성된 건조된 고체(2.3g)를 미세하게 분쇄하고, 0.3M NaCl 용액(130ml)에 재용해시키고, 이렇게 수득된 용액을 3kDa 컷-오프 막을 사용하여 한외여과에 적용하고, 보유물의 pH를 7.0에서 유지시켰다. 이어서, 한외여과된 용액을 염을 제거하기 위해 투석하고, 생성물을 동결건조시켜 회수한다.

생성된 생성물을 최종적으로 50℃ 및 10mbar에서 1g의 물질이 수득될 때까지 건조시켰으며, 이는 GPC를 위한 통합된 전문 소프트웨어가 장착된 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)로 측정되는 경우 95%의 적정농도(글루쿠론산-펄스화 전류측정 검출 "PAD"를 측정함으로써 계산됨), 60kDa의 Mn 및 67.3kDa의 Mw를 나타낸다.

실시예 4

설페이트화

실시예 1에 예시된 바와 같이 수득된 테트라부틸 암모늄 염으로서의 1.21g의 콘드로이틴 및 72ml의 DMF를 불활성 대기(N₂), 기계적 교반하에 버블 냉각 시스템, 염화칼슘 트랩 및 온도계의 존재하에 유지시킨 250ml 4구 플라스크에 충전했다.

생성된 현탁액을 완전히 용해시킬 때까지 교반하에 정치시킨 후, 온도를 10℃에서 조정했다.

온도가 조정되면, 고체 삼산화황 DMF 착물을 용액에 첨가하고(0.88g, 3eq), 반응물을 1시간 동안 교반하에 유지시켰다. 탄산수소나트륨(0.97g; 6eq)을 동일한 온도를 유지하면서 첨가하고, 온도를 20℃ 까지 상승시켜 유지시키면서 교반을 1시간 동안 계속하였다. 생성된 현탁액을 뷰흐너 상에서 여과하고, 회수된 여액을 진공하에 증발 건조시켰다.

생성된 건조된 고체(2.05g)를 미세하게 분쇄하고, 0.3M NaCl 용액(130ml)에 재용해시키고, 이렇게 수득된 용액을 3kDa 컷-오프 막을 사용하여 한외여과에 적용하고, 보유물의 pH를 7.0에서 유지시켰다. 이어서, 한외여과된 용액을 염을 제거하기 위해 투석하고, 생성물을 동결건조시켜 회수했다.

생성된 생성물을 최종적으로 50℃ 및 10mbar에서 0.95g의 물질이 수득될 때까지 건조시켰고, 이는 GPC를 위한 통합된 전문 소프트웨어가 장착된 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)로 측정되는 경우 94%의 적정농도(글루쿠론산-PAD를 측정함으로써 계산됨), 62kDa의 Mn 및 68.3kDa의 Mw를 나타낸다.

실시예 5

콘드로이틴 6-설페이트의 분석

실시예 3 및 4로부터 수득된 CS의 조성물을, 문헌[참조: Joon-Soo Sim 등(J. Chromatography B, 2005 vol. 818, pages 133-139)]에 개시된 방법에 따라, 상기한 바와 같이 수득된 CS를 콘드로이티나제 ABC로 처리하여 이의 소화 생성물을 HPLC로 연구했다.

분석은 HCl 3.5mM(pH= 3.5)(100%) 중의 1M NaCl과 동일한 농도까지 3.5mM HCl(pH= 3.5)(100%) 초기 상으로부터 출발하여 구배로 용출시키는 컬럼 HPLC-SAX, 250 x 4.6mm 10㎛을 사용하여 수행했다.

콘드로이티나제 ABC에 의한 소화로부터 생성된 동일한 생성물을 비 소화된 폴리사카라이드의 존재를 지시하기 위해, FACE(형광단 보조 탄수화물 전기영동) 분석으로 분석했다. 결과는 95% 초과의 소화율을 보여준다. 높은 소화율은 수득된 CS의 구조에서 트리- 및/또는 테트라-설페이트 디사카라이드의 실질적인 부재를 지시한다.

다음 표 2는 실시예 3 및 4에서 제조된 생성물에 대해 확인된 주요 디사카라이드를 나타낸다.

상기 표를 표 1과 비교하면, 본 발명의 CS 목적물의 조성이 매우 소량의 디-4S를 나타내고, 대부분 디-6S로 구성되는 반면, 디-0S, 디-2,6디S 및 디-4,6디S는 상어 CS에 대해 보고된 값과 대략적으로 겹치는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명의 CS 목적물의 조성은 상어 CS와 밀접하게 관련된 것으로 보이며; 추가로 본 발명의 CS는 1.0을 초과하는 전하 밀도를 나타냈다는 것을 알 수 있다. 또한, 두 실시예 3 및 4를 수행하여 수득된 생성물은 CS의 트리S 형태도 테트라S 형태도 나타내지 않았다.

게다가, 본 발명의 CS 목적물은 다음 표 3에 설명된 바와 같이, 선행 기술 분야에 개시된 생성물들의 일부와 비교할 때 특유의 설페이트 함량을 나타낸다.

실시예 6

CS 유효성은 이의 항-염증성 활성, 예를 들면, 사람 백혈구 엘라스타제(HLE)로서의 분해 효소의 활성을 억제하는 이의 능력에 엄격하게 관련되기 때문에, 본 발명의 CS 목적물은 이러한 HLE의 활성을 억제하는 이의 능력에 대해 시험관내에서 시험되고 소 CS(1^st 유럽 약전 CS 표준) 및 상어 연골 샘플로부터 추출된 CS와 비교되었다. 비교 결과는 도 1에 도시된다.

실시예 3에 기술된 절차에 따라 수득된 본 발명에 따르는 상어-유사 CS의 샘플을 바이오베리카(Bioberica)로부터 시판되는 소 CS(1^st 유럽 약전 CS 표준) 및 상어 연골로부터 추출된 CS와 비교했다.

엘라스타제 활성은 HLE에 대해 특이적인 발색성 인공 기질(N-석시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드)을 사용하여 분광광도 검정으로 측정했다. CS의 양을 증가시키면서 효소를 예비항온배양한 후, 발색성 기질(N-석시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드)과 함께 항온배양하여 활성을 측정했다. 반응을 중지시킨 후, 생성된 생성물을 분광광도 평가로 정량적으로 측정했다.

도 1은 표 4에 기록된 데이터를 설명하고, 본 발명의 상어-유사 CS가, 천연 CS 샘플에 의해 제시된 것에 필적하게, 사람 백혈구 엘라스타제 활성을 유효한 방식으로 의미 있게 억제할 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 CS 목적물에 의한 시험관내에서 보여주는 생물학적 활성 및 항-염증성 특성은 본 발명의 CS 목적물이 천연 생성물에 필적할 만하게 하고, 따라서 약제학적 제제 및 약효식품에서 약물로서 잠재적으로 유용하게 한다.

Claims

상어-유사(shark-like) 콘드로이틴 설페이트로서,
상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는, 트리-, 테트라- 및 2,4디-설페이트화 디사카라이드를 함유하지 않고, 60 내지 99%의 6-설페이트, 0.5 내지 30%의 2,6-디설페이트, 0.1 내지 5%의 4,6 디설페이트, 0.1 내지 5%의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 및 0.1 내지 1%의 4-설페이트로 이루어지고(모든 백분율은 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 총 디사카라이드 함량을 기준으로 하여 나타낸 것이다), 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 40 내지 85kDa의 수평균분자량(Mn) 및 50 내지 95kDa의 중량평균분자량(Mw)을 나타내는, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트.
제1항에 있어서, 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 70 내지 90%의 6-설페이트, 8,5 내지 20%의 2,6-디설페이트, 0.1 내지 5%의 4,6 디설페이트, 0.1 내지 5%의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 및 0,1 내지 1%의 4-설페이트로 이루어지고(모든 백분율은 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트의 총 디사카라이드 함량을 기준으로 하여 나타낸 것이다), 상기 상어-유사 콘드로이틴 설페이트는 40 내지 65kDa의 수평균분자량(Mn) 및 50 내지 70kDa의 중량평균분자량(Mw)을 나타내는, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2,6-디설페이트 및 4,6-디설페이트의 합이 총 디사카라이드 함량의 10 내지 25%에 달하는, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 골관절염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 또는 근골격 건강을 유지하기 위한, 상어-유사 콘드로이틴 설페이트.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 상어-유사 콘드로이틴 설페이트 및 약제학적으로 또는 약효식품적으로(nutraceutically) 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제5항에 있어서, 골관절염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 또는 근골격 건강을 유지하기 위한, 조성물.
a) 이미 수성 환경에 용해된, 유리 산으로서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-, 암모늄 또는 피리디늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 염을 사용하여 염화시키고;
b) 단계 a)에서 생성된 유리 산 및/또는 나트륨 염으로서의 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 함수량이 5 내지 15%가 될 때까지 건조시키고;
c) 단계 b)에서 생성된 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴을 100 내지 170℃의 온도에서 함수량이 0.1 내지 3%가 될 때까지 건조시키고;
d) 0 내지 30℃의 온도에서 N-메틸 피롤리돈 또는 디메틸포름아미드에 용해된, 단계 c)에서 생성된 염화된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 6-위치를, 1 내지 2당량의 삼산화황 피리딘 착물 또는 삼산화황 디메틸포름아미드 착물을 총 2 내지 15당량의 삼산화황 피리딘 착물 또는 삼산화황 디메틸포름아미드 착물이 첨가될 때까지 1 내지 3시간의 시간 간격으로 첨가하여, 선택적으로 설페이트화하고; 생성된 용액을 2 내지 24시간 동안 교반하에 정치시키고;
e) 단계 d)에서 수행된 반응을 중탄산나트륨 또는 탄산나트륨 수용액으로 켄칭시키고, 생성된 용액을 여과하고 농축 건조시켜 건조된 고체를 수득하고;
f) 건조된 고체를 염화나트륨 수용액에 용해시키고, 생성된 용액을 한외여과하고, 투석하고;
g) 단계 f)로부터 생성된 용액으로부터 생성물을 회수하고;
h) 단계 g)로부터 생성된 생성물을 정제하고, 상기 생성물을 산성 형태로 또는 이의 나트륨 염으로 수득하고;
i) 단계 h)로부터 생성된 생성물을 회수함을 포함하는, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 상어-유사 콘드로이틴의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 a)에서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 염화가 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-암모늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 염을 사용하여 수행되는, 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단계 a)에서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 염화가 테트라부틸 암모늄을 사용하여 수행되는, 방법.
제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴의 건조가 동결 건조 또는 분무 건조로 수행되는, 방법.
제7항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 c)에서의 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염의 건조가, 물이 0.5 내지 2%가 될 때까지 수행되는, 방법.
제7항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 c)에서 생성된 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 염의 가용화가 디메틸포름아미드 중에서 수행되는, 방법.
제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에서의 선택적 설페이트화가 총 6 내지 12당량의 삼산화황 피리딘 착물을 첨가하여 수행되는, 방법.
제7항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에서의 선택적 설페이트화가 총 6 내지 9당량의 삼산화황 피리딘 착물을 첨가하여 수행되는, 방법.
제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에서의 선택적 설페이트화가 총 1 내지 9당량의 삼산화황 디메틸포름아미드 착물을 첨가하여 수행되는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 단계 d)에서의 선택적 설페이트화가 총 2 내지 4당량의 삼산화황 디메틸포름아미드 착물을 첨가하여 수행되는, 방법.
제7항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에서의 선택적 설페이트화가 10 내지 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
제7항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 말기에, 상기 생성된 용액을 2 내지 6시간 동안 교반하에 정치시키는, 방법.
제7항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 g)에서, 상기 생성물을 동결 건조, 분무 건조 또는 알코올성 환경에서의 침전에 의해 회수하는, 방법.
골관절염의 치료 또는 예방, 또는 근골격 건강의 유지를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제3항 및 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 CS(콘드로이틴 설페이트) 또는 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 골관절염을 치료 또는 예방하거나, 근골격 건강을 유지하기 위한 방법.