JP5081629B2 - 長鎖コンドロイチン糖鎖及びその製造方法並びにコンドロイチン合成の促進方法 - Google Patents
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Description
CH:コンドロイチン
CS:コンドロイチン硫酸
HA:ヒアルロン酸
Glc:グルコース
GlcUA:グルクロン酸
GlcNAc:N−アセチルグルコサミン
GalNAc:N−アセチルガラクトサミン
GPC:ゲル浸透クロマトグラフィー
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
K4CP:大腸菌K4株由来コンドロイチンポリメラーゼ
MALDI−TOF−MS: Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization−飛行時間型−質量分析
UDP:ウリジン5’−ジリン酸
長鎖CH糖鎖を合成する技術は今まで知られていないが、産業上の有用性からも長鎖高分子CH糖鎖やその製造方法の開発が望まれている。
工程:「GlcUA供与体」、「GalNAc供与体」、「糖受容体」及び「CHを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。
1)重量平均分子量:ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、5万以上である。
2)コンドロイチナーゼABCで完全に二糖に分解される。
3)当該糖鎖をコンドロイチナーゼABCで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがCH不飽和二糖に一致する。
本発明方法1により製造されるCH糖鎖の分子量は、重量平均分子量で、好ましくは7万5千以上、より好ましくは20万以上であり、好ましい分子量の範囲として具体的には、5万〜20万、5万〜50万、5万〜100万、7万5千〜20万、7万5千〜50万、7万5千〜100万、20万〜50万、20万〜100万、50万〜100万等の範囲を例示することができる。
1)重量平均分子量:ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、5万以上である。
2)コンドロイチナーゼABCで完全に二糖に分解される。
3)当該糖鎖をコンドロイチナーゼABCで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがCH不飽和二糖に一致する。
本発明糖鎖の分子量は、重量平均分子量で、好ましくは7万5千以上、より好ましくは20万以上であり、好ましい分子量の範囲として具体的には、5万〜20万、5万〜50万、5万〜100万、7万5千〜20万、7万5千〜50万、7万5千〜100万、20万〜50万、20万〜100万、50万〜100万等の範囲を例示することができる。
本発明方法1は下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、CH糖鎖の製造方法である。
工程:「GlcUA供与体」、「GalNAc供与体」、「糖受容体」及び「CHを合成する菌体酵素」を界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。すなわち、CHを合成する菌体酵素を反応触媒として、GlcUA供与体からのGlcUA残基と、GalNAc供与体からのGalNAc残基と交互に糖受容体に転移させ、CH糖鎖を生成させる工程である。
これらの糖ヌクレオチドは、公知の方法で製造しても良く、市販のものを用いても良い。
GlcUA−R1 ・・・・(1)
GalNAc−R2 ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、R1及びR2は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。)
また、一般式(1)の非還元末端糖残基GlcUAはβ構造であることが好ましく、そのGlcUA残基がR1基のGlcNAcやGalNAcと結合している場合には、そのグリコシド結合はβ1−3構造であることが好ましい。一般式(2)の非還元末端糖残基GalNAcもβ構造であることが好ましく、そのGalNAc残基がR2基のGlcUAと結合している場合には、そのグリコシド結合はβ1−4構造であることが好ましい。
また、本発明方法1において用いられる「CHを合成する菌体酵素」は、CHを合成する活性を有する菌体酵素である限りにおいて特に限定されない。
本発明方法1に用いられる菌体酵素は、公知の方法を当業者が適宜選択し調製できる。具体的方法については後述の実施例1を参照されたい。
1)重量平均分子量:ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、5万以上である。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの諸条件は、実施例を参照されたい。
2)コンドロイチナーゼABCで完全に二糖に分解される。
3)当該糖鎖をコンドロイチナーゼABCで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがCH不飽和二糖に一致する。
GlcUA−R1 ・・・・(1)
GalNAc−R2 ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、R1及びR2は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。)
また、本発明で用いる「実質的に全て」とは、上記分解産物を二糖分析したときに、CH不飽和二糖以外のピークが通常のHPLCにおいて検出できないことを意味する。
本発明方法2は、「CHを合成する菌体酵素」による酵素反応時に、界面活性剤を共存させることを特徴とする、CH合成の促進方法である。
本発明方法2は、例えば、本発明方法1のような「CH糖鎖の製造方法」において、「CHを合成する菌体酵素」による酵素反応を界面活性剤の存在下に行うことによりCH合成が促進されるという知見に基づくものであり、本発明方法2にいう「CHを合成する菌体酵素」、「界面活性剤」、「共存」の語の意味は、いずれも本発明方法1について説明したものと同じである。
本発明糖鎖は、下記1)〜3)の全ての性質を有するCH糖鎖である。
1)重量平均分子量:ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、5万以上である。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの諸条件については、実施例を参照されたい。
2)コンドロイチナーゼABCで完全に二糖に分解される。
3)当該糖鎖をコンドロイチナーゼABCで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがCH不飽和二糖に一致する。
また、本発明糖鎖で用いられる「コンドロイチナーゼABC」の用語の意義は本発明方法1で述べたものと同じである。
なお、本発明糖鎖は例えば本発明方法1を用いることにより製造することができる。
特願2003-199583に示された方法に従い、大腸菌由来のCHポリメラーゼ(K4CP)酵素の遺伝子及び発現ベクターを製造した。発現ベクターとしてはpTrcHisプラスミド(インビトロゲン社製)を用いた。この方法で得られた発現ベクターを導入した大腸菌をアンピシリン含有LB培地にて波長600nmにおける培養液の吸光度が約0.6となるまで37℃で培養し、発現誘導分子であるβ−イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を終濃度1mMとなるように添加し、さらに37℃で3時間培養し、酵素発現を誘導した。その培養液1mlをとり、遠心チューブに移して 10,000 rpm で1分間遠心した。上清を捨て、残った細胞沈殿物を菌体酵素とした。また、この細胞沈殿物は−80℃で保存することにより少なくとも1年間酵素活性を維持できる。
CSを化学的に脱硫酸化したCH(生化学工業株式会社製)に、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダーゼ(シグマ社製)を添加し、NaClを含有する酢酸ナトリウム緩衝液中で限定分解することによって、非還元末端がGlcUA残基である偶数糖のCHオリゴ糖を得た。得られたオリゴ糖をゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、CH6に相当する画分を集めて、凍結乾燥した。この得られた画分についてウロン酸含有量分析(カルバゾール法)、HPLC(GPC)、MALDI−TOF−MS、コンドロイチナーゼ処理後の二糖分析等を行った結果、還元末端がGalNAc残基で非還元末端がGlcUA残基である6糖であることを確認した。
実施例1で得られた菌体酵素に、終濃度0、0.1、0.2、0.4、1.0又は2.0%の界面活性剤ナイミーンS−215(Nymeen S-215;日本油脂株式会社製)を含有する50 mM Tris-HCl(pH7.2)緩衝液(20 mM MnCl2、150 mM NaCl、0.1 nmole CH6、3 nmol UDP−GalNAc、0.2 μCi UDP−[3H]GalNAc及び3nmol UDP−GlcUAを含有するもの)を添加して懸濁し、30℃で15時間振盪した。反応後、沸騰水中で10分間加熱処理した後、15,000 rpmで5分間遠心して沈殿を除去し、上清をSuperdex peptide HR10/30 カラム(アマシャム社製)を用いたゲル濾過に付した。溶出液中の糖鎖は225nmの吸収により検出した。
界面活性剤ナイミーンS−215の終濃度を0.4%として実施例3と同様にCH糖鎖の合成を行った結果、使用した[3H]GalNAcの約37%が高分子画分に取り込まれることが再確認された。この高分子画分を実施例3と同様に処理した後、上清をSuperdex peptide HR10/30 カラム(アマシャム社製)を用いたゲル濾過に付し、実施例3と同様に検出した。さらに、この画分をコンドロイチナーゼABC(生化学工業株式会社製)で処理した結果、完全に低分子化された。またこれにより生じた分解産物を二糖分析した結果、全ての分解産物がCH不飽和二糖と一致することを確認した。したがって、前記の高分子画分はCHであることが確認され、酵素反応時における界面活性剤の濃度を0.4%以上とすることによって非常に効率よく高分子のCHを製造することが示された。
本発明方法により合成されるCHポリマーの分子量をさらに詳細に検討するため、以下のように合成と分子量の分析を行った。
すなわち、実施例4と同様に菌体酵素を用いて得られたCHポリマー、及び実施例4と同様の条件においてUDP−GlcUAとUDP−GalNAc濃度を30nmolに変更して合成したCHポリマーのそれぞれを直列につないだ Sephacryl S500 HR 10/30カラムとSuperose 6 HR 10/30 カラムに付したところ、HA標準品を指針として前者は重量平均分子量7万5千の位置に(図3中の黒丸)、後者は重量平均分子量20万の位置に溶出した(図3中の黒四角)。
終濃度0.4%の各種界面活性剤を用い、実施例3と同様に試験することによって、界面活性剤の種類による[3H]GalNAcの取り込みに対する影響を調べた。酵素としては、実施例1で製造した菌体酵素を用いた。また用いた界面活性剤は以下の通りである。
Triton X-100 (ポリエチレングリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、ナカライテスク株式会社製)
Tween 20 (ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ナカライテスク株式会社製)
Tween 80 (ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ナカライテスク株式会社製)
Brij 35 (ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ナカライテスク株式会社製)
Brij 58 (ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル、ナカライテスク株式会社製)
Nonidet P-40 (ノニデット P−40、ナカライテスク株式会社製)
Tergitol NP-40 (タージトール NP−40、ナカライテスク株式会社製)
CHAPS (3−〔(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕−1−プロパンスルホネート、Dojindo製)
Octyl-thioglucoside (n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド、キシダ化学製)
Dodecyl-maltoside (n−ドデシル−β−D−マルトピラノシド、キシダ化学製)
MEGA-9 (n−ノナノイル−N−メチルグルカミド、キシダ化学製)
MEGA-10 (n−デカノイル−N−メチルグルカミド、キシダ化学製)
CHAPSO (3−〔(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート、キシダ化学製)
LDS (ラウリル硫酸リチウム、キシダ化学製)
SDS (ドデシル硫酸ナトリウム、キシダ化学製)
Octyl-glucoside (n−オクチル−β−D−グルコピラノシド、キシダ化学製)
Heptyl-thioglucoside (n−ヘプチル−β−D−チオグルコピラノシド、キシダ化学製)
Nonyl-thiomaltoside (n−ノニル−β−D−チオマルトピラノシド、キシダ化学製)
Sucrose monocholate (ショ糖コール酸モノエステル、キシダ化学製)
Sucrose monocaprate (ショ糖カプリン酸モノエステル、キシダ化学製)
Sucrose monolaurate (ショ糖ラウリン酸モノエステル、キシダ化学製)
終濃度1%の種々の有機溶媒を用い、実施例3と同様に試験することによって、有機溶媒の種類による[3H]GalNAcの取り込みに対する影響を調べた。酵素としては、実施例1で製造した菌体酵素を用いた。また用いた有機溶媒は以下の通りである。
パラホルムアルデヒド
ホルマリン
グルタールアルデヒド
クロロホルム
パラフィン
クロロホルム・エタノール混液
クロロホルム・キシレン混液
パラフィン・キシレン混液
また、有機溶媒としてクロロホルムを用いる場合の濃度の依存性を調べるために、酵素反応液中のクロロホルム濃度を0、0.5、1.0、2.0、5.0又は10.0%として実施例3と同様に試験することによって、高分子画分中の[3H]GalNAcの取り込み量を調べた。結果を図6に示す。
特開2003-199583で示された大腸菌K4株の遺伝子クラスターRegion 2(R-II)のDNA配列をテンプレートとして、PCR法により大腸菌由来UDP−Glc4−エピメラーゼ遺伝子(kfoA)及び大腸菌由来UDP−Glcデヒドロゲナーゼ遺伝子(kfoF)のcDNAを得た。得られたDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、以下の通りPCRを行った。
kfoA-AS:CCCAAGCTTGGGTAGAAGTTATCGTAAAAT(下線部はHindIIIサイト、配列番号6)
kfoF-SP:CGGGATCCCGATGAAAATTGCAGTTGCTGG(下線部はBamHIサイト、配列番号7)
kfoF-AS:CCCAAGCTTGGGTCTTTAATAGCCATAAAA(下線部はHindIIIサイト、配列番号8)
KfoA及びKfoFの発現ベクターをそれぞれ大腸菌TOP10に形質転換し、アンピシリン含有LB液体培地 100 ml中でO.D.600 = 0.5となるまで37℃で培養し、終濃度1mMとなるようIPTGを添加して3時間発現誘導を行った。その後、超音波処理して得られた可溶性画分をNi-NTA Agarose(キアゲン社製)カラムに通し、KfoA及びKfoFの精製酵素を得た。得られた酵素画分を1 Lの20 % Glycerol 含有PBS溶液中で終夜透析した後、溶液を入れ替えて6時間の透析を2回繰り返した。
実施例1と同様にして、KfoA及びKfoFの発現ベクターをそれぞれ大腸菌TOP10に形質転換し、アンピシリン含有LB液体培地 100 ml中でO.D.600 = 0.5となるまで37℃で培養し、終濃度1 mMとなるようIPTGを添加した後、発現誘導を3時間行なった。培養液をそれぞれ1 mlずつに分注して、15,000×gで1分間遠心して上清を取り除き、-80℃で保存して、KfoAとKfoFの菌体酵素とした。この2種の菌体リアクターと実施例1で得たK4CP菌体を混ぜ、CH6 0.1 nmol, UDP-[3H]GlcNAc 3 nmol (0.1 μCi), UDP-Glc 3 nmol, β-NAD+ 30 nmolを加え、150 mM NaCl, 0.2 mM MnCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 0.4 % Nymeen S-215(界面活性剤)となるよう全量100 μlに調製し、30℃で激しく攪拌しながら終夜合成反応を行った。反応液は10分間煮沸した後に15,000×gで1分間遠心し、上清を0.45 μm孔径のフィルター(ミリポア社製)を通して濾過した。各サンプルをSuperdex Peptide 10/300 GL(アマシャム社製)でサイズ分画した後に、各画分の3H含量をシンチレーションカウンターで計測し、CHポリマーの合成を確認した。生成物のSuperdex Peptideカラムにおける溶出曲線を図7に示す(C-ABC(-))。さらにその生成物をコンドロイチナーゼABC処理した後、上記と同様にして各画分の3H含量をシンチレーションカウンターで計測した。コンドロイチナーゼABC処理した生成物のSuperdex Peptideカラムにおける溶出曲線を図7に示す(C-ABC(+))。生成物のコンドロイチナーゼABC処理により高分子ピークが消失したことから、得られた高分子はCH多糖鎖であることが明確となった(図7)。
以上より、これら3つの酵素リアクターを用いた合成系により、UDP−GlcとUDP−GlcNAcを供与体基質として、受容体基質のCH6が伸長されて超高分子のCHポリマーが合成されたことが確認された。
Claims (19)
- 下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン糖鎖の製造方法。
工程:「グルクロン酸供与体」、「N−アセチルガラクトサミン供与体」、「糖受容体」及び「コンドロイチンを合成する菌体酵素」をナイミーン、MEGA−10、コール酸ナトリウム、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド、n−ノニル−β−D−チオマルトピラノシド、スクロースモノコール酸、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれる界面活性剤存在下において反応系中に共存させる。 - 「コンドロイチンを合成する菌体酵素」が、大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼを発現させた菌体酵素である、請求項1に記載の製造方法。
- 大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼが、K4CPである、請求項2に記載の製造方法。
- 菌体酵素として用いる宿主が、大腸菌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 大腸菌が、大腸菌TOP10株である、請求項4に記載の製造方法。
- 界面活性剤が、ナイミーン、n−ノニル−β−D−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 界面活性剤が、n−ノニル−β−D−チオマルトピラノシド、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 「共存」が、25〜37℃の条件下で1時間〜10日間行われることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 「共存」が、25〜37℃の条件下で10〜30時間行われることを特徴とする、請求
項1〜8のいずれか1項に記載の製造方法。 - 「共存」が、25〜37℃の条件下で15〜24時間行われることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の製造方法。
- 「グルクロン酸供与体」がUDP−グルクロン酸であり、かつ、「N−アセチルガラクトサミン供与体」がUDP−N−アセチルガラクトサミンである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
- UDP−グルコース4−エピメラーゼ及びUDP−N−アセチルグルコサミン、並びにUDP−グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP−グルコースを反応系中に共存させ、「N−アセチルガラクトサミン供与体」としてのUDP−N−アセチルガラクトサミン、及び「グルクロン酸供与体」としてのUDP−グルクロン酸を供給する、請求項11に記載の製造方法。
- さらに、キシレン、クロロホルム、パラフィン及びホルムアルデヒドからなる群から選ばれる1又は2以上の有機溶媒を共存させることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 共存させる有機溶媒が、クロロホルム又は「クロロホルム及びキシレン」であることを特徴とする、請求項13に記載の製造方法。
- 共存状態における有機溶媒の濃度が、0%超5%未満であることを特徴とする、請求項13又は14に記載の製造方法。
- 製造されるコンドロイチン糖鎖が、下記1)〜3)の全ての性質を有することを特徴とする、請求項1〜15のいずれか1項に記載の製造方法。
1)重量平均分子量:ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した場合、5万以上である。
2)コンドロイチナーゼABCで完全に二糖に分解される。
3)当該糖鎖をコンドロイチナーゼABCで分解して得られる産物を二糖分析すると、実質的に全てがコンドロイチン不飽和二糖に一致する。 - 重量平均分子量が7万5千以上である請求項16に記載の製造方法。
- 重量平均分子量が20万以上である請求項17に記載の製造方法。
- 「コンドロイチンを合成する菌体酵素」による酵素反応時に、ナイミーン、MEGA−10、コール酸ナトリウム、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド、n−ノニル−β−D−チオマルトピラノシド、スクロースモノコール酸、スクロースモノカプロン酸及びスクロースモノラウリル酸からなる群から選ばれる界面活性剤を共存させることを特徴とする、コンドロイチン合成の促進方法。
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