DE60319529T2

DE60319529T2 - Chondroitinsynthetase und das enzym codierende nukleinsäure

Info

Publication number: DE60319529T2
Application number: DE60319529T
Authority: DE
Inventors: Hisashi Tsukuba-shi NARIMATSU; Koji Nagoya-shi Kimata; Toshikazu Kuwana-shi YADA; Takashi Tsukuba-shi SATO; Masanori Tsukuba-shi GOTO
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2023-05-31
Also published as: EP1514939B1; US7470529B2; WO2003102193A1; DE60319529D1; EP1514939A4; JP4338038B2; AU2003241686A1; ATE388233T1; US20080070996A1; EP1514939A1; US7232676B2; JPWO2003102193A1; AU2003241686A8; US20060057697A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, das ein Zuckerketten-Rückgrat aus Chondroitin/Chondroitinsulfat synthetisiert (Grund-Rückgrat: nachfolgend ebenfalls bezeichnet als „Chondroitin-Rückgrat") und eine DNA, die das Enzym kodiert. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym, welches einen D-Glucuronsäurerest auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest transferiert, wenn der N-Acetyl-D-galactosamin-Rest am nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Rückgrats vorhanden ist, oder einen N-Acetyl-D-galctosamin-Rest auf einen D-Glucuronsäure-Rest transferiert, wenn der D-Glucuronsäurerest an dem nicht reduzierenden Ende vorhanden ist, und eine DNA, die das Enzym kodiert.
Hintergrund der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung sind hinsichtlich der Zucker und Zuckerreste, die hier verwendet werden, alle optischen Isomere D-Isomere, sofern nichts anderes angegeben ist.
Chondroitinsulfat und Chondroitin sind Glycosaminoglycan-Typen mit einer sich wiederholenden Struktur aus einem Disaccharid eines D-Glucuronsäure-Restes (nachfolgend manchmal einfach als „Glucuronsäure" oder „GlcUA" bezeichnet) und einem N-Acetyl-D-galactosamin-Rest (nachfolgend manchmal einfach als „N-Acetyl-galactosamin" oder „GalNAc" bezeichnet) als Grund-Rückgrat (d. h. -[GluUAβ(1,3)-GalNAcβ(1,4)-]_n ist eine ganze Zahl von 2 oder mehr).
Bis jetzt sind Glycosaminoglycane, insbesondere Chondroitin und Chondroitinsulfat aus Knorpeln, Organen und ähnlichen von Tieren extrahiert und gereinigt worden. Aufgrund eines Mangels an Materialien ist jedoch kürzlich ein Verfahren zum künstlichen Synthetisieren eines Chondroitin-Rückgrats, das Chondroitin und Chondroitinsulfat gemeinsam haben, untersucht worden. Insbesondere ist ein Verfahren unter Verwendung eines vom Menschen stammenden Enzyms bevorzugt, da ein biologischer Abwehrmechanismus, wie beispielsweise eine Antigen-Antikörper-Reaktion nicht so stark auftritt, selbst wenn das künstlich synthetisierte Chondrotin oder Chondroitinsulfat mit dem Enzym kontaminiert ist. Gegenwärtig ist nur ein Enzym dafür bekannt, dass es ein Enzym ist, das ein Chondroitin-Rückgrat synthetisiert, insbesondere ein Enzym, welches vom Menschen stammt und GlcUA transferierende Wirkung und GalNAc transferierende Wirkung (J. Biol. Chem., 276, 38721–38726 (2001)) aufweist.
Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines Cocktailsystems, welches mehrere Arten von Enzymen enthält, zur Synthese des Chondroitin-Rückgrats bevorzugt ist. Dies liegt daran, dass verschiedene optimale Reaktionsbedingungen der jeweiligen Enzyme die Reaktionsbedingungen des allgemeinen Reaktionssystems entspannen können. Jedoch ist nur das oben beschriebene Enzym gegenwärtig als ein Enzym bekannt, welches vom Menschen stammt und sowohl GlcUA transferierende Aktivität und GalNAc transferierende Aktivität besitzt, und es ist der gegenwärtige Zustand, dass Studien über die Synthese des Chondroitin-Rückgrats unzureichend sind, da die Schwierigkeit besteht, die Bedingungen strikt zu kontrollieren.
Demgemäß sind ein vom Menschen stammendes neues Enzym, welches ein Enzym für die Synthese eines Chondroitin-Rückgrats ist und das sowohl GlcUA transferierende Aktivität als auch GalNAc transferierende Aktivität aufweist, gewünscht worden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden (1) bis (14).

(1) Eine Chondroitinsynthase, die aus einem Polypeptid besteht, welches aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, oder eine Aminosäuresequenz, die aus dem Aminosäureresten 130 bis 882 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, besteht, oder ein Zuckerketten-gebundenes Polypeptid, bei dem die Zuckerkette an das Polypeptid gebunden ist.
(2) Eine Chondroitinsynthase, umfassend ein Polypeptid, das die enzymatische Aktivität des Transferierens eines N-Acetyl-D-galactosamin-Restes auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptor besitzt oder eine Enzymaktivität des Transferierens eines D-Glucuronsäurerestes auf einen D-Glucuronsäure-Akzeptor, und die aus einer Aminosäuresequenz besteht, welche eine Substitution, Deletion, Insertion, Addition und/oder Transposition von einer bis 150 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz hat, die aus den Aminosäureresten 130 bis 882 in der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
(3) Die Chondroitinsynthase gemäß (2), welche die Enzymaktivität des Transferierens eines N-Acetyl-D-galactosamin-Restes von einem N-Acetyl-D-Galactosamin-Donor auf einen D-Glucuronsäure-Rest von Chondroitin mit dem D-Glucuronsäure-Rest am nicht reduzierenden Ende besitzt, und die Enzymaktivität hat, einen D-Glucuronsäure-Rest von einem D-Glucuronsäure-Donor auf ein N-Actyl-D-galactosamin-Rest des Chondroitins mit dem N-Acetyl-D-galactosamin-Rest am nicht reduzierenden Ende, zu transferieren.
(4) Eine Nucleinsäure, welche die Chondroitinsynthase gemäß irgendeines aus (1) bis (3) kodiert.
(5) Expressionsvektor, welcher die Nucleinsäure gemäß (4) umfasst.
(6) Expressionsvektor gemäß (5), welcher in der Lage ist, in einer eukaryontischen Zelle exprimiert zu werden.
(7) Eine Transformante, welche den Expressionsvektor gemäß (5) oder (6) umfasst.
(8) Ein Verfahren zum Herstellen einer Chondroitinsynthase, welches das Züchten der Transformante gemäß (7) umfasst, um eine Chondroitinsynthase als Zuchtmaterial herzustellen und anzuhäufen, und das Gewinnen der Chondroitinsynthase aus dem Zuchtmaterial.
(9) Ein Verfahren zum Synthetisieren einer Zuckerkette mit einer Struktur, die durch die folgende Formel (2) dargestellt wird, welches umfasst, dass einer Chondroitinsynthase gemäß irgendeinem aus (1) bis (3) ermöglicht wird, auf einen N-Actyl-D-galactosamin-Akzeptor einzuwirken, der eine Struktur hat, die in der folgenden Formel (1) dargestellt ist, und einen N-Acetyl-D-galactosamin-Donor, um dadurch einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptor zu transferieren: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)worin in den Formeln (1) und (2) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest darstellt; GlcUA einen D-Glucuronsäure-Rest darstellt; n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist; m 1 oder 0 ist; und – eine Glycosidbindung darstellt.
(10) Verfahren zum Synthetisieren einer Zuckerkette mit einer Struktur, welche durch die folgende Formel (4) dargestellt wird, welches umfasst, dass einer Chondroitinsynthase gemäß irgendeinem aus (1) bis (3) ermöglicht wird, auf einen D-Glucuronsäure-Akzeptor einzuwirken, der eine Struktur hat, die in der folgenden Formel (3) dargestellt ist, und auf einen D-Glucuronsäure-Donor, um dadurch einene D-Glucuronsäure-Rest auf den D-Glucuronsäure-Akzeptor zu transferieren: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (4)worin in den Formeln (3) und (4) GalNAc einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest darstellt; GlcUA einen D-Glucuronsäure-Rest darstellt; n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist; m 1 oder 0 ist; und – eine Glucosidbindung darstellt.
(11) Verwendung der Chondroitinsynthase gemäß irgendeinem aus (1) bis (3) zur Synthese einer Zuckerkette mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (2) dargestellt ist, durch das Überführen eines N-Acetyl-D-galactosamin-Restes auf einen D-Glucuronsäure-Rest, welcher am nicht reduzierenden Ende eines N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptors vorhanden ist, und die Struktur hat, welche in der folgenden Formel (1) dargestellt ist: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)wobei in den Formeln (1) und (2) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest darstellt; GlcUA einen D-Glucuronsäurerest darstellt; n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist; m 1 oder 0 ist und – eine Glucosidbindung darstellt.
(12) Verwendung der Chondroitinsynthase gemäß irgendeinem aus (1) bis (3) zur Synthese einer Zuckerkette mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (4) dargestellt ist, durch das Überführen eines D-Glucuronsäure-Restes auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest, welcher am nicht reduzierenden Ende eines D-Glucuronsäure-Akzeptors vorhanden ist, mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (3) dargestellt ist: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (4)worin in Formel (3) und (4) GalNAc einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest darstellt; GlcUA den D-Glucuronsäure-Rest darstellt; n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist; m 1 oder 0 ist; und – eine Glycosidbindung darstellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Kurve, welche eine Chromatographie-Kurve zeigt, welche die Synthese von Sacchariden mit ungerader Zahl durch die GalNAc-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt. Die offenen Kreise stellen eine Kurve dar, welche die GalNAc-Transfer-Aktivität auf Chondroitinsulfat darstellt, die gefüllten Kreise stellen die Kurve dar, welche die GalNAc-Transfer-Aktivität auf Chondroitin darstellt, die offenen Dreiecke stellen die Kurve dar, welche die GalNAc-Transfer-Aktivität auf Chondroitinsulfat-deka-Saccharid zeigt, und die gefüllten Dreiecke stellen eine Kurve dar, welche die GalNAc-Transfer-Aktivität auf Chondroitin-deka-Saccharid zeigt.
2 ist eine Kurve, welche eine chromatographische Darstellung von undeka-Saccharid zeigt, welches durch die GalNAc-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms hergestellt wurde und dessen Chondroitinase ACII-Verdau, und die offenen Kreise stellen eine Kurve der Chondroitinase ACII unverdauten undeka-Saccharide dar, und die gefüllten Kreise stellen eine Kurve des verdauten Produktes nach Chondroitinase ACII-Verdau dar.
3 ist ein Graph, welche eine chromatographische Kurve zeigt, welche die Synthese von geradzahligen Sacchariden durch die GlcUA-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt. Die offenen Kreise stellen eine Kurve dar, welche die GlcUA-Transfer-Aktivität auf Chondroitinsulfat zeigt, die gefüllten Kreis zeigen eine Kurve, welche die GlcUA-Transfer-Aktivität auf Chondroitin zeigt, die offenen Dreiecke stellen eine Kurve dar, welche die GlcUA-Transfer-Aktivität auf Chondroitinsulfat-undeka-Saccharid zeigt und die gefüllten Dreiecke stellen eine Kurve dar, welche die GlcUA-Transfer-Aktivität auf Chondroitin-undeka-Saccharid zeigt.
4 ist eine Kurve, welche eine chromatographische Kurve eines dodeka-Saccharids zeigt, welches durch die GlcUA-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms hergestellt wurde und dessen Chondroitinase ACII-Verdau. Die offenen Kreise stellen eine Kurve der nicht mit Chondroitinase ACII verdauten dodeka-Saccharide dar, und die gefüllten Kreise stellen eine Kurve des verdauten Produktes nach dem Chondroitinase ACII-Verdau dar.
5 ist eine Kurve, welche den optimalen pH-Wert der GlcUA-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt. Die offenen Kreise stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Acetatpuffers dar, die gefüllten Kreise stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung von MES-Puffer dar, die offenen Dreiecke stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Imidazolpuffers dar und die gefüllten Dreiecke stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Tris-Puffers dar.
6 ist eine Kurve, welche den optimalen pH-Wert der GalNAc-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt. Offene Kreise stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Acetatpuffers dar, die gefüllten Kreise stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines MES-Puffers dar, die offenen Dreiecke stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Imidazolpuffers dar, und die gefüllten Dreiecke stellen den optimalen pH-Wert unter Verwendung eines Tris-Puffers dar.
7 ist eine Kurve, welche den Einfluss von divalenten Kationen auf die Aktivitäten des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt. Die offenen Balken zeigen die GlcUA-Transfer-Aktivität und die gefüllten Balken zeigen die GalNAc-Transfer-Aktivität an.
8 ist eine Kurve, welche den Einfluss der Manganionen-Konzentration auf die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Enzyme zeigt. Die offenen Kreise stellen den Einfluss auf die GlcUA-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms dar und die gefüllten Kreise stellen den Einfluss auf die GalNAc-Transfer-Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms dar.
9 ist eine Kurve, welche die Expressionswerte des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt, die in jeweiligen Geweben einer gesunden Person bestimmt wurden.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, haben die vorstelligen Erfinder intensive Studien durchgeführt und als Ergebnis herausgefunden, dass es ein anderes Enzym mit einer Enzymaktivität gibt, die ähnlich der der konventionell bekannten Chondroitinsynthase ist. Danach wurde die vorliegende Erfindung durch Gewinnen einer DNA für das Enzym und Herstellen des Enzyms ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail auf Grundlage der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
(1) Enzym der vorliegenden Erfindung
Das Enzym der vorliegenden Erfindung ist eine Chondroitinsynthase, welche aus einem Polypeptid besteht, welches aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird oder eine Aminosäuresequenz, die aus den Aminosäureresten 130 bis 882 in der Aminosäuresequenz besteht, welche durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, oder ein Zuckerketten-gebundenes Polypeptid, bei dem eine Zuckerkette an das Polypeptid gebunden ist.
Das erfindungsgemäße Enzym zeigt die Aktivität des Überführens von GalNAc und die Aktivität des Überführens von GlcUA (die Aktivität des Transferierens von GalNAc wird als „GalNAc transferierende Aktivität" bezeichnet und die Aktivität des Transferierens von GlcUA wird als „GlcUA transferierende Aktivität" bezeichnet) auf Zuckerreste, die am nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Rückgrats vorhanden sind. Das bedeutet, dass das erfindungsgemäße Enzym die Aktivität des Transferierens von GalNAc auf einen GlcOA-Rest zeigt, wenn der GlcUA-Rest am nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Rückgrats vorhanden ist, und die Aktivität des Transferierens von GlcUA auf einen GalNAc-Rest zeigt, wenn der GalNAc-Rest an dem nicht reduzierenden Ende vorhanden ist. Deshalb ist ein derartiges Enzym am wertvollsten beim Synthetisieren des Chondroitin-Rückgrats.
Demgemäß ist es bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Enzym sowohl einen GalNAc-Akzeptor mit einem GlcUA-Rest am nicht reduzierenden Ende des Chondroitin-Rückgrats verwendet und einen GlcUA-Akzeptor mit einem GalNAc-Rest an dem nicht reduzierenden Ende als Zuckerreste-Akzeptoren.
Der GalNAc-Akzeptor des erfindungsgemäßen Enzyms hat beispielsweise eine Struktur, die in der folgenden Formel (1) dargestellt ist: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1)
In der Formel (1) stellt GlcUA einen D-Glucuronsäure-Rest dar; GalNAc einen N-Acetyl-D-galctosamin-Rest; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – stellt eine Glycosidbindung dar. In dem GalNAc-Akzeptor ist das oben beschriebene n vorzugsweise 2 oder mehr und mehr bevorzugt 4 oder mehr. Das liegt daran, dass das Chondroitin-Rückgrat wirksam verlängert werden kann, wenn es innerhalb eines derartigen Bereichs liegt. Beispiele des GalNAc-Akzeptors mit der Struktur der Formel (1) schließen Chondroitin, Chondroitinsulfat und ein Chondroitin oder Chondroitinsulfat mit verringertem Molekulargewicht ein, welche durch Verdauen derselben gewonnen werden, obwohl sie nicht darauf beschränkt sind.
Das erfindungsgemäße Enzym transferiert einen GalNAc-Rest von einem GalNAc-Donor auf einen GalNAc-Akzeptor mit der Struktur der Formel (1). Da das erfindungsgemäße Enzym beim Synthetisieren des Chondroitin-Rückgrats nützlich ist, wird es bevorzugt, dass der GalNAc-Rest auf einen GlcUA-Rest am nicht reduzierenden Ende durch eine β1,4-Glycosid-Bindung transferiert wird.
Der GalNAc-Donor ist vorzugsweise ein Zuckernucleotid mit dem GalNAc-Rest. Beispiele einer derartigen Substanz schließen Adenosindiphosphat-N-acetylgalactosamin (ADP-GalNAc), Uridindiphosphat-N-acetylgalactosamin (UDPO-GalNAc), Guanosindiphosphat-N-acetylgalactosamin (GDP-GalNAc), Cytidindiphosphat-N-acetylgalactosamin (CDP-GalNAc) und ähnliche ein und UDP-GalNAc ist am meisten bevorzugt. Dies liegt daran, dass UDP-GalNAc hauptsächlich als ein GalNAc-Donor in der in vivo Synthese des Chondroitin-Rückgrats dient. Jedoch ist bezüglich der GalNAc-transferierenden Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms der GalNAc-Donor nicht besonders beschränkt, sofern er einen GalNAc-Rest bereitstellen kann.
Eine Zuckerkette mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (2) dargestellt ist, wird gewonnen, wenn ein GalNAc-Rest durch das erfindungsgemäße Enzym auf einen GalNAc- Akzeptor transferiert wird, welcher eine Struktur hat, die in der oben beschriebenen Formel (1) dargestellt ist: GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)
In der Formel (2) haben GlcUA, GalNAc, n, m und – die gleichen Bedeutungen, wie oben beschrieben.
Der GalNAc-Akzeptor hat eine Struktur, welche in der oben beschriebenen Formel (1) dargestellt ist, und eine Substanz mit einer Struktur, in der eine Zuckerkette, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische hochmolekulargewichtige Verbindung oder ähnliche weiter daran gebunden sind, können ebenfalls als GalNAc-Akzeptor verwendet werden. Wenn ein GalNAc-Rest auf den GalNAc-Akzeptor transferiert wird, wird eine Verbindung mit einer Struktur, die durch die oben beschriebene Formel (2) dargestellt wird und ebenfalls eine Zuckerkette hat, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische hochmolekulargewichtige Verbindung oder ähnliche am reduzierenden Ende gewonnen.
Die GalNAc-transferierende Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms kann leicht unter Verwendung einer Technik gemessen und nachgewiesen werden, in der GalNAc mit einem Radioisotop markiert ist, wie in dem Verfahren, das in Beispiel 2 (1) dieser Beschreibung beschrieben ist.
Der GlcUA-Akzeptor des erfindungsgemäßen Enzyms umfasst beispielsweise eine Strukur, die durch die folgende Formel (3) dargestellt wird: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3)
In der Formel (1) stellt GlcUA einen D-Glucuronsäure-Rest; GalNAc stellt einen N-Acetyl-D-galacotsamin-Rest; n eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0; und – stellt eine Glucosidbindung dar. In dem GlcUA-Akzeptor ist das oben beschriebene n vorzugsweise 2 oder mehr und mehr bevorzugt 4 oder mehr. Das liegt daran, dass das Chondroitin-Rückgrat effizient verlängert werden kann, wenn es innerhalb eines solchen Bereichs liegt.
Beispiele des GlcUA-Akzeptors mit der Struktur der Formel (3) schließen Chondroitin, Chondroitinsulfat oder Chondroitin oder Chondroitinsulfat mit niedrigerem Molekulargewicht ein, welche gewonnen werden, indem sie gespalten werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Das erfindungsgemäße Enzym transferiert einen GlcUA-Rest von einem GlcUA-Donorsubstrat auf einen GlcUA-Akzeptor mit der Struktur, welche in Formel (3) dargestellt ist. Da das erfindungsgemäße Enzym nützlich ist bei der Synthetisierung eines Chondroitin-Rückgrats, ist es bevorzugt, dass der GlcUA-Rest durch eine β1,3-Glycosidbindung auf den GalNAc-Rest transferiert wird.
Der GlcUA-Donor ist vorzugsweise ein Zuckernucleotid mit einem GlcUA-Rest. Beispiele für eine solche Substanz schließen Adenosindiphosphat-N-glucuronsäure (UDP-GlcUA), Guanosindiphosphat-N-glucuronsäure (GDP-GlcUA), Cytidindiphosphat-N-glucuronsäure (CDP-GlcUA) und ähnliche ein, und UDP-GlcUA ist am meisten bevorzugt. Dies liegt daran, dass UDP-GlcUA hauptsächlich als GlcUA-Donor in der in vivo Synthese des Chondroitin-Rückgrats wirkt. Jedoch ist bezüglich der GlcUA-transferierenden Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms der GlcUA-Donor nicht besonders beschränkt, sofern er den GlcUA-Rest bereitstellen kann.
Eine Zuckerkette mit einer Struktur der folgenden Formel (4) wird gewonnen, wenn ein GlcUA-Rest durch das erfindungsgemäße Enzym auf einen GlcUA-Akzeptor überführt wird, der eine Struktur hat, die in der oben beschriebenen Formel (3) dargestellt ist: GlcUA-(GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (4)
In der Formel (4) haben GlcUA, GalNAc, n, m und – die gleichen Bedeutungen, wie oben beschrieben.
Auch der GlcUA-Akzeptor hat eine Struktur, die in der oben beschriebenen Formel (3) dargestellt ist, und eine Substanz mit einer Struktur, in der eine Zuckerkette, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische hochmolekulargewichtige Verbindung oder ähnliche ferner daran gebunden ist, kann ebenfalls als GlcUA-Akzeptor verwendet werden. Wenn ein GlcUA-Rest auf einen solchen GlcUA-Akzeptor überführt wird, wird eine Verbindung mit einer Struktur, die durch die oben beschriebene Formel (4) dargestellt wird und ebenfalls eine Zuckerkette, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische hochmolekulargewichtige Verbindung oder ähnliche am reuzierenden Ende hat, gewonnen.
Die GlcUA-transferierende Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms kann leicht unter Verwendung einer Technik gemessen werden, in der GlcUA mit einem Radioisotop markiert wird, wie im Verfahren, das in Beispiel (2) dieser Beschreibung beschrieben ist.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Enzym ein Polypeptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus den Aminosäureresten 130 bis 882 in der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, besteht. Dies liegt daran, dass ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines derartigen Bereichs umfasst, sowohl die oben beschriebene GalNAc-transferierende Aktivität und die GlcUA-transferierende Aktivität aufweist (siehe Beispiel 2 dieser Beschreibung).
Im Allgemeinen wird die Aktivität eines Enzyms bewahrt, selbst wenn es ein Protein bildet, das geringe Substitution, Deletion, Insertion, Addition und/oder Transposition von Aminosäuren hat (nachfolgend allgemein bezeichnet als „Aminosäuremutation"), und ein Enzym, das eine derartige Aminosäuremutation hat, wird als Variante bezeichnet. Im Allgemeinen wird die Enzymaktivität ausreichend bewahrt, wenn die Aminosäuremutation ungefähr 20% der gesamten Anzahlen der Aminosäuren beträgt, sofern es nicht eine Mutation ist, die das aktive Zentrum betrifft. Demgemäß kann sofern es die oben beschriebene GalNAc-transferierende Aktivität und GlcUA-transferierende Aktivität hat, das Enzym der vorliegenden Erfindung ebenfalls einige wenige Aminosäuremutationen in der Aminosäuresequenz haben, die aus den Aminosäureresten 130 bis 882 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, besteht (es ist möglich, das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Enzymaktivität gemäß Beispiel 2 dieser Beschreibung, wie oben beschrieben wurde, zu messen). Ebenfalls sind die oben beschriebenen „einige wenige" 20% oder weniger der gesamten Anzahl an Aminosäuren, die das Enzym bilden (150 oder weniger im Fall des Polypeptids, das aus den Amionsäureresten 130 bis 882 der SEQ ID Nr. 2 besteht, d. h. eine Homologie von 80% oder mehr), vorzugsweise 15% oder weniger (112 oder weniger im Fall des Polypeptids, das aus den Aminosäureresten 130 bis 882 in SEQ ID Nr. 2 besteht, d. h. eine Homologie von 85% oder mehr), und am meisten bevorzugt 10% oder weniger (75 oder weniger im Fall des Polypeptids, das aus den Aminosäureresten 130 bis 822 der SEQ ID Nr. 2 besteht, d. h. eine Homologie von 90% oder mehr). Die Homologie der Aminosäuresequenzen kann leicht unter Verwendung konventionell bekannter Computersoftware, wie beispielsweise FASΤA, berechnet werden. Computersoftware wie FASIA wird ebenfalls im Internet vertrieben.
Außerdem kann gesagt werden, dass ein Enzym, das aus einem Polypeptid gebildet wird, das aus der vollständigen Sequenz der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist, ebenfalls aus einem Polypeptid gebildet wird, das durch einige wenige Mutationen gewonnen wird, welche in dem Polypeptid erzeugt wurden, welches aus den Aminosäureresten 130 bis 882 besteht, und es kann behauptet werden, dass dies innerhalb des Bereichs eines bevorzugten Polypeptids als erfindungsgemäßes Enzym liegt.
Zusätzlich gibt es viele vom Säuger abstammende Proteine, an die Zuckerketten gebunden sind, und sowohl das Enzym, das aus dem Polypeptid alleine besteht, und das Enzym, bei dem eine Zuckerkette an das Polypeptid gebunden ist, sind von dem erfindungsgemäßen Enzym umfasst.
Ebenfalls ist es bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Enzym die folgenden Eigenschaften hat.
Aktivitätsanstieg:
Die Aktivität steigt an, wenn 10 mmol/l eines divalenten Metallkations (vorzugsweise eines Manganions oder Kobaltions) in dem Reaktionssystem vorhanden ist. Genauer gesagt kann ein Halid (wie beispielsweise Chlorid) des oben erwähnten Metallkations in dem Reaktionssystem vorhanden sein.
Inhibierung der Aktivität:
Die Enzymaktivität geht wesentlich verloren, wenn 10 mmol/l der Konzentration an Ethylendiamintetraessigsäure in dem Reaktionssystem vorhanden ist.
Optimaler pH-Wert:
Die GlcUA-transferierende Enzymaktivität liegt bei von pH 5,7 bis 6,7, vorzugsweise von pH 6,0 bis 6,5, in einem 2-Morpholinoethansulfonat (MES)-Puffer, und die GalNAc-transferierende Enzymaktivität liegt bei pH 5,7 bis 6,7, vorzugsweise von pH 6,0 bis 6,4 in einem MES-Puffer.
Zusätzlich kann durch die Verwendung eines die Aktivität messenden Systems des erfindungsgemäßen Enzyms eine Substanz mit Aktivität zur Beschleunigung oder Inhibierung der Enzymaktivität durch das Screening gewonnen werden. Es ist möglich, eine derartige Substanz als wirksamen Inhaltsstoff eines Aktivitäts-kontrollierenden Mittels für das erfindungsgemäße Enzym zu verwenden. Außerdem kann das Aktivitäts-kontrollierende Mittel als Mittel zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch eine Veränderung der Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms verursacht werden.
(2) Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure wird dadurch gekennzeichnet, dass sie das Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert.
Das bedeutet, dass die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung nicht besonders beschränkt ist, soforn sie als Enzym der vorliegenden Erfindung durch Expression in einer Transformante hergestellt werden kann, welche mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der die Nucleinsäure oder Nucleinsäure mit einer dazu komplementären Nucleotidsequenz enthält. Die Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls entweder eine DNA oder eine RNA sein, aber eine DNA wird bevorzugt, da sie in der Stabilität merklich hervorsticht.
Die vorliegenden Ausführungsformen der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung schließen eine DNA ein, die aus den Nucleotidresten 388 bis 2.649 der Nucleotidsequenz bestehen, welche durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, und eine DNA, die aus der vollständigen Nucleotidsequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird.
Im Übrigen ist bei der Biosynthese eines Proteins der genetische Code (Triplet) und der Aminosäure nicht immer 1:1, und es gibt Fälle, in denen die gleiche Aminosäure verschiedenen Triplets entspricht (Degeneriertheit des genetischen Codes). Demgemäß kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht verstanden werden, dass eine Nucleinsäure, die anders ist als die beispielhaft angegebene spezifische Nucleotidsequenz, welche ein anderes Triplet enthält, was der gleichen Aminosäuresequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes entspricht, verwendet werden kann, um das gleiche Enzym der vorliegenden Erfindung als Ergebnis zu gewinnen, und es ist überflüssig zu erwähnen, dass eine derartige Nucleinsäure in die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist.
Eine Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die aus den Nucleotidresten 388 bis 2.649 der Nucleotidsequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, oder eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die komplementär dazu ist, kann verwendet werden, um beispielsweise als eine Sonde zum Untersuchen der in vivo Expressionsstatus und ähnlicher im Hinblick auf die erfindungsgemäße Nucleinsäure verwendet werden, und sie ist als Reaktionsmittel äußerst nützlich. Da die Nucleinsäure als Sonde schwer zu handhaben ist, wenn ihr Molekulargewicht zu groß ist, beträgt das Molekulargewicht beispielsweise 500 bp bis 10 kbp, mehr bevorzugt 600 bp bis 9 kbp, und am meisten bevorzugt von 700 bp bis 8 kbp.
In diesem Zusammenhang schließen die stringenten Bedingungen, so wie sie hier verwendet werden, Bedingungen ein, die allgemein in Hybridisierungstechniken verwendet werden (z. B. Northern-Blot-Hybridisierung und Southern-Blot-Hybridisierung), und bevorzugte Bedingungen sind Bedingungen bei 42°C in Gegenwart von 37,5% Formamid, 5 × SSPE (Natriumchlorid/Natriumphosphat/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)-Puffer), 5 × Denhardt's Lösung und 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat).
(3) Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor ist ein Expressionsvektor, welcher die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst. In dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung sind die Bereiche, die mit der Genexpression zusammenhängen (Promotorbereich, Enhancerbereich, Operatorbereich etc.) passend arrangiert, so dass die oben beschriebene Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung in einer Wirtszelle von Interesse exprimiert werden kann, und der Vektor wird in einer derartigen Weise konstruiert, dass die erfindungsgemäße Nucleinsäure entsprechend exprimiert werden kann. Demgemäß kann eine Transformante durch Einschleusen des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung in eine geeignete Wirtszelle gewonnen werden. Ein Basalvektor des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung (ein Vektor vor dem Überführen des Gens der vorliegenden Erfindung) wird gegebenenfalls in Bezug auf die Wirtszelle ausgewählt, in die der Expressionsvektor eingeschleust ist. Beispielsweise wird ein Vektor für eukaryontische Zellen als Basalvektor ausgewählt, wenn eine eukaryontische Zelle (Säugerzelle, Hefe, Insektenzelle etc.) als Wirtszelle verwendet wird, und ein Vektor für prokaryontische Zellen wird als Basalvektor ausgewählt, wenn eine prokaryontische Zelle (Escherichia coli, Bacillus subtilis etc.) als Wirtszelle verwendet wird. Im Übrigen wird, da das erfindungsgemäße Enzym ein Enzym ist, das aus einem Menschen stammt, in Erwägung gezogen, dass ein erfindungsgemäßes Enzym Eigenschaften hat, die dem natürlichen Gegenstück nahekommen (z. B. Zuckerketten hinzugefügte Ausführungsform etc.) und gewonnen werden kann, wenn eine eukaryontische Zelle in der vorliegenden Erfindung als Wirtszelle verwendet wird. Demgemäß wird eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Säugerzelle, vorzugsweise als Wirtszelle ausgewählt, und ein Vektor für eine eukaryontische Zelle, insbesondere ein Vektor für eine Säugerzelle, wird vorzugsweise als Grundvektor des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
In diesem Zusammenhang sind in den vergangenen Jahren Techniken etabliert worden, wie beispielsweise genetische Rekombinationstechniken, in denen eine Transformante kultiviert oder gezüchtet wird, und die Substanz von Interesse wird aus der Kultur oder dem Zuchtmaterial isoliert und gereinigt. Es ist bevorzugt, den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung in einer derartigen Weise zu konstruieren, dass die Isolierung und Reinigung des Enzyms der vorliegenden Erfindung leicht wird. Insbesondere ist es bevorzugt, das erfindungsgemäße Enzym mit Hilfe der genetischen Rekombination unter Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors herzustellen, welcher in solch einer Form konstruiert worden ist, dass das erfindungsgemäße Enzym als Fusionsprotein mit einem Markerpeptid exprimiert wird, da dessen Isolierung, Reinigung und Detektion relativ leicht wird.
Beispiele des oben beschriebenen Markerpeptids schließen ein Peptid ein, welches die Sekretion, Isolierung, Reinigung oder Detektion des Proteins von Interesse aus dem Zuchtmaterial einer Transformante leicht macht, indem es als Fusionsprotein exprimiert wird, indem das Peptid an das Protein von Interesse gebunden ist, beim Herstellen des Proteins von Interesse durch genetische Rekombination. Beispiele des Markerpeptids schließen Peptide, wie beispielsweise ein Signalpeptid ein (Peptid bestehend aus 15 bis 30 Aminosäureresten, welches am N-Terminus zahlreicher Proteine vorhanden ist und innerhalb der Zellen in dem intrazellulären Membran-Permeationsmechanismus für die Auswahl von Protein funktioniert, z. B. OmpA, OmpT, Dsb etc.), Proteinkinase A, Protein A (Protein, das als konstituierender Bestandteil der Zellwand von Staphylococcus aureus bekannt ist, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 42.000), Glutathion S-Transferase, His-Tag (Sequenz, in der 6 bis 10 Histidinreste arrangiert sind), Myc-Tag (vom cMyc-Protein abstammende Sequenz aus 13 Aminosäureresten), FLAG-Peptid (ein Marker für die Analyse, bestehend aus 8 Aminosäureresten), T7-Tag (bestehend aus den ersten 11 Aminosäureresten des Gen 10 Proteins), S-Tag (bestehend aus 15 Aminosäureresten, die von der Pancreas-RNAse A stammen), HSV-Tag, pelB (eine Sequenz aus 22 Aminosäureresten des äußeren Membranproteins Escherichia coli von, pelB), HA-Tag (bestehend aus 10 Aminosäureresten, die von Hämagglutinin abstammen), Trx-Tag (Thioredoxinsequenz), CBP-Tag (Calmodulin bindendes Peptid), CBD-Tag (Cellulose bindende Domäne), CBR-Tag (Collagen bindende Domäne), β-lac/blu (β-Lactamase), β-gal (β-Galactosidase), luc (Luciferase), HP-Thio (His-Patch Thioredoxin), HSP (Hitze-Schock-Peptid), Lnγ (Laminin-γ-Peptid), Fn (Fibronectin-Teilpeptid), GFP (grün fluoreszierendes Peptid), YFP (gelb fluoreszierendes Peptid), CFP (blaugrün fluoreszierendes Peptid), BFP (blau fluoreszierendes Peptid), DsRed, DsRed 2 (rot fluoreszierendes Peptid), MBP (Maltose-bindendes Peptid), LacZ (Lactose-Operator), IgG (Immunglobulin G), Avidin und Protein G und jedes dieser Markerpeptide kann verwendet werden. Von diesen wird ein Signalpeptid, Proteinkinase A, Protein A, Glutathion S-Transferase, His-Tag, myc-Tag, FLAG-Peptid, T7-Tag, S-Tag, HSV-Tag, pelB oder HA-Tag bevorzugt, da es die Expression der Substanz der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der Genrekombinationstechniken und dessen Reinigung erleichtert, und es ist besonders bevorzugt, das erfindungsgemäße Enzym als Fusionsprotein mit dem FLAG-Peptid herzustellen, da dies eine merklich herausragende Handhabbarkeit verleiht.
Beispiele des Basalvektors, welche in Säugerzellen exprimiert werden können und das erfindungsgemäße Enzym bereitstellen kann als Fusionsprotein mit dem oben beschriebenen FLAG-Peptid schließen pFLAG-CMV-1 (hergestellt von Sigma) und ähnliche ein, aber es ist möglich für Fachleute auf dem Gebiet, einen geeigneten Basalvektor durch Beurteilung der Wirtszelle, des Restriktionsenzyms, des Markerpeptids und ähnlicher auszuwählen, die in der Expression des erfindungsgemäßen Enzyms verwendet werden.
(4) Verfahren zur Herstellung der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung, des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung und der Transformante
Da die Nucleotidsequenz der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung durch die vorliegende Erfindung offenbart worden ist, ist es für Fachleute auf dem Gebiet möglich, gegebenenfalls Primer herzustellen, die auf den Nucleotidsequenzen beider Termini einer Region der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung beruhen, oder einer Nucleinsäure, die herzustellen ist, und um den Bereich von Interesse durch Amplifizieren derselben durch PCR oder ähnliche unter Verwendung von Primern herzustellen. Eine DNA, die aus den Nucleotidresten 388 bis 2.649 der SEQ ID Nr. 1 besteht, als bevorzugte Ausführungsform der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann wie folgt hergestellt werden.
Eine Teilsequenz der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann durch Durchführen einer BLAST-Recherche unter Verwendung der Aminosäuresequenz einer bekannten β1,4-Galactosyltransferase (β4Gal-T) (Aminosäuresequenz kodiert durch GenBank Accession No. D29805) als Anfrage durchgeführt werden. Danach kann die genomische Sequenz aus einer Datenbank herausgesucht werden, beispielsweise auf Grundlage des ESTs, der hierdurch gewonnen wird (GenBank Accession No. AC004219, etc.). Die genomische Sequenz kann beispielsweise unter Verwendung von GenScan (Stanford University, USA) oder ähnlicher gesucht werden. Die gesamte Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, kann durch dieses Verfahren gewonnen werden. Die DNA, die aus den Nucleotidresten 388 bis 2.649 besteht, kann durch Herstellen von Primern von der Nucleotidsequenz hergestellt werden, welche auf diese Weise gewonnen wurde. Als Herstellungsverfahren von DNA kann beispielsweise vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktionsmethode (nachfolgend bezeichnet als „PCR-Methode") erwähnt werden. In dem PCR-Verfahren ist es bevorzugt, dass geeignete Restriktionsenzym-Schnittstellen in den entsprechenden Primern vor denen, die dem Vektor entsprechend enthalten sind, um die Einschleusung der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung in den Vektor zu erleichtern. Beispiele der Primer schließen die Nucleotidsequenz ein, die durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt wird (enthaltend eine HindIII-Schnittstelle) als 5'-Primer, und die Nucleotidsequenz, welche durch SEQ ID Nr. 4 dargestellt wird (enthaltend die XbaI-Schnittstelle) als 3'-Primer.
Zum Beispiel kann aus den Informationen einer Datenbank gefunden werden, dass das Genom, welches durch die Recherche, beruhend auf dem EST der GenBank Accession No. AC004219, gewonnen wurde, durch GenScan im menschlichen Hirn exprimiert wird. Demgemäß kann eine kommerziell erhältliche menschliche Hirn-cDNA-Bibliothek (z. B. Marathon-Ready cDNA human brain (hergestellt von Clontech, etc.)) oder ähnliche als Matrize für das PCR-Verfahren verwendet werden.
Wenn das PCR-Verfahren durchgeführt wird, indem die Primer, die oben beispielhaft angegeben wurden, verwendet werden, wird die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung (DNA) als amplifziertes Produkt von ungefähr 2,3 kb gebildet. Das amplifizierte Produkt kann nach gewöhnlichen Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Abtrennen der DNA auf Grundlage des Molekulargewichts, wie beispielsweise durch Agarosegel-Elektrophorese, Ausschneiden aus dem Gel und Extraktion der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung.
Da die oben beispielhaft angegebenen Primer HindIII- und XbaI-Schnittstellen enthalten, kann die Insertion in einen Vektor mit HindIII- und XbaI-Schnittstellen in gewöhnlicher Weise durch Behandlung mit diesen Restriktionsenzymen durchgeführt werden. Beispielsweise kann, da pFLAG-CMV-1 als Grundvektor, welcher oben beispielhaft angegeben wurde, HindIII- und XbaI-Schnittstellen enthält, der Vektor der vorliegenden Erfindung durch Verdauen dieses Grundvektors mit HindIII und XbaI sowie durch das Ligieren desselben mit der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung gewonnen werden.
Der erfindungsgemäße Vektor kann in eine Wirtszelle mit einem gewöhnlichen Verfahren eingeführt werden. Wenn pFLAG-CMV-1 als Grundvektor verwendet wird, kann eine Transformante durch Einschleusen derselben in eine von einem Säuger stammende Zelle gewonnen werden, wie beispielsweise eine COS1-Zelle oder COS7-Zelle, welche als Wirtszelle für pFLAG-CMV-1 dient, mit einem gewöhnlichen Verfahren, wie beispielsweise der Elektroporation.
(5) Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen Enzyms
Das Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen Enzyms wird dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäße Transformante gezüchtet wird, das Enzym der Erfindung hergestellt wird und in dem Zuchtmaterial akkumuliert wird, und dann wird das oben beschriebene erfindungsgemäße Enzym aus dem Zuchtmaterial isoliert.
Das erfindungsgemäße Enzym kann durch Züchten einer Transformante unter geeigneten Wachstumsbedingungen hergestellt werden, durch das Exprimieren der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung und dann durch das Herstellen des Produktes aus dem Zuchtmaterial.
In diesem Fall ist das Wachstum einer Wirtszelle eine allgemeine Idee, welche nicht nur das Kultivieren der Wirtszelle einschließt, sondern auch die Verabreichung der Wirtszelle oder eines lebenden Körpers oder ähnlicher und das anschließende Wachstum der Wirtszelle in vivo. Zusätzlich ist das Zuchtmaterial eine allgemeine Idee, welches nicht nur eine kultivierte Wirtszelle einschließt und einen Kulturüberstand, sondern auch, wenn die Wirtszelle in vivo gezüchtet wird, ausgeschiedene Substanzen, sezernierte Substanzen und ähnliche des lebenden Körpers.
Wenn beispielsweise eine COS7-Zelle als Wirtszelle ausgewählt wird, ist es möglich, die Transformante in vitro zu kultivieren, und die erfindungsgemäße Substanz aus diesem Zuchtmaterial zu reinigen (Transformante und Kulturüberstand nach dessen Kultivierung). Als Verfahren zur Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms ist es gegebenenfalls möglich, ein geeignetes konventionelles Verfahren auszuwählen, abhängig von dem Markerpeptid. Insbesondere, wenn der oben beschriebene pFLAG-CMV-1-Vektor verwendet wird, wird das erfindungsgemäße Enzym als Fusionsprotein mit dem FLAG-Peptid gewonnen, so dass es möglich ist, das erfindungsgemäße Enzym von der erfindungsgemäßen Substanz durch ein Verfahren, wie beispielsweise Affinitätsreinigung, beispielsweise unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörpers (z. B. M1 etc.) zu isolieren und zu reinigen. Wenn ein Harz oder ähnliches, an das ein Anti-FLAG-Antikörpergebunden ist, verwendet wird, ist es möglich, das Protein aus den kultivierten Materialien der Wirtszelle (Kulturüberstand, Extrakte der Wirtszelle etc.) leicht zu isolieren und zu reinigen, und es ist ebenfalls möglich, das Harz als Enzymsuspension durch direktes Suspendieren desselben in einem Puffer oder ähnlicher zu verwenden.
(6) Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung
(a) Syntheseverfahren 1 der vorliegenden Erfindung
Das Syntheseverfahren 1 der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Synthetisierung einer Zuckerkette mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (2) gegeben ist, dadurch gekennzeichnet, dass das erfindungsgemäßen Enzym ermöglicht wird, auf einen GalNAc-Akzeptor einzuwirken, der die Struktur hat, welche in der folgenden Formel (1) dargestellt ist, und auf einen GalNAc-Donor, um dadurch einen GalNAc-Rest vom GalNAc-Donor auf den GalNAc-Akzeptor zu überführen: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)
In den Formeln (1) und (2) stellt GalNAc einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest dar; GlcUA stellt einen D-Glucuronsäure-Rest dar; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – stellt eine Glycosidbindung dar.
Nach dem Syntheseverfahren 1 der vorliegenden Erfindung ist der GalNAc-Akzeptor nicht besonders beschränkt, sofern er eine Zuckerkette der oben beschriebenen Formel (1) als Gegenstand hat, auf den der GalNAc-Rest transferiert wird, GlcUA-transferierende Enzymaktivität und es kann ein Material sein mit einer Struktur, in der eine Zuckerkette, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder ähnliche weiter an dessen reduzierendes Ende gebundes ist.
Wenn der GalNAc-Rest vom GalNAc-Donor transferiert wird, indem dem erfindungsgemäßen Enzym ermöglicht wird, auf den GalNAc-Akzeptor der oben beschriebenen Formel (1) einzuwirken, wird eine Verbindung mit einer Struktur, die in der oben beschriebenen Formel (2) dargestellt ist, gewonnen.
Das Chondroitin-Rückgrat besteht aus einer Struktur, in der ein Disaccharid, das durch den GlcUA-Rest und den GalNAc-Rest durch eine β1,3-Glycosidbindung gewonnen wurde, weiter durch eine a β1,4-Glycosidbindung gebunden wird, und es ist bevorzugt, dass der GalNAc-Rest in einer solchen Zuckerkette ebenfalls im Fall des Syntheseverfahrens 1 der vorliegenden Erfindung gebunden werden kann. Das bedeutet, dass es mehr bevorzugt wird, dass der GalNAc-Akzeptor die Struktur der oben beschriebenen Formel (1) hat und eine Struktur der folgenden Formel (1') hat: (4GlcUAβ1-3GalNAcβ1)_n-4(GlcUA)_m (1')
In der Formel (1') haben GlcUA, GalNAc und – die gleichen Bedeutungen wie die, die in der oben beschriebenen Formel (1) beschrieben wurden; β stellt eine β-Bindung dar; und die Nummernzeichen weisen auf die Bindungspositionen der angehängten Zuckerreste hin (Position, an der eine Glucosidbindung vorhanden ist).
Ein Produkt, das eine Struktur der folgenden Formel (2') umfasst, ist bevorzugt durch das Überführen eines GalNAc-Restes auf die Formel (1') durch das erfindungsgemäße Enzym zu erhalten. Dies liegt daran, dass die Aktivität der Bindung des GalNAc-Restes an den GlcUA-Rest durch eine β1,4-Glucosidbindung für die Synthese des Chondroitin-Rückgrats notwendig ist: GalNAcβ1-(4GlcUAβ1-3GalNAcβ1)_n-4(GlcUA)_m (2')
In der Formel (2') haben GlcUA, GalNAc und – die gleichen Bedeutungen, wie in der oben beschriebenen Formel (2); β stellt eine β-Bindung dar; und die Nummernzeichen weisen auf die Bindungsposition des damit verbundenen Zuckerrests hin (Position, an der eine Glucosidbindung vorhanden ist).
Gemäß dem Syntheseverfahren (1) der vorliegenden Erfindung wird der GalNAc-Rest vom GalNAc-Donor auf einen GalNAc-Rezeptor überführt. Das erfindungsgemäße Enzym, das in dem Syntheseverfahren 1 der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist bevorzugt 1, welches den GalNAc-Rest von dem oben beschriebenen GalNAc-Donor auf den oben beschriebenen GalNAc-Akzeptor durch eine β1,4-Glucosidbindung transferiert. Dies liegt daran, dass der GalNAc-Rest an das Chondroitin-Rückgrat durch eine β1,4-Glucosidbindung gebunden ist.
Die Transferreaktion des GalNAc-Restes vom GalNAc-Donor auf einen GalNAc-Akzeptor in dem Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise innerhalb des Bereichs des optimalen Reaktions-pH-Werts und der optimalen Reaktionstemperatur des erfindungsgemäßen Enzyms durchgeführt. Beispielsweise beträgt der pH-Wert vorzugsweise von 5,0 bis 9,0, mehr bevorzugt von 5,3 bis 8,0, mehr bevorzugt von 5,7 bis 7,5 und am meisten bevorzugt von 6,0 bis 7,0. Um solche Bedingungen aufrecht zu erhalten, wird die oben beschriebene Transferreaktions vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt. Beispiele des Puffers schließen einen Acetatpuffer, einen MES-Puffer, einen Hydroxymethylaminoethansalzsäure-Puffer ein (nachfolgend manchmal bezeichnet als „Tris-HCl-Puffer"), einen Imidazol-Puffer, einen Natriumphosphat-Puffer und ähnliche, und jeder davon kann verwendet werden. Jedoch ist MES am meisten bevorzugt, aufgrund der starken Aktivität, den pH-Wert über den am meisten bevorzugten pH-Bereich (pH 6,0 bis 7,0) gemäß dem Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung aufrecht zu erhalten. Obwohl die Konzentration der Puffermittel des Puffers nicht besonders beschränkt ist, kann ein Bereich von 10 bis 200 mol/l, von 20 bis 100 mmol/l als bevorzugter Bereich beispielhaft angegeben werden.
Zusätzlich ist es bevorzugt, dass ein divalentes Metallkation, mehr bevorzugt ein Manganion, ein Kobaltion, ein Cadmiumion oder ähnliche, am meisten bevorzugt ein Manganion, in diesem Puffer zum Zweck der Beschleunigung der Enzymaktivität enthalten ist. Das Metallkation kann in Form eines Salzes zum Puffer gegeben werden. Beispiele des Salzes schließen ein Halid des oben beschriebenen Metallkations ein, wie beispielsweise Manganchlorid. Außerdem enthält der Puffer vorzugsweise Adenosintriphosphat (nachfolgend ebenfalls bezeichnet als „ATP").
Die Temperatur zum Zeitpunkt der Reaktion beträgt beispielsweise von 20 bis 45°C, bevorzugt von 24 bis 40°C und mehr bevorzugt von 36 bis 37°C.
Das erfindungsgemäße Enzym kann in der Synthese der Zuckerketten, die in der oben beschriebenen Formel (2) und Formel (2') beschrieben sind, verwendet werden, und dessen Verwendung zum Transferieren des GalNAc-Restes, welcher an dem nicht reduzierenden Ende einer Zuckerkette mit einer Struktur der Formel (2) oder Formel (2') vorhanden ist, wird als Verwendung der vorliegenden Erfindung angesehen.
(b) Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung
Das Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Synthetisieren einer Zuckerkette mit einer Struktur, die in der folgenden Formel (4) dargestellt ist, dadurch gekennzeichnet, dass dem erfindungsgemäßen Enzym ermöglicht wird, auf einen GlcUA-Akzeptor mit einer Struktur, welche in der folgenden Formel (3) dargestellt ist und einen GlcUA-Donor einzuwirken, um dadurch einen GlcUA-Rest vom GlcUA-Donor auf den GlcUA-Akzeptor zu transferieren: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-(GalNAc)m (4)
In der Formel (3) und (4) stellt GalNAc einen N-Acetyl-D-galctosamin-Rest; GlcUA stellt einen D-Glucuronsäure-Rest dar; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0; und – stellt eine Glycosidbindung dar.
Nach dem Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung ist der GlcUA-Akzeptor nicht besonders limitiert, sofern er eine Zuckerkette der oben beschriebenen Formel (3) als Gegenstand hat, auf den ein GlcUA-Rest überführt wird, und es kann ein Material mit einer Struktur sein, in der eine Zuckerkette, ein Protein, ein Lipid, eine synthetische Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder ähnliche ebenfalls an dessen reduzierendes Ende gebunden sind.
Wenn der GlcUA-Rest vom GlcUA-Donor dadurch transferiert wird, dass dem erfindungsgemäßen Enzym ermöglicht wird, auf den GlcUA-Akzeptor der oben beschriebenen Formel (3) einzuwirken, wird eine Verbindung mit einer Struktur, die in der oben beschriebenen Formel (4) dargestellt ist, gewonnen.
Das Chondroitin-Rückgrat besteht aus einer Struktur, in der ein Disaccharid durch den GlcUA-Rest und den GalNAc-Rest durch eine β1,3-Glycosidbindung gewonnen wird, und dieses wird ferner durch eine β1,4-Glycosidbindung gebunden, und es ist bevorzugt, dass der GlcUA-Rest an eine derartige Zuckerkette ebenfalls in dem Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung ähnlich wie im Fall des Syntheseverfahrens 1 der vorliegenden Erfindung gebunden werden kann. Das bedeutet, dass der bevorzugtere GlcUA-Akzeptor mit der Struktur der oben beschriebenen Formel (3) eine Struktur der folgenden Formel (3') hat: (3GalNAcβ1-4GlcUAβ1)_n-3(GalNAc)_m (3')
In der Formel (3') haben GlcUA, GalNAc und – die gleichen Bedeutungen wie die, die in der oben beschriebenen Formel (3) angegeben sind; β stellt eine β-Bindung dar; und die Nummernzeichen weisen auf die Bindungspositionen der angehängten Zuckerreste hin (Positionen, an denen eine Glycosidbindung vorhanden ist).
Ein Produkt, das eine Struktur der folgenden Formel (4') umfasst, wird vorzugsweise durch das Überführen des GlcUA-Restes der Formel (3') durch das erfindungsgemäße Enzym gewonnen. Das liegt daran, dass die Bindungsaktivität des GlcUA-Restes für den GalNAc-Rest durch eine β1,3-Glycosidbindung für die Synthese des Chondroitin-Rückgrats notwendig ist: GlcUAβ1-(3GalNAcβ1-4GlcUAβ1)_n-3(GalNAc)_m (4)
In den Formeln (3') und (4') haben GlcUA, GalNAc und – die gleichen Bedeutungen wie in den oben beschriebenen Formeln (1) und (2); β stellt eine β-Bindung dar; und die Nummernzeichen weisen auf die Bindungspositonen der angehängten Zuckerreste hin (Positionen, an denen eine Glycosidbindung vorhanden ist).
Nach dem Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung wird der GlcUA-Rest vom GlcUA-Donor auf einen GlcUA-Akzeptor transferiert. Das erfindungsgemäße Enzym, das in dem Syntheseverfahren 2 der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist bevorzugt eines, welches den GlcUA-Rest von dem oben beschriebenen GlcUA-Donor auf den oben beschriebenen GlcUA-Akzeptor durch eine β1,3-Glycosidbindung überführt. Das liegt daran, dass der GlcUA-Rest durch eine β1,3-Glycosidbindung mit dem Chondroitin-Rückgrat verbunden ist.
Die Transferreaktion des GlcUA-Restes von einem GlcUA-Donor auf einen GlcUA-Akzeptor in dem Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bei einem optimalen Reaktions-pH-Wert und einer optimalen Reaktionstemperatur des erfindungsgemäßen Enzyms durchgeführt. Beispielsweise beträgt der pH-Wert vorzugsweise von 4,0 bis 8,0, mehr bevorzugt von 4,5 bis 7,0 und am meisten bevorzugt von 5,0 bis 6,5. Um solche Bedingungen zu erhalten, wird die oben beschriebene Transferreaktion vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt. Beispiele des Puffers schließen einen Acetatpuffer, MES, einen Tris-HCl-Puffer, einen Natriumphosphat-Puffer und ähnliche ein, und jeder davon kann verwendet werden. Jedoch sind der Acetatpuffer und MES bevorzugt, und MES ist aufgrund seiner starken Aktivität am meisten bevorzugt, den pH-Wert über den am meisten bevorzugten pH-Bereich (pH 5,0 bis 5,5) gemäß dem Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung zu halten. Dies liegt daran, dass der pH-Wert stabiler gehalten werden kann, da der pH-Wert 5,0 bis 6,5 ein zentraler Bereich unter den Pufferbereichen ist. Obwohl die Konzentration der Puffermittel des Puffers nicht besonder beschränkt ist, kann beispielhaft ein Bereich von 10 bis 200 mmol/l, von 20 bis 100 mmol/l als bevorzugter Bereich angegeben werden.
Zusätzlich ist ein divalentes Metallkation, mehr bevorzugt ei Manganion, ein Kobaltion, ein Cadmiumion oder ähnliche, und am meisten bevorzugt ein Manganion zum Zweck der Beschleunigung der Enzymaktivität in dem Puffer enthalten. Das Metallkation kann in Form eines Salzes zum Puffer gegeben werden. Beispiele für das Salz schließen ein Halid des oben beschriebenen Metallkations ein, wie beispielsweise Manganchlorid.
Die Temperatur zum Zeitpunkt der Reaktion beträgt beispielsweise von 20 bis 45°C, bevorzugt von 24 bis 40°C, und am meisten bevorzugt von 36 bis 37°C.
Das erfindungsgemäße Enzym kann in der Synthese der Zuckerketten, welche in der oben beschriebenen Formel (4) und Formel (4') beschrieben ist, verwendet werden, und dessen Verwendung zum Transferieren des GlcUA-Restes, welche am nicht reduzierenden Ende einer Zuckerkette vorhanden ist, mit einer Struktur der Formel (4) oder Formel (4') wird als die Verwendung der vorliegenden Erfindung angesehen.
Beispiel 1
Herstellung des Enzyms der vorliegenden Erfindung:
(1) Klonierung von cDNA und Konstruktion eines Expressionsvektors
Eine BLAST-Recherche wurde durch die Verwendung einer Aminosäuresequenz von β1,4-Galactosyltransferase (β4Gal-T) (die Aminosäuresequenz, die durch GenBank Accession No. D29805 kodiert wird) als Anfrage durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein EST (GenBank Accession No. AC0004219) gefunden. Da jedoch diese Sequenz unvollständig war, wurde ein ORF von einer genomischen Datenbank durch GenScan (Stanford University, USA) untersucht. Als Ergebnis wurde die Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird (die kodierte Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2) gefunden. Es wurde durch RT-PCR unter Verwendung der Marathon-Ready cDNA (hergestellt von Clontech) als Matrize bestätigt, dass ein Gen, das aus der Nucleotidsequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, zumindest im menschlichen Hirn exprimiert wird (als Primer für die PCR wurden SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8, welche eine Kombination aus 5'-Primer und 3'-Primer sind, verwendet). Um die Klonierung der löslichen Region dieses Genes durchzuführen, ausgenommen eines Bereichs, der den Transmembranbereich einschließt (eine Region, die aus den Aminosäureresten 1 bis 129 der SEQ ID Nr. 2 besteht), wurde eine PCR in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren durch die Verwendung von 2 Primern durchgeführt, die in SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 dargestellt sind. Als Matrizen-cDNA wurde Marathon-Ready cDNA Human Brain (hergestellt von Clontech) verwendet. Die so amplifizierte Bande von ungefähr 2,3 kb wurde mit HindIII und XbaI in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren verdaut und in die HindIII- und XbaI-Schnittstellen eines Expressionsvektors für Säugerzellen, pFLAG-CMV-1 (hergestellt von Sigma) inseriert, um dadurch den Vektor der vorliegenden Erfindung zu gewinnen (K3-FLAG-CMV1). Als Ergebnis, das die Nucleotidsequenz des so gewonnen Vektors bestätigt wurde, wurde untersucht, dass ein DNA-Fragment, das aus den Nucleotidnummern 388 bis 2.649 der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, besteht, inseriert war.
(2) Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms
Unter Verwendung von 15 μg K3-FLAG-CMV1 und TransFast (hergestellt von Promega) in Übereinstimmung mit dem Protokoll wurde ein Gen in COS-7-Zellen eingeschleust, welche in einer 100 mm Kulturschale kultiviert worden sind, um ein Stadium mit 70% Konfluenz zu erreichen. Der Überstand nach dem Kultivieren für 3 Tage wurde gewonnen und durch ein 0,22 μm Filter filtriert und dann wurde 100 μl des Anti-FLAG M2-Agarose-Affinitätsgels (hergestellt von Sigma) zu 10 ml des Überstands zugegeben und bei 4°C über auf einer Walze Nacht gemischt. Nach der Reaktion wurde das Gel dreimal mit 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4/20% Glycerol gewaschen, und dann wurde das überschüssige Waschwasser unter Verwendung einer Spritze mit einer 27G Injektionsnadel entfernt. Dieses Gel wurde in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4/20% Glycerol/10 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid/1 μg/ml Leupeptin/1 μg/ml Pepstatin suspendiert, um eine Konzentration von 50% (v/v) zu ergeben, gefolgt von einer Zentrifugation und dann wurde der Überstand verworfen, um eine Enzym-adsorbierte Gelsuspension zu gewinnen.
Beispiel 2
Verlängerung des Chondroitin-Rückgrats unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms
(1) Herstellung eines Chondroitin/Chondroitinsulfat-Saccharids mit ungerader Zahl
Chondroitin (aus einem Hai stammendes Chondroitinsulfat: hergestellt von Seikagaku Corporation, wurde chemisch desulfatiert) und Chondroitinsulfat (Knorpel, die vom Hai stammen: hergestellt von Seikagaku Corporation) wurden in geringem Umfang mit Rindertestikel-Hyaluronidase (hergestellt von Sigma) verdaut, und dann wurde die Reaktionslösung für 10 Minuten bei 100°C gehalten, um das Enzym durch Hitze zu inaktivieren. Diese Reaktionslösung wurde auf eine Superdex 30-Säule (60 × 1,6 cm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase: 0,2 mol/l NH₄HCO₃, Fließrate: 2 ml/Minute) aufgetragen und die Eluate wurden in 2 ml fraktioniert, während bei einer Absorption von 225 nm überwacht wurde, um die Fraktionen zusammenzugeben, die Deka-Sacchariden entsprechen. Jede Fraktion wurde unter Verwendung einer PD10-Säule entsalzt (hergestellt von Amersham Bioscience), und Uronsäure wurde durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren in Übereinstimmung mit dem bekannten Verfahren, gefolgt vom Gefriertrocknen bestimmt. Die gefriergetrockneten Proben wurden in destilliertem Wasser gelöst, um eine Konzentration von 1 mmol/l zu ergeben, und sie wurden als geradzahlige Oligosaccharidproben verwendet (das vom Chondroitin abstammende Deka-Saccharid wird als „CH10" bezeichnet, und das vom Chondroitinsulfat stammende Deka-Saccharid wird als „CS10" bezeichnet).
Zu 50 mmol/l MES-Puffer (pH 6,5) welcher 10 nmol/l MnCl₂ und 171 μmol ATP-Natriumsalz enthält, wurden 10 μl der Enzym-adsorbierten Gelsuspension gegeben, 1 nmol einer zu testenden Substanz (Chondroitin (CHEL), Chondroitinsulfat (SCEL), CH10 oder CS10) und 0,036 nmol an [³H]UDP-GalNAc wurde zugegeben, und das Gesamtvolumen wurde auf 30 μl eingestellt. Die Enzymreaktion wurde bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt, und dann wurde die Reaktion durch das Aufbewahren der Reaktionslösung für 1 Minute bei 100°C gestoppt, um das Enzym zu inaktivieren.
Jede Reaktionslösung wurde durch einen Mikrofilter mit 0,2 μm Porengröße filtriert (hergestellt von Millipore) und dann auf einer Superdex Peptidsäule (30 × 1,0 cm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase: 0,2 mol/l NaCl, Fließrate 1,0 ml/Minute) getrennt und die Eluate wurden in 0,5 ml fraktioniert, um die Radioaktivität unter Verwendung eines Scintillisations-Messgerätes zu messen (1). Als Ergebnis wurde eine starke GalNAc-transferierende Aktivität beobachtet, wenn CHEL (17. bis 18. Fraktionen), CH10 (23. Fraktion) und CS10 (23. Fraktion) als GalNAc-Akzeptor-Substrate verwendet wurden, während die GalNAc-transferierende Aktivität nicht für CSEL (16. Fraktion) beobachtet wurde. Die 23. Fraktion der Reaktionsprodukte, die durch CH10 und CS10 gewonnen wurden, waren die Fraktionen, die Molekulargewichte der eluierten Undeka-Saccharide zeigten. Die Undeka-Saccharide, die aus CH10 gewonnen wurden, werden als „CH11" bezeichnet und die Urideka-Saccharide, die von CS10 gewonnen werden, werden als „CS11" bezeichnet.
Die 21. bis 25. Fraktion von CS11 wurden zusammengegeben und unter Verwendung von PD10-Säulen entsalzt. Die so erhaltene Probe wurde in zwei gleiche Teile geteilt und gefriergetrocknet. Einer der zwei geteilten Teile wurde in 100 μl 0,1 mol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gelöst, der 30 mmol/l Natriumacetat (CS11A) enthält, und ein anderer wurde mit Chondroitinase ACII verdaut (100 mU Chondroitinase ACII (hergestellt von Seikagaku Corporation) wurde in 100 μl CS11-Fraktion gelöst, gefolgt von einem enzymatischen Verdau bei 37°C für 10 Stunden und dann der Erwärmung, um das Enzym zu inaktivieren: CS11B).
CS11A und CS11B wurden durch einen Mikrofilter von 0,22 μm Porengröße (hergestellt von Millipore) filtriert und dann durch eine Superdex-Peptidsäule (30 × 10 mm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase 0,2 mol/l NaCl, Fließrate 0,5 ml/Minute) getrennt und die Eluate wurden bei 0,5 ml fraktioniert, und wenn die Radioaktivität gemessen wurde, indem ein Scintillations-Zählgerät verwendet wurde, wurde der Radioaktivitätspeak zur Trisaccharid-Fraktion in CS11B (2) verschoben. Es wurde aus diesem Ergebnis gefunden, dass das erfindungsgemäße Enzym ein Undeka-Saccharid durch Überführen von GalNAc durch eine β1,4-Bindung auf GlcUA am nicht reduzierenden Ende des vom Chondroitinsulfat stammenden Deka-Saccharids herstellen kann.
(2) Herstellung von Chondroitin/Chondroitinsulfat mit Sacchariden gerader Anzahl
Chondroitin (vom Hai stammendes Chondroitinsulfat wurde chemisch entsalzt: hergestellt von Seikagaku Corporation) und Chondroitinsulfat (aus Haiknorpel stammend: hergestellt von Seikagaku Corporation) wurden mit Rinderhodenhyaluronidase (hergestellt von Sigma) begrenzt verdaut und dann wurde die Reaktionslösung für 10 Minuten bei 100°C gelassen, um das Enzym durch Hitze zu inaktivieren. Diese Reaktionslösung wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt und mit einer aus der Rinderleber stammenden β-Glucuronidase (hergestellt von Sigma) weiter verdaut. Die Enzymreaktion wurde gestoppt, indem die Reaktionslösung für 10 Minuten bei 100°C gelassen wurde. Diese Reaktionslösung wurde auf eine Superdex 30-Säule (60 × 1,6 cm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase: 0,2 mol/l NH₄HCO₃, Fließrate: 2 ml/Minute) aufgetragen und die Eluate wurden bei 2 ml fraktioniert, während diese bei einer Absorption von 225 nm überwacht wurden, um Fraktionen zusammenzugeben, die Undeka-Sacchariden entsprechen. Jede Fraktion wurde unter Verwendung einer PD10-Säule entsalzt (hergestellt von Amersham Bioscience) und Uronsäure wurde durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren bestimmt, gefolgt von der Gefriertrocknung. Die gefriergetrockneten Proben wurden in destilliertem Wasser gelöst, um eine Konzentration von 1 mmol/l zu ergeben und als Oligosaccharid-Proben mit gerader Anzahl verwendet (die vom Chondroitin stammenden Undeka-Saccharide: „CH11", vom Chondroitinsulfat abstammende Undeka-Saccharide: „CS11").
Auch Chondroitin (vom Hai stammendes Chondroitinsulfat wurde chemisch desulfatiert: hergestellt von Seikagaku Corporation) und Chondroitinsulfat (aus Haiknorpeln stammend: hergestellt von Seikagaku Corporation) mit Rinderleber β-Glucuronidase (hergestellt von Sigma) verdaut, um Proben herzustellen (bezeichnet als „CHOL" bzw. „CSOL").
Zu 50 mmol/l Acetatpuffer (pH 5,6) enthaltend 10 nmol/l MnCl₂ 10 μl der Enzym-adsorbierten Gelsuspension, 1 nmol an zur testenden Substanz (CHOL, CSOL, CH11 oder CS11) und 0,432 nmol an [¹⁴C]UDP-GlcUA hinzugegeben und das Gesamtvolumen wurde auf 30 μl eingestellt. Die Enzymreaktion wurde bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt, und die Reaktion wurde dann durch Bewahren der Reaktionslösung bei 100°C für 1 Minute gestoppt, um das Enzym zu inaktivieren.
Jede Reaktionslösung wurde durch einen Mikrofilter mit 0,22 μm Porengröße (hergestellt von Millipore) gefiltert und dann auf einer Superdex Peptidsäule (30 × 1,0 cm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase 0,2 mol/l NaCl, Fließrate: 0,5 ml/Minute) aufgetrennt un die Eluate wurden bei 0,5 ml fraktioniert, um die Radioaktivität unter Verwendung eines Scintillations-Messgerätes zu messen (3). Im Ergebnis wurde eine starke GlcUA-transferierende Aktivität beobachtet, wenn CHOL (17. bis 18. Fraktion), CH11 (23. Fraktion) und CS11 (23. Fraktion) als GlcUA-Akzeptor-Substrate verwendet wurden, während die GlcUA-transferierende Aktivität nicht für CSOL beobachtet wurde (16. Fraktion). Die 22. und 23. Fraktionen der Reaktionsprodukte, die von CH11 und CS11 gewonnen wurden, waren Fraktionen, die Molekulargewichte der eluierten Dodeka-Saccharide zeigten. Die Dodeka-Saccharide, die aus CH11 gewonnen wurden, werden als „CH12" bezeichnet, und das Dodeka-Saccharid, das aus CS11 gewonnen wird, wird als „CS12" bezeichnet.
Die 21. bis 25. Fraktionen von CS12 wurden zusammengegeben und unter Verwendung einer PD10-Säule entsalzt. Die so erhaltene Probe wurde in zwei gleiche Teile geteilt und gefriergetrocknet. Einer der in zwei Teile geteilten Teile wurde in 100 μl 0,1 mol/l Tris-HCL-Puffer (pH 7,4) enthaltend 30 mmol/l Natriumacetat (CS12A) gelöst und der andere wurde mit Chondroitinase ACII (100 mU Chondroitinase ACII (hergestellt von Seikagaku Corporation) in 100 μl CS11-Fraktion gelöst, gefolgt von einem enzymatischen Verdau bei 37°C für 10 Stunden und dann das Erwärmen, um das Enzym zu inaktivieren: CS12B).
CS12A und CS12B wurden durch einen Mikrofilter mit 0,22 μm Porengröße (hergestellt von Millipore) filtriert und dann durch eine Superdex-Peptidsäule aufgetrennt (30 × 1,0 cm: hergestellt von Amersham Bioscience, Chromatographiebedingungen; mobile Phase: 0,2 mol/NaCl, Fließrate: 0,5 ml/Minute) und die Eluate wurden bei 0,5 ml fraktioniert, und wenn die Radioaktivität unter Verwendung eines Scintillationsmessgerätes gemessen wurde, wurde der Radioaktivitätspeak zur Disaccharidfraktion in CS12B (4) verschoben. Es wurde aus diesem Ergebnis abgeleitet, dass das erfindungsgemäße Enzym ein Dodeka-Saccharid durch Überführen von GlcUA durch eine β1,3-Bindung auf Chondroitinsulfat abstammendes Undeka-Saccharid herstellen kann.
Ein vom Chondroitinsulfat abstammendes Okta-Saccharid und Nona-Saccharid wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben hergestellt, und im Ergebnis, dass sie als GlcUA-Akzeptor und GalNAc-Akzeptor verwendet wurden, wurde gefunden, dass sie eine Aktivität des Überführens eines Zuckerrestes in gleicher Weise haben.
Beispiel 3
Die GlcUA- und GalNAc-transferierenden Aktivitäten des erfindungsgemäßen Enzyms aus Beispiel 2 wurden hinsichtlich ihres optimalen pH-Bereichs durch Ändern des pH-Wertes des Puffers überprüft. Ein Acetatpuffer, ein MES-Puffer, ein Imidazol-Puffer und ein Tris-HCl-Puffer wurden bei einer Endkonzentration von 50 mmol/l für jeden Puffer verwendet.
Im Ergebnis wurde gefunden, dass der optimale pH-Wert der GlcUA-transferierenden Aktivität 5,8 war (5), und der optimale pH-Wert der GalNAc-transferierenden Aktivität war 6,2 (6).
Beispiel 4
Unter den Messbedingungen der GlcUA-transferierenden Aktivität und der GalNAc-transferierenden Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms aus Beispiel 2 wurde die GlcUA-transferierende Aktivität und die GalNAc-transferierende Aktivität durch Zugeben von 10 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zum Reaktionssystem untersucht, um herauszufinden, dass die Enzymaktivitäten vollständig verloren gingen (7). Auf diese Weise wurde herausgefunden, dass das erfindungsgemäße Enzym ein divalentes Kation für seine Aktivität benötigt.
Es wurde ebenfalls gefunden, dass hohe Enzymaktivitäten erzielt wurden, wenn 10 mmol/l CoCl₂ oder CdCl₂ zu dem Reaktionssystem statt MnCl₂ zugegeben wurden (7).
Zusätzlich wurden, um die Einflüsse der Konzentrationen des Manganions auf die Aktivitäten des erfindungsgemäßen Enzyms zu messen, die GlcUA-transferierende Aktivität und GalNAc-transferierende Aktivität in gleicher Weise gemessen, indem die Endkonzentrationen des Manganions innerhalb des Bereichs von 0 bis 50 mmol/l bei den Reaktionsbedingungen des Beispiels 2 geändert wurden, wobei gefunden wurde, dass die optimalen Manganionenkonzentrationen für die GlcUA-transferierende Aktivität und die GalNAc-transferierende Aktivität 20 bis 30 mmol/l bzw. 5 bis 10 mmol/l betrugen (8).
Beispiel 5
Analyse des Expressionsmusters des Gens der vorliegenden Erfindung in menschlichen Geweben
Um das Expressionsniveau des erfindungsgemäßen Gens in verschiedenen menschlichen Geweben zu analysieren, wurde eine Real-Time-PCR-Methode (RT-PCR) verwendet. Die Amplifikation und Bestimmung wurden durch verschiedene Arten von Marathon-Ready cDNA (hergestellt von Clontech) als Matrize durchgeführt, mit zwei Primern (SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10) und einer Sonde (SEQ ID Nr. 11), in der ein Bindemittel für die kleinere Vertiefung (hergestellt von Applied Biosystems) an das 3'-Ende gebunden wurde. Als Standardgen wurde das Plasmid pCR2.1 verwendet (hergestellt von Invitrogen), welches Glyceraldehydtriphosphatdehydrogenase enthält (GAPDH), indem eine Verdünnungsreihe hergestellt wurde, und dadurch wurde eine Kalibrierungskurve hergestellt. Zusätzlich wurde ABI PRISM 7700 (hergestellt von Applied Biosystems) in RT-PCR verwendet (9).
Im Ergebnis wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Gen im gesamten Hirn und im Uterus stark exprimiert wird, insbesondere im Cerebralcortex und im Dünndarm.
Diese Anmeldung beruht auf den Japanischen Anmeldenummern 2002-160855 und 2003-128344 , die am 31. Mai 2003 bzw. 6. Mai 2003 eingereicht wurden, deren gesamte Inhalte hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue vom Menschen stammende Chondroitinsynthase bereit, welche ein Enzym ist, um ein fundamentales Rückgrat aus Chondroitin zu synthetisieren und das sowohl Glucuronsäure-Transferaseaktivität und N-Acetylgalactosamin-Transferaseaktivität besitzt.
Freier Text der Sequenzliste

SEQ ID Nr. 3 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 4 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 5 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 6 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 7 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 8 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 9 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 10 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA
SEQ ID Nr. 11 – Erklärung der synthetischen Sequenz: Synthetische DNA

SEQUENZLISTE

Claims

Chondroitinsynthase, die aus einem Polypeptid besteht, bestehend aus der Aminosäuresequenz dargestellt durch SEQ ID Nr. 2 oder einer Aminosäuresequenz bestehend aus den Aminosäurezahlen 130 bis 882 in der durch SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder dem Polypeptid, an das eine Zuckerkette gebunden ist.
Chondroitinsynthase, umfassend ein Polypeptid, das eine Enzymaktivität zur Übertragung eines N-Acetyl-D-galactosamin-Rests auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptor oder eine Enzymaktivität zur Übertragung eines D-Glucuronsäure-Rests auf einen D-Glucuronsäure-Akzeptor aufweist und aus einer Aminosäuresequenz besteht, mit Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen und/oder Transpositionen von 1 bis 150 Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz, bestehend aus Aminosäurezahlen 130 bis 882 in der durch SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz.
Chondroitinsynthase gemäß Anspruch 2, die eine Enzymaktivität zur Übertragung eines N-Acetyl-D-galactosamin-Rests von einem N-Acetyl-D-galactosamin-Donor auf einen D-Glucuronsäure-Rest eines Chondroitins aufweist, das den D-Glucuronsäure-Rest am nicht reduzierenden Ende aufweist, und eine Enzymaktivität zur Übertragung eines D-Glucuronsäure-Rests von einem D-Glucuronsäure-Donor auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest eines Chondroitins, das den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest am nicht reduzierenden Ende aufweist.
Nukleinsäure, codierend die Chondroitinsynthase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Expressionsvektor, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 umfasst.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 5, der in einer eukaryontischen Zelle exprimiert werden kann.
Transformante, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Verfahren zur Erzeugung einer Chondroitinsynthase, das das Züchten der Transformante gemäß Anspruch 7 umfasst, zur Produktion und Anhäufung einer Chondroitinsynthase als gezüchtetes Material und Gewinnen der Chondroitinsynthase aus dem gezüchteten Material.
Verfahren zur Synthese einer Zuckerkette mit einer Struktur repräsentiert durch die folgende Formel (2), das umfasst, dass die Chondroitinsynthase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptor mit einer Struktur repräsentiert durch die folgende Formel (1) und einen N-Acetyl-D-galactosamin-Donor wirken kann, um dadurch einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest auf den N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptor zu übertragen: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)worin in den Formeln (1) und (2) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest repräsentiert; GlcUA repräsentiert einen D-Glucuronsäure-Rest; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – repräsentiert eine Glycosidbindung.
Verfahren zur Synthese einer Zuckerkette mit einer durch die folgende Formel (4) dargestellten Struktur, das umfasst, dass die Chondroitinsynthase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 auf einen D-Glucuronsäure-Akzeptor mit einer durch die folgende Formel (3) repräsentierten Struktur und einen D-Glucuronsäure-Donor wirken kann, um dadurch einen D-Glucuronsäure-Rest auf den D-Glucuronsäure-Akzeptor zu übertragen: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (4)worin in den Formeln (3) und (4) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest repräsentiert; GlcUA repräsentiert einen D-Glucuronsäure-Rest; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – repräsentiert eine Glycosidbindung.
Verwendung der Chondroitinsynthase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Synthese einer Zuckerkette mit einer durch die folgende Formel (2) repräsentierten Struktur durch Übertragung eines N-Acetyl-D-galactosamin-Rests auf einen D-Glucuronsäure-Rest, der am nicht reduzierenden Ende eines N-Acetyl-D-galactosamin-Akzeptors mit einer Struktur repräsentiert durch die folgende Formel (1) vorliegt: (GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (1) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)_n-(GlcUA)_m (2)worin in den Formeln (1) und (2) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest repräsentiert; GlcUA repräsentiert einen D-Glucuronsäure-Rest; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – repräsentiert eine Glycosidbindung.
Verwendung der Chondroitinsynthase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Synthese einer Zuckerkette mit einer wie durch die folgende Formel (4) repräsentierten Struktur durch Übertragung eines D-Glucuronsäure-Rests auf einen N-Acetyl-D-galactosamin-Rest, der am nicht reduzierenden Ende eines D-Glucuronsäure-Akzeptors mit der durch die folgende Formel (3) repräsentierten Struktur vorliegt: (GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (3) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)_n-(GalNAc)_m (4)worin in den Formeln (3) und (4) GalNAc den N-Acetyl-D-galactosamin-Rest repräsentiert; GlcUA repräsentiert einen D-Glucuronsäure-Rest; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; m ist 1 oder 0 und – repräsentiert eine Glycosidbindung.