JPWO2007058252A1 - コンドロイチンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法や、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法等を提供する。下記の工程、（ａ）グルクロン酸残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体及びＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、および（ｂ）Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びグルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程を含み、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるコンドロイチンの製造方法。
Description
本発明は、所望の糖鎖長からなるコンドロイチンの新規な製造方法等に関する。
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＧｌｃＵＡ：グルクロン酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｋ４ＣＰ：大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ
Ｄ２４１Ｋ：Ｋ４ＣＰ（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号２４１のアスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素はＧａｌＮＡｃの転移活性を実質的に有さず、ＧｌｃＵＡの転移活性を有している。
Ｄ５２１Ｋ：Ｋ４ＣＰ（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号５２１のアスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素はＧｌｃＵＡの転移活性を実質的に有さず、ＧａｌＮＡｃの転移活性を有している。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ:
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization−飛行時間型−質量分析
ＵＤＰ：ウリジン５’−ジリン酸
ＰＡ:アミノピリジン
ＣＨは、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃがそれぞれβ１−３結合及びβ１−４結合で交互に直線上に結合したグリコサミノグリカンの一種である。ＣＨは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織にＣＳプロテオグリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分化、神経細胞伸展、軟骨・骨形成、組織再生などにおいて重要な役割を担っている。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＧｌｃＵＡ：グルクロン酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｋ４ＣＰ：大腸菌Ｋ４株由来のコンドロイチンポリメラーゼ
Ｄ２４１Ｋ：Ｋ４ＣＰ（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号２４１のアスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素はＧａｌＮＡｃの転移活性を実質的に有さず、ＧｌｃＵＡの転移活性を有している。
Ｄ５２１Ｋ：Ｋ４ＣＰ（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号５２１のアスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素はＧｌｃＵＡの転移活性を実質的に有さず、ＧａｌＮＡｃの転移活性を有している。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ:
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization−飛行時間型−質量分析
ＵＤＰ：ウリジン５’−ジリン酸
ＰＡ:アミノピリジン
ＣＨは、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃがそれぞれβ１−３結合及びβ１−４結合で交互に直線上に結合したグリコサミノグリカンの一種である。ＣＨは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織にＣＳプロテオグリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分化、神経細胞伸展、軟骨・骨形成、組織再生などにおいて重要な役割を担っている。
動物由来のＣＨポリメラーゼがクローニングされてはいるが、この酵素のみではＣＨを合成することができず、また有している酵素活性も弱いため、工業的にＣＨ糖鎖を効率よく製造するためには十分とはいえない。一方、Ｋ４ＣＰもクローニングされており、この酵素は単独でＣＨを合成する活性を有することが知られている。（特許文献１、非特許文献１）
Ｋ４ＣＰは２つの糖転移活性部位を持つ酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをそれぞれ供与体として、糖鎖を伸長させていくポリメラーゼである。反応時間や基質の添加量を変化させることによって、合成されたＣＨのサイズ（糖鎖長）をある程度調整することもできるが、得られる画分は様々な分子量の糖鎖を含有する混合物であり、所望の糖鎖長のＣＨのみから構成される画分を得ることはできない。
Ｋ４ＣＰは２つの糖転移活性部位を持つ酵素であり、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをそれぞれ供与体として、糖鎖を伸長させていくポリメラーゼである。反応時間や基質の添加量を変化させることによって、合成されたＣＨのサイズ（糖鎖長）をある程度調整することもできるが、得られる画分は様々な分子量の糖鎖を含有する混合物であり、所望の糖鎖長のＣＨのみから構成される画分を得ることはできない。
また、Ｋ４ＣＰにおける２カ所の糖転移活性部位は、それぞれＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの一方の糖転移活性を担っている。そして一方の糖転移活性部位におけるアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体は、他方の糖転移活性しか示さないことが知られている。（特許文献２）
また、動物感染性病原菌であるパストレアマルトシダ由来のＨＡ合成酵素の点変異体を利用して、ＨＡオリゴ糖を製造できることが知られているが、ＣＨオリゴ等の製造に関しての開示はない。（非特許文献２）
特開２００３−１９９５８３号公報
特開２００５−６５５６５号公報
ニノミヤ、Ｔ（Ninomiya, T.）ら、２００２年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７７巻、第２４号、ｐ．２１５６７−２１５７５
ポール、Ｌ．デアンジェリス（Paul, L. DeAngelis）ら、２００３年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７８巻、第３７号、ｐ．３５１９９−３５２０３
また、動物感染性病原菌であるパストレアマルトシダ由来のＨＡ合成酵素の点変異体を利用して、ＨＡオリゴ糖を製造できることが知られているが、ＣＨオリゴ等の製造に関しての開示はない。（非特許文献２）
本発明は、所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法や、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法等を提供することを課題とする。
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の糖転移酵素等を用い、特定の複数の工程を交互に行うことによって、所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法及び実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法等を提供するに至り、本発明を完成した。
すなわち本発明は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を反応系中に共存させる工程。
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を反応系中に共存させる工程。
また本発明は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を反応系中に共存させる工程。
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を反応系中に共存させる工程。
また本発明は、本発明方法１に記載の（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨの製造方法（以下、「本発明方法３」という。）を提供する。
以下、本発明方法１〜３をまとめて単に「本発明方法」という。
以下、本発明方法１〜３をまとめて単に「本発明方法」という。
本発明方法の工程（ａ）におけるＧａｌＮＡｃ転移酵素及び工程（ｂ）におけるＧｌｃＵＡ転移酵素は、いずれも下記（Ａ）に示す酵素であることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素。
また、本発明方法の工程（ａ）におけるＧａｌＮＡｃ転移酵素が下記（Ｂ）に示す酵素であり、かつ、工程（ｂ）におけるＧｌｃＵＡ転移酵素が下記（Ｃ）に示す酵素であるものも好ましい。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号４３５〜５３９で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号１５３〜２５８で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素。
また、本発明方法の工程（ａ）におけるＧａｌＮＡｃ転移酵素が下記（Ｂ）に示す酵素であり、かつ、工程（ｂ）におけるＧｌｃＵＡ転移酵素が下記（Ｃ）に示す酵素であるものも好ましい。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号４３５〜５３９で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号１５３〜２５８で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
その中でも、「アミノ酸番号４３５〜５３９の領域」が「アミノ酸番号５１９〜５２１の領域」であり、「アミノ酸番号１５３〜２５８の領域」が「アミノ酸番号２３９〜２４１の領域」であり、かつ「１〜数個」が「１〜３個」であるものが好ましい。またその中でも、アミノ酸番号５２１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつ、アミノ酸番号２４１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されているものが好ましい。
また本発明方法における工程（ａ）及び（ｂ）の直後に、それぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことが好ましい。この場合、転移酵素のみを除去することが好ましい。
また、本発明方法において用いるＧａｌＮＡｃ供与体がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、かつ、ＧｌｃＵＡ供与体がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡである態様も好ましい。
また、本発明方法において用いるＧａｌＮＡｃ供与体がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、かつ、ＧｌｃＵＡ供与体がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡである態様も好ましい。
また、本発明方法における「共存」は、１０℃〜５０℃の条件下で１０分間〜２４時間行われることが好ましく、２０℃〜４０℃の条件下で３０分間〜５時間行われることがより好ましく、２５℃〜３７℃の条件下で１時間〜４時間行われることがさらに好ましい。
また、本発明方法における工程（ａ）及び（ｂ）の各工程において共存させる転移酵素は、担体に固定化されていることが好ましい。
また、本発明方法において用いる受容体基質は、ＣＨ又はその誘導体であることが好ましい。このＣＨの誘導体は、ＰＡが共有結合したＣＨであることが好ましい。
また、本発明方法における工程（ａ）及び（ｂ）の各工程において共存させる転移酵素は、担体に固定化されていることが好ましい。
また、本発明方法において用いる受容体基質は、ＣＨ又はその誘導体であることが好ましい。このＣＨの誘導体は、ＰＡが共有結合したＣＨであることが好ましい。
本発明方法は、副生成物をほとんど出すことなく、所望の糖鎖長からなるＣＨや、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分等を簡便かつ安価に工業的スケールで製造できることから極めて有用である。
また、本発明方法により製造した所望の糖鎖長からなるＣＨや実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分等は、今まで未開拓であった糖鎖の変化による生理活性の探求等に極めて有用な物質であり、医薬品、飲食品、化粧品等の素材としても有用である。
また、本発明方法により製造した所望の糖鎖長からなるＣＨや実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分等は、今まで未開拓であった糖鎖の変化による生理活性の探求等に極めて有用な物質であり、医薬品、飲食品、化粧品等の素材としても有用である。
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法１
本発明方法１は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法である；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を共存させる工程。
＜１＞本発明方法１
本発明方法１は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法である；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を共存させる工程。
本発明方法１によれば、糖鎖長の増加をコントロールしつつＣＨを製造することができるため、所望の糖鎖長からなるＣＨを容易に製造することができる。したがって、本発明方法１には、ＣＨの糖鎖長の増加のコントロール（調整）方法などの概念も包含される。なお、本発明方法１による製造の目的物（糖鎖長の増加のコントロール対象）たる「ＣＨ」は、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃの繰返単位のみからなる本来のＣＨのみならず、ＣＨオリゴ糖およびＣＨの誘導体などを含む概念である。
工程（ａ）は、ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を共存させる工程である。すなわち、ＧａｌＮＡｃ転移酵素を反応触媒として、ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質のＧｌｃＵＡ残基に、ＧａｌＮＡｃ供与体のＧａｌＮＡｃ残基を転移させ、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃを非還元末端として有し、受容体基質よりも１残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる工程である。
また工程（ｂ）は、ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を共存させる工程である。すなわち、ＧｌｃＵＡ転移酵素を反応触媒として、ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質のＧａｌＮＡｃ残基に、ＧｌｃＵＡ供与体のＧｌｃＵＡ残基を転移させ、ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＵＡを非還元末端として有し、受容体基質よりも１残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる工程である。
ここにいう「ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に有している糖鎖（その誘導体も含む）である限りにおいて特に限定されない。また、ここにいう「ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に有している糖鎖（その誘導体も含む）である限りにおいて特に限定されない。
これらの受容体基質としては、例えば下記一般式（１）及び（２）で示される糖鎖を例示することができる。
GlcUA−GalNAc−R1 ・・・・（１）
GalNAc−GlcUA−R2 ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、Ｒ１及びＲ２は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。）
GlcUA−GalNAc−R1 ・・・・（１）
GalNAc−GlcUA−R2 ・・・・（２）
（各式中、−はグリコシド結合を、Ｒ１及びＲ２は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。）
「Ｒ１」や「Ｒ２」としては、例えば、ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基や、ＨＡ骨格を有する糖鎖の残基等が例示される。例えばここにいう「ＣＨ骨格を有する糖鎖の残基」としてはＣＨ残基やＣＳ残基等が例示される。このような糖鎖残基には、さらに他の化学物質などが結合していても良い。
なお本発明方法における「ＧｌｃＵＡ」及び「ＧａｌＮＡｃ」は、それぞれＤ−ＧｌｃＵＡ及びＤ−ＧａｌＮＡｃであることが好ましい。また、ＧｌｃＵＡとＧａｌＮＡｃとの間のグリコシド結合（GlcUA−GalNAc）はβ１−３結合であることが好ましく、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＵＡとの間のグリコシド結合（GalNAc−GlcUA）はβ１−４結合であることが好ましい。
なお本発明方法における「ＧｌｃＵＡ」及び「ＧａｌＮＡｃ」は、それぞれＤ−ＧｌｃＵＡ及びＤ−ＧａｌＮＡｃであることが好ましい。また、ＧｌｃＵＡとＧａｌＮＡｃとの間のグリコシド結合（GlcUA−GalNAc）はβ１−３結合であることが好ましく、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＵＡとの間のグリコシド結合（GalNAc−GlcUA）はβ１−４結合であることが好ましい。
また、受容体基質の糖鎖のサイズも特に限定されず、高分子の糖鎖から１〜２０糖程度のオリゴ糖であってもよい。「ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質」として具体的には、例えば、式（１）の糖鎖としてのＣＨの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＨオリゴ糖および高分子のＣＨ、Ｒ１としてＣＳの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＳオリゴ糖および高分子のＣＳ、ＨＡの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＨＡオリゴ糖および高分子のＨＡを有する一般式（１）の糖鎖が挙げられる。また「ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質」として具体的には、式（２）の糖鎖としてのＣＨの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＨオリゴ糖および高分子のＣＨ、Ｒ２としてＣＳの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＣＳオリゴ糖および高分子のＣＳ、ＨＡの２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖などのＨＡオリゴ糖および高分子のＨＡを有する一般式（２）の糖鎖が挙げられる。
このような受容体基質は、公知の方法で製造することもでき、また市販のものなどを用いることもできる。また、これらの糖鎖の誘導体としては、これらの糖鎖に他の化学物質などが結合しているものを例示することができる。これらの糖鎖に結合する他の化学物質の種類等も特に限定されない。このような化学物質としては、例えばＰＡなどが例示される。またその化学物質と糖鎖との間の結合様式も限定されない。結合様式としては、共有結合などが例示される。なかでも、ＰＡが糖鎖に共有結合しているものが好ましく、ＰＡが糖鎖の還元末端に共有結合しているものがより好ましい。最も好ましいのは、ＣＨ（ＣＨのオリゴ糖を含む）の還元末端にＰＡが共有結合しているものである。ＰＡが共有結合した糖鎖は、糖鎖の還元末端に還元剤を使ってＰＡをアミノアルキル化する方法で調製することができる。還元剤としては、シアノボロハイドライドやジメチルアミノボラン、トリメチルアミノボラン複合体等を用いることが好ましく、特にトリメチルアミノボラン複合体を使用する方法が好ましい。
本発明方法１においては、このような受容体基質として一種類の化合物からなる受容体基質を使用して、所望の糖鎖長からなる一種類の糖鎖を製造してもよい。また、複数種類（好ましくは２〜５種類、より好ましくは２〜３種類）の受容体基質を使用して、それぞれの基質に由来する所望の糖鎖長からなる複数の糖鎖を製造してもよい。例えば、ＣＨオリゴ１０糖（糖鎖長：１０糖）のみの製造を所望する場合には、１０糖よりも鎖長が短い一種類のＣＨオリゴ糖を受容体基質として用いることができる。また例えば、ＣＨオリゴ８糖（糖鎖長：８糖）とＣＨオリゴ１２糖（糖鎖長：１２糖）の混合物を同時に製造する場合には、それぞれ（８−ｎ）糖及び（１２−ｎ）糖（ｎは１以上の整数）の鎖長からなるＣＨオリゴ糖を受容体基質として用いることができる。
本発明方法１は、前記の工程（ａ）と（ｂ）を交互に行うことを特徴とする。したがって、工程（ａ）における「ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、工程（ｂ）の後に本工程を行う際には「工程（ｂ）によって得られた糖鎖」を意味することとなる。同様に、工程（ｂ）における「ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、工程（ａ）の後に本工程を行う際には「工程（ａ）によって得られた糖鎖」を意味することとなる。
本発明方法１で用いる「ＧｌｃＵＡ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧｌｃＵＡ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧｌｃＵＡヌクレオチドが好ましい。ＧｌｃＵＡヌクレオチドとしては、ＵＤＰ-ＧｌｃＵＡや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５’−ジリン酸）−ＧｌｃＵＡ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが好ましい。
本発明方法１で用いる「ＧｌｃＵＡ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧｌｃＵＡ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧｌｃＵＡヌクレオチドが好ましい。ＧｌｃＵＡヌクレオチドとしては、ＵＤＰ-ＧｌｃＵＡや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５’−ジリン酸）−ＧｌｃＵＡ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが好ましい。
また本発明方法１で用いる「ＧａｌＮＡｃ供与体」は、ある糖鎖分子に対してＧａｌＮＡｃ残基を供与する能力を有する分子である限りにおいて限定されないが、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドが好ましい。ＧａｌＮＡｃヌクレオチドとしては、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃや、ｄＴＤＰ（デオキシチミジン５’−ジリン酸）−ＧａｌＮＡｃ等が例示されるが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが好ましい。
これらの糖ヌクレオチドは、公知の方法で製造しても良く、市販のものなどを用いても良い。
また本発明方法１で用いる「ＧａｌＮＡｃ転移酵素」は、ＧａｌＮＡｃを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的にＧｌｃＵＡを転移しないものが好ましい。また本発明方法１で用いる「ＧｌｃＵＡ転移酵素」は、ＧｌｃＵＡを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的にＧａｌＮＡｃを転移しないものが好ましい。また両転移酵素は、同一種類の酵素であっても、異なる種類の酵素であっても良い。
両酵素として同一種類の酵素を用いる場合には、下記（Ａ）に示す酵素であることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素。
また本発明方法１で用いる「ＧａｌＮＡｃ転移酵素」は、ＧａｌＮＡｃを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的にＧｌｃＵＡを転移しないものが好ましい。また本発明方法１で用いる「ＧｌｃＵＡ転移酵素」は、ＧｌｃＵＡを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的にＧａｌＮＡｃを転移しないものが好ましい。また両転移酵素は、同一種類の酵素であっても、異なる種類の酵素であっても良い。
両酵素として同一種類の酵素を用いる場合には、下記（Ａ）に示す酵素であることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素。
また両酵素として異なる種類の酵素を用いる場合には、本発明方法の工程（ａ）におけるＧａｌＮＡｃ転移酵素が下記（Ｂ）に示す酵素であり、かつ、工程（ｂ）におけるＧｌｃＵＡ転移酵素が下記（Ｃ）に示す酵素であることが好ましい。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号４３５〜５３９で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号１５３〜２５８で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする大腸菌由来ＤＮＡ配列をアミノ酸配列と共に示す。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号４３５〜５３９で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号１５３〜２５８で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする大腸菌由来ＤＮＡ配列をアミノ酸配列と共に示す。
その中でも、「アミノ酸番号４３５〜５３９の領域」が「アミノ酸番号５１９〜５２１の領域」であり、「アミノ酸番号１５３〜２５８の領域」が「アミノ酸番号２３９〜２４１の領域」であり、かつ「１〜数個」が「１〜３個」であるものが好ましい。またその中でも、アミノ酸番号５２１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつアミノ酸番号２４１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されているものが好ましい。
上記領域において置換されるアミノ酸、置換されるアミノ酸の数、上記「他のアミノ酸」の種類などのアミノ酸の置換の態様は、置換後の酵素が所望の酵素活性を維持する限りにおいて特に限定されない。上記「他のアミノ酸」は、天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸の何れから選択してもよい。
上記領域において置換されるアミノ酸、置換されるアミノ酸の数、上記「他のアミノ酸」の種類などのアミノ酸の置換の態様は、置換後の酵素が所望の酵素活性を維持する限りにおいて特に限定されない。上記「他のアミノ酸」は、天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸の何れから選択してもよい。
遺伝子工学的に置換を導入する場合には、上記の「他のアミノ酸」は天然型アミノ酸（グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン）から選択することが好ましい。
特に、配列番号２におけるアミノ酸番号５２１のアミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸）のみを他のアミノ酸に置換する場合や、配列番号２におけるアミノ酸番号２４１のアミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸）のみを他のアミノ酸に置換する場合における「他のアミノ酸」は、いずれもＬ−リジンであることが好ましい。以下、配列番号２におけるアミノ酸番号５２１のアミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸）のみをＬ−リジンに置換した酵素を「Ｄ５２１Ｋ」と、配列番号２におけるアミノ酸番号２４１のアミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸）のみをＬ−リジンに置換した酵素を「Ｄ２４１Ｋ」とそれぞれ表記することもある。
「Ｄ５２１Ｋ」及び「Ｄ２４１Ｋ」は、前記の非特許文献２に記載された方法によって取得することができる。この「Ｄ２４１Ｋ」は、ＧａｌＮＡｃ酸残基を非還元末端に持つＣＨを受容体基質とし、ＧｌｃＵＡヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ等）を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端にＧｌｃＵＡを転移してグリコシド結合させる酵素であって、かつ実質的にＧａｌＮＡｃの転移活性を持たない酵素（変異体）である。また「Ｄ５２１Ｋ」は、ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端にもつＣＨを受容体基質とし、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ等）を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端にＧａｌＮＡｃを転移してグリコシド結合させる酵素であって、かつ実質的にＧｌｃＵＡの転移活性を持たない酵素（変異体）である。
これらの酵素は、遊離の状態で用いてもよく、担体に固定化された状態（固定化酵素の状態）で用いてもよい。
これらの酵素は、遊離の状態で用いてもよく、担体に固定化された状態（固定化酵素の状態）で用いてもよい。
工程（ａ）及び（ｂ）において、受容体基質、糖供与体及び糖転移酵素を共存させる方法及び条件は、これらの分子が相互に接触し、糖転移酵素が作用する条件である限りにおいて限定されない。また共存させる際のこれらの分子の量なども、目的等に応じて当業者が適宜設定することができる。
例えば、「共存」は中性ｐＨ付近（例えばｐＨ６．５〜８．５程度）で行われることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝溶液中で行われることがより好ましい、また「共存」させるの温度や時間としては、例えば１０℃〜５０℃の条件下で１０分間〜２４時間や、２０℃〜４０℃の条件下で３０分間〜５時間や、２５℃〜３７℃の条件下で１時間〜４時間などが例示される。一般に、所望の糖鎖長が長いほど、長い接触時間が必要となり、多少他のピークが見られることがある。しかしこの問題は、接触時間をさらに長くすることにより解消することができる。
例えば、「共存」は中性ｐＨ付近（例えばｐＨ６．５〜８．５程度）で行われることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝溶液中で行われることがより好ましい、また「共存」させるの温度や時間としては、例えば１０℃〜５０℃の条件下で１０分間〜２４時間や、２０℃〜４０℃の条件下で３０分間〜５時間や、２５℃〜３７℃の条件下で１時間〜４時間などが例示される。一般に、所望の糖鎖長が長いほど、長い接触時間が必要となり、多少他のピークが見られることがある。しかしこの問題は、接触時間をさらに長くすることにより解消することができる。
また、例えば「共存」時の糖転移酵素及び受容体基質の量は、糖転移酵素９０μｌに対して受容体基質１nmol〜１mmol程度となるようにすることが好ましく、１００nmol程度とすることがより好ましい。また「共存」時、糖供与体は受容体基質に対して１等量以上あればよいが、糖転移酵素の反応を完全に行うためにも受容体基質の１．５〜３０等量存在させることが好ましく、２〜１０等量存在させることがより好ましい。
また「共存」は、糖転移酵素を適当な担体（ビーズ、限外濾過膜、透析膜等）に固定化させ、これに前記の糖供与体及び受容体基質を含有する溶液を連続的に接触させることにより行ってもよい。したがって、例えばカラム型のリアクターや、膜型リアクター等を採用することもできる。また、ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ００／２７４３７号に記載された方法と同様に、受容体基質を担体に固定化させて酵素反応させることもできる。さらに、糖供与体を再生（合成）するバイオリアクター等を組み合わせてもよい。
また「共存」は、糖転移酵素を適当な担体（ビーズ、限外濾過膜、透析膜等）に固定化させ、これに前記の糖供与体及び受容体基質を含有する溶液を連続的に接触させることにより行ってもよい。したがって、例えばカラム型のリアクターや、膜型リアクター等を採用することもできる。また、ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ００／２７４３７号に記載された方法と同様に、受容体基質を担体に固定化させて酵素反応させることもできる。さらに、糖供与体を再生（合成）するバイオリアクター等を組み合わせてもよい。
本発明方法１は、前記の工程（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含んでいる限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明方法１における工程（ａ）及び（ｂ）の直後に、それぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことが好ましい。この場合、転移酵素のみを除去することが好ましい。
本発明方法１における「除去」の語は、前記の共存系からある分子の作用を取り除くことを意味する。したがって、分子自体を物理的に取り除くことはもちろん、分子を失活させることによって当該分子の作用を取り除く態様も包含される。
転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する方法は特に限定されないが、転移酵素を除去する場合は、該酵素を固相に固定化しておき、該固相を適当な方法により除去することにより酵素を除去することができる。供与体は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー又は限外濾過膜を用いることにより除去できる。
転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する方法は特に限定されないが、転移酵素を除去する場合は、該酵素を固相に固定化しておき、該固相を適当な方法により除去することにより酵素を除去することができる。供与体は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー又は限外濾過膜を用いることにより除去できる。
ただし、本発明方法１における工程（ａ）および（ｂ）において受容体基質よりも１残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる反応は、後述の実施例にも記載するように、反応条件（反応時間など）により制御することができるので、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去して各反応を独立して行うことは必ずしも必須ではない。
したがって、「除去」の程度も必ずしも１００％である必要はなく、その程度は目的等に応じて当業者が適宜設定することができる。
したがって、「除去」の程度も必ずしも１００％である必要はなく、その程度は目的等に応じて当業者が適宜設定することができる。
例えば糖転移酵素を除去する場合には、熱により失活させてもよく、糖転移酵素が担体に固定化されている場合には当該担体を物理的に除去することにより行ってもよい。担体の物理的除去は、例えば濾過フィルター等を用いたり、遠心分離等を行うことによって容易に行うことができる。
またさらに、本発明方法１により得られたＣＨ（所望の糖鎖長からなる）を精製する工程や、品質チェック工程などを含んでいても良いことは言うまでもない。
本発明方法１は、前記の工程（ａ）及び（ｂ）を交互に行うことを特徴とする。したがって、工程（ａ）から出発して交互に行ってもよく（工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ａ）、工程（ｂ）・・・のように）、工程（ｂ）から出発して交互に行ってもよい（工程（ｂ）、工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ａ）・・・のように）。なお、本発明方法１における「交互」の語には、２工程のみで終了する場合（例えば、工程（ａ）と工程（ｂ）を行って終了する場合や、工程（ｂ）と工程（ａ）を行って終了する場合）も包含される。
工程（ａ）又は工程（ｂ）を１回行うことにより、糖鎖長が単糖１つ分だけ伸長する。したがって、前記の各工程を「交互」に行う回数を適宜設定することにより、所望の糖鎖長のＣＨを製造することができる。交互に行う回数等は、前記の各工程における各分子の共存の条件等に基づいて、当業者が適宜設定・コントロールすることができる。
本発明方法１により製造される物（所望の糖鎖長からなるＣＨ）は、溶液状態のままでよく、固体状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）としてもよい。
本発明方法１は、前記の工程（ａ）及び（ｂ）を交互に行うことを特徴とする。したがって、工程（ａ）から出発して交互に行ってもよく（工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ａ）、工程（ｂ）・・・のように）、工程（ｂ）から出発して交互に行ってもよい（工程（ｂ）、工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ａ）・・・のように）。なお、本発明方法１における「交互」の語には、２工程のみで終了する場合（例えば、工程（ａ）と工程（ｂ）を行って終了する場合や、工程（ｂ）と工程（ａ）を行って終了する場合）も包含される。
工程（ａ）又は工程（ｂ）を１回行うことにより、糖鎖長が単糖１つ分だけ伸長する。したがって、前記の各工程を「交互」に行う回数を適宜設定することにより、所望の糖鎖長のＣＨを製造することができる。交互に行う回数等は、前記の各工程における各分子の共存の条件等に基づいて、当業者が適宜設定・コントロールすることができる。
本発明方法１により製造される物（所望の糖鎖長からなるＣＨ）は、溶液状態のままでよく、固体状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）としてもよい。
＜２＞本発明方法２
本発明方法２は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法である；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を共存させる工程。
本発明方法２は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法である；
工程（ａ）：ＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、ＧａｌＮＡｃ供与体及びＧａｌＮＡｃ転移酵素を共存させる工程、
工程（ｂ）：ＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、ＧｌｃＵＡ供与体及びＧｌｃＵＡ転移酵素を共存させる工程。
本発明方法２は、本発明方法１における「受容体基質」を「一種類だけ使用」することにより、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法としたものである。
したがって本発明方法２は、製造の目的物が「実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分」である点、並びにＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質及びＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質が、いずれも「実質的に単一の糖鎖長からなるもの」である点を除き、本発明方法１と同じである。したがって、各工程における反応、酵素など、および反応体であるＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質及びＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質そのものについては本発明方法１と同様である。
したがって本発明方法２は、製造の目的物が「実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分」である点、並びにＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質及びＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質が、いずれも「実質的に単一の糖鎖長からなるもの」である点を除き、本発明方法１と同じである。したがって、各工程における反応、酵素など、および反応体であるＧｌｃＵＡ残基を非還元末端に持つ受容体基質及びＧａｌＮＡｃ残基を非還元末端に持つ受容体基質そのものについては本発明方法１と同様である。
ここで「実質的に単一」とは、ある画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析したときに、特定の糖鎖長の糖鎖に由来するピークの高さが、これを含む全体のピークの高さの総和の７割以上を示すことをいう。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの分析条件は、後述の実施例を参照されたい。
本発明方法２における工程（ａ）および（ｂ）で受容体基質よりも１残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる反応においても、本発明方法１と同様に各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去して各反応を独立して行うことは必ずしも必須ではないが、転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を実質的に１００％除去して各反応を行うことが好ましい。転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する方法については本発明方法１と同様である。
ここで「実質的に１００％除去する」とは、１残基だけ糖残基数の多い糖鎖を生成する工程を当該酵素または基質を除去して行った場合に、１残基だけ糖残基数の多い糖鎖のピークがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおいて実質的に検出されない（実質的に無視し得る）程度に除去することをいう。例えば、後述の実施例３の（２）においてＤ５２１Ｋを使用しない条件、即ちＰＡ−ＣＨ６（１００nmol）、２０ｍＭ塩化マンガン１．２ｍＭ及び１５０ｍＭＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した後、５０ｍＭＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを１０μｌ添加した溶液を３０℃で２時間震盪した溶液を精製し、凍結乾燥した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに付すと、ＰＡ−ＣＨ７のピークは実質的に検出されず（実質的に無視し得る）、このような条件を「実質的に１００％除去」（この場合は酵素）された状態と考える。
＜３＞本発明方法３
本発明方法３は、本発明方法１に記載の（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨの製造方法である。
本発明方法３は、本発明方法１における工程（ａ）及び（ｂ）を交互に行うことなく、いずれか一方の工程のみを行うことによって、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨの製造方法としたものである。
本発明方法３は、本発明方法１に記載の（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨの製造方法である。
本発明方法３は、本発明方法１における工程（ａ）及び（ｂ）を交互に行うことなく、いずれか一方の工程のみを行うことによって、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨの製造方法としたものである。
したがって本発明方法３は、製造の目的物が「受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したＣＨ」である点、並びに本発明方法１における工程（ａ）及び（ｂ）のいずれか一方の工程のみを行う点を除き、本発明方法１と同じである。したがって、各工程における反応、酵素、反応体などについては本発明方法１と同様である。
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
（分析法）
以下の実施例で得られたＣＨ及びＣＨ誘導体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ブルカー社製AutoFlex）によって構造解析した。分析には発生した陰イオンを検出するネガティブモードを用い、リフレクションモードで解析した。
（分析法）
以下の実施例で得られたＣＨ及びＣＨ誘導体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ブルカー社製AutoFlex）によって構造解析した。分析には発生した陰イオンを検出するネガティブモードを用い、リフレクションモードで解析した。
（ターゲットの調製）
得られた検体 1 μｌ（２０〜１００ ｐmoleのＣＨを含有）と１０ ｍｇ/ｍｌのＤＨＢ（2,5-dihydroxy-benzoic acid）−５０% アセトニトリル水溶液
１ μｌとを混合し、その１μl をターゲットプレートにスポットして、速やかに窒素ガスを吹き付け乾燥させた。
得られた検体 1 μｌ（２０〜１００ ｐmoleのＣＨを含有）と１０ ｍｇ/ｍｌのＤＨＢ（2,5-dihydroxy-benzoic acid）−５０% アセトニトリル水溶液
１ μｌとを混合し、その１μl をターゲットプレートにスポットして、速やかに窒素ガスを吹き付け乾燥させた。
酵素の固定化
ＮＨＳ−activated Sepharose Beads (アマシャム社製、０．１ｍｌ)に、Ｄ２４１Ｋ又はＤ５２１Ｋ（それぞれ特開２００５−６５５６５号公報の実施例にしたがって得られたもの）０．５ｍｇ及びグリセロール（終濃度２０％）を含有する生理的リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「ＰＢＳ」という。）１ｍｌ溶液を添加し、４℃で６時間震盪した。反応後、１Ｍエタノールアミンを４μｌ添加し、さらに４℃で１時間震盪した。その後、２０ ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）で３回、２０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で３回、２０％グリセロール−ＰＢＳで３回順次洗浄して、Ｄ２４１Ｋ、Ｄ５２１Ｋそれぞれの固定化酵素を作成した。得られた固定化酵素は２０％グリセロール−ＰＢＳで懸濁して、４℃で保存した。
ＮＨＳ−activated Sepharose Beads (アマシャム社製、０．１ｍｌ)に、Ｄ２４１Ｋ又はＤ５２１Ｋ（それぞれ特開２００５−６５５６５号公報の実施例にしたがって得られたもの）０．５ｍｇ及びグリセロール（終濃度２０％）を含有する生理的リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「ＰＢＳ」という。）１ｍｌ溶液を添加し、４℃で６時間震盪した。反応後、１Ｍエタノールアミンを４μｌ添加し、さらに４℃で１時間震盪した。その後、２０ ｍＭTris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）で３回、２０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で３回、２０％グリセロール−ＰＢＳで３回順次洗浄して、Ｄ２４１Ｋ、Ｄ５２１Ｋそれぞれの固定化酵素を作成した。得られた固定化酵素は２０％グリセロール−ＰＢＳで懸濁して、４℃で保存した。
また、得られた固定化酵素をそれぞれ１０ μｌ使用し、ＣＨ６糖とＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃを基質としてＧａｌＮＡｃ転移活性を、ＣＨ７糖とＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡを基質としてＧｌｃＵＡ転移活性をそれぞれ測定した。その結果、Ｄ２４１Ｋ固定化酵素（以下、Ｄ２４１Ｋビーズという）はＧｌｃＵＡ転移活性のみが、Ｄ５２１Ｋ固定化酵素（以下、Ｄ５２１Ｋビーズという）はＧａｌＮＡｃ転移活性のみが保持されていることを確認した。
ＰＡが共有結合した（ＰＡ化された）ＣＨオリゴ糖の製造
（１）ＣＨ６（ＣＨ６糖）及びＣＨ７（ＣＨ７糖）の製造
ＣＳを化学的に脱硫酸化したＣＨ（生化学工業株式会社製）に、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社）を加え、ＮａＣｌを含有する酢酸ナトリウム緩衝液中で限定分解することによって、非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である偶数糖のオリゴ糖を得た。それらをゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、ＣＨ６に相当する画分を集めて、凍結乾燥した。この得られた画分についてウロン酸含有量分析（カルバゾール法）、ＨＰＬＣ（ＧＰＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、コンドロイチナーゼ処理後の二糖分析等を行った結果、還元末端がＧａｌＮＡｃ残基で非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である６糖であることを確認した。
（１）ＣＨ６（ＣＨ６糖）及びＣＨ７（ＣＨ７糖）の製造
ＣＳを化学的に脱硫酸化したＣＨ（生化学工業株式会社製）に、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社）を加え、ＮａＣｌを含有する酢酸ナトリウム緩衝液中で限定分解することによって、非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である偶数糖のオリゴ糖を得た。それらをゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、ＣＨ６に相当する画分を集めて、凍結乾燥した。この得られた画分についてウロン酸含有量分析（カルバゾール法）、ＨＰＬＣ（ＧＰＣ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、コンドロイチナーゼ処理後の二糖分析等を行った結果、還元末端がＧａｌＮＡｃ残基で非還元末端がＧｌｃＵＡ残基である６糖であることを確認した。
また、上記と同様にＣＨをヒアルロニダーゼ処理することによって得られた複数種類の偶数糖ＣＨオリゴ糖の混合物に、β−グルクロニダーゼ（シグマ社）を添加し、ＮａＣｌを含有する酢酸ナトリウム緩衝溶液中で３７℃、１８時間静置した。その反応液を上記方法と同様の精製処理に付し、ＣＨ７に相当する画分を集めて凍結乾燥した。この得られた画分について前記と同様の分析を行った結果、還元末端がＧａｌＮＡｃで非還元末端もＧａｌＮＡｃであるＣＨ７であることを確認した。
（２）ＰＡが共有結合したＣＨ６（ＰＡ−ＣＨ６）の製造
上記（１）で得られたＣＨ６（１０ ｍｇ）を水１ ｍｌに溶解し、これに塩酸でｐＨ５．６に調整したＰＡ水溶液１ ｍｌと、トリメチルアミノボラン複合体（アルドリッチ社製）のメタノール溶液１ｍｌとを添加して密封し、７０℃で３日間反応させた。反応液を減圧濃縮し、ついで凍結乾燥した後、再度水０．１ ｍｌに溶解した。その後Dowex 50 WX8 陽イオン交換樹脂（ダウケミカル社製）に通した後、０．２ Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex 30 HR 16/60 カラム（アマシャム社製）でゲルろ過クロマトグラフィー（流速：２ ｍｌ/分）を行った。検出液を蛍光検出器（Ｅｘ：３１０ｎｍ、Ｅｍ：３７０ｎｍ）でモニターしてＰＡ−ＣＨ６を含有する画分を集めた。この画分をさらに、SAX Magnum 9/25HPLCカラム（ワットマン社製）を用いた３０〜２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４リニアグラディエントによるイオン交換クロマトグラフィーにより精製して、ＰＡ−ＣＨ６を得た。ＰＡ−ＣＨ６は、上記（１）と同様に分析し、構造及び純度を確認した（図１）。
（２）ＰＡが共有結合したＣＨ６（ＰＡ−ＣＨ６）の製造
上記（１）で得られたＣＨ６（１０ ｍｇ）を水１ ｍｌに溶解し、これに塩酸でｐＨ５．６に調整したＰＡ水溶液１ ｍｌと、トリメチルアミノボラン複合体（アルドリッチ社製）のメタノール溶液１ｍｌとを添加して密封し、７０℃で３日間反応させた。反応液を減圧濃縮し、ついで凍結乾燥した後、再度水０．１ ｍｌに溶解した。その後Dowex 50 WX8 陽イオン交換樹脂（ダウケミカル社製）に通した後、０．２ Ｍ 酢酸アンモニウムを展開緩衝液とするSuperdex 30 HR 16/60 カラム（アマシャム社製）でゲルろ過クロマトグラフィー（流速：２ ｍｌ/分）を行った。検出液を蛍光検出器（Ｅｘ：３１０ｎｍ、Ｅｍ：３７０ｎｍ）でモニターしてＰＡ−ＣＨ６を含有する画分を集めた。この画分をさらに、SAX Magnum 9/25HPLCカラム（ワットマン社製）を用いた３０〜２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４リニアグラディエントによるイオン交換クロマトグラフィーにより精製して、ＰＡ−ＣＨ６を得た。ＰＡ−ＣＨ６は、上記（１）と同様に分析し、構造及び純度を確認した（図１）。
所望の糖鎖長からなるＰＡ化オリゴ糖の製造
（１）反応時間の決定
実施例２の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ６（１００nmol）を、１．２ ｍｌの２０ｍＭ塩化マンガン及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ ｍＭ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、これを実施例１で得られたＤ５２１Ｋビーズが入った容器に添加した。これに５０ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを１０ μｌ及びＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃを５ｐｍｏｌ（０．１μＣｉ）添加した。３０℃で震盪し、１時間後にSuperdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより反応液を分離し、シンチレーションカウンターでＧａｌＮＡｃの転移量を測定したところ、１時間でほぼ完全に糖転移反応が完結することを確認した。この結果より反応時間を２時間とした。
（１）反応時間の決定
実施例２の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ６（１００nmol）を、１．２ ｍｌの２０ｍＭ塩化マンガン及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ ｍＭ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、これを実施例１で得られたＤ５２１Ｋビーズが入った容器に添加した。これに５０ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを１０ μｌ及びＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃを５ｐｍｏｌ（０．１μＣｉ）添加した。３０℃で震盪し、１時間後にSuperdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより反応液を分離し、シンチレーションカウンターでＧａｌＮＡｃの転移量を測定したところ、１時間でほぼ完全に糖転移反応が完結することを確認した。この結果より反応時間を２時間とした。
（２）ＰＡ−ＣＨ７の製造
実施例３の（１）と同様に、実施例２の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ６を上記と同じTris-HCl緩衝液に溶解し、実施例１で得られたＤ５２１Ｋビーズが入った容器に添加した。これにＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添加して、３０℃で２時間震盪した。反応液（１．２ｍｌ）をフィルター（ウルトラフリーＣＬ、ミリポア社製、孔径０．４５ μｍ）で濾過して固定化酵素ビーズを除去し、ＰＡ−ＣＨ７を含有する濾液を得た。次の糖転移反応にはこのままこの濾液を用いた。
ＰＡ−ＣＨ７をSuperdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥した。精製された画分は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって高純度なＰＡ−ＣＨ７であることを確認した（図２）。
実施例３の（１）と同様に、実施例２の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ６を上記と同じTris-HCl緩衝液に溶解し、実施例１で得られたＤ５２１Ｋビーズが入った容器に添加した。これにＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添加して、３０℃で２時間震盪した。反応液（１．２ｍｌ）をフィルター（ウルトラフリーＣＬ、ミリポア社製、孔径０．４５ μｍ）で濾過して固定化酵素ビーズを除去し、ＰＡ−ＣＨ７を含有する濾液を得た。次の糖転移反応にはこのままこの濾液を用いた。
ＰＡ−ＣＨ７をSuperdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥した。精製された画分は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって高純度なＰＡ−ＣＨ７であることを確認した（図２）。
（３）ＰＡ−ＣＨ８（ＰＡ化ＣＨ８糖）の製造
実施例３の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ７溶液を、Ｄ２４１Ｋビーズの入った容器に添加し、さらに５０ ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを１０μｌを添加して、３０℃で２時間震盪した。反応液を上記（２）と同様に処理し、固定化酵素ビーズを除去して、ＰＡ−ＣＨ８を含有する濾液を得た。下記ＰＡ−ＣＨ９〜ＰＡ−ＣＨ１６（ＰＡ化ＣＨ９糖〜ＰＡ化ＣＨ１６糖）の製造におけるＰＡ−ＣＨ９の製造の糖転移反応にはこの濾液をそのまま用いた。ＰＡ−ＣＨ８の精製及び分析は、上記と同様に行った（図３）。
実施例３の（２）で得られたＰＡ−ＣＨ７溶液を、Ｄ２４１Ｋビーズの入った容器に添加し、さらに５０ ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを１０μｌを添加して、３０℃で２時間震盪した。反応液を上記（２）と同様に処理し、固定化酵素ビーズを除去して、ＰＡ−ＣＨ８を含有する濾液を得た。下記ＰＡ−ＣＨ９〜ＰＡ−ＣＨ１６（ＰＡ化ＣＨ９糖〜ＰＡ化ＣＨ１６糖）の製造におけるＰＡ−ＣＨ９の製造の糖転移反応にはこの濾液をそのまま用いた。ＰＡ−ＣＨ８の精製及び分析は、上記と同様に行った（図３）。
（４）ＰＡ−ＣＨ９〜ＰＡ−ＣＨ１６の製造
上記ＰＡ−ＣＨ８を含有する濾液を使用して、上記（２）と同様の操作を行うことによりＰＡ−ＣＨ９が得られた。そのＰＡ−ＣＨ９を含有する濾液を使用して、上記（３）と同様の操作を行うことによりＰＡ−ＣＨ１０が得られた。同様にして、上記（２）および（３）の操作を交互に繰り返すことによって、１糖ずつ糖鎖長が延長したＰＡ化ＣＨオリゴ糖が得られた。このようにして得られたＰＡ−ＣＨ９〜ＰＡ−ＣＨ１６の精製及び分析は上記と同様に行った（図４〜図１１）。
上記ＰＡ−ＣＨ８を含有する濾液を使用して、上記（２）と同様の操作を行うことによりＰＡ−ＣＨ９が得られた。そのＰＡ−ＣＨ９を含有する濾液を使用して、上記（３）と同様の操作を行うことによりＰＡ−ＣＨ１０が得られた。同様にして、上記（２）および（３）の操作を交互に繰り返すことによって、１糖ずつ糖鎖長が延長したＰＡ化ＣＨオリゴ糖が得られた。このようにして得られたＰＡ−ＣＨ９〜ＰＡ−ＣＨ１６の精製及び分析は上記と同様に行った（図４〜図１１）。
逐次糖鎖伸長オリゴ糖の合成
実施例２の（１）で得られたＣＨ６を使用して、実施例３と同様に所望の鎖長の糖鎖が得られるまで交互に反応を行い、ＣＨ７〜ＣＨ１６（ＣＨ７糖〜ＣＨ１６糖）をそれぞれ製造した。精製及び分析を上記と同様に行い、ＣＨ７〜ＣＨ１６がそれぞれ得られたことを確認した。
実施例２の（１）で得られたＣＨ６を使用して、実施例３と同様に所望の鎖長の糖鎖が得られるまで交互に反応を行い、ＣＨ７〜ＣＨ１６（ＣＨ７糖〜ＣＨ１６糖）をそれぞれ製造した。精製及び分析を上記と同様に行い、ＣＨ７〜ＣＨ１６がそれぞれ得られたことを確認した。
Claims (16)
- 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるコンドロイチンの製造方法。
工程（ａ）：グルクロン酸残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体及びＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びグルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程。 - 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなるコンドロイチンを含有する画分の製造方法。
工程（ａ）：グルクロン酸残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体及びＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、
工程（ｂ）：Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びグルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程。 - 請求項１に記載の（ａ）又は（ｂ）のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加したコンドロイチンの製造方法。
- 工程（ａ）におけるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素及び工程（ｂ）におけるグルクロン酸転移酵素が、いずれも下記（Ａ）に示す酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素。 - 工程（ａ）におけるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素が下記（Ｂ）に示す酵素であり、かつ、工程（ｂ）におけるグルクロン酸転移酵素が下記（Ｃ）に示す酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号４３５〜５３９で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号２におけるアミノ酸番号１５３〜２５８で示される領域内の１〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを特徴とするもの。 - 「アミノ酸番号４３５〜５３９の領域」が「アミノ酸番号５１９〜５２１の領域」であり、「アミノ酸番号１５３〜２５８の領域」が「アミノ酸番号２３９〜２４１の領域」であり、かつ「１〜数個」が「１〜３個」である、請求項５に記載の製造方法。
- アミノ酸番号５２１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつ、アミノ酸番号２４１のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
- 工程（ａ）及び（ｂ）の直後にそれぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
- 転移酵素のみを除去することを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
- Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体がＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンであり、かつ、グルクロン酸供与体がＵＤＰ−グルクロン酸であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
- 「共存」が、１０℃〜５０℃の条件下で１０分間〜２４時間行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
- 「共存」が、２０℃〜４０℃の条件下で３０分間〜５時間行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
- 「共存」が、２５℃〜３７℃の条件下で１時間〜４時間行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
- 工程（ａ）及び（ｂ）の各工程において反応系中に共存させる転移酵素が、担体に固定化されているものであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 受容体基質が、コンドロイチン又はその誘導体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
- コンドロイチンの誘導体が、アミノピリジンが共有結合したコンドロイチンである、請求項１５に記載の製造方法。
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| JPN6012027971; Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ．２７８, 2003, ｐ．３５１９９-２０３ * |
| JPN6012027973; Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ｖｏｌ．２５８, 1999, ｐ．７４１-４ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090233336A1 (en) | 2009-09-17 |
| EP1950308A1 (en) | 2008-07-30 |
| WO2007058252A1 (ja) | 2007-05-24 |
| EP1950308A4 (en) | 2009-11-11 |
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