JP4932722B2 - 新規コンドロイチン画分製造方法 - Google Patents
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Description
CH:コンドロイチン
CS:コンドロイチン硫酸
GlcA:グルクロン酸
GalNAc:N−アセチルガラクトサミン
HA:ヒアルロン酸
K4CP:大腸菌K4株由来コンドロイチンポリメラーゼ
MALDI−TOF−MS: Matrix Assisted Laser
Desorption−飛行時間型−質量分析
UDP:ウリジン5’−ジリン酸
CHは、GlcA及びGalNAcがそれぞれβ1−3結合及びβ1−4結合で交互に直線上に結合したグリコサミノグリカンの1種である。CHは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分化、神経細胞伸展、軟骨・骨形成、組織再生などに重要な役割を担っている。CSは、医薬品や健康食品等に有用な物質として市販されている。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
なかでも、上記の反応が22℃〜37℃かつpH6.2〜7.8の条件で、10分間〜3時間行われることが好ましく、24℃〜35℃かつpH6.5〜7.8の条件で、10分間〜2時間行われることがより好ましく、26℃〜35℃かつpH6.8〜7.6の条件で、10分間〜2時間行われることがさらに好ましく、28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、10分間〜2時間行われることが特に好ましく、28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、10分間〜1時間行われることが極めて好ましい。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件1:GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、5時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
なかでも、上記の反応が、22℃〜37℃かつpH6.2〜7.8の条件で、10時間〜30時間行われることが好ましく、24℃〜35℃かつpH6.5〜7.8の条件で、12時間〜24時間行われることがより好ましく、26℃〜35℃かつpH6.8〜7.6の条件で、12時間〜24時間行われることがさらに好ましく、28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、12時間〜24時間行われることが特に好ましく、28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、15時間〜20時間行われることが極めて好ましい。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件4:GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、8時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件A:GlcA供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件D:GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
なかでも、上記の反応が22℃〜37℃かつpH6.2〜7.8の条件で、10〜30時間行われることが好ましく、24℃〜35℃かつpH6.5〜7.8の条件で、12〜24時間行われることがより好ましく、26℃〜35℃かつpH6.8〜7.6の条件で、12〜24時間行われることがさらに好ましく、さらに28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、12時間〜24時間行われることがより好ましく、28℃〜32℃かつpH7〜7.5の条件で、15時間〜18時間行われることが極めて好ましい。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
<1>本発明方法1
本発明方法1は、GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、これを20℃〜40℃かつpH6〜8の条件で、0.5分間〜4時間反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(1)で示されるCHを50%超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数(本明細書において「整数」は正の整数を意味する)をそれぞれ示す。)
本発明方法において用いる「GlcA供与体」は、ある糖鎖分子に対してGlcA残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、GlcAヌクレオチドが好ましい。GlcAヌクレオチドとしては、UDP-GlcAや、dTDP(デオキシチミジン5'−ジリン酸)−GlcA等が例示されるが、UDP−GlcAが好ましい。
GlcA−GalNAc−R1 ・・・・(3)
GalNAc−GlcA−R2 ・・・・(4)
(各式中、−はグリコシド結合を、R1及びR2は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。)
「R1」や「R2」としては、例えば、CH骨格を有する糖鎖の残基や、HA骨格を有する糖鎖の残基等が例示される。CH骨格を有する糖鎖の残基としては、CH残基やCS残基等が例示される。そのサイズも特に限定されない。
なお、本発明方法により製造される画分中の一般式(1)又は(2)で示されるCHは、上記糖受容体に由来するR1又はR2を鎖端に有するCH分子も包含するものとする。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
ここで「上記一般式(1)で示されるCHを50%超含有する」とは、上記一般式(1)で示されるCHと下記一般式(2)で示されるCHの分子数の総和に対して、上記一般式(1)で示されるCHの分子数が50%を超えて含有されていることを意味する。すなわち、画分中における上記一般式(1)で示されるCHの分子数が、下記一般式(2)で示されるCHの分子数よりも多く含有されていることを意味する。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
また、本発明方法における「GlcA供与体」、「GalNAc供与体」、「糖受容体」、「Mn2+」及び「K4CP」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意味は上記と同じである。
本発明方法2は、GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(1)で示されるCHを50%超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件1:GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、5時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
本発明方法3は、GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させ、これを20℃〜40℃かつpH6〜8の条件で、10時間以上反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(2)で示されるCHを50%超含有する画分の製造方法である。
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
なお、本発明方法3で用いることができる「GlcA供与体」、「GalNAc供与体」、「糖受容体」、「Mn2+」及び「K4CP」について、並びに「共存」、「反応」及び「画分」等の用語の意義は、前記の本発明方法1における説明と同じである。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
(式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
なお、前記一般式(2)で示されるCHを50%超含有するか否かの確認の方法も、前記の本発明方法1における説明と同様である。
本発明方法4は、GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件4〜6を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(2)で示されるCHを50%超含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件4:GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、8時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
本発明方法5は、GlcA供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件A〜Cを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(1)で示されるCHを実質的に100%含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件A:GlcA供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成する画分中のCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
Mn2+濃度は、上記条件において5〜100mMであることが好ましく、10〜30mMであることがより好ましく、15〜25mMであることがさらに好ましく、20mMであることが極めて好ましい。
また本発明方法5において、「Yよりも長い時間」とは、具体的には、Yよりも、例えば10分〜24時間、好ましくは30分〜18時間、より好ましくは30分〜5時間、長い時間である。
本発明方法6は、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件D〜Fを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(2)で示されるCHを実質的に100%含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件D:GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成するCH含量比をXとする。ここで「CH含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるCHの分子数」/「上記一般式(2)で示されるCHの分子数」の比を意味するものとする。
Mn2+濃度は、上記条件において5〜100mMであることが好ましく、10〜30mMであることがより好ましく、15〜25mMであることがさらに好ましく、20mMであることが極めて好ましい。
また本発明方法6において、「Yよりも長い時間」とは、具体的には、Yよりも、例えば10分〜24時間、好ましくは30分〜18時間、より好ましくは30分〜5時間、長い時間である。
本発明方法7は、GlcA供与体、GalNAc供与体、糖受容体、K4CP及び終濃度で0.02〜2 mMのMn2+を共存させ、これを20℃〜40℃かつpH6〜8の条件で、5時間以上反応させるステップを少なくとも含む下記一般式(1)及び(2)で示されるCHが含有比((1):(2))として45:55〜55:45で含有する画分の製造方法である。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
本発明方法7における反応は、20℃〜40℃かつpH6〜8の条件で5時間以上反応させるステップが含まれている限りにおいて特に限定されない。
本発明方法8は、GlcA供与体及び/又はGalNAc供与体、並びに糖受容体、K4CP及びMn2+を共存させ、これを20℃〜40℃かつpH6〜8の条件で反応させるステップを少なくとも含む下記一般式(1)及び(2)で示されるコンドロイチンを所望の含有比で含有する画分の製造方法であるを提供する。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
本発明方法8の具体的な実施方法としては、反応温度、pH、Mn2+濃度などを一定としてGlcA供与体及び/又はGalNAc供与体、並びに糖受容体を種々の反応時間で反応させ、生成された画分中の一般式(1)及び(2)で示されるCHの比率を測定し、所望の比率が得られる反応時間で反応を行うことができる。
(1)MALDI−TOF−MS検体用CH画分の製造
以下の[A]は、反応時間を0.5時間または1時間としたときの、非還元末端が偶数糖である前記一般式(1)で示されるCHを50%超含有するCH画分の製造例である。また以下の[B]は、反応時間を18時間としたときの、非還元末端が奇数糖である前記一般式(2)で示されるCHを50%超含有するCH画分の製造例である。
(CH6糖(CH6)の調製)
CSを化学的に脱硫酸化したCH(生化学工業株式会社製)を羊睾丸ヒアルロニダーゼ(シグマ社)で限定分解することによって、非還元末端がGlcA残基である偶数糖のオリゴ糖を得た。それらをゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、CH6糖(CH6)に相当する画分の集めて、凍結乾燥した。このCH6は使用したヒアルロニダーゼの性質からして明らかに還元末端がGalNAc残基で非還元末端がGlcA残基である6糖である。
(2)分析
(1)で得られたCHに対してMALDI−TOF−MS(ブルカー社製 AutoFlex)による構造解析を行った。分析には発生した陰イオンを検出するネガティブモードを用い、低分子領域(1〜4kDa)ではリフレクションモードで、高分子領域(3〜10kDaおよび 5〜20kDa)ではリニヤモードで解析した。
(ターゲットの調整)
得られた検体 1 μl(20〜100 pmole CH 含有)と10 mg/mlのDHB(2,5-dihydroxy-benzoic acid)50% アセトニトリル−水溶液1 μlを混合し、その1μl をターゲットプレートにスポットし、速やかに窒素ガスを吹き付け乾燥させた。
解析結果をそれぞれ図1、図2に示す。CH6を受容体基質とした0.5時間や1時間の短時間の反応では、生成される糖鎖は比較低分子であることから、MALDI−TOF−MS分析ではリフレクション・ネガティブモードで測定を行いて低分子領域(分子量範囲 1,000−4,000)をスキャンした。MALDI−TOF−MSでは1糖ずつ付加した糖鎖生成物がそれぞれしっかり分離されたイオンピークとして検出されCH10糖:CH10(m/z- = 1912.56)に相当するイオンピークが最も高かった。その前後の糖鎖ピークを比較すると、反応時間が1時間のものの方が0.5時間のものよりも高分子側にシフトしていることが分かる。すなわち、酵素反応の時間経過で糖鎖が伸長されていることが分かる。
解析結果を図3〜図7に示す。Superdex Peptide カラムによる酵素生成物の溶出画分のうち、画分番号17から画分番号21までのMALDI−TOF−MS解析を行った。画分番号21および画分番号20 の検体は比較的低分子であったので、分子量範囲1, 000−6,000のリフレクション・ネガティブモードで測定した。画分番号19および画分番号18ではリニア・ネガティブモードで高分子領域(3,000−10,000)を測定した。画分番号17はより高分子の領域(5,000−20,000)をリニア・ネガティブモードで測定した。
(A) 非還元末端がGalNAc残基であるCH画分の製造
CSを化学的に脱硫酸化することにより得られた非還元末端が不揃いなCH(生化学工業株式会社製、平均分子量1万)(1mg)、UDP−GalNAc(3μmol) 、50 mM Tris HCl緩衝液, pH7.2、20 mM MnCl2及び0.15 M NaClを含有する酵素反応液(500 μl)中にK4CP酵素液(特開2003-199583号公報の実施例にしたがって得られた組換え酵素)(37.5μg 蛋白質相当)を添加した。30℃で18時間反応を行い、沸騰水中で1分間熱失活させ、エタノール沈殿後、残渣を蒸留水200μlに再溶解させた。その溶液を、0.2 M 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex 75 HR10/30 カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、1ml/分の流速で流し、1分間(1ml)毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各10μlの蒸留水に再溶解した。その一部を採取し、1nmole/μl相当の溶液10μl を調製し、少量のDowex 50 XW8 (H+ form)ゲルに通し、MALDI−TOF−MSの検体とした。
UDP−GalNAcに代えてUDP−GlcAを用いた他は(A)と同じ操作を行って糖鎖画分を調製し、MS検体液を作製した。
(C)分析
(A)、(B)の検体について、前記(2)と同様に質量分析を行った。その結果、イオンピークのm/zから、(A)によって得られた画分中のCHは、実質的に全てGalNAcが非還元末端に存在する奇数糖であり、(B)によって得られた画分中のCHは、実質的に全てGlcAが非還元末端に存在する偶数糖であることが分かった(図8、9)。
(A) 非還元末端がGalNAcであるCH画分の製造
前記(1)と同様にCH6、UDP−GalNAcおよびUDP−GlcAを基質とし、K4CP酵素を添加して30℃かつpH7.2の条件で8時間反応を行った後、再度UDP−GalNAcを300nmole添加し、再び30℃で5時間反応させた。沸騰水中で1分間熱失活させ、エタノール沈殿後、残渣を蒸留水200μlに再溶解させた。その溶液を、0.2 M 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex Peptide HR10/30 カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、1 ml/分の流速で流し、1分間(1 ml)毎に分画した。得られた画分を凍結乾燥し、各10μlの蒸留水に再溶解し、少量のDowex 50 XW8 (H+ form)ゲルに通し、MALDI-TOF-MSの検体とした。
(B) 非還元末端がGlcAであるCH画分の製造
再添加する糖ヌクレオチドをUDP−GalNAcからUDP−GlcAに代えた他は(A)と同じ操作を行って糖鎖画分を調製し、MS検体液を作製した。
(A)、(B)の検体について前記(2)と同様に質量分析を行った。その結果、イオンピークのm/zから、(A)によって得られた画分中のCHは実質的に全てGalNAcが非還元末端に存在する奇数糖であり、(B)によって得られた画分中のCHは、実質的に全てGlcAが非還元末端に存在する偶数糖であることが分かった(図10、11)。
K4CP酵素反応におけるMn2+の影響を検討した。実施例1で調製したCH6(10
nmol)、UDP−GalNAcおよびUDP−GlcA(それぞれ300 nmol)、50 mM Tris HCl緩衝液, pH7.2並びに0.15M NaClを含む溶液に、それぞれMnCl2を終濃度が0.002、0.02、0.2、2、20mMとなるように添加し、酵素反応液とした。この各酵素反応液(200 μl)中にそれぞれK4CP酵素液(3.75μg 蛋白質相当)を添加した。0.5時間の酵素反応ではMn2+の濃度が低下するほど酵素活性(産生されるCH量)が低下した(図12)。次に18時間後のMn2+濃度依存性を調べた。MnCl2の濃度が0.002mMではかなり活性が低い結果になったが、0.2mMの濃度では20mMの時に比べ1.8倍程度の酵素活性がみられた(図13)。
Claims (7)
- グルクロン酸供与体、N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件1〜3を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(1)で示されるコンドロイチンを50%超含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはN−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件1:グルクロン酸供与体、N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、5時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をXとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるコンドロイチンの分子数」/「上記一般式(2)で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件2:条件1における「30℃かつpH7.2」を、「大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつpH」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がXとなる反応時間をYとする。
条件3:条件2と同一の温度かつpHにおいて、Yよりも短い時間で反応させる。 - グルクロン酸供与体、N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件4〜6を全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(2)で示されるコンドロイチンを50%超含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはN−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件4:グルクロン酸供与体、N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌
K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で5〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、8時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をXとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるコンドロイチンの分子数」/「上記一般式(2)で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件5:条件4における「30℃かつpH7.2」を、「大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつpH」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がXとなる反応時間をYとする。
条件6:条件5と同一の温度かつpHにおいて、Yよりも長い時間で反応させる。 - グルクロン酸供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件A〜Cを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(1)で示されるコンドロイチンを実質的に100%含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはN−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件A:グルクロン酸供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をXとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるコンドロイチンの分子数」/「上記一般式(2)で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件B:条件Aにおける「30℃かつpH7.2」を、「大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつpH」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がXとなる反応時間をYとする。
条件C:条件Bと同一の温度かつpHにおいて、Yよりも長い時間で反応させる。 - N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させ、下記条件D〜Fを全て満たすように反応させるステップを少なくとも含む、下記一般式(2)で示されるコンドロイチンを実質的に100%含有する画分の製造方法。
(GlcA−GalNAc)n ・・・・(1)
GalNAc−(GlcA−GalNAc)n ・・・・(2)
(各式中、GlcAはグルクロン酸残基を、GalNAcはN−アセチルガラクトサミン残基を、−はグリコシド結合を、nは任意の整数をそれぞれ示す。)
(条件)
条件D:N−アセチルガラクトサミン供与体、糖受容体、大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ及び終濃度で0.02〜100mMのMn2+を共存させて30℃かつpH7.2の条件で、0.5時間反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比をXとする。ここで「コンドロイチン含量比」とは、「上記一般式(1)で示されるコンドロイチンの分子数」/「上記一般式(2)で示されるコンドロイチンの分子数」の比を意味するものとする。
条件E:条件Dにおける「30℃かつpH7.2」を、「大腸菌K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼが作用する任意の温度かつpH」に置き換えて反応させたときに生成する画分中のコンドロイチン含量比がXとなる反応時間をYとする。
条件F:条件Eと同一の温度かつpHにおいて、Yよりも長い時間で反応させる。 - Mn2+の濃度が10〜30mMであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- Mn2+の濃度が15〜25mMであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- Mn2+の濃度が20mMであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
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