ITPD940042A1 - Processo per la preparazione di acido ialuronico mediante sintesi enzimatica e relative composizioni farmaceutiche - Google Patents
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Abstract
La presente invenzione descrive un procedimento per la preparazione di acido ialuronico mediante sintesi enzimatica. Tale processo viene eseguito impiegando una proteina purificata od una frazione proteica che la contiene e consente di ottenere un acido ialuronico esente da contaminanti quali proteine, virus ed altre impurezze normalmente presenti in tale polimero secondo i processi di estrazione noti.La presente invenzione comprende altresì l'impiego di frazioni di acido ialuronico, ottenuto secondo il procedimento descritto, per la preparazione di composizioni farmaceutiche da impiegarsi in campo medico - sanitario.
Description
Descrizione di una invenzione industriale dal titolo: "PROCESSO PER LA PREPARAZIONE DI ACIDO IALURONICO MEDIANTE SINTESI ENZIMATICA E RELATIVE COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE"
OGGETTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive un processo per la preparazione di acido ialuronico mediante sintesi enzimatica. Tale processo viene eseguito impiegando una proteina purificata od una frazione proteica che la contiene.
DESCRIZIONE DELLO STATO DELL'ARTE
L’acido ialuronico (HA) è un glicosaminoglicano lineare composto da subunità disaccaridiche ripetitive unite da legami fi (1-4). Ogni subunità è formata da acido glucuronico ed N-acetilglucosamina collegati tramite legame β(l-3). Come componente ubiquitario della matrice extracellulare, l'ΗΑ svolge molte funzioni importanti sia nell’uomo che nell’animale . Esso gioca un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula, nella differenziazione e nella migrazione cellulare e nel riparo tìssutale. In relazione al peso molecolare dell'HA, questi effetti possono essere di stimolo o di inibizione. E' stato dimostrato che oligosaccaridi di HA costituiti da 6-20 monosaccaridi sono angiogenici, stimolano e dirigono la risposta migratoria delle cellule endoteliali, stimolano la proliferazione endoteliale (West, D. C. e Kumar, S., in 'The biology of Hyaluronan" Ciba Foundation Symposium 143: 187-207, 1989), inibiscono la formazione di aggregati di cellule precartilaginee durante la condriogenesi e l’assemblaggio di matrici pericellulari di cellule di cresta neurale in migrazione (Knudson, C. B. e Knudson, W . FASEB J., 7: 1233-1241, 1993). Fino ad ora gli oligosaccaridi di HA sono stati preparati tramite digestione con Ialuronidasi di HA ad alto peso molecolare e frazionamento con tecniche cromatografiche standard come quella descritta da West, D. C. e Kumar, S. Exp. Celi Res., 183: 176-196, 1989 e EP 88 305255.7. In base ai metodi conosciuti, si possono isolare solo oligosaccaridi di HA con pesi molecolari compresi tra 2-4 kDa, quindi altamente polidispersi, e non è possibile decidere in anticipo quali sono le unità saccaridiche di inizio e di termine.
Come conseguenza delle propietà descritte sopra e di altre proprietà interessanti, come l’alta viscosità e la biocompatibilità, l'ΗΑ viene ampiamente utilizzato nelle industrie farmaceutiche e sanitarie.
Fino ad oggi questo polimero era comunemente ottenuto per purificazione da fonte animale, come le creste di gallo. Recentemente si è manifestato un maggiore impegno per l'utilizzazione di streptococchi di gruppo A e C come fonte alternativa di HA. La molecola di HA prodotta da questi batteri è chimicamente identica a quella ottenuta dai tessuti animali. Queste fonti di materiale grezzo presentano tuttavia alcuni svantaggi, come quella di offrire rese limitate, in quanto la purificazione di questo polimero ad alto peso molecolare è ostacolata dalla tendenza dell'HA a formare complessi con altre molecole, incluse le proteine. La possibilità quindi- di sintetizzare HA in-vitro fornirebbe certamente dei vantaggi rispetto alle fonti di HA attualmente disponibili.
Sono stati fatti inoltre molti tentativi per isolare e studiare la forma attiva dell'acido ialuronico sintasi (HAS). Recentemente il gene che codifica per ΓΗΑ sintasi è stato clonato da streptococco (De Angelis et al., J.Biol.Chem., 268: 19181-19184, 1993).
Tuttavia da studi precedenti non è chiaro se esista realmente la possibilità di purificare l'acido ialuronico sintasi o di determinare precisamente le caratteristiche chimico-fisiche dell'acido ialuronico prodotto.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE.
La possibilità di isolare quantità sufficienti di HAS attiva altamente purificata permette lo sviluppo di un metodo sintetico efficiente per la produzione in-vitro di HA. L’HA prodotto da tale sistema offre notevoli vantaggi rispetto ai prodotti attualmente disponibili che provengono da fonti animali o batteriche.
Per esempio, utilizzando una HAS immobilizzata, é possibile produrre un HA libero da quantità significative di proteine contaminanti o agenti infettivi. Variando poi i tempi e/o le condizioni di reazione é possibile stabilire il peso molecolare del polimero che si vuole ottenere, permettendo quindi la sintesi di HA a determinati pesi molecolari per applicazioni specifiche. La possibilità di mettere a punto condizioni di reazione sincronizzate consente di controllare la polidispersità del peso molecolare, ottenendo così un prodotto molto più omogeneo.
Inoltre, impiegando una HAS immobilizzata, è possibile produrre oligosaccaridi di HA a peso molecolare definito: incubando l'enzima immobilizzato in modo alternato con gli UDP-precursori, UDP-addo glucuronico (UDP-GlcA) e UDP-N-acetilglucosamina (UDP-NAcGlc) é possibile determinare il peso molecolare degli oligosaccaridi di HA.
Scopo principale della presente invenzione è di fornire pertanto un valido processo che consenta di ottenere un acido ialuronico esente da contaminanti quali proteine, virus ed altre impurezze, normalmente presenti in tale polimero secondo i processi di estrazione ad oggi noti. Scopo della presente invenzione é altresì quello di fornire un metodo che permetta di isolare e purificare una proteina o una frazione proteica con attività sintetica per l'acido ialuronico (HAS) ed un metodo per immobilizzare l'HAS.
La presente invenzione descrive quindi un metodo per la preparazione di acido ialuronico (HA) a diversi pesi molecolari caratterizzato dalle seguenti fasi:
a) l'incubazione degli UDP-precursori UDP-GlcA e UDP-NAcGlc con tale HAS, o HAS immobilizzata, sotto condizioni idonee alla sintesi di acido ialuronico; e
b) il riciclo degli UDP-precursori dall'UDP rilasciato durante la reazione di polimerizzazione; e
c) il recupero dell'acido ialuronico, dove il peso molecolare di tale acido ialuronico possa essere controllato variando i tempi di reazione e/o le condizioni di reazione in cui l'UDP-GlcA e l'UDP-NAcGlc sono incubati in presenza di HAS o HAS immobilizzata.
L'invenzione descrive poi un metodo per il riciclo degli UDP-precursori (UDP-GlcA e UDP-NAcGlc) da UDP e glucosio-l-fosfato (Glc-l-P) ed N-acetil-glucosamina-l-fosfato (NAcGlc-l-P).
Infine, viene descritto nella presente invenzione un metodo per la produzione di oligosaccaridi di acido ialuronico a peso molecolare definito, caratterizzato da:
a) reazioni in alternanza degli UDP-precursori (UDP-GlcA e UDP-NAcGlc) con l’HAS immobilizzata, in condizioni di reazione convenienti; e
b) recupero degli oligosaccaridi di acido ialuronico, dove il peso molecolare di tali oligosaccaridi di acido ialuronico possa essere determinato variando il numero di ccli di reazione di UDP-GlcA e UDP-NAcGlc con l'HAS. Inoltre, le unità di inizio e di termine dell'oligosaccaride di addo ialuronico possono essere stabilite in anticipo, incubando l'HAS immobilizzata prima con UDP-GlcA o con UDP-NAcGlc ed in ultimo con UDP-GlcA o UDP-NAcGlc.
ESEMPI DI PREPARAZIONE
Esempio 1 - Isolamento e purificazione dell’HAS
Al fine di ottenere la sintesi in-vitro dell'HA e sfruttare i vantaggi dei processi descritti in precedenza, è necessario sviluppare un metodo veloce e semplice per la purificazione dell’HAS attiva. Per purificare l'HAS attiva possono essere utilizzati diversi approcci, come ad esempio la separazione di fase o la cromatografia di affinità, etc.
L'HAS può essere purificata procedendo in accordo al seguente protocollo:
1. Il ceppo Streptococcus equisimilis D181 (o altre cellule in grado di produrre l’HAS, come specie correlate al gruppo A e C di Lancefield, cellule eucariote, o organismi ricombinanti che esprimano l’HAS) viene fatto crescere in un volume desiderato di terreno Todd-Hewitt, o qualsiasi altro terreno nutriente, ad una temperatura compresa tra i 30°C e i 40°C, e preferibilmente a 37°C, fino ad una OD600nm finale maggiore di 0.01, e preferibilmente di circa 0.5. Un'ora prima di raccogliere le cellule, si aggiunge alla coltura in crescita una quantità di ialuronidasi sufficiente a degradare l'ΗΑ prodotto e facilitare così la raccolta delle cellule.
2. Le cellule vengono raccolte per centrifugazione, lavate una volta con un tampone appropriato, come un tampone salino standardizzato freddo (PBS), e risospese in un volume finale compreso tra 1 e 100 mi, preferibilmente 20 mi, di PBS freddo contenente approssimativamente ImM ditiotreitolo (DTT),
3. Questa sospensione viene trattata mediante delle procedure atte a causare la distruzione delle cellule, come la sonicazione a 0°C, in condizioni tali da assicurare la completa distruzione delle cellule pur minimizzando l'inattivazione dell'enzima. Possono essere utilizzate diverse condizioni di sonicazione, ma quella che si è rivelata la più adatta richiede 15 min a 120 watt. In assenza di specifiche diverse, le operazioni seguenti vengono eseguite a 4°C.
4. I detriti cellulari vengono rimossi per centrifugazione e il supematante è sottoposto ad ultracentrifugazione in condizioni tali da far sedimentare le membrane batteriche, preferibilmente a 100,000xg per 30 min.
5. Il sedimento, che contiene le membrane cellulari, viene risospeso tramite sonicazione in condizioni leggere, per esempio 30 sec. a 20 watt, in un piccolo volume di tampone Tris-malonato 50 mM, o qualsiasi altro tampone adatto, contenente approssimativamente 1 mM DTT. Si determina quindi la concentrazione proteica, e la sospensione viene diluita nello stesso tampone ad una concentrazione proteica finale compresa tra 1 e 10 mg/ml, preferibilmente 3 mg/ml.
6. Viene quindi aggiunto al campione proveniente dal punto 5. un detergente leggero, come la digitonina, ad una concentrazione finale compresa tra 0.5 e 2%, preferibilmente 1%. La sospensione viene lasciata in agitazione per circa 1 ora a 0°C e sottoposta quindi ad ultracentrifugazione, al fine di separare frammenti di membrana, a 100,000xg per 30 min. o in condizioni simili.
7. Per separare la sintasi dalla fase del detergente, possono essere utilizzate una serie di strategie, ma quella preferita è la procedura descritta da Parish et al, (Anal. Biochem., 156: 594-502, 1986), dove la separazione di fase è raggiunta in certi detergenti tramite l'aggiunta di glicol polietilenico (PEG) 6000. Per assicurarsi che la sintasi si separi all'interno della fase acquosa, la proteina può essere "caricata" con HA di nuova sintesi, al fine di incrementare la sua affinità per la fase acquosa.
A questo scopo vengono aggiunti a 5 mi del supernatante proveniente dal punto 6. i seguenti composti: tra 0.2 e 5 ml di una soluzione di PEG 6000 al 50%, preferibilmente 1 mi; 0.05 mi di una soluzione di MgCl2 1 M, tra 0.5 e 5 mg di UDP-N-acetilglucosamina e UDP-acido glucuronico, preferibilmente 2 mg di ognuno. La miscela viene quindi incubata in condizioni tali da favorire la sintesi di HA, per esempio a 37°C per 30 min., ed in seguito viene rapidamente raffreddata a 0°C in un bagno di sale freddo. Si aggiunge un'ulteriore aliquota di PEG 6000 al 50% (1 mi), e si passa la soluzione sul vortex. Questa assumerà un aspetto torbido, indicando che è avvenuta la separazione di fase. La sospensione viene sottoposta nuovamente ad ultracentrifugazione, per esempio a 100,000xg per 30 min a 4°C.
8. Per separare l'HAS attiva da detta miscela si possono utilizzare una serie di approcci, inclusa la cromatografia a fase inversa, come ad esempio l'HPLC. Preferibilmente, il supernatante viene sottoposto ad una colonna HPLC a scambio ionico, come una Waters DEAE-protein Pak 5WP (7.5 cm x 7.5 mm), che sia stata precedentemente equilibrata con un tampone idoneo, come il tampone Tris-malonato 50 mM, pH 7.0, contenente una quantità, opportuna di detergente, come la digitonina, ad una concentrazione finale compresa tra 0.01% e 1%, preferibilmente 0.5%. Il campione viene iniettato nella colonna ad un flusso desiderato, preferibilmente ad un flusso di 1 ml/min.
Dopo il caricamento del supernatante, la colonna viene lavata con il tampone di partenza, e le proteine possono essere eluite incrementando progressivamente la concentrazione salina del tampone, per esempio da 0 M a 0.5 M NaCl in 30 min., con un flusso costante di 1 ml/min. Si possono raccogliere frazioni del volume desiderato; è consigliabile un volume di 1 mi.
9. Per identificare le frazioni contenenti l'HAS attiva, vengono eseguite una serie di analisi a carico di ogni singola frazione. Queste includono: assorbanza a 280 nm, conduttività e attività dell'HAS determinata utilizzando precursori marcati , come descritto da Prehm (Biochem. J., 211: 181-189, 1983). Per poter associare l'attività dell'HAS ad una data proteina o frazione proteica, il profilo proteico di ogni frazione può essere analizzato tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide, in seguito alla precipitazione delle proteine da un volume specifico di ogni frazione, per esempio 200 μl, tramite una tecnica standard, come quella descritta da Wessel e Flugge (Anal. Biochem., 138: 141-143, 1984).
Il risultato di un esperimento di purificazione é mostrato in Fig. 1. Il picco di attività dell'HAS cade nelle frazioni contenenti una proteina sostanzialmente pura di approssimativamente 42 kDa, che corrisponde all'HAS sopracitata.
Questi risultati dimostrano che la proteina di 42 kDa costituisce la sintasi attiva, e ciò è sufficiente a consentire la sintesi in-vitro di HA avente caratteristiche superiori all'HA isolato attualmente da fonti animali o batteriche.
Esempio 2 - Immobilizzazione di una HAS isolata e purificata
Tale HAS può essere immobilizzata su dei supporti solidi (matrici), come quelli descritti da Scouten (Meth. Enzym., 135: 30-65, 1987), e utilizzata per la sintesi in- vitro dell'HA.
Un protocollo tipico è il seguente:
1. In un recipiente di reazione del volume desiderato, si diluisce l'HAS isolata e purificata in un "coupling" tampone, come NaHCO3 tampone (0.1 M, pH 8.3) contenente NaCl (0.5 M), o qualsiasi altro tampone adatto.
2. La soluzione proveniente dal punto 1. viene miscelata ad un supporto, come Sepharose 4B CNBr-attivata (Pharmacia), che sia stato precedentemente lavato con HC1 1 mM (200 mi per 1 g di detto supporto), o qualsiasi altro supporto adatto, ed incubato in condizioni opportune al fine di accoppiare l'HAS al supporto, per esempio 16 ore a 4°C usando un agitatore rotante o apparecchi simili.
3. Il supporto proveniente dal punto 2. viene trasferito in una soluzione contenente un agente bloccante come l'etanolammina 1 M o la glicina 0.2 M o qualsiasi altro agente bloccante opportuno, e incubato in condizioni atte a bloccare i gruppi attivi residui, per esempio 2 ore a temperatura ambiente.
4. Il supporto proveniente dal punto 3. viene lavato a temperatura ambiente con il "coupling" tampone, o con qualsiasi altro tampone adatto, per pulirlo da qualsiasi eccesso proteico e dall'agente bloccante.
5. Il suppurto proveniente dal punto 4. viene conservato in una soluzione di mantenimento a 4°C, come PBS o qualsiasi altra soluzione di conservazione.
Esempio 3 - Produzione in-vitro di acido ialuronico di diversi pesi molecolari utilizzando l'HAS o l'HAS immobilizzata E' possibile sintetizzare acido ialuronico di differenti pesi molecolari per diverse applicazioni, utilizzando HAS purificata o HAS purificata ed immobilizzata.
Un protocollo tipico è il seguente:
1. In un recipiente di reazione del volume desiderato, l'HAS purificata o l'HAS purificata ed immobilizzata vengono diluite in tampone fosfato 100 mM o qualsiasi altro tampone idoneo ad una concentrazione proteica finale compresa tra 0.01 e 1.0 mg/ml, preferibilmente 0.1 mg/ml. Si aggiungono alla soluzione ditiotreitolo ad una concentrazione finale di circa 1 mM, MgCl2 ad una concentrazione finale di circa 10 mM, UDP-GlcA e UDP-NAcGlc entrambi a concentrazioni comprese tra 0.01 e 5 mM, preferibilmente 1 mM.
2. La miscela viene quindi incubata ad una temperatura compresa tra i 30°C e i 40°C, preferibilmente 37°C, per un periodo sufficiente a favorire la sintesi di HA, e sottoposta in seguito a gel filtrazione su di una colonna Sephadex G-25 o su di una qualsiasi altra colonna adatta. L'HA viene eluito con PBS o con qualsiasi altro tampone idoneo.
3. Per identificare il peso molecolare dell'HA prodotto negli stadi 1. e 2. si possono utilizzare dei precursori marcati, come descritto da Prehm (Biochem. J., 211: 181-189, 1983). In alternativa, 1ΉΑ prodotto può essere analizzato tramite SDS-PAGE, come descritto da Moller et al. (Anal. Biochem. 209: 169-175, 1993).
Il peso molecolare dell'HA sintetizzato in-vitro mediante l'impiego della HAS, può essere variato modificando i periodi di incubazione e/ o le condizioni di reazione. Le condizioni di reazione che possono essere variate per influenzare il peso molecolare del prodotto finale di HA includono, ma non sono limitate, a pH, temperatura, tempo etc. Il pH può essere variato tra 4.2 e 8.9; una diminuzione del pH porta ad una diminuzione del peso molecolare dell'HA. Rispetto agli effetti della temperatura, essa può essere variata tra i 10°C e i 40°C; una diminuizione della temperatura porta ad una diminuzione del peso molecolare dell'HA prodotto. L'intervallo di variazione per i tempi è compreso tra i 5 e i 90 min.; una diminuzione del tempo di incubazione porta ad una diminuzione del peso molecolare dell'HA prodotto.
Esempio 4 -Produzione di oligosaccaridi di HA a peso molecolare definito
E' possibile sintetizzare oligosaccaridi di acido ialuronico di peso molecolare definito e con determinate unità saccaridiche di inizio e di termine utilizzando l'HAS immobilizzata e gli UDP-precursori UDP-GlcA e UDP-NAcGlc (A o B). A seconda del tipo di unità saccaridica desiderata per l'inizio (il termine), il primo (l'ultimo) stadio di reazione viene avviato (terminato) con uno dei due UDP-precursori. Il peso molecolare dell'oligosaccaride di acido ialuronico può essere determinato variando il numero di volte in cui l'HAS immobilizzata viene incubata con UDP-GlcA o UDP-NAcGlc.
Un protocollo tipico è il seguente:
1. In un recipiente di reazione del volume desiderato, si diluisce l'HAS immobilizzata in un tampone fosfato 100 mM o in un qualsiasi altro tampone idoneo ad una concentrazione finale compresa tra 0.1 e 10.0 mg/ml, preferibilmente 1.0 mg/ml. Si aggiunge a tale sospensione ditiotreitolo ad una concentrazione finale di circa 1 mM e MgCl2 aduna concentrazione finale di circa 10 mM. Inoltre si aggiunge alla sospensione un UDP-precursore (A) ad una concentrazione finale compresa tra 0.01 e 5 mM, preferibilmente 1 mM.
2. La miscela viene incubata in condizioni opportune, per esempio a 25 °C per 5 min.
3. La miscela proveniente dallo stadio 2. viene lavata con PBS, o qualsiasi altro tampone adatto, Su di un filtro di vetro a setto poroso (porosità: per esempio G3), e viene recuperata la matrice.
4. La matrice recuperata viene risospesa in tampone fosfato 100 mM, o qualsiasi altro tampone adatto, ad una concentrazione proteica finale compresa tra 0.1 e 10.0 mg/ml, preferibilmente 1.0 mg/ml. A questa sospensione vengono aggiunti ditiotreitolo, ad una concentrazione finale di circa 1 mM, e MgCl2 ad una concentrazione finale di circa 10 mM. Infine viene aggiunto l’UDP-precursore (B) ad una concentrazione finale compresa tra 0.01 e 5 mM, preferibilmente 1 mM.
5. I cicli successivi di incubazione, lavaggio, recupero e risospensione sono uguali a quelli descritti negli stadi 2., 3., e 4., ma gli UDP-precursori (A e B) vengono alternati ad ogni ciclo.
6. Una volta raggiunto il numero di deli desiderato, la miscela proveniente dallo stadio 2. viene lavata con PBS, o qualsiasi altro tampone idoneo, su di un filtro di vetro a setto poroso (porosità: per esempio G3), e la matrice recuperata.
7. La matrice viene risospesa ed incubata in una soluzione ad alto sale, al fine di permettere il rilascio della catena oligosaccaridica di addo ialuronico dall'HAS immobilizzata, per esempio in NaCl 1 M per 30 min. a 25°C. La matrice viene quindi nuovamente lavata su di un filtro di vetro a setto poroso.
8. Il filtrato è sottoposto a gel filtrazione su di una colonna Sephadex G-25 o su di una qualsiasi altra colonna adatta. L’HA viene eluito con PBS o con un qualsiasi altro tampone adatto.
9. Per determinare il peso molecolare degli oligosaccaridi di HA prodotti eseguendo i metodi descritti dal punto 1. al punto 8., si possono utilizzare dei precursori marcati, come descritto da Prehm (Biochem. J.
211: 181-189, 1983). In alternativa, ΓΗΑ prodotto può essere analizzato tramite SDS-PAGE, come descritto da Moller et al. (Anal. Biochem., 209: 169-175, 1993).
Esempio 5 -Riciclo di UDP-acido glucuronico e UDP-N-acetilglucosamina durante la produzione in-vitro di addo ialuronico Gli UDP-precursori, UDP-addo glucuronico (UDP-GlcA) e UDP-N-acetilglucosamina (UDP-NAcGlcA), utilizzati per la sintesi in-vitro, possono essere riddati enzimaticamente partendo da glucosio-l-fosfato (Glc-l-P) e N-acetilglucosamina-l-fosfato (NAcGlc-l-P), fosfoenolpiruvato (PEP) e quantità catalitiche di NAD+ e UDP. Metodi simili sono stati descritti da Ichikawa et al. (Anal. Biochem., 202: 215-238, 1992), Hindsgaul et al. (Enzymes in Carbohydrate Synthesis, ACS Symposium Series 466: 38-50, 1991), e Gygax et al. (Tetrahedron, 47: 5119-5122, 1991).
Un protocollo tipico è il seguente:
1. In un recipiente di reazione del volume desiderato, si diluisce in un tampone adatto l'HAS purificata o l’HAS purificata ed immobilizzata, per esempio 100 mM HEPES tampone, pH 7.5.
2. Alla soluzione proveniente dallo stadio 1. vengono aggiunti i seguenti reagenti alle concentrazioni approssimative indicate di seguito: DTT (da 0.1 a 5 mM, preferibilmente 1 mM), MgCl2 (da 0.1 M a 5 mM, preferibilmente 10 mM), MnCl2 (da 0.25 M a l mM, preferibilmente 2.5 mM), KC1 (da 0.1 M a 5 mM, preferibilmente 10 mM), UDP (da 0.2 a 10 mM, preferibilmente 2 mM), NAD+ e NADH+ (ognuno da 0.1 a 10 mM, preferibilmente 1 mM), Glc-l-P e NAcGlc-l-P (ognuno da 2 mM a 100 mM, preferibilmente 20 mM), piruvato kinasi (PK) e lattato deidrogenasi (LDH) (ognuno da 10 a 1000 Unità/ml, preferibilmente 100 Unità/ml), pirofosforilasi inorganica (PPase) (da 1.2 a 120 Unità/ml, preferibilmente 12 Unità/ml), UDP-Glc pirofosforilasi, UDP-GlcNAc pirofosforilasi, e UDP-Glc deidrogenasi (ognuno da 0.1 a 10 Unità/ml, preferibilmente 1 Unità/ml).
3. La soluzione proveniente dallo stadio 2. viene incubata in condizioni di reazione adatte, preferibilmente per 48 ore a 25°C, al fine di minimizzare l'ossidazione dei componenti di reazione, preferibilmente in condizione anaerobiche, per esempio sotto argon.
4. La soluzione proveniente dallo stadio 3. è sottoposta a gel filtrazione su di una colonna Sephadex G-25, o si di una qualsiasi altra colonna adatta. L'HA viene eluito con PBS o con qualsiasi altro tampone adatto.
5. Per determinare il peso molecolare dell'HA prodotto seguendo i punti 1., 2., 3. possono essere utilizzati dei precursori marcati, come decritto da Prehm (Biochem. J., 211: 181-189, 1983). In alternativa, l’HA prodotto può essere analizzato tramite SDS-PAGE, come descritto da Moller et al. (Anal. Biochem., 209: 169-175, 1993).
L'HA prodotto possiede in questo modo tutte le caratteristiche necessarie per essere vantaggiosamente utilizzato in applicazioni farmaceutiche ed altre applicazioni correlate, in quanto esso risulta estremamente puro, se confrontato con acido ialuronico purificato da fonti convenzionali, ed esente da quantità significative di proteine contaminanti, sostanze pirogene o infiammatorie, o virus.
COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE
Le composizioni farmaceutiche contenenti una quantità efficace di acido ialuronico preparato secondo la presente invenzione, da solo o in associazione ad uno o più principi attivi ed a eccipienti farmacologicamente accettabili, possono essere vantaggiosamente impiegate in campo medico-farmaceutico, come ad esempio in oftalmologia, nel settore della riparazione tessutale ed in reumatologia. Queste composizioni farmaceutiche possono essere adatte ad una somministrazione per via topica, intra-articolare, oftalmica e sistemica. Per la via di somministrazione topica ed intra-articolare possono essere quindi in forma di creme, gel, unguenti e pomate, bende e garze. Per la via oftalmica si possono preparare gel, colliri e lenti. Infine, nel sistemico, possono essere utilizzate forme farmaceutiche adatte ad una somministrazione endovenosa o intramuscolare, come fiale e flaconcini.
La dose da somministrare dipende dai bisogni individuali, dagli effetti desiderati e dalla via di somministrazione.
Essendo l'invenzione così descritta, é chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di addo ialuronico che comprende le seguenti fasi: (a) l'isolamento di una proteina od una frazione proteica (HAS) con attività sintetica per l'acido ialuronico; (b) l'incubazione degli UDP-precursori UDP-GlcA e UDP-NAcGlc con tale proteina; (c) il riddo degli UDP-precursori dall'UDP rilasciato durante la reazione di polimerizzazione; e (d) il recupero dell'addo ialuronico preparato.
- 2. Processo per la preparazione di acido ialuronico secondo la rivendicazione 1 dove i precursori vengono incubati con l'HAS immobilizzata su supporto solido.
- 3. Processo per la preparazione di acido ialuronico che prevede l'ottenimento di un polimero ad un peso molecolare definito e controllato a seconda dei tempi e/o delle condizioni di reazione impiegati nella fase (b) della rivendicazione 1.
- 4. Processo per la preparazione di acido ialuronico secondo la rivendicazione 3, caratterizzato da un peso molecolare dai 50.000 ai 10.000.000 Da.
- 5. Processo per la preparazione di oligosaccaridi di acido ialuronico che comprende le seguenti fasi: (a) l'isolamento di una proteina od una frazione proteica (HAS) con attività sintetica per l'acido ialuronico; (b) l'immobilizzazione della HAS su supporto solido; (c) l'incubazione alternata dei precursori UDP-GlcA e UDP-NAcGlc con l'HAS immobilizzata; (d) il riciclo degli UDP-pr e cursori dall'UDP rilasciato durante la reazione di polimerizzazione; e (e) il recupero degli oligosaccaridi di acido ialuronico.
- 6. Processo per la preparazione di oligosaccaridi di acido ialuronico secondo la rivendicazione 5, che consente di ottenere un polimero ad un peso molecolare definito e controllato a seconda del numero di stadi di reazione impiegati, ovvero il numero di cicli in cui UDP-GlcA e UDP-NAcGlc vengono aggiunti alla miscela di reazione contenente l'HAS immobilizzata.
- 7. Processo per la preparazione di oligosaccaridi di acido ialuronico secondo le rivendicazioni 5-6, caratterizzati da un peso molecolare dai 400 ai 50.000 Da.
- 8. Processo per la preparazione di acido ialuronico secondo le rivendicazioni 1 e 5, in cui l'HAS é isolata da una linea cellulare procariota o eucariota contenente una sequenza di DNA codificante per l'HAS, o una sua variante genetica, in cui tale sequenza di DNA sia esprimibile.
- 9. Frazioni di acido ialuronico ottenute secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzate da una polidispersità del peso molecolare che varia da 1 a 2.
- 10. Frazioni di oligosaccaridi di addo ialuronico ottenute secondo le rivendicazioni 5-7, caratterizzate da una polidispersità del peso molecolare che si attesta intorno all'l.
- 11. Frazioni di acido ialuronico secondo le rivendicazioni 1-10 caratterizzate dall'assenza di quantità significative di proteine contaminanti, sostanze pirogene o infiammatorie o virus.
- 12. Impiego di frazioni di addo ialuronico secondo le rivendicazioni 1-11 per la preparazione di composizioni farmaceutiche in campo medico-sanitario.
- 13. Impiego di composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 12 in oftalmologia, nel settore della riparazione tissutale ed in reumatologia.
- 14. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 13 per la somministrazione topica, intra-articolare, oftalmica e sistemica.
- 15. Impiego di frazioni di acido ialuronico secondo la rivendicazione 12 per la preparazione di biomateriali.
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