JP2003199583A - コンドロイチン合成酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なコンドロイチン合成酵素及びそれをコ
ードするＤＮＡ等を提供する。 【解決手段】 下記の性質を有するコンドロイチン合成
酵素。 (1)GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalNAc
を、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。 (2)非還元末端にGalNAcを有しかつコンドロイチン骨格
を有するオリゴ糖に対しては、GlcUA供与体からGlcUAを
転移するが、GalNAc供与体からGalNAcを実質的に転移し
ない。非還元末端にGlcUAを有する同オリゴ糖に対して
は、GalNAc供与体からGalNAcを転移するが、GlcUA供与
体からGlcUAを実質的に転移しない。 (3)Ｍｎ^２＋イオンの存在下で作用し、Ｃａ^２＋若しく
はＣｕ^２＋イオン又はＥＤＴＡの存在下では実質的に作
用しない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なコンドロイ
チン合成酵素、それをコードするＤＮＡ、コンドロイチ
ン合成酵素の製造方法、コンドロイチンの二糖繰返し単
位を有する糖鎖の製造方法、及びコンドロイチン合成酵
素に対するハイブリダイゼーション用プローブ等に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】まず、本明細書中で共通して用いる略号
について説明する。「GlcUA」はD-グルクロン酸を、「G
alNAc」はＮ-アセチル-D-ガラクトサミンを、「GlcNA
c」はＮ−アセチル-D-グルコサミンを、「UDP」はウリ
ジン 5'-ジリン酸を、式中に記載された「-」はグリコ
シド結合をそれぞれ意味する。

【０００３】コンドロイチンは、GlcUA残基とGalNAc残
基の二糖の繰り返し構造（-GlcUAβ(1-3)-GalNAcβ(1-
4)-；本明細書において、コンドロイチン骨格ともい
う）からなる糖鎖であり、このコンドロイチンがさらに
硫酸化された糖鎖がコンドロイチン硫酸である。

【０００４】GlcUA供与体とGalNAc供与体から、GlcUAと
GalNAcを交互に受容体に転移してコンドロイチンを合成
する酵素（コンドロイチン合成酵素）や、それをコード
するＤＮＡについては、Pasteurella multocida由来の
コンドロイチン合成酵素（J.Biol.Chem. 275(31), 2412
4-24129(2000)）が知られているのみである。

【０００５】また、ある種の大腸菌株（Escherichia co
li Serotype O5:K4(L):H4、以下大腸菌K4株という）は
莢膜抗原としてコンドロイチン骨格を有する多糖体を産
生するが、その構造はGlcUA残基の側鎖にフルクトース
がβ2-3位で結合した三糖繰り返し構造をしている。し
たがって、大腸菌K4株がはたして自身の莢膜抗原合成系
としてコンドロイチン合成酵素を有しているかは不明で
あった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、新規なコンドロイチン合成酵素、
それをコードするＤＮＡ、コンドロイチン合成酵素の製
造方法、コンドロイチンの二糖繰返し単位を有する糖鎖
の製造方法、及びコンドロイチン合成酵素に対するハイ
ブリダイゼーション用プローブ等を提供することを課題
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、特定の微生物
（大腸菌Ｋ４株（Escherichia coli Serotype O5:K4
(L):H4、ATCC23502））が産生する新規なコンドロイチ
ン合成酵素を見出し、これをコードするｃＤＮＡを単離
し、さらにこのｃＤＮＡを用いてコンドロイチン合成酵
素を製造することに成功して、本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】すなわち本発明は、下記の性質を有するコ
ンドロイチン合成酵素（以下、本発明酵素ともいう）を
提供する。なお、本明細書において「コンドロイチン合
成」あるいは「コンドロイチンの合成」とは、コンドロ
イチン等の糖鎖に単糖を転移・付加して、コンドロイチ
ンの糖鎖を延長することを含む概念である。よって、コ
ンドロイチンを合成する単糖(GlcUA及びGalNAc)を交互
に糖鎖に転移・付加してコンドロイチンの糖鎖を延長す
る反応は、「コンドロイチン」ないし「コンドロイチン
の合成」という概念に包含される。 (1)作用：GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からG
alNAcを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。 (2)基質特異性：非還元末端にGalNAcを有しかつコンド
ロイチン骨格を有するオリゴ糖に対しては、GlcUA供与
体からGlcUAを転移するが、GalNAc供与体からGalNAcを
実質的に転移しない。非還元末端にGlcUAを有しかつコ
ンドロイチン骨格を有するオリゴ糖に対しては、GalNAc
供与体からGalNAcを転移するが、GlcUA供与体からGlcUA
を実質的に転移しない。 (3)金属イオン等による影響：Ｍｎ^２＋イオンの存在下
で作用し、Ｃａ^２＋若しくはＣｕ^２＋イオン又はエチレ
ンジアミン四酢酸の存在下では実質的に作用しない。本
発明酵素は、大腸菌由来であるものが好ましい。

【０００９】また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタ
ンパク質（以下、本発明タンパク質ともいう）を提供す
る。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列を含み、かつ、コンドロイチン合成酵素活
性を有するタンパク質。

【００１０】また本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）のいず
れかを保持するＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）
を提供する。 （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ。このＤＮＡは配列番号１で
示されるＤＮＡであることが好ましい。 （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン合成酵素
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。

【００１１】また本発明は、本発明ＤＮＡを保持するベ
クター（以下、本発明ベクターともいう）を提供する。
本発明ベクターは、発現ベクターであることが好まし
い。

【００１２】また本発明は、本発明ベクターによって宿
主が形質転換された形質転換体（以下、本発明形質転換
体ともいう）を提供する。

【００１３】また本発明は、本発明形質転換体を生育さ
せ、その生育物からコンドロイチン合成酵素を採取する
ことを特徴とする、コンドロイチン合成酵素の製造方法
（以下、本発明酵素製造方法ともいう）を提供する。

【００１４】また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示
すアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に包含し、かつ下
記（イ）及び（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパク質
を含有する、糖鎖合成剤（以下、本発明合成剤ともい
う）を提供する。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列。 （イ）GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalN
Acを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。 （ロ）GlcNAc供与体からGlcNAcを、非還元末端にGlcUA
を有する糖鎖の当該非還元末端に転移する。

【００１５】また本発明は、本発明合成剤を、GalNAc供
与体及び下記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる工
程を少なくとも含む、下記一般式(3)で示される糖鎖の
製造方法（以下、本発明糖鎖製造方法１ともいう）を提
供する。 GlcUA-X-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-X-R¹ (3) （各式中、XはGalNAc又はGlcNAcを、R¹は任意の基を示
す。）また本発明は、本発明合成剤を、GlcNAc供与体及
び下記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる工程を少
なくとも含む、下記一般式(4)で示される糖鎖の製造方
法（以下、本発明糖鎖製造方法２ともいう）を提供す
る。 GlcUA-X-R¹ (1) GlcNAc-GlcUA-X-R¹ (4) （各式中、X及びR¹はいずれも前記と同義である。）

【００１６】また本発明は、本発明合成剤を、GlcUA供
与体及び下記一般式(2)で示される糖鎖に接触させる工
程を少なくとも含む、下記一般式(5)で示される糖鎖の
製造方法（以下、本発明糖鎖製造方法３ともいう）を提
供する。 GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (5) （各式中、R²は任意の基を示す。）

【００１７】また本発明は、本発明合成剤を、GalNAc供
与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(1)で示される
糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式
(6)及び(8)から選ばれる糖鎖の製造方法（以下、本発明
糖鎖製造方法４ともいう）を提供する。 GlcUA-X-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (8) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、X及びR¹はいずれ
も前記と同義である。）

【００１８】また本発明は、本発明合成剤を、GalNAc供
与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(2)で示される
糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式
(7)及び(9) から選ばれる糖鎖の製造方法（以下、本発
明糖鎖製造方法５ともいう）を提供する。 GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (9) （各式中、ｎ及びR²はいずれも前記と同義である。）ま
た本発明は、配列番号１で示される塩基配列又はその一
部と相補的な塩基配列を有するハイブリダイゼーション
用プローブ（以下、本発明プローブともいう）を提供す
る。

【００１９】さらに本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に
示すアミノ酸配列を含む酵素タンパク質を含有し、GlcU
A供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalNAcを、GlcN
Ac供与体からGlcNAcをそれぞれ糖鎖の非還元末端に転移
する機能を有する、糖転移触媒（以下、本発明触媒とも
いう）を提供する。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を発明の実施の形態
によって詳説する。 ＜１＞本発明酵素、本発明タンパク質 本発明酵素は、下記の(1)〜(3)の性質を有するコンドロ
イチン合成酵素である。 (1)作用：GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からG
alNAcを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。

【００２１】ここで、GlcUA供与体としてはヌクレオシ
ドジリン酸−GlcUAが好ましく、UDP-GlcUAが特に好まし
い。また、GalNAc供与体としてはヌクレオシドジリン酸
−GalNAcが好ましく、UDP-GalNAcが特に好ましい。

【００２２】本発明酵素は、これらそれぞれの糖供与体
から、GlcUAとGalNAcを交互に糖鎖（受容体）の非還元
末端に転移する。例えば、糖鎖（受容体）の非還元末端
にまずGlcUAが転移された場合には、次いでGalNAcが転
移され、次いでGlcUAが転移され、次いでGalNAcが転移
され、という要領で単糖が転移される。同様に、糖鎖
（受容体）の非還元末端にまずGalNAcが転移された場合
には、次いでGlcUAが転移され、次いでGalNAcが転移さ
れ、次いでGlcUAが転移され、という要領で単糖が転移
される。この結果、本発明酵素によってGlcUA残基とGal
NAc残基の二糖の繰り返し構造、すなわちコンドロイチ
ン骨格が合成されることになる。

【００２３】単糖の受容体となる糖鎖としては、コンド
ロイチン骨格を有する糖鎖が好ましい。コンドロイチン
骨格を有する糖鎖としては、コンドロイチン硫酸やコン
ドロイチンが例示される。コンドロイチン硫酸のなかで
も、コンドロイチン６−硫酸構造を主とし、若干のコン
ドロイチン４−硫酸構造をも含むコンドロイチン硫酸
（以下、コンドロイチン硫酸Ｃという）が好ましい。

【００２４】また、受容体となる糖鎖はオリゴ糖である
ことがより好ましい。オリゴ糖のサイズは特に限定され
ないが、受容体がコンドロイチン硫酸Ｃのオリゴ糖の場
合には６糖又は７糖が、コンドロイチンのオリゴ糖の場
合には４糖又は６糖がそれぞれ好ましい。

【００２５】また本発明酵素は、さらにGalNAc供与体か
らGalNAcを、ヒアルロン酸骨格(GlcUA残基とGlcNAc残基
の二糖の繰り返し構造）を有する糖鎖に転移する作用を
有しているものが好ましい。ヒアルロン酸骨格を有する
糖鎖もオリゴ糖であることが好ましい。オリゴ糖のサイ
ズは特に限定されないが、６糖程度のものが特に好まし
い。

【００２６】(2)基質特異性：非還元末端にGalNAcを有
しかつコンドロイチン骨格を有するオリゴ糖に対して
は、GlcUA供与体からGlcUAを転移するが、GalNAc供与体
からGalNAcを実質的に転移しない。

【００２７】非還元末端にGlcUAを有しかつコンドロイ
チン骨格を有するオリゴ糖に対しては、GalNAc供与体か
らGalNAcを転移するが、GlcUA供与体からGlcUAを実質的
に転移しない。

【００２８】本発明酵素は、さらに、非還元末端にGalN
Acを有しかつコンドロイチン骨格を有するオリゴ糖に対
して、GlcNAc供与体からGlcNAcを実質的に転移しないも
のが好ましい。本発明酵素は、さらに、非還元末端にGl
cUAを有しかつコンドロイチン骨格を有するオリゴ糖に
対して、GlcNAc供与体からGlcNAcを転移するものが好ま
しい。ただし、GlcNAcが転移されて生成したオリゴ糖に
対して、GlcUA供与体からGlcUAを実質的に転移しないも
のが好ましい。

【００２９】また本発明酵素は、非還元末端にGlcUAを
有しかつヒアルロン酸骨格を有するオリゴ糖に対して
は、GalNAc供与体からGalNAcを転移するが、GlcUA供与
体からGlcUAを実質的に転移しないものが好ましい。

【００３０】(3)金属イオン等による影響：Ｍｎ^２＋イ
オンの存在下で作用し、Ｃａ^２＋若しくはＣｕ^２＋イオ
ン又はエチレンジアミン四酢酸の存在下では実質的に作
用しない。

【００３１】なお本発明酵素は、好ましくは、さらにＦ
ｅ^２＋又はＭｇ^２＋イオンの存在下でも作用するもので
ある。また本発明酵素は、Ｍｎ^２＋イオンの存在下にお
ける作用の程度（酵素活性）が、Ｆｅ^２＋又はＭｇ^２＋
イオンの存在下における作用の程度（酵素活性）よりも
高いものが好ましい。

【００３２】また本発明酵素を用いて反応させると、２
５℃以上において、反応温度の上昇とともに反応生成物
（コンドロイチン鎖）のサイズが小さくなることが観察
されれいる（実施例参照）。従って本発明酵素は、後述
の実施例に記載の反応条件においては、２５℃以上にお
いて反応温度の上昇につれて酵素活性が低下するものと
考えられる。

【００３３】本発明酵素は大腸菌由来であるものが好ま
しい。特に莢膜多糖体の生産に関与する遺伝子を持つ大
腸菌が好ましく、莢膜抗原（Ｋ）が「Ｋ４」である大腸
菌がより好ましい。莢膜抗原の抗原型（Serotype）が
「Ｋ４」である大腸菌としては、大腸菌K4株(Escherich
ia coli Serotype O5:K4(L):H4)が好ましく例示され、
更に具体的にはATCC23502, NCDC U1-41, Freiburg coll
ection number 2616等が好ましく例示される。

【００３４】また本発明酵素は、下記（Ａ）又は（Ｂ）
のタンパク質（本発明タンパク質）であることが好まし
い。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列を含み、かつ、コンドロイチン合成酵素活
性を有するタンパク質。

【００３５】天然に存在するタンパク質には、それをコ
ードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質
の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ
酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変
異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しない
タンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示す
ものがあることが知られている。このように構造的に若
干の差違があってもその機能については大きな違いが認
められないタンパク質も、本発明タンパク質に包含され
る。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような
変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに
多種多様の変異体を作製することが可能である。例え
ば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中
の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチ
ドがインターロイキン２活性を保持することが知られて
いる(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパ
ク質は、活性には必須でないペプチド領域を有している
ことが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタン
パク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの
前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これ
らの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質へ
の転換に際して除去される。このようなタンパク質は、
一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には
同等の機能を有するタンパク質である。

【００３６】本明細書において「数個のアミノ酸」と
は、コンドロイチン合成酵素の活性が失われない程度の
変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６０
０アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程
度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の
数を示す。

【００３７】また本発明タンパク質は、上記（Ａ）又は
（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含んでいる限りにおいて
他のタンパク質やペプチドのアミノ酸配列を含んでいて
も良い。すなわち本発明タンパク質は、他のタンパク質
やペプチドとの融合タンパク質であっても良い。

【００３８】例えば、上記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のア
ミノ酸配列からなるタンパク質とマーカーペプチドとの
融合タンパク質等も本発明タンパク質に包含される。こ
のような本発明タンパク質は、精製を容易にすることが
できるというメリットがある。上記マーカーペプチドと
しては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、
His、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GS
T（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げ
られる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、Ｉ
ｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマト
グラフィーによって簡便に精製することができる。同様
に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケ
ルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合
タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用
いることができる。またインスリンシグナルとの融合タ
ンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、
細胞破砕等の抽出操作が不要となる。本発明タンパク質
（本発明酵素）は可溶性のものが好ましい。

【００３９】ここで好ましいのは、配列番号４のアミノ
酸配列で示されるペプチド（Hisタグ）との融合タンパ
ク質である。このＨｉｓタグは、配列番号２で示される
アミノ酸配列の直前の位置に連続して融合させることが
好ましい。この融合タンパク質は、配列番号４の塩基配
列を、配列番号１の塩基配列の直前の位置に連続して結
合させたＤＮＡを発現させることによって製造すること
ができる。この融合タンパク質は可溶性である。

【００４０】「コンドロイチン合成酵素活性」は、グリ
コシルトランスフェラーゼの一般的なアッセイ方法に準
じて検出することができる。具体的には、GlcUA供与
体、GalNAc供与体、及び受容体となる糖鎖を用い、GlcU
AとGalNAcが交互に糖鎖（受容体）の非還元末端に転移
してコンドロイチンを合成する活性として検出すること
ができる。

【００４１】例えば、非還元末端にGalNAcを有する糖鎖
に対してはGlcUA供与体からGlcUAを転移し、かつ、非還
元末端にGlcUAを有する糖鎖に対してはGalNAc供与体か
らGalNAcを転移する場合には、GlcUAとGalNAcが交互に
糖鎖の非還元末端に転移する活性、すなわちコンドロイ
チン合成酵素活性を有すると判定できる。具体的方法と
しては、後述の実施例に記載した酵素活性の測定方法を
採用することが好ましい。このような方法によって、コ
ンドロイチン合成酵素活性を保持しているアミノ酸の欠
失、置換、挿入又は転位を容易に選択することができ
る。

【００４２】本発明酵素及び本発明タンパク質の製造方
法は特に限定されず、後述の本発明ＤＮＡを適当な細胞
で発現させることによって製造することができる。また
天然物から単離されたものや、化学合成等によって製造
されたものについても当然に本発明酵素や本発明タンパ
ク質に包含される。本発明ＤＮＡを用いた本発明酵素
（本発明タンパク質）の製造方法については後述する。

【００４３】＜２＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを保持
するＤＮＡである。 （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ。このＤＮＡは配列番号１で
示されるＤＮＡであることが好ましい。 （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン合成酵素
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡ。

【００４４】本明細書において「ストリンジェントな条
件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、
非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sa
mbrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory
Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条
件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳ
Ｃ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's soluti
on、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブ
リダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ
溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄す
る条件が挙げられる。

【００４５】本発明ＤＮＡは、もともとはＫ４抗原を有
する大腸菌から取得されたものであるが、形質転換され
た他の生物種から取得されたものや、化学合成等によっ
て製造されたＤＮＡも当然に包含される。本発明ＤＮＡ
の製造方法も特に限定されないが、例えば後述の実施例
に記載の方法を用いることが好ましい。本発明ＤＮＡと
して、遺伝暗号の縮重による種々の異なった塩基配列を
有するＤＮＡが存在することは、当業者にとって容易に
理解されるところである。

【００４６】＜３＞本発明ベクター 本発明ベクターは、本発明ＤＮＡを保持するベクターで
ある。本発明ベクターに保持される本発明ＤＮＡとして
好ましいＤＮＡは、前記＜２＞の説明と同様である。ま
た本発明ベクターは、後述する本発明酵素製造方法に好
ましく用いられることから、発現ベクターであることが
好ましい。本発明ＤＮＡを公知のベクターに組込むこと
によって、本発明ベクターを調製することができる。

【００４７】本発明ＤＮＡを導入するベクターとして
は、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる
適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミ
ドベクター等）を使用することができ、本発明ベクター
を組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような
宿主−ベクター系としては、COS細胞、3LL-HK46細胞な
どの哺乳類細胞と、pGIR201（Kitagawa, H., and Pauls
on, J. C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1394-1401）、
pEF-BOS（Mizushima, S., and Nagata, S. (1990) Nucl
eic Acid Res. 18, 5322）、pCXN2(Niwa, H., Yamanur
a, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)、
pCMV-2（イーストマン コダック(EastmanKodak)製）、
pCEV18、pME18S（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(199
0)）又はpSVL（ファルマシア バイオテック社製）等の
哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせ、大腸菌（E. c
oli）と、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX（ファ
ルマシア バイオテック社製）、pTrc99（ファルマシア
バイオテック社製）、pKK233-3（ファルマシア バイ
オテック社製）、pEZZZ18（ファルマシア バイオテッ
ク社製）、pCH110（ファルマシア バイオテック社
製）、pET（ストラタジーン社製）、pBAD（インビトロ
ゲン社製）、pRSET（インビトロゲン社製）、及びpSE42
0（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクタ
ーとの組み合わせのほか、宿主細胞として昆虫細胞、酵
母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベク
ターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特
に大腸菌とpTrcHisとの組み合わせが好ましい。

【００４８】また、本発明ＤＮＡを組込むベクターは、
本発明タンパク質（本発明酵素）とマーカーペプチドと
の融合タンパク質を発現するように構築されたものを用
いることもでき、前記＜１＞で説明した通り、本発明ベ
クターを用いて発現されるコンドロイチン合成酵素を精
製する場合には特に好ましい。具体的には、例えばＨｉ
ｓを発現する塩基配列（例えば配列番号４の塩基配列）
を保有するベクターが好ましい。

【００４９】いずれのベクターを用いる場合であって
も、本発明ＤＮＡとベクターとの連結が可能となるよう
に、これら双方を制限酵素等によって処理し、必要に応
じて平滑化や粘着末端の連結を行った後、本発明ＤＮＡ
とベクターとを連結することができる。本発明ベクター
の製造方法としては、例えば後述の実施例に記載の方法
を用いることができ、かつ、好ましい。

【００５０】＜４＞本発明形質転換体 本発明形質転換体は、本発明ベクターによって宿主が形
質転換された形質転換体である。ここでいう「宿主」
は、本発明ベクターによる組換えが可能なものであれば
よいが、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを組み込んだ組
換えベクターの機能を発揮できるものが好ましい。宿主
としては、動物細胞、植物細胞、微生物細胞（菌体）が
包含され、COS細胞（COS-1細胞、COS-7細胞等）、3LL-H
K46細胞などの哺乳類細胞、大腸菌（E. coli）、昆虫細
胞、酵母、枯草菌などが例示される。宿主は、本発明ベ
クターにあわせて適宜選択することができるが、例えば
pTrcHisをベースとする本発明ベクターを用いる場合に
は大腸菌を選択することが好ましい。

【００５１】本発明ベクターによる宿主の形質転換は、
常法によって行うことができる。例えば、市販のトラン
スフェクション用試薬を用いる方法や、DEAE-デキスト
ラン法、エレクトロポレーション法等によって本発明ベ
クターを宿主に導入し、形質転換を行うことができる。
このようにして得られる本発明形質転換体は、後述の本
発明酵素製造方法に用いることができる。

【００５２】＜５＞本発明酵素製造方法 本発明酵素製造方法は、本発明形質転換体を生育させ、
その生育物からコンドロイチン合成酵素を採取すること
を特徴とする、コンドロイチン合成酵素の製造方法であ
る。

【００５３】ここで「生育」とは、本発明形質転換体で
ある細胞や微生物自体の増殖、本発明形質転換体である
細胞を組み込んだ動物、昆虫等の生育を含む概念であ
る。また、ここでいう「生育物」とは、本発明形質転換
体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養され
た宿主細胞、分泌物、排出物等を包含する概念である。
生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わ
せて適宜選択される。本発明酵素製造方法によれば、用
いる形質転換体に応じて種々の形態のコンドロイチン合
成酵素を産生させることができる。

【００５４】例えば、マーカーペプチドとの融合タンパ
ク質を発現するよう構築された発現ベクターによって形
質転換された形質転換体を生育させれば、マーカーペプ
チドと融合したコンドロイチン合成酵素が産生される。
具体的には、例えば配列番号４のアミノ酸配列が、配列
番号２で示されるアミノ酸配列の直前の位置に連続して
融合したタンパク質を発現するよう構築された発現ベク
ターによって形質転換された形質転換体を生育させるこ
とによって、Ｈｉｓタグと融合したコンドロイチン合成
酵素が産生される。特に、配列番号４の塩基配列を、配
列番号１の塩基配列の直前の位置に連続して結合させる
ことによって構築した発現ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体を用いることが好ましい。

【００５５】生育物からのコンドロイチン合成酵素の採
取は、産生されるコンドロイチン合成酵素の形態に応じ
て、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うこ
とができる。

【００５６】例えばコンドロイチン合成酵素が、培地
（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生さ
れる場合には、培地を採取し、これをそのままコンドロ
イチン合成酵素として用いてもよい。またコンドロイチ
ン合成酵素が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は
不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素
キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガ
ラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融
解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこ
れらの組み合わせ等の処理操作によってコンドロイチン
合成酵素を抽出することができ、その抽出物をそのまま
コンドロイチン合成酵素として用いてもよい。

【００５７】これらの培地や抽出物から、コンドロイチ
ン合成酵素をさらに精製することもでき、かつ好まし
い。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完
全な精製であってもよく、コンドロイチン合成酵素の使
用目的等に応じて適宜選択することができる。

【００５８】精製方法として具体的には、例えば硫酸ア
ンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠
心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作
が挙げられる。コンドロイチン合成酵素の製造は、アミ
ノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって
確認することができる。

【００５９】＜６＞本発明合成剤 本発明合成剤は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸
配列をそのアミノ酸配列中に包含し、かつ下記（イ）及
び（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパク質を含有す
る、糖鎖合成剤である。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列。 （イ）GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalN
Acを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。 （ロ）GlcNAc供与体からGlcNAcを、非還元末端にGlcUA
を有する糖鎖の当該非還元末端に転移する。 本発明合成剤の有効成分である「上記（Ａ）又は（Ｂ）
に示すアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に包含し、か
つ上記（イ）及び（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパ
ク質」としては、本発明酵素又は本発明タンパク質をそ
のまま用いることができる。

【００６０】本発明合成剤は、本発明酵素及び本発明タ
ンパク質が有する「GalNAcの転移作用」、「GlcNAcの転
移作用」及び「GlcUAの転移作用」を、糖鎖の合成剤と
して応用したものである。

【００６１】本発明合成剤は糖鎖の合成に用いるもので
ある。本明細書において「糖鎖の合成」あるいは「糖鎖
合成」とは、ある糖鎖に単糖を転移・付加して、糖鎖を
延長することを含む概念である。例えば、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸等の糖鎖に、
GlcUA、GalNAc又はGlcNAc等の単糖を転移・付加してこ
れらの糖鎖を延長する概念は、本明細書における「糖鎖
合成」という用語に包含される。

【００６２】本発明合成剤の形態も限定されず、溶液形
態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化酵
素形態のいずれであってもよい。またコンドロイチン合
成酵素の活性に影響を与えない限りにおいて他の成分
（例えば、医薬的又は試薬的に許容される担体等）を含
んでいてもよい。

【００６３】＜７＞本発明糖鎖製造方法 本発明糖鎖製造方法は、いずれも本発明合成剤を用いる
ものであり、使用する糖供与体と受容体基質に応じて、
以下の４つに分けることができる。 （１）本発明糖鎖製造方法１ 本発明合成剤を、GalNAc供与体及び下記一般式(1)で示
される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一
般式(3)で示される糖鎖の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-X-R¹ (3)

【００６４】（２）本発明糖鎖製造方法２ 本発明合成剤を、GlcNAc供与体及び下記一般式(1)で示
される糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一
般式(4)で示される糖鎖の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) GlcNAc-GlcUA-X-R¹ (4)

【００６５】（３）本発明糖鎖製造方法３ 本発明合成剤を、GlcUA供与体及び下記一般式(2)で示さ
れる糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般
式(5)で示される糖鎖の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (5)

【００６６】（４）本発明糖鎖製造方法４ 本発明合成剤を、GalNAc供与体及びGlcUA供与体、並び
に下記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる工程を少
なくとも含む、下記一般式(6)及び(8)から選ばれる糖鎖
の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (8)

【００６７】（５）本発明糖鎖製造方法５ 本発明合成剤を、GalNAc供与体及びGlcUA供与体、並び
に下記一般式(2)で示される糖鎖に接触させる工程を少
なくとも含む、下記一般式(7)及び(9) から選ばれる糖
鎖の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (9) 上記各式中の「X」はGalNAc又はGlcNAcを、「R¹」及び
「R²」は任意の基を示す。「R¹」と「R²」は互いに同一
でも異なっていてもよい。

【００６８】「R¹」及び「R²」としては、例えば、コン
ドロイチン骨格を有する糖鎖や、ヒアルロン酸骨格を有
する糖鎖等が例示される。

【００６９】上記一般式(1)で示される糖鎖として好ま
しいものは、非還元末端にGlcUAを有するコンドロイチ
ン硫酸（特にコンドロイチン硫酸Ｃ）、コンドロイチン
若しくはヒアルロン酸又はこれらのオリゴ糖である。

【００７０】上記一般式(2)で示される糖鎖として好ま
しいものは、非還元末端にGalNAcを有するコンドロイチ
ン硫酸（特にコンドロイチン硫酸Ｃ）若しくはコンドロ
イチン又はこれらのオリゴ糖である。

【００７１】GalNAc供与体としては、ヌクレオシドジリ
ン酸−GalNAcが好ましく、UDP-GalNAcが特に好ましい。
GlcNAc供与体としては、ヌクレオシドジリン酸−GlcNAc
が好ましく、UDP-GlcNAcが特に好ましい。また、GlcUA
供与体としては、ヌクレオシドジリン酸−GlcUAが好ま
しく、UDP-GlcUAが特に好ましい。

【００７２】「接触」のさせ方は、本発明合成剤中に含
まれる本発明酵素（又は本発明タンパク質）、供与体、
及び受容体（糖鎖）の分子が相互に接触して酵素反応が
生ずる限りにおいて特に限定されない。例えばこれら三
者が溶解した溶液中で接触させてもよい。また本発明合
成剤中に含まれるコンドロイチン合成酵素を適当な固相
（ビーズ等）に結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、
透析膜等を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に酵
素反応させることもできる。また、ＰＣＴ国際公開パン
フレットＷＯ００／２７４３７号に記載された方法と同
様に、受容体を固相に結合させて酵素反応させることも
できる。さらに、供与体を再生（合成）するバイオリア
クターを組み合わせて用いてもよい。

【００７３】また、上記（４）及び（５）においては、
必ずしもGalNAc供与体とGlcUA供与体とを同時に本発明
合成剤及び上記一般式(1)又は(2)で示される糖鎖に接触
させる必要はなく、これら供与体を交互に接触させても
よい。

【００７４】酵素反応させる条件は、本発明酵素（又は
本発明タンパク質）が作用する条件である限りにおいて
特に限定されないが、中性ｐＨ付近（例えばpH 7.0〜7.
5程度）で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩
衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好まし
い。またこのときの温度も、本発明酵素（又は本発明タ
ンパク質）の活性が保持されている限りにおいて特に限
定されないが、25℃〜30℃程度が例示される。また本発
明酵素（又は本発明タンパク質）の活性を増加させる物
質がある場合には、その物質を添加してもよい。例えば
Ｍｎ²⁺等を共存させることが好ましい。反応時間は、使
用する本発明合成剤、供与体及び受容体の量、並びにそ
の他の反応条件に応じて当業者が適宜決定することがで
きる。

【００７５】生成物からの糖鎖の単離等は、公知の方法
によって行うことができる。また、本発明合成剤（コン
ドロイチン合成酵素）と、硫酸基転移酵素（スルホトラ
ンスフェラーゼ）とを組み合わせて用いることによっ
て、コンドロイチン硫酸等の硫酸化糖を製造することも
できる。

【００７６】例えば、上記の糖鎖の製造方法において、
さらに硫酸基供与体（3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ
硫酸(PAPS)など）と硫酸基転移酵素を共存せしめ、コン
ドロイチンの生成と硫酸基の転移とを同時に行うことに
よって、コンドロイチン硫酸等の硫酸化糖を製造するこ
とができる。硫酸基転移酵素は、前記と同様に適当な固
相（ビーズ等）に結合させた固定化酵素として用いても
よく、限外濾過膜、透析膜等を用いる膜型リアクターを
用いて、連続的に反応させてもよい。この際、硫酸基供
与体を再生（合成）するバイオリアクターを組み合わせ
て用いてもよい。

【００７７】ここで用いることができる硫酸基転移酵素
は、コンドロイチンに硫酸基を転移する酵素であればよ
く、所望のコンドロイチン硫酸のタイプに応じて、公知
のものから適宜選択することができる。また、硫酸基の
転移位置が異なる２種類以上の硫酸基転移酵素を組み合
わせて用いてもよい。硫酸基転移酵素の一例として、例
えばコンドロイチン６−Ｏ−硫酸基転移酵素（J. Biol.
Chem., 275(28), 21075-21080 (2000)）を挙げること
ができるが、これに限定されず、他の酵素を用いること
もできる。

【００７８】＜８＞本発明プローブ 本発明プローブは、配列番号１で示される塩基配列又は
その一部と相補的な塩基配列を有するハイブリダイゼー
ション用プローブである。本発明プローブは、配列番号
１に示される塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを作成し、これをハイブリ
ダイゼーションに適した標識（例えば、放射性同位体）
で標識することによって得ることができる。

【００７９】オリゴヌクレオチドの長さは、本発明プロ
ーブを用いるハイブリダイゼーションの条件等によって
適宜選定される。本発明プローブは、コンドロイチン硫
酸の生物学的機能を調べる有用な道具となることが期待
される。コンドロイチン硫酸は、広く発現し、かつ、多
くの組織、特に脳において重要な役割を果たしているか
らである。このプローブはさらに、遺伝子と疾患との関
連を探るのにも有用と考えられる。

【００８０】＜９＞本発明触媒 本発明触媒は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸配
列を含む酵素タンパク質を含有し、GlcUA供与体からGlc
UAを、GalNAc供与体からGalNAcを、GlcNAc供与体からGl
cNAcをそれぞれ糖鎖の非還元末端に転移する機能を有す
る、糖転移触媒である。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
アミノ酸配列。 本発明触媒の有効成分である「上記（Ａ）又は（Ｂ）に
示すアミノ酸配列を含む酵素タンパク質」としては、本
発明酵素又は本発明タンパク質をそのまま用いることが
できる。

【００８１】本発明触媒は、本発明酵素及び本発明タン
パク質が有する「GalNAcの転移作用」、「GlcNAcの転移
作用」及び「GlcUAの転移作用」を、糖転移触媒として
応用したものである。本発明触媒は、GlcUA、GalNAc又
はGlcNAcの転移に用いることができる。例えば、コンド
ロイチン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸等の糖
鎖の非還元末端に、GlcUA、GalNAc又はGlcNAc等の単糖
を転移する際に用いることができる。

【００８２】本発明触媒の形態も限定されず、溶液形
態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化酵
素形態のいずれであってもよい。またGlcUA、GalNAc又
はGlcNAcの転移活性に影響を与えない限りにおいて他の
成分（例えば、医薬的又は試薬的に許容される担体等）
を含んでいてもよい。

【００８３】

【実施例】以下に、本発明の実施例を具体的に説明す
る。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。なお、本実施例において用
いたUDP-[¹⁴C]GlcUA、UDP-[³H]GalNAc及びUDP-[¹⁴C]Glc
NAcは、NEN ライフサイエンス社から入手した。また、U
DP-GlcUA、UDP-GalNAc及びUDP-GlcNAcはシグマ社から入
手した。

【００８４】実施例１ コンドロイチン合成酵素遺伝子
のクローニング (1)DNAライブラリーの作製 大腸菌K4株（serotype O5:K4(L):H4、ATCC 23502）を、
50mlのＬＢ培地中で 37℃、一晩培養した。遠心分離（3
800rpm、15分）して菌体を集め、1mM エチレンジアミン
四酢酸（EDTA）を含む10mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液
（以下TEという）9mlに懸濁し、10％ SDS 0.5ml及びpro
teinase K（20mg/ml：Boehringer Mannheim）50μlを加
えて37℃で1時間処理した。その懸濁液に、10mlのPCI溶
液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
＝25：24：1）を加えて30分間攪拌し、遠心分離（3800r
pm、15分）して水層及び中間の不溶物を集め、再度遠心
分離（10000rpm、30分）した。上清を集めRNaseA（20mg
/ml：Sigma）50μlを加えて37℃で1時間反応させた。そ
の処理液に、10mlのPCI溶液を加えて30分間攪拌し、遠
心分離（3800rpm、15分）によって水層を集め再度遠心
分離（10000rpm、30分）した。上清を集めて2000mlのTE
に対して４℃で一晩透析して得られた透析内液（7.5m
l）を染色体DNA溶液（DNA濃度0.9mg/ml）とした。得ら
れたK4株由来の染色体DNA溶液120μlを制限酵素Sau3A1
（4単位：NEB）を用いて37℃で30分間切断処理をし、0.
3％アガロースゲル電気泳動した後、約7〜11kbpのDNAが
泳動される位置のアガロースゲルを切り出した。切り出
したゲルを注射針で底に穴をあけた1.5mlチューブに入
れ、そのチューブごと2mlチューブに重ねて遠心分離（8
000rpm、1分）してゲルを潰した。そして、ゲルとほぼ
等量の中和フェノールを加えて強く攪拌して、−80℃で
凍結処理した。30分後室温に戻し融解させた後、遠心分
離（13000rpm、5分）によって水層を集めて、等量のPCI
溶液を加えて攪拌後、遠心分離（13000rpm、5分）し
た。水層を集めて1/10量の3M 酢酸ナトリウム溶液及び
等量の2-プロパノールを加えてDNAを沈殿させ、遠心分
離（13000rpm、30分）して集めた。集めた沈殿に70％
エタノール溶液を加えて遠心分離（13000rpm、5分）
し、沈殿にTEを100μl加えて溶解した。この溶液を濃縮
するために10μlの3M 酢酸ナトリウム溶液及び300μlの
エタノールを加えてDNAを沈殿させ、遠心分離（13000rp
m、20分）して回収した。集めた沈殿に70％ エタノール
溶液を加えて遠心分離（13000rpm、5分）し、沈殿を精
製水4μlに溶解して染色体DNA断片溶液を得た。そのDNA
断片溶液2μlを制限酵素（BamH I（80単位：NEB）及びE
coRI（80単位：NEB））で処理したλファージベクター
（λEMBL3：STRATAGENE）に組み込み、パッケージング
キット（Gigapack III Gold Packaging Extract、STRAT
AGENE）を用いて添付の操作法に従ってパッケージング
を行い、大腸菌（NM539株）にλファージを感染させて
増殖させ、K4染色体DNAライブラリーを作製した。

【００８５】(2)プローブの作製 既に配列が分かっている（Mol. Microbiol. 17 (4), 61
1-620 (1995)）大腸菌K5株（Serotype O10:K5(L):H4、A
TCC 23506）のＫ抗原遺伝子クラスター部分３領域の
内、Ｋ抗原糖鎖特異的領域 R-II部（gene bank accessi
on NO.X77617）を挟んで、大腸菌株間で相同性が高いと
言われているR-I部（gene bank accession NO.X74567）
の3'端寄りの1kbp程度のDNAフラグメントが得られるよ
うなプライマーセット（CS-S 5'-ACCCAACACTGCTACAACCT
ATATCGG-3'（配列番号５）;CS-AS5'-GCGTCTTCACCAATAAA
TACCCACGAAACT-3'（配列番号６））と、R-III部（gene
bank accession NO.X53819）の 5'端寄りの1kbp程度のD
NAフラグメントが得られるようなプライマーセット（TM
-S 5'-CGAGAAATACGAACACGCTTTGGTAA-3'（配列番号７）;
TM-AS 5'-ACTCAATTTTCTCTTTCAGCTCTTCTTG-3'（配列番号
８））を選択・作製した。

【００８６】R-I用, R-III用それぞれのプライマーセッ
トを使って、上記(1)のSau3A1処理してアガロースゲル
電気泳動後抽出精製したK4株のゲノムDNAフラグメント
を鋳型にして、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(PCR)（94℃、1分−(94℃、45秒−47℃、30秒−72℃、5
分) 30サイクル−72℃、10分(R-I用)、94℃、1分−(94
℃、45秒−50℃、30秒−72℃、5分) 30サイクル−72
℃、10分(R-III用)）を行い、R-I 部 1.3kbp（K4RI
3）、R-III部 1.0kbp（K4RIII5） のK4由来のDNAフラグ
メントを得た。得られたDNAフラグメントのヌクレオチ
ド配列をABI PRISM 310Genetic Analyzer（Perkin-Elme
r）を用いて決定した。同じ遺伝子位置でのK5株DNAとの
ホモロジーは、それぞれ９６％、及び９５％であった。

【００８７】(3)K4R-II部の遺伝子クローニング R-I部、R-III部それぞれのDNAフラグメント（K4RI3、K4
RIII5）をプローブとして、(1)で得られたK4染色体DNA
ライブラリーから K4抗原遺伝子クラスターのスクリー
ニングを行った。大腸菌（NM539株）培養液300μlにK4
染色体DNAライブラリー（λファージ40μl）を感染（37
℃,15分間）させ、10mlのTop agaroseを加えて10×14cm
角形シャーレ中のLBプレート培地５枚に塗布し37℃で9.
5時間培養してプラークを形成させた。各プレートにつ
き２枚ずつ9×13cmのメンブレン（Hybond-N+ : Amersha
m ファルマシア社 Biotech）を準備し、１枚目は１分
間、２枚目は３分間培地に接面させた。余分な水分を除
いた後1.5M NaClを含む0.5M NaOH溶液に２分間浸して変
性処理し、続いて1.5M NaClを含む1M Tris-HCl（pH7.
4）に３分間浸して中和処理した。乾燥後80℃で2時間ベ
ーキングしてフィルターを作成した。このフィルターを
65℃で１時間プレハイブリダイズ処理した後、0.5M チ
ャーチリン酸緩衝液（pH 7.2）、1mM EDTA及び７％ SDS
中で、[^３２P]でラベルしたK4RI3と64℃で一晩（15時
間）ハイブリダイズさせ、1％ SDSを含む40mM チャーチ
リン酸緩衝液（pH 7.2）で３回（65℃下、各15分間）洗
浄した。フィルターを乾燥させた後Ｘ線フィルムに感光
させ、陽性のプラークを30個とった。それぞれについて
PCRでK4RI3の存在を確認し、うち7個を２次スクリーニ
ングに移行させた。次に、K4RI3とハイブリダイズさせ
たフィルターを0.5％ SDS溶液中で３分間煮沸処理してK
4RI3を除き、乾燥させてK4RIII5ハイブリダイズ用フィ
ルターとした。このフィルターを65℃で１時間プレハイ
ブリ処理した後、[ ^３２P]でラベルしたK4RIII5と65℃で
一晩ハイブリダイズさせ、1％ SDSを含む40mM チャーチ
リン酸液で３度洗浄した。フィルターを乾燥させた後Ｘ
線フィルムに感光させ、陽性のプラークを29個とった。
それぞれについてPCRでK4RIII5の存在を確認し、うち18
個を２次スクリーニングに移行させた。２次スクリーニ
ングではφ9cmのLBプレート培地を使用し、１次スクリ
ーニングと同じ方法で陽性のプラークを取得した。

【００８８】１次、２次スクリーニング後、R-I部から4
個、R-III部から10個のλファージクローンが得られ
た。各クローンについてEcoRI（10単位：NEB）、SalI
（10単位：NEB）、BamHI（10単位：NEB）それぞれ単独
で、あるいは様々な組み合わせで同時に酵素処理を行
い、電気泳動で見える断片の大きさからそれらの制限酵
素地図を作製した（図１）。

【００８９】これらのクローンのうちの１クローン（CS
23、挿入部15.4kbp）は、R-III部のプローブを元に作ら
れたDNAクローンであるが、R-I部のプローブとも弱い反
応を示していたことから挿入部の5'端のシークエンスを
見たところ、そこに R-I部のプローブの3'端と完全に一
致する配列が見られた。挿入部にR-I部とR-III部の両DN
Aフラグメントを含むことから、K4株のK抗原遺伝子クラ
スターのR-II部を全て含むクローンであると判断した。

【００９０】(4)K4 R-II部の遺伝子解析 上記CS23クローンについてシークエンシングを行うため
にサブクローニングを行った。まず、CS23クローンをEc
oRI処理して得られた約３kbp,８kbpのDNAフラグメント
とSalI処理して得られた約２kbp,５kbp,７kbpのDNAフラ
グメントをそれぞれクローニングベクター（pBluescrip
t II KS(-)）とライゲーションさせ、大腸菌（XLI-Blue
株）に組み込みインサートの向きの異なるクローンを得
た。そのクローンについて、「ベクターのマルチクロー
ニングサイトにある各種制限酵素で処理・ライゲーショ
ン・トランスフォーメーション」を繰り返して、R-II部
の部分DNAフラグメントを持つ22種類のプラスミドを得
た。それらの挿入DNAフラグメントのシークエンシング
を行い、それらを繋げて K4 R-II部の全遺伝子配列を決
定した（配列番号３）。

【００９１】(5)コンドロイチン合成酵素遺伝子の同定 K4株R-II部のDNA配列を解析した結果、８個のオープン
リーディングフレーム（ORF）の存在が予想された（図
２）。

【００９２】その中で R-III側から３番目のORF（2061
bp（配列番号３における塩基番号３７８７〜５８４７。
終止コドンを除いた2058 bpの配列を配列番号１に示
す）、アミノ酸数として 686個、計算によって求めた分
子量 79,256（配列番号２））は、Pasteurella multoci
da の ヒアルロン酸合成酵素(クラス２型 pmHAS； J.Bi
ol. Chem., 273 (14), 8454-8458 (1998)) と59％の相
同性があった。また、Pasteurella multocida のコンド
ロイチン合成酵素（pmCS； Biol. Chem. 275 (31), 241
24-24129 (2000)）と61％の相同性があった。また、R-I
II側から１番目のORF（1017 bp（配列番号３における塩
基番号６４３〜１６５９）、アミノ酸数として 339個）
は、Pasteurella multocidaのUDP-Glucose-4-epimerase
（Submitted (29-OCT-1996) Genetics and Microbiolog
y, Autonomus University of Barcelona, Edifici C, B
ellaterra, BCN 08193, Spain）と60％の相同性を、４
番目のORF（1332 bp（配列番号３における塩基番号５８
７７〜７２０７））はInsertion Sequence 2（Nucleic
Acids Res. 6 (3), 1111-1122 (1979)）と高い相同性
（98％）を、７番目のORF（1167 bp（配列番号３におけ
る塩基番号１１４５３〜１２６１９）、アミノ酸数とし
て 389個）は、大腸菌（K5株）のkfiD（Mol. Microbio
l. 17 (4), 611-620 (1995)）遺伝子（UDP-Glucose deh
ydrogenaseをコード）と65％の相同性をそれぞれ持って
いた。また８番目のORF（1035 bp（配列番号３における
塩基番号１３０５４〜１４０８８）、アミノ酸数として
345個）はグリコシルトランスフェラーゼに共通するＤ
ＸＤモチーフを含み、糖転移活性を有していると予想さ
れた。残る他の３つのORF（No. 2、5及び6（配列番号３
における塩基番号はそれぞれ、１８４９〜３４８６、７
２１０〜８６７３、及び９０６６〜１０６３１）につい
ては相同性を持つものは発見されなかった。

【００９３】実施例２ コンドロイチン合成酵素タンパ
ク質の発現と酵素活性 (1)K4 R-II部のORF（No. 3）がコンドロイチン合成酵素
遺伝子であることを確認するために、制限酵素切断部位
を持ち該当するORF部分を挟むプライマー（K4C-SP 5'-C
GGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3'（配列番号９）;K4C
-AS 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3'（配列番号
１０））を作成し、PCR（94℃、1分−(94℃、30秒−59
℃、30秒−74℃、3分)20サイクル−74℃、10分）を行っ
た。このPCR産物を0.7％ Agarose gel電気泳動し、ゲル
抽出キット（QIAGEN）を用いて抽出・精製した。制限酵
素（BamHI及びEcoRI）処理をした後、再度0.7％ アガロ
ースゲル電気泳動し、同様に抽出・精製してインサート
とした。

【００９４】発現ベクター（pTrcHisC：Invitrogen；配
列番号４の塩基配列を保持している）を制限酵素（BamH
I及びEcoRI）処理及びCIP処理したものと、上記で調製
したインサートを、T4DNA ligaseの存在下で16℃,１時
間かけて挿入して、大腸菌（TOP10株）にトランスフォ
ーメーションを行った。その大腸菌株を培養（アンピシ
リンを含むLBプレート培地、37℃、一晩）して７個のコ
ロニーを得た。この中から上記インサートが正確に挿入
されているプラスミドを保持している１クローンを選択
した。その大腸菌を1.5mlの アンピシリン（100μg/m
l）を含むLB培地で培養（37℃，一晩）し、その培養菌
液50μlを50mlのアンピシリン（100μg/ml）を含むLB培
地に接種して37℃でOD_６００が0.6になるまで培養し
た。0.5 M β−イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を
1ml（最終濃度:1mM）培養液に添加して37℃で３時間誘
導した。遠心分離（10000rpm、30分）して菌体を集め、
Lysis buffer（300mM NaCl及び10mM イミダゾールを含
む50mM NaH_２PO_４ (pH 8.0)）を４ml 加えて懸濁し
た。その懸濁液にリゾチーム（シグマ社）を４mg加え、
氷上で３０分間静置した後、ソニケーターで10秒ずつ３
回超音波処理して菌体を破砕した。遠心分離（10000rp
m、30分）して上清を集め、Ni-NTA アガロースカラム
（担体量１ml，Lysis buffer で平衡化；QIAGEN）にア
プライし、ローターで撹拌（４℃で１時間）した。カラ
ムを立てて担体を沈め、Wash buffer（300mM NaCl及び2
0mM イミダゾールを含む50mM NaH_２PO_４ (pH 8.0)）を
用いて４mlずつ２回に分けてカラムを洗浄した。次いで
Elution buffer（300mM NaCl及び250mM イミダゾールを
含む50mM NaH_２PO_４ (pH 8.0)）を0.5 ml ずつ４回に
分けて流し、タンパク質を溶出した。目的のタンパク質
を含む溶出液１mlを500mlの20％グリセロールを含むPBS
（リン酸緩衝生理食塩液）に対して４℃で２日間透析
し、およそ0.5ml（タンパク量0.4mg/ml）の透析液（本
発明酵素（本発明タンパク質）の溶液）を得た。

【００９５】ここで得られたタンパク質についてドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(S
DS-PAGE)とウエスタンブロッティングを行った。SDS-PA
GEには10％ゲルを使用した。タンパク質はクマシー・ブ
リリアント・ブルー(coomassie brilliant blue)染色に
よって検出した。ウエスタンブロッティングは、SDS-PA
GEゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、
その膜を５％スキムミルク（150mM NaCl及び0.05％ Twe
en 20を含有する25mM Tris-HCl(pH 7.5)（この溶液をTB
S-Tという）に溶解）でブロッキングした後、抗-テトラ
-His抗体(Qiagen)で処理した。TBS-Tで数回洗浄した
後、この膜をペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGで処理
した。TBS-Tで洗浄した後、反応したタンパク質をECL検
出システム(ECL detection system；アマシャム社)で検
出した。

【００９６】その結果このタンパク質は、SDS-PAGE及び
抗テトラHis抗体を用いたウエスタンブロッティング解
析において80kDa付近にバンドを呈した。これに対し、
コントロール（インサートを有さない発現ベクター）の
培養抽出物においては、免疫学的に反応するバンドは検
出されなかった。

【００９７】(2)酵素活性の解析(GalNAc転移活性の解
析) 20mM MnCl_２、0.1M (NH_４)_２SO_４、1M エチレングリコ
ールを含む50mM Tris-HCl(pH 7.2)に、本発明酵素（2μ
g）、受容体として睾丸ヒアルロニダーゼで分解して精
製したサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃの６糖（70
pmol）並びに供与体としてUDP-GalNAc（3 nmol）、UDP
-GlcUA（3 nmol）及びUDP-［^３H］GalNAc（0.1 nmol 0.
1 μCi）を加えて全量を50μlに調整し、30℃で30分間
酵素反応させ、酵素を加熱失活させた。その反応液に1.
3％ 酢酸カリウムを含有する95％エタノールを３倍量添
加し、サンプルを 10,000×ｇで20分間遠心した。沈殿
を50μlの蒸留水で溶解し、これをSuperdex peptideカ
ラム（300×φ10 mm:ファルマシア社、クロマトグラフ
ィー条件；buffer:0.2M NaCl、流速：0.5ml/分）にかけ
て溶出液を0.5ml毎に分画し、各フラクションの放射活
性（［^３H］のカウント）をシンチレーションカウンタ
ーで計測した。コンドロイチン合成活性は、受容体基質
よりも高い分子量の画分に取り込まれた放射活性の量を
計算することによって決定した。結果を図３に示す。な
お、図３中の黒四角印は、受容体としてコンドロイチン
硫酸Ｃのオリゴ６糖を用いた場合の放射活性を、白三角
印は酵素反応産物をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理し
た場合の放射活性を、黒丸印はコントロール（熱で失活
させた本発明酵素を用いた場合）をそれぞれ示す。

【００９８】その結果、放射活性の溶出位置はコンドロ
イチン硫酸Ｃの６糖よりも高分子量側に現れた（5,000D
a付近に頂をもつ幅広いピーク）（図３中の黒四角
印）。また、酵素反応産物をコンドロイチナーゼＡＢＣ
処理すると、高分子ピークが２糖画分に相当する位置に
移動していた（図３中の白三角印）。このコンドロイチ
ナーゼＡＢＣ消化物を高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を用いて二糖組成分析した結果、硫酸化されて
いない不飽和のコンドロイチン二糖（Δdi0S）のみが検
出された。

【００９９】また酵素反応産物はコンドロイチナーゼＡ
ＣII処理によっても完全に消化されたが、ストレプトマ
イセス(Streptomyces)のヒアルロニダーゼやヘパリチナ
ーゼＩによっては消化されなかった。以上のことから、
得られた本発明酵素は少なくともUDP-GalNAc（供与体）
からGalNAcをコンドロイチン硫酸Ｃの６糖に転移するこ
とが示された。この比活性は3.25±0.64 nmol GalNAc/
分/mgタンパク質 であった。

【０１００】(3)酵素反応生成物のサイズの解析 上記「(2)酵素活性の解析」と同様に酵素反応及びクロ
マトグラフィーを行い、酵素反応生成物のサイズを調べ
た。結果を図４に示す。図４より、前記で得られた本発
明酵素は、少なくともGalNAc供与体(UDP-GalNAc)からGa
lNAcを受容体（コンドロイチン骨格を有するオリゴ糖
(睾丸ヒアルロニダーゼで調製したコンドロイチン硫酸
Ｃの６糖)）に転移して、分子量１万〜２万以上のコン
ドロイチンを生成することが確認された。

【０１０１】(4)供与体基質の特異性の解析 供与体としてUDP-［^１４C］GlcUA、UDP-［^１４C］GlcNA
c又はUDP-［^３H］GalNAcを用い、前記の「(2)酵素活性
測定」に記載した方法に準じて、以下の受容体に対する
転移活性を調べた。酵素反応後の生成物をゲル濾過で分
析した。

【０１０２】コンドロイチン硫酸Ｃの６糖又は７糖を受
容体として用いたときの結果を図５に示す。なお図５中
の黒丸印はコントロール（熱で失活させた本発明酵素を
用いた場合）を示す。 （イ）コンドロイチン硫酸Ｃの６糖（サメ軟骨由来のコ
ンドロイチン硫酸Ｃを睾丸ヒアルロニダーゼ分解し、精
製したもの。非還元末端がGlcUAである。） 供与体としてUDP-GalNAcのみを使用すると７糖のみが合
成された（図５中の黒菱形印）。

【０１０３】供与体としてUDP-GlcUAのみを用いた場合
には、実質的な転移は見られなかった（図５中の黒三角
印）。

【０１０４】供与体としてUDP-GlcNAcのみを用いた場合
には、わずかであるがGlcNAcの転移が見られた。この転
移活性は、UDP-GalNAcを供与体としたときを100％とす
ると、6.3％であった（図５中の黒四角印）。しかし、
これにUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAの両方を存在させて
も、８糖又はそれ以上のサイズの糖鎖は得られなかっ
た。

【０１０５】また、受容体基質の非存在下では放射能の
取り込みは見られなかったことから、この酵素によるコ
ンドロイチンの合成には、受容体基質が必須であること
が示唆された。 （ロ）コンドロイチン硫酸Ｃの７糖（上記のコンドロイ
チン硫酸Ｃの６糖に本発明酵素を作用させて、該６糖の
非還元末端にGalNAcを１残基結合させたもの。） 供与体としてUDP-GlcUAのみを使用すると８糖のみが合
成された（図５中の白三角印）。

【０１０６】供与体としてUDP-GalNAc又はUDP-GlcNAcの
いずれか一方のみを用いた場合には、いずれも実質的な
転移は見られなかった（それぞれ、図５中の白菱形印及
び白四角印）。

【０１０７】また、同様の実験を別個独立に行った結果
を表１に示す。なお表１中の「ＣＳ」はコンドロイチン
硫酸Ｃを意味する。また表中のカッコ内は酵素反応後の
糖鎖の長さを示し、「−」は標識化UDP-糖が受容体基質
に転移されなかったことを意味する。

【０１０８】

【表１】（表１）

【０１０９】以上の結果から、前記で得られた本発明酵
素は、非還元末端がGlcUAであるコンドロイチン骨格を
有する糖鎖（受容体）に対して、UDP-GalNAcからGalNAc
を転移することが示された。またこの受容体を用いた場
合、前記で得られた本発明酵素はUDP-GlcNAcからGlcNAc
を転移する活性も有しているが、その活性はGalNAc転移
活性よりはるかに低いものであることが示された。また
この受容体を用いた場合、前記で得られた本発明酵素
は、UDP-GlcUAからGlcUAを転移する活性を実質的に有さ
ないことが示された。これらのことから、前記の本発明
酵素は、非還元末端のGlcUAに対してGlcUAを転移せず、
GalNAc（あるいは、わずかではあるがGlcNAc）を１残基
転移する作用を有することが示された。

【０１１０】また、前記で得られた本発明酵素は、非還
元末端がGalNAcであるコンドロイチン骨格を有する糖鎖
（受容体）に対して、UDP-GlcUAからGlcUAを転移するこ
とが示された。またこの受容体を用いた場合、前記で得
られた本発明酵素は、UDP-GalNAcからGalNAcを転移する
活性、及びUDP-GlcNAcからGlcNAcを転移する活性のいず
れをも実質的に有さないことが示された。これらのこと
から、前記の本発明酵素は、非還元末端のGalNAcに対し
てGalNAcを転移せず、GlcUAを１残基転移する作用を有
することが示された。以上のことから、前記の本発明酵
素は、GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalN
Acを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する作用を有する
ことが示された。

【０１１１】(5)受容体基質の特異性の解析 受容体として、睾丸ヒアルロニダーゼで分解して精製し
たコンドロイチン硫酸Ｃの４糖（140 pmol）若しくは６
糖（140 pmol）、長沢法（Carbohydrate Reserch,97,26
3-278(1981)）によって分解して精製したコンドロイチ
ン４糖（260 pmol）若しくは６糖（175 pmol）、睾丸ヒ
アルロニダーゼで分解して精製したヒアルロン酸６糖
（175 pmol）、コンドロイチン硫酸Ｃ（分子量20,00
0）、コンドロイチン（分子量10,000）、デルマタン硫
酸（分子量15,000）、ヒアルロン酸（分子量20,000）、
又はヘパリン（分子量10,000）を用い、以下の方法で転
移活性を調べた。なお、これらの糖鎖は生化学工業株式
会社から入手した。

【０１１２】20mM MnCl_２、0.1M (NH_４)_２SO_４、1M エ
チレングリコールを含む50mM Tris-HCl(pH 7.2)に、本
発明酵素（2μg）、供与体としてUDP-GalNAc（Sigma）
（60 pmol）、UDP-GlcUA（Sigma）（0.6 nmol）及びUDP
-［^３H］GalNAc（0.1 nmol 0.1μCi）を、受容体として
上記の各糖鎖を加えて全量を50μlに調整し、30℃で30
分間酵素反応させ、酵素を加熱失活させた。その反応液
をSuperdex peptideカラム（300×φ10 mm: ファルマシ
ア社、クロマトグラフィー条件；buffer:0.2M NaCl、流
速：1 ml/分）にかけて溶出液を0.5ml毎に分画し、各フ
ラクションの放射活性（［^３H］のカウント）をシンチ
レーションカウンターで計測した。結果を表２に示す。
表中のカッコ内の数字は、コンドロイチン硫酸Ｃの６糖
を受容体としたときの放射活性量（GalNAcが転移した
量）を100％とした場合における相対値である。

【０１１３】

【表２】（表２）

【０１１４】この結果から、コンドロイチン硫酸Ｃの６
糖は最も良い受容体基質となることが示された。コンド
ロイチン６糖も受容体基質として機能したが、その活性
はコンドロイチン硫酸Ｃの６糖の場合に比して低かった
（３７％）。コンドロイチン硫酸４糖又はコンドロイチ
ン４糖への取り込みも同様であった（それぞれ４３％、
３３．５％）。驚くべきことに、ヒアルロン酸６糖及び
ヒアルロン酸（分子量20,000）も受容体基質として機能
した。コンドロイチン硫酸Ｃ（分子量20,000）の取り込
みのレベルは、コンドロイチン硫酸Ｃの６糖と同程度で
あった。コンドロイチン（分子量10,000）では、それほ
ど高い取り込みは見られなかった。

【０１１５】以上の結果を総合すると、前記本発明酵素
は、コンドロイチン骨格を有するオリゴ糖や多糖（少な
くともコンドロイチン硫酸Ｃの４糖、６糖及び７糖、コ
ンドロイチン４糖及び６糖、コンドロイチン硫酸Ｃ(分
子量20,000)並びにコンドロイチン（分子量10,000））
及びヒアルロン酸のオリゴ糖や多糖（少なくとも、ヒア
ルロン酸６糖及びヒアルロン酸（分子量20,000））を受
容体とすることが示された。一方、デルマタン硫酸（分
子量15,000）やヘパリン（分子量10,000）には放射活性
の取り込みは見られず、受容体基質として実質的に機能
しないことが示された。

【０１１６】(6)温度による影響の解析 酵素反応温度を25、30、37、40、45又は100℃として前
記「(2)酵素活性の解析」と同様に酵素反応させ、反応
後の液をSuperdex75カラム（300×φ10 mm: ファルマシ
ア社、クロマトグラフィー条件；buffer:0.2M NaCl、流
速：0.5ml/分）にかけた。溶出液を１ml毎に分画し、各
フラクションの放射活性（［^３H］のカウント）をシン
チレーションカウンターで計測した。結果を図６に示
す。なお図６中の菱形印、四角印、三角印、バツ印、及
び＊印は、それぞれ25、30、37、40、45及び100℃の結
果を示す。また図６中の丸印はコントロール（熱で失活
させた本発明酵素を用いた場合）の結果を示す。

【０１１７】図６より、今回調べた反応条件・温度範囲
においては、温度が上がると反応生成物の分子量は小さ
くなっていた。３０℃において最も高い取り込みが見ら
れたが、２５℃において最も高分子量の産物が得られ
た。この結果から、前記の本発明酵素は、今回の反応条
件においては、２５℃以上において反応温度の上昇につ
れて酵素活性が低下するものと考えられる。

【０１１８】(7)金属イオン等による影響の解析 前記「(2)酵素活性の解析」におけるMnCl_２に代えて、
種々の金属塩（MnCl_２、FeCl_２、MgCl_２、CaCl_２又はCu
Cl_２）又はＥＤＴＡを添加した場合の酵素反応後の液
を、Superdex75カラム（300×φ10 mm: ファルマシア
社、クロマトグラフィー条件；buffer:0.2M NaCl、流
速：0.5ml/分）にかけた。溶出液を１ml毎に分画し、各
フラクションの放射活性（［^３H］のカウント）をシン
チレーションカウンターで計測した。MnCl_２を添加した
場合における放射活性を１００％とした場合の相対値を
以下に示す。

【０１１９】

【表３】（表３）

【０１２０】この結果から、前記の本発明酵素はＭｎ
^２＋イオンの存在下で最も高い活性を示した。またＦｅ
^２＋又はＭｇ^２＋イオンの存在下では、Ｍｎ^２＋イオン
の存在下における場合に比して約３０％の活性を示し
た。また、Ｃａ^２＋若しくはＣｕ ^２＋イオン又はエチレ
ンジアミン四酢酸の存在下では実質的に作用しないこと
が示された。

【０１２１】また前記の本発明酵素はＦｅ^２＋又はＭｇ
^２＋イオンの存在下でも作用し、Ｍｎ^２＋イオンの存在
下における酵素活性はＦｅ^２＋又はＭｇ^２＋イオンの存
在下における酵素活性よりも高いことが示された。

【０１２２】(8)至適反応ｐＨ 前記「(2)酵素活性の解析」におけるｐＨを種々変化さ
せて本発明酵素の至適反応ｐＨを調べた結果、ｐＨ
７．０〜７．５であった。

【０１２３】(9)酵素反応時間との関係 酵素反応時間を10分間、30分間、１時間、３時間、６時
間又は18時間として、前記「(2)酵素活性の解析」と同
様に酵素反応させ、酵素反応産物に取り込まれた放射活
性を分析した。種々の反応時間における[³H]GalNAcのゲ
ル濾過パターンを図７に、各々の酵素反応時間における
放射活性の取り込みの総量を図８にそれぞれ示す。図７
中の白丸印、黒丸印、白三角印、黒三角印、白四角印及
び黒四角印は、それぞれ10分間、30分間、１時間、３時
間、６時間及び18時間の結果を示す。また「20k」、「1
0k」、「５k」、「14」、「８」又は「６」と付された
矢印は、それぞれ分子量20,000、10,000、5,000、14糖
（分子量約2,800）、８糖（分子量約1,600）又は６糖
（分子量約1,200）のヒアルロン酸（スタンダード）の
溶出位置を示す。

【０１２４】図８の結果から、本実験条件下において
は、３時間や６時間において速やかな[³H]GalNAcの取り
込みが見られるが、20時間近くになると取り込みが遅く
なることが示された。また図７の結果から、長時間の反
応においては取り込みが増加して、高分子量の反応産物
が得られることが示された。そして、受容体基質（６
糖）を低濃度とした場合には高分子量の産物が速やかに
得られ、受容体基質（６糖）を高濃度とした場合には、
より低分子量の産物が得られた。

【０１２５】(10)ミカエリス定数(Km)の決定 前記「(2)酵素活性の解析」における本発明酵素の使用
量を1.3μｇとし、かつ、一方の供与体基質（UDP-糖；U
DP-GlcUA又はUDP-GalNAc）を一定濃度（240μM）含有さ
せ、これに放射性標識した種々の濃度の他方の供与体基
質（放射化UDP-糖；UDP-[³H]GalNAc又はUDP-[¹⁴C]GlcU
A）（0.6〜200μM）を添加することによって、酵素反応
産物に取り込まれた放射活性を測定した。独立した実験
を３回行い、その平均値を測定値とした。

【０１２６】取り込まれた放射活性(Ｖ)とUDP-糖の基質
濃度(Ｓ)との関係を図９に、そのダブル・レシプロカル
・プロットを図１０にそれぞれ示す。図中の黒丸印及び
白四角印は、それぞれUDP-GlcUA及びUDP-GalNAcについ
ての結果を示す。この結果、UDP-GlcUAに対するKmは3.4
4μＭ、UDP-GalNAcに対するKmは31.6μＭと算出され
た。

【０１２７】

【発明の効果】本発明酵素及び本発明タンパク質は、単
独の分子でGlcUAとGalNAcを交互に転移することがで
き、コンドロイチン骨格を有する糖鎖（コンドロイチン
やコンドロイチン硫酸等）の大量製造のためのツールと
して、本発明合成剤や本発明触媒の有効成分として、あ
るいは試薬等として極めて有用である。また本発明ＤＮ
Ａは、このような本発明酵素及び本発明タンパク質の大
量製造のためのツールとして極めて有用である。本発明
ベクターは、このような本発明ＤＮＡを安定に保持し、
その機能を有効かつ効率的に発揮させることができるこ
とから極めて有用である。また本発明形質転換体は、こ
のような本発明ベクターを安定に保持し、その機能を有
効かつ効率的に発揮させることができるのみならず、本
発明酵素や本発明タンパク質の大量製造にそのまま利用
できることから極めて有用である。さらに本発明酵素製
造方法は、本発明酵素や本発明タンパク質の大量製造に
極めて有用である。また本発明糖鎖製造方法は、コンド
ロイチン骨格を有する糖鎖（コンドロイチンやコンドロ
イチン硫酸等）の大量製造に極めて有用である。本発明
合成剤や本発明触媒は、本発明糖鎖製造方法に用いるこ
とができ極めて有用である。

【０１２８】このような本発明によって、高品質かつ均
質なコンドロイチン合成酵素を簡便・迅速かつ大量に製
造することができることから、安価な製品を産業界に提
供するとにもつながり、極めて有用性が高い。

【０１２９】

【配列表】 <110> 生化学工業株式会社 <120> コンドロイチン合成酵素及びそれをコードするＤＮＡ <130> J200101120 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(2058) <400> 1 atg agt att ctt aat caa gca ata aat tta tat aaa aac aaa aat tat 48 Met Ser Ile Leu Asn Gln Ala Ile Asn Leu Tyr Lys Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 15 cgc caa gct tta tct ctt ttt gag aag gtt gct gaa att tat gat gtt 96 Arg Gln Ala Leu Ser Leu Phe Glu Lys Val Ala Glu Ile Tyr Asp Val 20 25 30 agt tgg gtc gaa gca aat ata aaa tta tgc caa acc gca ctc aat ctt 144 Ser Trp Val Glu Ala Asn Ile Lys Leu Cys Gln Thr Ala Leu Asn Leu 35 40 45 tct gaa gaa gtt gat aag tta aat cgt aaa gct gtt att gat att gat 192 Ser Glu Glu Val Asp Lys Leu Asn Arg Lys Ala Val Ile Asp Ile Asp 50 55 60 gca gca aca aaa ata atg tgt tct aac gcc aaa gca att agt ctg aac 240 Ala Ala Thr Lys Ile Met Cys Ser Asn Ala Lys Ala Ile Ser Leu Asn 65 70 75 80 gag gtt gaa aaa aat gaa ata ata agc aaa tac cga gaa ata acc gca 288 Glu Val Glu Lys Asn Glu Ile Ile Ser Lys Tyr Arg Glu Ile Thr Ala 85 90 95 aag aaa tca gaa cgg gcg gag tta aag gaa gtc gaa ccc att cct tta 336 Lys Lys Ser Glu Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Glu Pro Ile Pro Leu 100 105 110 gat tgg cct agt gat tta act tta ccg ccg tta cct gag agc aca aac 384 Asp Trp Pro Ser Asp Leu Thr Leu Pro Pro Leu Pro Glu Ser Thr Asn 115 120 125 gat tat gtt tgg gcg ggg aaa aga aaa gag ctt gat gat tat cca aga 432 Asp Tyr Val Trp Ala Gly Lys Arg Lys Glu Leu Asp Asp Tyr Pro Arg 130 135 140 aaa cag tta atc att gac ggg ctt agt att gta att cct aca tat aat 480 Lys Gln Leu Ile Ile Asp Gly Leu Ser Ile Val Ile Pro Thr Tyr Asn 145 150 155 160 cga gca aaa ata ctt gca att aca ctt gct tgt ctt tgt aac caa aag 528 Arg Ala Lys Ile Leu Ala Ile Thr Leu Ala Cys Leu Cys Asn Gln Lys 165 170 175 acc ata tac gac tat gaa gtt att gtt gcc gat gat gga agt aaa gaa 576 Thr Ile Tyr Asp Tyr Glu Val Ile Val Ala Asp Asp Gly Ser Lys Glu 180 185 190 aat att gaa gaa ata gta aga gaa ttt gaa agt tta tta aat ata aaa 624 Asn Ile Glu Glu Ile Val Arg Glu Phe Glu Ser Leu Leu Asn Ile Lys 195 200 205 tat gta cgt cag aag gat tat gga tat caa ctg tgt gct gtt aga aat 672 Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val Arg Asn 210 215 220 ctt ggg ctt agg gct gca aag tat aat tat gtt gca att ctg gat tgt 720 Leu Gly Leu Arg Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Val Ala Ile Leu Asp Cys 225 230 235 240 gat atg gct ccg aac cca cta tgg gtt cag tca tat atg gaa cta tta 768 Asp Met Ala Pro Asn Pro Leu Trp Val Gln Ser Tyr Met Glu Leu Leu 245 250 255 gcg gtg gac gat aat gtt gct cta att ggc cct aga aaa tat ata gat 816 Ala Val Asp Asp Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Ile Asp 260 265 270 aca agc aag cat aca tat tta gat ttc ctt tcc caa aaa tca cta ata 864 Thr Ser Lys His Thr Tyr Leu Asp Phe Leu Ser Gln Lys Ser Leu Ile 275 280 285 aat gaa att cct gaa atc att act aat aat cag gtt gca ggc aag gtt 912 Asn Glu Ile Pro Glu Ile Ile Thr Asn Asn Gln Val Ala Gly Lys Val 290 295 300 gag caa aac aaa tca gtt gac tgg cga ata gaa cat ttc aaa aat acc 960 Glu Gln Asn Lys Ser Val Asp Trp Arg Ile Glu His Phe Lys Asn Thr 305 310 315 320 gat aat cta aga tta tgc aac aca cca ttt cga ttt ttt agc gga ggt 1008 Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asn Thr Pro Phe Arg Phe Phe Ser Gly Gly 325 330 335 aat gtc gct ttt gcg aaa aaa tgg ctt ttc cgt gca gga tgg ttt gat 1056 Asn Val Ala Phe Ala Lys Lys Trp Leu Phe Arg Ala Gly Trp Phe Asp 340 345 350 gaa gag ttt acg cat tgg ggg ggg gag gat aat gag ttt gga tat cgt 1104 Glu Glu Phe Thr His Trp Gly Gly Glu Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Arg 355 360 365 ctc tac aga gaa gga tgt tac ttt cgg tct gtt gaa gga gca atg gca 1152 Leu Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr Phe Arg Ser Val Glu Gly Ala Met Ala 370 375 380 tat cat caa gaa cca ccc ggg aaa gaa aac gag acg gat cgt gcg gca 1200 Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg Ala Ala 385 390 395 400 ggg aaa aat att act gtt caa ttg tta cag caa aaa gtt cct tat ttc 1248 Gly Lys Asn Ile Thr Val Gln Leu Leu Gln Gln Lys Val Pro Tyr Phe 405 410 415 tat aga aaa aaa gaa aaa ata gaa tcc gcg aca tta aaa aga gta cca 1296 Tyr Arg Lys Lys Glu Lys Ile Glu Ser Ala Thr Leu Lys Arg Val Pro 420 425 430 cta gta tct ata tat att ccc gcc tat aac tgc tct aaa tat att gtt 1344 Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Val 435 440 445 cgt tgt gtt gaa agc gcc ctt aat cag aca ata act gac tta gaa gta 1392 Arg Cys Val Glu Ser Ala Leu Asn Gln Thr Ile Thr Asp Leu Glu Val 450 455 460 tgc ata tgc gat gat ggt tcc aca gat gat aca ttg cgg att ctt cag 1440 Cys Ile Cys Asp Asp Gly Ser Thr Asp Asp Thr Leu Arg Ile Leu Gln 465 470 475 480 gag cat tat gca aac cat cct cga gtt cgt ttt att tca caa aaa aac 1488 Glu His Tyr Ala Asn His Pro Arg Val Arg Phe Ile Ser Gln Lys Asn 485 490 495 aaa gga att ggt tca gca tct aat aca gca gtt aga ttg tgt cgg gga 1536 Lys Gly Ile Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ala Val Arg Leu Cys Arg Gly 500 505 510 ttc tat ata ggt cag tta gac tct gat gac ttt ctt gaa cca gat gct 1584 Phe Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Phe Leu Glu Pro Asp Ala 515 520 525 gtt gaa cta tgt cta gat gaa ttt aga aaa gat cta tca ttg gca tgt 1632 Val Glu Leu Cys Leu Asp Glu Phe Arg Lys Asp Leu Ser Leu Ala Cys 530 535 540 gtt tat aca act aac cgt aat ata gat cgt gaa ggt aat ttg ata tca 1680 Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Ile Asp Arg Glu Gly Asn Leu Ile Ser 545 550 555 560 aat ggc tat aat tgg ccc att tat tcg cga gaa aaa ctt act agt gca 1728 Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Ile Tyr Ser Arg Glu Lys Leu Thr Ser Ala 565 570 575 atg ata tgt cat cat ttc agg atg ttc aca gca aga gca tgg aac cta 1776 Met Ile Cys His His Phe Arg Met Phe Thr Ala Arg Ala Trp Asn Leu 580 585 590 act gaa ggt ttc aac gaa tcg atc agc aac gca gtt gat tac gat atg 1824 Thr Glu Gly Phe Asn Glu Ser Ile Ser Asn Ala Val Asp Tyr Asp Met 595 600 605 tat tta aaa ctt agt gaa gtt gga ccg ttc aag cat ata aac aaa att 1872 Tyr Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly Pro Phe Lys His Ile Asn Lys Ile 610 615 620 tgt tat aat cgc gta ttg cat ggt gaa aat acg tct ata aaa aag ttg 1920 Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly Glu Asn Thr Ser Ile Lys Lys Leu 625 630 635 640 gat att caa aag gaa aat cat ttt aaa gtt gtt aac gaa tca tta agt 1968 Asp Ile Gln Lys Glu Asn His Phe Lys Val Val Asn Glu Ser Leu Ser 645 650 655 agg cta ggc ata aaa aaa tat aaa tat tca cca tta act aat ttg aat 2016 Arg Leu Gly Ile Lys Lys Tyr Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Asn Leu Asn 660 665 670 gaa tgt aga aaa tat acc tgg gaa aaa ata gag aat gat tta 2058 Glu Cys Arg Lys Tyr Thr Trp Glu Lys Ile Glu Asn Asp Leu 675 680 685 <210> 2 <211> 686 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ser Ile Leu Asn Gln Ala Ile Asn Leu Tyr Lys Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 15 Arg Gln Ala Leu Ser Leu Phe Glu Lys Val Ala Glu Ile Tyr Asp Val 20 25 30 Ser Trp Val Glu Ala Asn Ile Lys Leu Cys Gln Thr Ala Leu Asn Leu 35 40 45 Ser Glu Glu Val Asp Lys Leu Asn Arg Lys Ala Val Ile Asp Ile Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Lys Ile Met Cys Ser Asn Ala Lys Ala Ile Ser Leu Asn 65 70 75 80 Glu Val Glu Lys Asn Glu Ile Ile Ser Lys Tyr Arg Glu Ile Thr Ala 85 90 95 Lys Lys Ser Glu Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Glu Pro Ile Pro Leu 100 105 110 Asp Trp Pro Ser Asp Leu Thr Leu Pro Pro Leu Pro Glu Ser Thr Asn 115 120 125 Asp Tyr Val Trp Ala Gly Lys Arg Lys Glu Leu Asp Asp Tyr Pro Arg 130 135 140 Lys Gln Leu Ile Ile Asp Gly Leu Ser Ile Val Ile Pro Thr Tyr Asn 145 150 155 160 Arg Ala Lys Ile Leu Ala Ile Thr Leu Ala Cys Leu Cys Asn Gln Lys 165 170 175 Thr Ile Tyr Asp Tyr Glu Val Ile Val Ala Asp Asp Gly Ser Lys Glu 180 185 190 Asn Ile Glu Glu Ile Val Arg Glu Phe Glu Ser Leu Leu Asn Ile Lys 195 200 205 Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val Arg Asn 210 215 220 Leu Gly Leu Arg Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Val Ala Ile Leu Asp Cys 225 230 235 240 Asp Met Ala Pro Asn Pro Leu Trp Val Gln Ser Tyr Met Glu Leu Leu 245 250 255 Ala Val Asp Asp Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Ile Asp 260 265 270 Thr Ser Lys His Thr Tyr Leu Asp Phe Leu Ser Gln Lys Ser Leu Ile 275 280 285 Asn Glu Ile Pro Glu Ile Ile Thr Asn Asn Gln Val Ala Gly Lys Val 290 295 300 Glu Gln Asn Lys Ser Val Asp Trp Arg Ile Glu His Phe Lys Asn Thr 305 310 315 320 Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asn Thr Pro Phe Arg Phe Phe Ser Gly Gly 325 330 335 Asn Val Ala Phe Ala Lys Lys Trp Leu Phe Arg Ala Gly Trp Phe Asp 340 345 350 Glu Glu Phe Thr His Trp Gly Gly Glu Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Arg 355 360 365 Leu Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr Phe Arg Ser Val Glu Gly Ala Met Ala 370 375 380 Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg Ala Ala 385 390 395 400 Gly Lys Asn Ile Thr Val Gln Leu Leu Gln Gln Lys Val Pro Tyr Phe 405 410 415 Tyr Arg Lys Lys Glu Lys Ile Glu Ser Ala Thr Leu Lys Arg Val Pro 420 425 430 Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Val 435 440 445 Arg Cys Val Glu Ser Ala Leu Asn Gln Thr Ile Thr Asp Leu Glu Val 450 455 460 Cys Ile Cys Asp Asp Gly Ser Thr Asp Asp Thr Leu Arg Ile Leu Gln 465 470 475 480 Glu His Tyr Ala Asn His Pro Arg Val Arg Phe Ile Ser Gln Lys Asn 485 490 495 Lys Gly Ile Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ala Val Arg Leu Cys Arg Gly 500 505 510 Phe Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Phe Leu Glu Pro Asp Ala 515 520 525 Val Glu Leu Cys Leu Asp Glu Phe Arg Lys Asp Leu Ser Leu Ala Cys 530 535 540 Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Ile Asp Arg Glu Gly Asn Leu Ile Ser 545 550 555 560 Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Ile Tyr Ser Arg Glu Lys Leu Thr Ser Ala 565 570 575 Met Ile Cys His His Phe Arg Met Phe Thr Ala Arg Ala Trp Asn Leu 580 585 590 Thr Glu Gly Phe Asn Glu Ser Ile Ser Asn Ala Val Asp Tyr Asp Met 595 600 605 Tyr Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly Pro Phe Lys His Ile Asn Lys Ile 610 615 620 Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly Glu Asn Thr Ser Ile Lys Lys Leu 625 630 635 640 Asp Ile Gln Lys Glu Asn His Phe Lys Val Val Asn Glu Ser Leu Ser 645 650 655 Arg Leu Gly Ile Lys Lys Tyr Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Asn Leu Asn 660 665 670 Glu Cys Arg Lys Tyr Thr Trp Glu Lys Ile Glu Asn Asp Leu 675 680 685 <210> 3 <211> 14483 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (3787)..(5847) <400> 3 cgacattatg tctttaagaa tttaaatatt gaaatccctt caggaaaaag tgttgccttt 60 attggtcgta atggtgcggg taaatcaacg ttactgagaa tgattggtgg cattgaccgc 120 cccgatagcg gaaagatcat caccaataaa acgatatcat ggccagtcgg ccttgcaggt 180 ggatttcagg gaagtttaac cggacgcgaa aatgtaaaat ttgtcgcgag gttatacgcg 240 aagcaagaag aactgaaaga gaaaattgag tttgttgaag aatttgccga actcggcaag 300 tattttgata tgccgatcaa aacttactcc tctggtatgc gatctcgcct aggctttggt 360 ttaagtatgg catttaaatt tgattattat atcgtcgatg aagtaaccgc agtcggtgat 420 gccaggttta aagaaaaatg cgctcaattg tttaaagaaa ggcataaaga atctagtttt 480 ttaatggttt cacatagttt gaattcattg aaagagtttt gtgatgtggc cattgttttt 540 aaggatgaca atgcggttag ttttcatgag gatgttcagg aggggataga agagtatata 600 acggaacaaa ataattactg atgttgtttt caagggtgaa aaatgaatat attagttaca 660 ggtggagcag gctatattgg ctcgcatact agtttatgtc ttctgaataa aggttacaat 720 gttgtaatca ttgacaactt aattaattca tcttgcgaga gcattcgaag gattgaatta 780 atagctaaaa aaaaagttac tttctatgag ttgaacatca acaatgaaaa agaagttaat 840 caaattctaa aaaaacacaa atttgattgt ataatgcatt ttgccggtgc aaagtctgtt 900 gctgaatctt taataaaacc cattttttat tatgataata atgtttcagg gacgttgcaa 960 ttaattaatt gcgctataaa aaacgatgtg gctaatttta tttttagctc ttctgcaacg 1020 gtttatggtg aaagcaaaat aatgcctgta acagaagatt gccatatagg aggaacatta 1080 aatccatatg gtacatcaaa gtatatatca gaattgatga ttagagatat tgcaaaaaaa 1140 tatagcgata ctaatttttt gtgtctgaga tattttaacc caacaggtgc tcacgagtcg 1200 ggaatgatcg gtgaaagtcc cgctgatata ccaagcaatt tagttcctta tatattacaa 1260 gttgctatgg gtaaactaga aaaacttatg gtgtttgggg gggattaccc tacaaaggat 1320 ggaaccggtg ttcgtgatta tatacacgta atggatttag cggaagggca tgtggctgct 1380 ttatcttacc ttttccgtga taataacact aattatcatg tttttaattt aggtactggt 1440 aaaggatatt ctgttttaga gctggtttct acctttgaaa aaatatctgg ggttagaatt 1500 ccatatgaaa ttgtttcgag aagagatggg gatattgctg aaagttggtc atcaccagaa 1560 aaagcaaata agtatctcaa ttggaaagct aaaagggaat tggaaacaat gcttgaggat 1620 gcctggcgct ggcaaatgaa aaacccaaat ggttatattt aatcatgcat aaggtaaagc 1680 aaaattttac gataacttct atatctattg gcatcttaat aatcgaaatt tagtgtggtg 1740 aattggttta ataaattcgt agacactaaa aagtagatgg ggtgttaatt aaagctaact 1800 aaacaaatgg cgaataaagg gttttctgcc ttggggggat aaaacatcat gaatagacta 1860 gtaatagttg gtcatccgag ctctaattat caaattgtag aagaactttt gcatcaaaga 1920 ggaatgaatt ctctatgtcc atcgaagcga gataatttaa gcccccaaga tatcactcag 1980 acgcttcgta aggcatatca atcccctgat atatacactg taacagatag tgctgatttc 2040 gaaccattac acgtttctac tgtctggaat ggtatagccc ttgacttgat gcttagtaat 2100 ttgaaccaaa aattgtgcgg atggtcggat cctaatgcaa tccatacatt agaatattgg 2160 aagagtgttg atgaaaacat tacatttatt ctaatttacg atcatccaaa gtctatttta 2220 acaaattatt tttcagatca aaatatatcg tccaactata cgtcagaaca tttaattaaa 2280 aactggcttg cctataatac agcattgtta cacttttttc ttaataatcg cggtaggtgt 2340 ttattagtaa gctcagaaca agtcaaacgt aatgcagagg attgcataca acaacttcaa 2400 cataagctta agttgaaatt tggtctttca ttttcaaata cgattaatca ttcactagaa 2460 caatctgtaa atgattttaa gacggctgaa gcttcgatta ctctggaaaa agagcatcag 2520 gaaataatgt ctctatcagg tattgatata ggaaccggag atattatatt caaacagagt 2580 gaaacagagg aatatttaat tttcaatgta ttgaatgatt atccagattg taaagagctt 2640 tattttgaat tacaatctaa tgcaaatact ccgcttaggg ttttagaaaa ggaaaattac 2700 aagccttcct ttatatggga gacatttata aaacaacgcc aaataacatt agatattgtc 2760 aatggattat atcagtcctc taaaaaaata attttagata acgagttaca cacatcaaaa 2820 caattaaatg catatcaggc tattttaaaa gaattgagtg actctaaaga agaattgatt 2880 caatatgatt taataataaa aaataagaca atacaagttc aggagcttga atgcgccata 2940 gaaaattttg aatcgctgtt aaagaaagaa caaaataaaa atgaattgca acaacaaaga 3000 ttggaaaaat taagttgtga aaaagaacta ctgcttaatc aattgcattt agtacaacaa 3060 aaacttgaac aatattttat tgataatcaa cgattagaaa aaaaacaact tccagaatta 3120 tatggtgcag cagaacgtat aacacaggac attggatatc gcctgggtgc tgtaatggtt 3180 agtcgttcaa aaacattttt aggattaatt agcattcctt ttgctttgat atccgaatgg 3240 cgaacatgga aaaagaaata cgatagtgaa tatcaagtct ctctgccatc aatatttctt 3300 tatgctgata aacatgaggc agaaagggtg aaaaaacatt tatcctatca attaggaaaa 3360 ttaatcataa atcaaaatca ttttccacta gggttgatat ctttgccatt ttcgatatac 3420 agaacaatac gtcaattcaa aagaacaaaa aataattctc aggtaggggt taaatactgt 3480 ggaaaataaa tccaggctac taaatataaa gttaaaatat cggctataaa tgcgtgcgaa 3540 ttaatagtga aaattttctt agttaagtga aatagctttt ttctaattgt ttaagtcata 3600 gtggtttacg ctttatttaa ttaaaaaaat aaaataataa attaaaaata cgattctcaa 3660 tatttcttca agtatcaatt aggatttaat ggggcaagat tatgatatcg catgaaaata 3720 tatatatagg gacatgatta ttatgcgtgt tgatacttta attatactag attaggttga 3780 aataat atg agt att ctt aat caa gca ata aat tta tat aaa aac aaa 3828 Met Ser Ile Leu Asn Gln Ala Ile Asn Leu Tyr Lys Asn Lys 1 5 10 aat tat cgc caa gct tta tct ctt ttt gag aag gtt gct gaa att tat 3876 Asn Tyr Arg Gln Ala Leu Ser Leu Phe Glu Lys Val Ala Glu Ile Tyr 15 20 25 30 gat gtt agt tgg gtc gaa gca aat ata aaa tta tgc caa acc gca ctc 3924 Asp Val Ser Trp Val Glu Ala Asn Ile Lys Leu Cys Gln Thr Ala Leu 35 40 45 aat ctt tct gaa gaa gtt gat aag tta aat cgt aaa gct gtt att gat 3972 Asn Leu Ser Glu Glu Val Asp Lys Leu Asn Arg Lys Ala Val Ile Asp 50 55 60 att gat gca gca aca aaa ata atg tgt tct aac gcc aaa gca att agt 4020 Ile Asp Ala Ala Thr Lys Ile Met Cys Ser Asn Ala Lys Ala Ile Ser 65 70 75 ctg aac gag gtt gaa aaa aat gaa ata ata agc aaa tac cga gaa ata 4068 Leu Asn Glu Val Glu Lys Asn Glu Ile Ile Ser Lys Tyr Arg Glu Ile 80 85 90 acc gca aag aaa tca gaa cgg gcg gag tta aag gaa gtc gaa ccc att 4116 Thr Ala Lys Lys Ser Glu Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Glu Pro Ile 95 100 105 110 cct tta gat tgg cct agt gat tta act tta ccg ccg tta cct gag agc 4164 Pro Leu Asp Trp Pro Ser Asp Leu Thr Leu Pro Pro Leu Pro Glu Ser 115 120 125 aca aac gat tat gtt tgg gcg ggg aaa aga aaa gag ctt gat gat tat 4212 Thr Asn Asp Tyr Val Trp Ala Gly Lys Arg Lys Glu Leu Asp Asp Tyr 130 135 140 cca aga aaa cag tta atc att gac ggg ctt agt att gta att cct aca 4260 Pro Arg Lys Gln Leu Ile Ile Asp Gly Leu Ser Ile Val Ile Pro Thr 145 150 155 tat aat cga gca aaa ata ctt gca att aca ctt gct tgt ctt tgt aac 4308 Tyr Asn Arg Ala Lys Ile Leu Ala Ile Thr Leu Ala Cys Leu Cys Asn 160 165 170 caa aag acc ata tac gac tat gaa gtt att gtt gcc gat gat gga agt 4356 Gln Lys Thr Ile Tyr Asp Tyr Glu Val Ile Val Ala Asp Asp Gly Ser 175 180 185 190 aaa gaa aat att gaa gaa ata gta aga gaa ttt gaa agt tta tta aat 4404 Lys Glu Asn Ile Glu Glu Ile Val Arg Glu Phe Glu Ser Leu Leu Asn 195 200 205 ata aaa tat gta cgt cag aag gat tat gga tat caa ctg tgt gct gtt 4452 Ile Lys Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val 210 215 220 aga aat ctt ggg ctt agg gct gca aag tat aat tat gtt gca att ctg 4500 Arg Asn Leu Gly Leu Arg Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Val Ala Ile Leu 225 230 235 gat tgt gat atg gct ccg aac cca cta tgg gtt cag tca tat atg gaa 4548 Asp Cys Asp Met Ala Pro Asn Pro Leu Trp Val Gln Ser Tyr Met Glu 240 245 250 cta tta gcg gtg gac gat aat gtt gct cta att ggc cct aga aaa tat 4596 Leu Leu Ala Val Asp Asp Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr 255 260 265 270 ata gat aca agc aag cat aca tat tta gat ttc ctt tcc caa aaa tca 4644 Ile Asp Thr Ser Lys His Thr Tyr Leu Asp Phe Leu Ser Gln Lys Ser 275 280 285 cta ata aat gaa att cct gaa atc att act aat aat cag gtt gca ggc 4692 Leu Ile Asn Glu Ile Pro Glu Ile Ile Thr Asn Asn Gln Val Ala Gly 290 295 300 aag gtt gag caa aac aaa tca gtt gac tgg cga ata gaa cat ttc aaa 4740 Lys Val Glu Gln Asn Lys Ser Val Asp Trp Arg Ile Glu His Phe Lys 305 310 315 aat acc gat aat cta aga tta tgc aac aca cca ttt cga ttt ttt agc 4788 Asn Thr Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asn Thr Pro Phe Arg Phe Phe Ser 320 325 330 gga ggt aat gtc gct ttt gcg aaa aaa tgg ctt ttc cgt gca gga tgg 4836 Gly Gly Asn Val Ala Phe Ala Lys Lys Trp Leu Phe Arg Ala Gly Trp 335 340 345 350 ttt gat gaa gag ttt acg cat tgg ggg ggg gag gat aat gag ttt gga 4884 Phe Asp Glu Glu Phe Thr His Trp Gly Gly Glu Asp Asn Glu Phe Gly 355 360 365 tat cgt ctc tac aga gaa gga tgt tac ttt cgg tct gtt gaa gga gca 4932 Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr Phe Arg Ser Val Glu Gly Ala 370 375 380 atg gca tat cat caa gaa cca ccc ggg aaa gaa aac gag acg gat cgt 4980 Met Ala Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg 385 390 395 gcg gca ggg aaa aat att act gtt caa ttg tta cag caa aaa gtt cct 5028 Ala Ala Gly Lys Asn Ile Thr Val Gln Leu Leu Gln Gln Lys Val Pro 400 405 410 tat ttc tat aga aaa aaa gaa aaa ata gaa tcc gcg aca tta aaa aga 5076 Tyr Phe Tyr Arg Lys Lys Glu Lys Ile Glu Ser Ala Thr Leu Lys Arg 415 420 425 430 gta cca cta gta tct ata tat att ccc gcc tat aac tgc tct aaa tat 5124 Val Pro Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ser Lys Tyr 435 440 445 att gtt cgt tgt gtt gaa agc gcc ctt aat cag aca ata act gac tta 5172 Ile Val Arg Cys Val Glu Ser Ala Leu Asn Gln Thr Ile Thr Asp Leu 450 455 460 gaa gta tgc ata tgc gat gat ggt tcc aca gat gat aca ttg cgg att 5220 Glu Val Cys Ile Cys Asp Asp Gly Ser Thr Asp Asp Thr Leu Arg Ile 465 470 475 ctt cag gag cat tat gca aac cat cct cga gtt cgt ttt att tca caa 5268 Leu Gln Glu His Tyr Ala Asn His Pro Arg Val Arg Phe Ile Ser Gln 480 485 490 aaa aac aaa gga att ggt tca gca tct aat aca gca gtt aga ttg tgt 5316 Lys Asn Lys Gly Ile Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ala Val Arg Leu Cys 495 500 505 510 cgg gga ttc tat ata ggt cag tta gac tct gat gac ttt ctt gaa cca 5364 Arg Gly Phe Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Phe Leu Glu Pro 515 520 525 gat gct gtt gaa cta tgt cta gat gaa ttt aga aaa gat cta tca ttg 5412 Asp Ala Val Glu Leu Cys Leu Asp Glu Phe Arg Lys Asp Leu Ser Leu 530 535 540 gca tgt gtt tat aca act aac cgt aat ata gat cgt gaa ggt aat ttg 5460 Ala Cys Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Ile Asp Arg Glu Gly Asn Leu 545 550 555 ata tca aat ggc tat aat tgg ccc att tat tcg cga gaa aaa ctt act 5508 Ile Ser Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Ile Tyr Ser Arg Glu Lys Leu Thr 560 565 570 agt gca atg ata tgt cat cat ttc agg atg ttc aca gca aga gca tgg 5556 Ser Ala Met Ile Cys His His Phe Arg Met Phe Thr Ala Arg Ala Trp 575 580 585 590 aac cta act gaa ggt ttc aac gaa tcg atc agc aac gca gtt gat tac 5604 Asn Leu Thr Glu Gly Phe Asn Glu Ser Ile Ser Asn Ala Val Asp Tyr 595 600 605 gat atg tat tta aaa ctt agt gaa gtt gga ccg ttc aag cat ata aac 5652 Asp Met Tyr Leu Lys Leu Ser Glu Val Gly Pro Phe Lys His Ile Asn 610 615 620 aaa att tgt tat aat cgc gta ttg cat ggt gaa aat acg tct ata aaa 5700 Lys Ile Cys Tyr Asn Arg Val Leu His Gly Glu Asn Thr Ser Ile Lys 625 630 635 aag ttg gat att caa aag gaa aat cat ttt aaa gtt gtt aac gaa tca 5748 Lys Leu Asp Ile Gln Lys Glu Asn His Phe Lys Val Val Asn Glu Ser 640 645 650 tta agt agg cta ggc ata aaa aaa tat aaa tat tca cca tta act aat 5796 Leu Ser Arg Leu Gly Ile Lys Lys Tyr Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Asn 655 660 665 670 ttg aat gaa tgt aga aaa tat acc tgg gaa aaa ata gag aat gat tta 5844 Leu Asn Glu Cys Arg Lys Tyr Thr Trp Glu Lys Ile Glu Asn Asp Leu 675 680 685 taa ttattgatat attacaagtg ataaacatgt agactggccc cctgaatctc 5897 cagacaacca atatcactta aataagtgat agtcttaata ctagttttta gactagtcat 5957 tggagaacag atgattgatg tcttagggcc ggagaaacgc agacggcgta ctacacagga 6017 aaagatcgct atcgttcagc agagctttga accgggaatg acggtctccc ttgttgcccg 6077 gcaacatggt gtggcagcca gccagctatt tctctggcgt aagcaatacc aggagggaag 6137 tcttactgct gtggctgccg gagaacaggt cgttcctgcc tctgaacttg ctgccgccat 6197 gaagcagatt aaagaactcc agcgtctgct cggcaaaaaa acgatggaaa atgaactcct 6257 taaagaagcc gttgaatatg ggcgagcaaa aaagtggata gcgcacgcgc ccttattgcc 6317 cggggatggg gagtaagctt cgtcagccgt tgtctccggg tgtcgcgtgc gcagttgcac 6377 gtcattctca gacgagccga tgactggaag gacggccgcc gcagccgtca cacggatgat 6437 acggatgtgc ttcgccgtat acaccatgtt atcggagagc tgcccacgta tggttatcgt 6497 cgggtatggg cgctgcttcg cagacaaaca gaacttgatg gtatgcctgc gatcaatgcc 6557 aaacgtgttt accggaccat gcgccagaat gcgctgttgc ttgagcgaaa acccgctgta 6617 ccgccatcga aacgggcaca taccggcaga gtggctgtga aagaaagtaa tcagcgatgg 6677 tgctctgacg ggtttgagtt ccgctgtgat aacggagaaa aactgcgggt cacgttcgcg 6737 ctggactgct gtgaccgtga ggcactgcac tgggcggtca caacgggtgg cttcgacagt 6797 gaaacagtac aggacgtcat gctgggagca gtggaacgcc gctttggcag cgagcttccg 6857 gcgtctccag tggagtggct gacggataat ggttcatgct accgggcgaa tgaaacacgt 6917 cagttcgcca ggatgttggg acttgaaccg aagaacacgg cagtgcggag tccggagagt 6977 aacggaatag cagagagctt cgtgaaaacg ataaagcgtg actacataag tatcatgccc 7037 aaaccagacg ggttaacggc agcaaagaac cttgcagagg cgttcgagca ttataacgaa 7097 tggcatccgc atagtgcgct gggttatcgc tcgccacggg aatatctgcg gcagtgggcc 7157 agtgatgggt taagtgataa caggtatctg gaaacatagg ggcaaatcca acatgctaaa 7217 aaacttaaca tttgatcata tattaagtct ttcaaagaaa gaagataaaa ttaaacttgt 7277 acaattaatt gtaaatcatt tagatgagag aacattaagc tgtataaaaa atatctctac 7337 tggtaaggga tttaatgctc atttaaaaat acttgaactt tttgacctat ggttgagtga 7397 gtattttgaa tatattatta tacctaataa gttaagcaat gcagggactt tttattttgc 7457 attctttttt cccgagtttt atattaaaag attcaataag aataatactg atctttcctc 7517 gttaggagac acatctttta aacgacttat gagtcgacca catataccaa actatgttta 7577 caatcttgtg ataaactcta atggatgtac ttttaactcc attaaattat tattgctggc 7637 tcttagtcta acatcaaaaa ggttttatga aacacctcag caagaacgta attttttgtg 7697 tcatataaat gaaattgtct tggctaatgc tgacgaatac tccggtatca tttcttgcat 7757 tataaaaagt agaatatctg taattgatga ctttatttca agtaatgttt cattaaatac 7817 aaacaggcaa atagctttat tcataactgg acaatcaaga ggttttatag atgccctacc 7877 taatctcgta agtgaaataa cgattccttc tgatgttgat gtttttatta gtacatggaa 7937 agatatcgga cacacacagt tatctaaaga aagaatatgt aggatatttg acagcgaggc 7997 tgcacaatat gtttcagagc cagataacta ctcgtttgta gacgaacact atgatgaatt 8057 aaaagacttg agcttaagtt catataaaaa taataattta gaggagatat attcaagttt 8117 tttctctgga tgtaactcag ttttaataaa cattaaagat gatggggaat atccatataa 8177 taaaatgagt aatgcagaaa aaatgtatta ccataattca ttttggttct gtagtcttaa 8237 aaatcataat tgggataaat ataggtgcat tataaagata aggcctgatg ctttattgca 8297 agtggataat gtgacaatta atgatataga tgtagatgat tctgtttatt gtgaggatag 8357 taatgggtgg atatttagag aatgggggtt tggcataggc gaccaattat tttacggcga 8417 tcctgatata atgaaaaagc tgatgtgtgt ccatggttta gaaaaaatat atagtcagct 8477 aacatccttg atctcaagtt ctaatgttta ttattcaggt catattaatg tagggttatg 8537 tgcttgggct aatgtatatg attgccaggt ttctaattta aaaataaaaa atattgttag 8597 cgcctcgaaa aatatcgcta gaacaaatac tttctttgcg ggaatgagtt atttattgca 8657 aggtatagat atcacttaac aatgaaagat gcactatatg aaaaaaataa ttgtagattt 8717 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gaattagtta cttcaaaatt tgattttacg gcggcactta aaaagtatca cgacagctat 9617 agtttagcct ctatatacgt gtctgattgg cttgattttg gacatattaa tacatactat 9677 aagtcaaaag tacaatacac aacccagcgt gcatttaatg aattatgcat tacaacaaaa 9737 tccgttatca aatcaagttc aaatgaaagt aaaattgaag ctgaatcaaa atggtttgaa 9797 actattcccg gagaattaaa gatctatact ccaatgttat tggaaccgtt tgatcatatc 9857 agaaagagtt ataagcttga atatttatat aatacgacgt taaatgaatt atttgttttt 9917 tctcgcctac caaataatat tttaacaaat atattaataa gttgtttaga cttcatcgat 9977 ctgtgcaaag aatatcattc aattgatact gacaaaaata tactgcaaga tttattttat 10037 gaaaaaacga ttgagcgggt tagcaagtac ataacagatt taaatattga tccaaatgca 10097 aaatggaatt ttaataataa tataagcgtt tcaattaatg atattcttta tgatactaat 10157 aaatttatcc caagtgaact gcaatataaa actattatgc atggcgattt atgctttagt 10217 aatataattt ttaactttag aactggtaga atacaagttt ttgatcccag aggattgaac 10277 cactctggag aaataagtat ttatggtgat tttcgttatg atatagctaa attatcacat 10337 tcaatactag ggctctatga ttggataatt gcaggatatt atataataaa taaaaaaaat 10397 aaaactcata gtattgaatt caaaattaat attgataata aattgtttga aattcaatca 10457 acatttgttt ctataataaa agagaaatat tcaatctccg aaaaatcatt gtatgcgatg 10517 caaatacatt tatttttatc aatgcttccc cttcattccg atgacaaaaa aaggcaagat 10577 gcactatttg ctaatgcatt tagattatat gaaattttta aggaggctgc agtatgatta 10637 taattccaat ggcggggatg agttcgcgtt ttttcaaggc tggatattcc aaaccaaaat 10697 atatgcttga attgaatggt gagtttctat tcgatctatg tttgaaaagt ttcaaattat 10757 attttgagac tgaacatttt gtctttatcc ttagggatgt tttcaatacg aagtcttttg 10817 tattacaaag aatagcatct ttagggatta atagctacac cttgattact cttgataaag 10877 aaactcgggg gcaagcagaa acagtatatt tggctatatc aaaattattt aatatagaac 10937 aaccaatcac tatttttaac attgatacaa ttaggcctaa ttttatattt actaagttcg 10997 aaggggaaaa tgaatgttat attgaagtat ttcgaggaga tggggataac tggtcttttg 11057 ttatgccatc aaatgatgta aaaaatgagg tcattgctac tagcgaaaaa aaacaaattt 11117 ctaacttatg ctgcacagga ttatatcatt tttctacaat taaaaatttt atttcagcat 11177 atgaacatta taaaaatcta cctcaagaaa attgggatgc tgggagagtt atatatagcc 11237 ccaatataca attatctaat tagtaatggg atcaaagtgt attatacaga aataaataag 11297 tctgatgtta ttttttgtgg tactcctaga gaatatgaaa atttgcaagg aaaaaaataa 11357 aaattaggtt tggcctaata aatctgataa tttattgtta tcaatgctta atcacatttc 11417 tttgatttta tacacggaat taaatataat ctattatgaa aattgcagtt gctggtgtag 11477 gatatgttgg tatatcaatt gctatattac tttcacaaaa acatgatatt atcgctctcg 11537 atatagatcc taagaaagtt cagttgatta ataaaaaaat atcaccaata tgtgatcctg 11597 aaatacaaaa atttttatct aatagaaaat taaacctata tgctacaaca gaaaaatacg 11657 aagcgtatag agatgctgat tatgttataa tcgcaacacc aaccaattat gatcccatta 11717 ataataactt cgatacactc tcagtagaat cagtagcatg tgacgtacta agtataaatc 11777 ctaatgcaac tatcataatt aaatctacag tccccgtcgg atttactgaa cgactaaaac 11837 gcgatctaaa cacgaataat attatctttt ccccagaatt tttacgtgaa ggtaaagctc 11897 tttatgacaa cctatatcca tctcgtatag ttgtgggaga gagtagcgaa cgagcaagaa 11957 agttcgcaga gcttctcagt gaaggcgcta taaaaaaaga tattccaata ttgttaacgg 12017 atagccctga agctgaagcc attaaacttt ttgcaaatac ttaccttgca atgcggattg 12077 cttatttcaa tgaattggat acttatgcct ccgttcatgg tttagataca aagcaaatta 12137 tagagggtgt tagtttagat cctagaattg gtcaacatta taataatcct tcttttggtt 12197 atggaggtta ctgcttacct aaggatacca agcaatcact cgcaaattat cgtgatgttc 12257 cgcagaactt aatccaggct attgtcgatg ccaatactac ccgaaaagac tttgttgcgg 12317 aggatatatt aagtcgtaaa ccaaaagttg taggaatcta tcgcctcata atgaaagcag 12377 gtagtgataa ctttagagca agtagtattc aaggtgtaat gaaacgactc aaagccaaag 12437 gaattgagat agttgtatat gaacctgtac taaaagagcc ttatttcttt ggttcttatg 12497 ttgagcgtga tattaattct tttaaagaac gtgttgatgt tatagtagcc aatcgccgca 12557 cgtcagaatt agaagatgta agtgaaaaag tttatacgcg agatttattt ggtgtcgact 12617 cttgattatg ttcaataatt taaaattttt atggctatta aagaaaagtc gatatgtaca 12677 tgctttagct gcaatacaag atgactgccg attttggcag tcaaaacgta tattggcaat 12737 gtacaggctt aatatgtatt ggtcattaca taatcttact gatacaccgt cagattggcg 12797 gtgtaaatta gcaatcaaaa tagctaaaat tgcctgtggt gacataagct taactccgga 12857 attactcatg gagtttaaag acgagttcac agacacacat caaaaagttg agttagcaaa 12917 aaccttagca tcatactctc ctacgttttc attatcatta ttagataatg tcgataattg 12977 tcccttagac ttgtatcagc tcttcaatta agaatcgggt taactcaaaa agctatatca 13037 acactcgctc agattgatgc cagtgatatt gtatattccc ctgatatatt actcttgcaa 13097 aaataatgct ttcagagaaa cggcagaaat ctcgttaaat agacttaacg aatactataa 13157 gtactttggt ttatctccgg tcgcactgac agataactca tctcctttgt caccttgtaa 13217 tattattaca tcgattcctt atcctgccca aacgggcccc ctgatttcta ttttaatgac 13277 aacatacaat accggtaggc gggtagaaaa tgcagtaata tcattgctta atcaaacata 13337 ccgttcattt gagctaatta ttgtggatga tgccagcacc gatgatacgc tattccgtct 13397 tcagagatta gcactcaaag atactcgaat aaaaattatt agcctgccac aaaatgttgg 13457 aacatatgct gcaaaacgaa taggcttaat acaggcaaag ggagagtttg tgacatgcca 13517 tgactcagat gactggtccc atcctgaaaa attatttaga cagatatcac ctttattgtt 13577 aaaccctaaa ctaatttgtt cgatttctga ttgggtaagg ttgcaagata atgggatttt 13637 ctatgcgcgt gcggtctatc cactaaaaag actgaatcct tcttctctgt tgtttagaag 13697 agcggatgta ttgcaaaaag cgggcgtttg ggactgtgtt aaaacggggg ctgatagtga 13757 attcattgct cgacttaagc taatttttgg tgattccact gtacatcgta ttaaattgcc 13817 tttgacgcta ggaagccatc gtaccgactc gttaatgaat tcacctacaa caggatatac 13877 atctcaggga atttcaccag atcgccaaaa atattgggat tcctggtcgc gatggcacat 13937 tcaggcgtta agaaataaag aaagtcttta cataggaaat tctgatttca ctaataaaaa 13997 tcgaccattt tctgcgcccg actcaatatt agtagatact aatgccatca aaactgcatt 14057 acaaagtgct catgttaact ttaccagtat ataacttatc actaaatgta taatctataa 14117 tatttatttt aataatttat tgtgttttct aattatagta tgttaatcat ttatttaatg 14177 aatgggagtt tatgaatggt tatgttaatg ccattcattg tgatgttttt ttgatagcat 14237 aatacaatct tttttatctt tttttatatt tttttatctt gttaaaaatc atctccccat 14297 aataaaccgc attaacctgc gtcttaacca ataaataccc tcgaaacttc ttaaacagtt 14357 tcatattcgg tttaaaatcg gcctgccaga actggtgcaa atgcccttga tacgtcaagc 14417 ctttgatgtc gtacagggca ttgcccatca ctttgagtgg tttgttatga atcagcgcag 14477 agatcc 14483 <210> 4 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoeding His-tag amino acid sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(108) <400> 4 atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act 48 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 ggt gga cag caa atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat aag gat 96 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 cga tgg atc ccg 108 Arg Trp Ile Pro 35 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer CS-S <400> 5 acccaacact gctacaacct atatcgg 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer CS-AS <400> 6 gcgtcttcac caataaatac ccacgaaact 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer TM-S <400> 7 cgagaaatac gaacacgctt tggtaa 26 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer TM-AS <400> 8 actcaatttt ctctttcagc tcttcttg 28 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer K4C-SP <400> 9 cgggatcccg atgagtattc ttaatcaagc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of primer K4C-AS <400> 10 ggaattccgg ccagtctaca tgtttatcac 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌K5株のK抗原遺伝子クラスターのR-I部
とR-III部の制限酵素地図を示す。

【図２】 大腸菌K4株のK抗原遺伝子クラスターのR-II
部のオープンリーディングフレーム（ORF）を示す。

【図３】 本発明酵素による、GalNAcのコンドロイチン
硫酸Ｃのオリゴ６糖への転移を示す。

【図４】 本発明酵素によるGalNAcのコンドロイチン硫
酸Ｃのオリゴ６糖への転移及び生成する糖鎖のサイズを
示す図である。

【図５】 供与体としてUDP-GlcUA、UDP-GlcNAc又はUDP
-GalNAcを、受容体としてコンドロイチン硫酸Ｃの６糖
又は７糖を用いたときの、各単糖の転移を示す。

【図６】 本発明酵素の活性に対する温度の影響を示
す。

【図７】 種々の酵素反応時間における、酵素反応産物
のゲル濾過パターンを示す図である。

【図８】 酵素反応時間と放射活性の取り込み量との関
係を示す図である。

【図９】 取り込まれた放射活性(Ｖ)とUDP-糖の基質濃
度(Ｓ)との関係を示す図である。

【図１０】 ダブル・レシプロカル・プロットを示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA10 CA04 CA09 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 HA14 4B050 CC01 CC03 DD02 FF05E FF12E FF13E LL05 4B064 AF21 CA02 CA21 CC24 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA01 CA27 CA60

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有するコンドロイチン合成
   酵素。 (1)作用：GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からG
   alNAcを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。（GlcUA
   はD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラク
   トサミンを示す） (2)基質特異性：非還元末端にGalNAcを有しかつコンド
   ロイチン骨格を有するオリゴ糖に対しては、GlcUA供与
   体からGlcUAを転移するが、GalNAc供与体からGalNAcを
   実質的に転移しない。非還元末端にGlcUAを有しかつコ
   ンドロイチン骨格を有するオリゴ糖に対しては、GalNAc
   供与体からGalNAcを転移するが、GlcUA供与体からGlcUA
   を実質的に転移しない。（GlcUA及びGalNAcは、いずれ
   も前記と同義である） (3)金属イオン等による影響：Ｍｎ^２＋イオンの存在下
   で作用し、Ｃａ^２＋若しくはＣｕ^２＋イオン又はエチレ
   ンジアミン四酢酸の存在下では実質的に作用しない。
2. 【請求項２】 大腸菌由来である、請求項１に記載のコ
   ンドロイチン合成酵素。
3. 【請求項３】 下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパ
   ク質。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
   アミノ酸配列を含み、かつ、コンドロイチン合成酵素活
   性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを保持す
   るＤＮＡ。 （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質をコードするＤＮＡ。 （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
   アミノ酸配列からなり、かつ、コンドロイチン合成酵素
   活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに
   相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列の一部を
   有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
   ダイズするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 前記（ａ）が、配列番号１で示されるＤ
   ＮＡである、請求項４に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４又は５に記載のＤＮＡを保持す
   るベクター。
7. 【請求項７】 発現ベクターである、請求項６に記載の
   ベクター。
8. 【請求項８】 請求項６又は７に記載のベクターによっ
   て宿主が形質転換された形質転換体。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換体を生育さ
   せ、その生育物からコンドロイチン合成酵素を採取する
   ことを特徴とする、コンドロイチン合成酵素の製造方
   法。
10. 【請求項１０】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸
    配列をそのアミノ酸配列中に包含し、かつ下記（イ）及
    び（ロ）の触媒活性を有する酵素タンパク質を含有す
    る、糖鎖合成剤。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
    アミノ酸配列。 （イ）GlcUA供与体からGlcUAを、GalNAc供与体からGalN
    Acを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する。 （ロ）GlcNAc供与体からGlcNAcを、非還元末端にGlcUA
    を有する糖鎖の当該非還元末端に転移する。 （GlcUA及びGalNAcは、いずれも前記と同義である。Glc
    NAcはＮ−アセチル-D-グルコサミンを示す。）
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の合成剤を、GalNAc
    供与体及び下記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる
    工程を少なくとも含む、下記一般式(3)で示される糖鎖
    の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) GalNAc-GlcUA-X-R¹ (3) （各式中、GlcUA及びGalNAcは、いずれも前記と同義で
    ある。XはGalNAc又はGlcNAc（GlcNAcは前記と同義であ
    る。）を、 - はグリコシド結合を、R¹は任意の基を示
    す。）
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の合成剤を、GlcNAc
    供与体及び下記一般式(1)で示される糖鎖に接触させる
    工程を少なくとも含む、下記一般式(4)で示される糖鎖
    の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) GlcNAc-GlcUA-X-R¹ (4) （各式中、GlcUA、GalNAc、X 及び - は、いずれも前記
    と同義である。 - はグリコシド結合を、R¹は任意の基
    を示す。）
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の合成剤を、GlcUA
    供与体及び下記一般式(2)で示される糖鎖に接触させる
    工程を少なくとも含む、下記一般式(5)で示される糖鎖
    の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R² (5) （各式中、GlcUA、GalNAc、及び - は、いずれも前記と
    同義である。R²は任意の基を示す。）
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の合成剤を、GalNAc
    供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(1)で示され
    る糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式
    (6)及び(8)から選ばれる糖鎖の製造方法。 GlcUA-X-R¹ (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R¹ (8) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、X
    及び - は、いずれも前記と同義である。またR¹は任意
    の基を示す。）
15. 【請求項１５】 請求項１０に記載の合成剤を、GalNAc
    供与体及びGlcUA供与体、並びに下記一般式(2)で示され
    る糖鎖に接触させる工程を少なくとも含む、下記一般式
    (7)及び(9) から選ばれる糖鎖の製造方法。 GalNAc-GlcUA-R² (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R² (9) （各式中、ｎは１以上の整数を示し、GlcUA、GalNAc、
    及び - は、いずれも前記と同義である。またR²はいず
    れも任意の基を示す。）
16. 【請求項１６】 配列番号１で示される塩基配列又はそ
    の一部と相補的な塩基配列を有するハイブリダイゼーシ
    ョン用プローブ。
17. 【請求項１７】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すアミノ酸
    配列を含む酵素タンパク質を含有し、GlcUA供与体からG
    lcUAを、GalNAc供与体からGalNAcを、GlcNAc供与体から
    GlcNAcをそれぞれ糖鎖の非還元末端に転移する機能を有
    する、糖転移触媒。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における１も
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位した
    アミノ酸配列。 （GlcUA、GalNAc及びGlcNAcは、いずれも前記と同義で
    ある。）