KR20010031682A - 히알우로난 합성효소 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소적으로 활성인 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소(seHAS)를 암호화하는 코딩 영역 절편을 갖는 핵산 절편, 및 히알우로네이트 합성효소와 그의 히알우론산 산물을 생성하는 재조합 세포의 제조에 있어서 상기 핵산 절편의 용도에 관한 것이다. 히알우로네이트는 히알우론산 또는 히알우로난으로도 알려져 있다.

Description

히알우로난 합성효소 유전자 및 그의 용도{Hyaluronan synthase gene and uses thereof}

연쇄상구균(스트렙토코커스) 감염의 발생은 세계 각국, 특히 개발도상국에서 주요한 위생 및 경제적 문제이다. 그 이유의 하나는 연쇄상구균 세균이 체내의 식작용 세포, 즉 거식세포와 다핵백혈구(PMN)에 의해 탐지됨없이 성장할 수 있기 때문이다. 상기 (식작용) 세포는 외래 미생물을 인식하여 삼키는데 관여한다. 세균이 이러한 통제를 피하는 한가지 효과적인 방법은 세균 자신을 히알우론산(HA) 캡슐과 같은 다당류 캡슐로 감싸는 것이다. HA의 구조는 원핵생물과 진핵생물 모두에서 동일하다. HA는 일반적으로 비면역원성이므로, 캡슐화된 세균은 면역반응을 유발하지 않을 것이므로 분해 대상으로되지 않는다. 또한, 상기 캡슐은 시험관내에서 PMN에 대한 항식세포 효과를 발휘하여 연쇄상구균이 대식세포에 부착되는 것을 방지한다. 바로 이 때문에 그룹 A 및 그룹 C 연쇄상구균에서, HA 캡슐은 천연 및 실험적 감염에서 주요한 독성 인자이다. 그룹 A 연쇄상구균은 인두염, 농가진, 깊은 조직 감염, 류마티스 열 및 독성 충격 유사 증후군과 같은 다수의 인간 질병에 관여한다. 그룹 C 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis)는 골수염, 인두염, 뇌 종기 및 폐렴에 관여한다.

구조적으로, HA는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 글루쿠론산 (GlcA)으로 구성된 이당류 반복 단위의 고분자량 직쇄 다당류이다. HA 분자중의 반복 이당류의 개수는 30,000을 초과하며, M_r〉 10⁷이다. HA는 포유동물과 세균 세포, 특히 그룹 A 및 C 연쇄상구균 및 타입 A 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida) 모두에 의해 합성되는 유일한 글리코사미노글리칸이다. 이들 균주는 HA를 만들어 HA 캡슐 뿐만 아니라 배지로 분비한다. 이들 세균이 HA를 합성하는 메카니즘은 의학적 관점에서 아주 중요한데, 이는 HA 캡슐의 제조가 연쇄상구균이 면역계에 의한 통제를 피하는 매우 효과적이고 영리한 방식이기 때문이다.

HA는 플라즈마 막에 위치하는 히알우로네이트 합성효소에 의해 포유동물과 세균 세포에 의해 합성된다. 이들 생물에서의 HA의 합성은 다단계 공정인 것으로 생각된다. 합성의 개시는 초기 전구체인 UDP-GlcNAc 또는 UDP-GlcA의 결합을 포함한다. 이어 2개의 당을 성장하는 올리고당쇄에 교대로 부가하는 것을 포함하는 사슬연장을 실시한다. 성장하는 중합체는 세포의 플라즈마 막 영역을 통하여 압출되어 세포외 공간으로 보내진다. 상기 HA 생합성 계는 연구된 제1 막 헤테로다당류 합성 경로의 하나이지만, HA 합성 메카니즘은 아직까지 잘 이해되지 않고 있다. 이것은 지금까지 개발된 생체외 계는 HA의 신규 합성이 달성되지 않아 부적합하기 때문이라고 할 수 있다.

HA 중합체 성장 방향은 당업자 사이에 여전히 의견이 일치되지않는 문제이다. 단당류의 부가는 성장하는 HA쇄의 환원성 또는 비환원성 말단에 부가될 수 있다. 또한 (i) 인접한 사슬이 단백질, UDP 또는 지질 중간체에 공유결합으로 연결되는지 여부, (ii) 사슬이 프라이머를 사용하여 개시되는지 여부, 그리고 (iii) 성숙 중합체가 연쇄상구균의 플라즈마 막을 통하여 압출되는 메카니즘에 대한 의문이 여전히 존재하고 있다. HA 생합성 메카니즘을 이해한다면, 상기 공정을 방해함으로써 연쇄상구균 및 파스투렐라 감염을 제어하기 위한 대안적 방법의 개발이 가능하게될 것이다.

HA는 척추동물의 실질적으로 모든 조직에서 확인되고 있으며 다양한 임상 분야에서 광범위하게 이용되고 있고, 특히 관절내 매트릭스 보충 및 눈 수술에서 그 이용이 현저하다. 과학 문헌에 의하면, HA가 주로 일부 연결 조직의 매트릭스 및 세균의 특정 균주의 캡슐에서 화합하기 어려운 구조 성분이라는 애초의 인식에서부터 도처에 있는 거대분자가 많은 생물학적 공정에 역동적으로 관여한다는 인식; 배발생하는 동안 세포가 이동 및 분화되는 것을 조절한다는 인식에서부터 전이, 상처 치료 및 감염의 복잡한 과정에서 중요한 역할을 하는 세포외 매트릭스 조직 및 대사를 조절한다는 인식으로 전환되고 있음을 보여준다. 또한 HA는 대사적으로 활성이 높고 또 세포가 HA의 합성과 이화작용 과정에 관심을 집중한다는 것은 점점 더 분명해지고 있다. 예컨대 조직에서 HA의 반감기는 연골에서 1 내지 3주에서부터 표피에서 1일 이하이다.

현재 단일 단백질이 당 기질을 이용하여 HA를 합성하는 것은 분명하다. HA 합성효소를 지칭하는 약어 HAS는 상기 유형의 효소를 지칭하는 것으로 널리 지지되고 있다. 마르코비츠 일행은 화농연쇄상구균으로부터 HAS 활성을 성공적으로 특징화하고 이 효소의 막 위치 및 당 뉴클레오티드 전구체와 Mg²⁺를 필요로하는 것을 발견하였다. 프렘(Prehm)은 B6 세포에 의해 제조된 성장되는 HA를 배지에 부가된 히알우로니다제에 의해 분해할 수 있다는 것을 발견하고 HA가 플라즈마 막에 존재한다고 제안하였다. 필립슨과 슈바르츠는 또한 HAS 활성은 마우스의 핍돌기 교종세포(oligodendroglioma cell)에서 플라즈마 막 마커와 공동분획처리된다고 나타내었다.

HAS는 글리코사미노글리칸 합성이 진행됨에 따라 막을 통하여 세포외 공간으로 동시에 압출되는 높은 M_r HA를 모은다(또는 세균의 경우, 세포 캡슐을 제조한다). 이러한 생합성 모드는 핵산, 단백질과 지질은 핵, 소포제/골지체, 세포질 또는 미토콘드리아에서 합성되기 때문에 거대분자중에서 아주 독특한 것이다. 성장하는 사슬을 세포외 공간으로 압출하는 것은 또한 무연결식 중합체 성장을 가능하게함으로써 아주 큰 HA를 형성하는 반면, 합성을 골지체 또는 후-골지체 분획내로 한정한다면 형성될 중합체의 전체 양 또는 길이를 제한할 수 있다. 한정된 관강내에서의 고농도 HA는 다른 기관 작용에 나쁜 영향을 줄 수 있는 높은 점도 환경을 만들 수 있다.

진핵 세포로부터 뿐만 아니라 HA의 캡슐 피복을 만드는 연쇄상구균 균주로부터 HAS를 용해시키고, 확인하여 정제하려는 몇몇 연구가 시도되었다. 연쇄상구균과 쥐의 핍돌기 교종 효소는 성공적으로 세제 용해됨이 연구되고 있으나, 추가의 연구나 분자 클로닝을 위해 활성 HAS를 정제하려는 노력은 수십년간 성공하지 못하고 있었다. 프렘(Prehm)과 마우솔프(Mausolf)는 과요오드산염-산화된 UDP-GlcA 또는 UDP-GlcNAc를 사용하여 HAS와 공동정제될 연쇄상구균성 막중의 ~52 kDa의 단백질을 친화성 라벨링하였다. 이렇게함으로써 그룹 C 연쇄상구균의 HAS를 클로닝하였다는 보고를 하였는데, 이는 불행히도 잘못된 것이었다. 이 연구는 활성 합성효소의 발현을 제시하지 못했고 실제로는 펩티드 수송체를 클로닝했을 것이다. 트리스코트(Triscott)와 반 데 리진(van de Rijn)은 연쇄상구균의 막으로부터 활성 형태의 HAS를 용해시키기 위해 디지토닌을 사용하였다. 반 데 리진과 드레이크는 42, 33 및 27 kDa의 세 개의 연쇄상구균 막 단백질을 5-아지도-UDP-GlcA와 함께 선택적으로 방사성표지시키고 33-kDa 단백질이 HAS라고 제시하였다. 그러나, 후술한 바와 같이, HAS는 실제로는 42-kDa 단백질인 것으로 드러났다.

이러한 노력에도 불구하고, HA 합성의 조절과 메카니즘을 이해하는데 있어 진척은 거의 정체상태에 있었는데, 이는 HAS mRNA 또는 HAS 단백질에 대한 분자 탐침이 존재하지 않았기 때문이다. 데안젤리스(DeAngelis) 일행이 HasA 단백질을 암호화하는 그룹 A 연쇄상구균 유전자의 분자 클로닝 및 특성을 보고한 1993년에야 주요한 획기적인 진전이 있었다. 상기 유전자는 세균성 HA 합성에 필요한 오페론의 일부인 것으로 알려져 있었으나, 상기 단백질 spHAS (화농연쇄상구균 HAS로 지칭)의 작용은 알려지지 않았다. spHAS는 나중에 HA 사슬 연장에 관여하는 것으로 밝혀졌고 또 확인되고 클로닝되고 성공적으로 발현된 최초의 글리코사미노글리칸 합성효소였다. 상기 화농연쇄상구균 HA 합성 오페론은 2개의 다른 단백질을 코딩한다. HasB는 UDP-글루코오스를 HA 합성을 위한 기질중의 하나인 UDP-GlcA로 전환시키는데 필요한 UDP-글루코오스 탈수소효소이다. HasC는 글루코오스 1-포스페이트와 UTP를 UDP-글루코오스로 전환시키는데 필요한 UDP-글루코오스 파이로포스포릴라제이다. hasA와 hasB 유전자 모두를 무캡슐 연쇄상구균 균주 또는 엔테로커스 파에칼리스(Enteroccus faecalis)에 공동감염시키면 이들에 HA 합성능과 캡슐 형성능을 부여한다. 이로써 HasA는 HA 합성효소라는 첫 번째 강력한 증거가 제공되었다.

손에 잡히지 않던 HA 합성효소 유전자는 마침내 트랜스포손 돌연변이법에 의해 클로닝되었는데, 이 방법은 HA 합성 오페론의 트랜스포손 단절을 함유하는 무캡슐 돌연변이 그룹 A 균주를 창제한다. 이 트랜스포손의 공지 서열은 야생형 세포로부터 확인되어 클로닝될 연쇄상구균 DNA와 접합될 영역을 제공한다. 코딩된 spHAS는 효모 키틴 합성효소군과 5 내지 10% 동일하고 제노푸스 라애비스(Xenopus laevis) 단백질 DG42 (원배형성하는 동안 발생적으로 발현됨)와 30% 동일하며, 이들의 작용은 당시에 알려지지 않고 있었다. 데안젤리스와 와이겔은 대장균에서 활성 재조합 spHAS를 발현시키고 이 단일한 정제 유전자 산물이 UDP-GlcA와 UDP-GlcNAc와 함께 시험관내에서 배양되면 높은 M_rHA를 합성함을 제시하였고, 그에 따라 1959년 처음 제안된 바와 같이, HA 합성에 필요한 글리코실트랜스퍼라제 활성이 동일한 단백질에 의해 촉진됨을 나타내었다. 이것은 HAS가 분명한 동위효소를 암호화하는 다중유전자군이라는 것을 제시하는 4개의 실험실에 의해 1996년 진핵생물 HAS cDNA를 거의 동시에 확인하는 단계를 가능하게했다. 2개의 유전자(HAS1 및 HAS2)를 포유동물(29-34)에서 즉시 발견하였고 제3의 유전자 HAS3은 나중에 발견하였다. 제2 연쇄상구균의 seHAS 또는 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소를 발견하였고, 이것은 본 발명의 명세서와 청구범위에 개시되어 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명자는 그룹 C 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis)로부터 진짜 HAS 유전자(seHAS)를 확인하였고; seHAS 단백질은 spHAS 효소와 높은 상동성(약 70%)을 갖고 있다. 그러나 이 상동성은 seHAS 유전자가 spHAS 유전자와 교차 혼성화하지 않기 때문에 중요하다.

재조합 seHAS를 발현하는 대장균으로부터 제조한 막은 양쪽 기질이 제공되면 HA를 합성한다. 그 결과는 그룹 C HAS를 클로닝했다고 주장한 랜싱 일행의 초기의 보고가 잘못된 것임을 확인시켜준다. 불행히도, 몇 개 연구는 이 특징화되지 않은 52-kDa 연쇄상구균 단백질에 대한 항체를 사용하여 진핵생물 HAS로 생각되는 것을 연구하였다.

이타노(Itano)와 키마타(Kimata)는 돌연변이 마우스 포유동물 발암 세포주에서 발현 클로닝을 이용하였는데, HA는 합성할 수 없었고 제1 추정 포유류 HAS cDNA (mmHAS1)를 클로닝하였다. HA 합성에서 결함을 갖는 서브클로닝은 세 개의 별도의 종류로 나누어지는데, 이들은 체세포 융합 실험에서 HA 합성에 대해 상보적이며, 적어도 3개의 단백질이 필요함을 나타낸다. 이들 종류의 2개는 일부 HA 합성 활성을 유지한 반면, 1개는 활성을 갖고 있지 않았다. 활성을 갖고 있지 않는 세포주는 양친 세포로부터 제조한 cDNA를 사용한 일시적 형질감염 실험에 사용하여 HA 합성 활성이 회복된 단일 단백질을 확인하였다. 서열 분석은 spHAS와 유사한 예상 막 토폴로지를 갖는 약 65 kDa 단백질에 대한 추론된 일차 구조를 제시하였다. mmHAS1은 spHAS와 30% 상동이고 DG42와는 55% 상동이다. 같은 달에 다른 세 그룹은 동일한 마우스와 사람의 효소일 것이라고 초기에 생각되었던 것을 암호화하는 cDNA를 기재한 논문을 제출하였다. 그러나, 아주 특별한 환경을 통하여, 각 네 개 실험실은 양쪽 종에서 별개의 HAS 동위효소를 발견하였다.

이타노와 키마타가 사용한 것과 유사한 작용의 클로닝 방법을 이용하여, 시잔(Shyjan) 일행은 사람의 HAS 1 동족체를 확인하였다. 장간막(腸間膜) 림프절 cDNA 라이브러리를 사용하여 쥐의 점막 T 림프구를 형질감염시킨 다음 로젯(rosette) 분석법으로 이들의 부착능을 조사하였다. 1개 형질전환체의 부착은 공지된 세포 표면 HA-결합 단백질인 CD44에 대한 항혈청에 의해 억제되며 또 히알우로니다제와 전처리하는 것에 의해 직접적으로 제거되었다. 따라서, 상기 형질전환체에 의한 로제팅(rosetting)은 HA의 합성을 필요로하였다. 관련된 cDNA의 클로닝과 서열결정에 의해 hsHAS1을 확인하였다. 이타노와 키마타는 또한 태아 뇌 라이브러리로부터 단리한 인간의 HAS1 cDNA를 보고하였다. 그러나 2개 그룹에 의해 보고된 이 hsHAS1 cDNA는 길이가 상이하며; 이들은 578 또는 543개의 아미노산 단백질을 코딩한다. HAS 활성은 더 긴 형태에서만 나타났다.

진짜 HA 합성효소로서 spHAS 및 DG42, spHAS 및 NodC (리조비움(Rhizobium)에서 β-GlcNAc 트랜스퍼라제 소결절 형성 인자)중에서 비슷한 상동성을 갖는 영역을 분자 수준으로 확인하는 것을 기초로하여, 스파이서(Spicer) 일행은 제2의 분명한 효소(mmHAS2로 표시)를 암호화하는 마우스 배 cDNA를 클로닝하기 위하여 변형 RT-PCR법을 이용하였다. mmHAS2 cDNA를 COS 세포로 형질감염시키는 것은 입자 배제 분석법에 의해 검출된 HA 세포 피복의 신규 제조에 관한 것으로, HAS2 단백질이 HA를 합성할 수 있다는 강한 증거를 제시한다. 이와 유사한 방법을 이용하여, 와타나베와 야마구치는 인간의 태아 뇌 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 hsHAS2를 확인하였다. 풀로프 일행은 독자적으로 유사한 방법을 이용하여 HA를 활발하게 합성하는 난구 세로로부터 분리된 RNA에서 mmHAS2를 확인하였는데, 이는 배란 전기 난포에서 정상 난구 팽창의 중요한 방법이다. 배란 주기 개시 직후, HA 합성 개시전 및 HA 합성 개시 후 (3시간 후) 또는 꽤 시간이 흐른 후(4 시간후)에 마우스로부터 난구세포-난모세포 복합체를 분리하였다. RT-PCR은 HAS2 mRNA가 처음에는 존재하지 않았지만 3-4 시간 후에 다량 나타남을 보여주는데, 이는 HAS2의 전사가 상기 공정에서 HA 합성을 조절함을 의미한다. hsHAS2 모두는 길이가 552 아미노산이고 98% 상동이었다. mmHAS1은 길이가 583 아미노산이고 578개 아미노산 길이를 갖는 hsHAS1과 95% 상동이었다.

가장 최근에 스파이서 일행은 PCR법을 이용하여 포유동물에서 제3의 HAS 유전자를 확인하였다. 이 mmHAS3 단백질은 길이가 554 아미노산이고 mmHAS1, mmHAS2, DG42 및 spHAS와 각각 71, 56 및 28% 상동이었다. 스파이서 일행은 또한 세 개의 인간 및 마우스 유전자가 세 개의 상이한 염색체에 위치함을 알아내었다(HAS 1은 hsChr 19/mmChr17에 상응; HAS2는 hsChr8/mmChr15에 상응; HAS3은 hsChr 16/mmChr8에 상응). 상이한 염색체상에서 세 개의 HAS 유전자가 위치하는 것과 척추동물류 전체를 통하여 HA가 존재하는 것은 이 유전자 군이 오래되었고 척추동물의 진화 초기에 복제에 의해 동위효소가 나타나게되었음을 제시한다. 세균과 진핵생물 HAS 사이에 높은 상동성(~30%)이 존재함은 세균과 진핵생물이 공통의 조상 유전자를 갖고 있음을 제시한다. 아마도 진핵생물 유전자 산물이 더 커지고 더 복잡하게되기 전에 원시 세균이 초기 척추류 조상으로부터의 HAS 유전자를 침범했을 것이다. 다르게는, 세균이 더 큰 척추생물 HAS 유전자를 얻어 효소 활성에 불필요한 조절 서열을 삭제했을 것이다.

다비드와 그의 동료에 의한 X. 라애비스 DG 42의 발견은, 비록 이 단백질이 HA 합성효소인 것으로는 공지되어 있지 않았지만, 상술한 최근의 발달에 상당히 중요한 역할을 하였다. 그럼에도 불구하고, DG42와 spHAS가 30% 상동이라는 것은 포유동물 HAS2의 확인을 가능하게하는 올리고뉴클레오티드 작성에 중요하였다. 그러나 DG42가 진실한 HA 합성효소라는 명확한 증거는, 데안젤리스와 아추탄이 효모(HA를 합성할 수 없는 생물)에서 재조합 단백질을 발현하고 또 분리된 막에 2개의 기질이 제공되면 HA를 합성한다는 것을 제시하였을 때, 포유류 동위효소의 발견 이후에야 보고되었다. 마이어와 크레일은 또한 DG42에 대한 cDNA로 형질감염된 세포로부터 용해산물은 상승된 수준의 HA를 합성함을 나타내었다. 이제 그의 작용이 공지되어 있으므로, DG42는 X1HAS로 지칭한다.

단백질의 아미노 및 카르복시 말단 모두에서 대형 중앙 도메인 및 2-3 트랜스멤브레인 또는 막-결합 도메인 군을 비롯한 모든 HAS 단백질에 의해 공유되는 공통되는 예상 구조적 특징이 있다. 예상되는 세포내 HAS 단백질 서열의 88% 이하를 포함하는 중앙 도메인은 바람직하게는 효소의 촉매 영역을 함유한다. 예상되는 중앙 도메인은 spHAS에서 264개 아미노산 길이(전체 단백질의 63%)이고 진핵생물 HAS 막에서 307-328 잔기(전체 단백질의 54-56%)이다. 막 도메인의 정확한 개수와 방향 그리고 세포외 및 세포내 루프의 토폴로지 구성은 어떤 HAS에 대해서 실험적으로 결정된 바 없다.

spHAS는 정제되고 부분적으로 특징화된 HAS군 멤버이다. spHAS/알칼리성 포스파타제 융합 단백질을 사용한 초기의 연구는 spHAS의 N 말단, C 말단 및 큰 중앙 도메인이 실제로는 세포내에 존재하는 것을 나타낸다. spHAS는 6개의 시스테인을 갖는데, HAS1, HAS2 및 HAS3은 13, 14 및 14 Cys 잔기를 각각 갖는다. spHAS중의 6 Cys 잔기의 2개는 보존되고 HAS1과 HAS2에서 동일하다. 오직 1개의 보존된 Cys 잔기가 모든 HAS 패밀리 멤버에서 동일 위치(spHAS에서 Cys-225)에서 발견되었다. 이것은 술프히드릴 독소에 의한 변형이 부분적으로 효소 활성을 억제하는 필수적인 Cys일 수 있다. 하기에 나타낸 다중 HAS 작용에 필요한 디술피드 결합의 존재 또는 중요한 Cys 잔기의 확인은 HAS군의 어떤 구성원에 대해서도 아직 밝혀지지 않았다.

플라즈마 막에서 제시된 독특한 합성 모드 이외에, HAS 효소군은 HA의 전체 중합에 필요한 다수의 작용에서 아주 예외적이다. HAS 효소내에는 적어도 6개의 별개 활성이 존재한다: 2개의 상이한 당 뉴클레오티드 전구체(UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA) 각각에 대한 결합 부위, 2개의 상이한 글리코실트랜스퍼라제 활성, 성장하는 HA 중합체를 효소에 부착시키는 1개 이상의 결합 부위(B-X₇-B 모티프), 및 성장하는 중합체를 한번에 1개 당을 움직이는 래칫-상(ratchet-like) 전달 반응. 후술한 활성은 막을 통한 중합체의 단계별 연장반응과도 일치한다. 이들 작용 모두 및 기타 아직 알려지지 않은 다른 작용은 419(spHAS) 내지 588(xHAS) 아미노산 크기의 비교적 작은 단백질에 존재한다.

모든 이용가능한 증거는 세균이나 시험관내에서 HA 생합성시 spHAS 단백질만이 필요하다는 결론을 지지하고 있지만, 더 큰 진핵생물 HAS군 멤버는 다성분 복합체의 일부일 수 있다. 진핵생물 HAS 단백질은 spHAS보다 약 40% 더 커기 때문에, 이들의 부가적 단백질 도메인은 세포내 왕래 및 위치측정, 효소 활성의 조절 및 다른 세포 성분과의 상호 작용을 매개하는 것과 같은 보다 정교한 작용에 관여할 수 있다.

상이한 합성효소를 암호화하는 복수의 척추생물류 HAS 유전자가 존재한다는 예상치 못한 발견은 HA가 세포 작용의 조절자로서 중요하고 조직에서 단순한 구조 성분이 아니라는 신생 의견을 강하게 지지한다. 따라서, 6개월도 채 안되어 이 분야는 공지되고 클로닝된 HAS (spHAS)로부터 HA의 합성과 생물학적 이해에 있어서 신속하고, 다수이고 재미있는 미래 진보를 약속하는 다중유전자 군을 인식하기에 이르게되었다.

예컨대, 이후에는 2개의 HAS 유전자의 서열을 기재한다: 하나는 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida)로부터 얻은 서열; 그리고 또 하나는 파라메시움 부르사리아 클로렐라(Paramecium bursaria chlorella) 바이러스 (PBCV-1)로부터 얻은 서열. 이들 2개 계에서 히알우로난 합성효소의 존재 및 이들 2개의 상이한 계로부터 얻은 히알우로난 합성효소의 정제와 용도는 많은 상이한 원핵생물 및 바이러스 공급원중에서 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 핵산 서열을 정제하고 분리할 수 있는 능력을 나타낸다.

그룹 C 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 균주 D181은 히알우론산(HA)을 합성하여 분비한다. 연구자들은 HA의 생합성을 연구하고 또 HA-합성 활성을 2가 양이온 요건, 전구체(UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA) 이용 및 최적 pH 면에서 특징화하기 위해 상기 균주와 S43 및 A111과 같은 그룹 A 화농연쇄상구균 균주를 사용하였다.

전통적으로, HA는 연쇄상구균 배양물로부터 수탉 볏(rooster comb) 또는 세포외 배지로부터 분리하는 것에 의해 상업적으로 제조되고 있다. HA를 제조하기 위해 개발된 한가지 방법은 HA-생산 연쇄상구균 세균의 배양물을 사용하는 것을 포함한다. 미국 특허 제4,517,295호에는 HA-생산 연쇄상구균을 혐기성 조건하, CO₂-풍부 성장 배지에서 발효시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 조건하에서, HA가 제조되며 육즙으로부터 추출될 수 있다. 수탉 볏(rooster comb)으로부터 HA를 분리하는 것은 실험실 규모로 실시되고 어려운 것으로 일반적으로 느껴지는데, 이는 덜 순수한 상태의 HA를 이용하여 실험을 개시하기 때문이다. 수탉 볏으로부터 분리하는 이점은 생산된 HA가 고분자량이라는 것이다. 그러나, 세균성 발효에 의해 HA를 제조하는 것은 고순도의 HA로 개시하기 때문에 더 쉽다. 그러나, 통상 이런 방식으로 제조된 HA의 분자량은 수탉 볏으로부터 제조된 것에 비하여 더 작다. 따라서, 세균성 발효에 의해 고분자량의 HA 제조를 허용하는 수법은 현재의 과정과 비교하여 향상된 것이다.

고분자량의 HA는 화장품에서부터 눈 수술에 이르기까지 광범위하게 유용한 응용범위를 갖는다. 고분자량의 HA의 고 점성 및 고 생체적합성으로 인하여, HA는 특히 눈 수술에서 유리체 액의 대체물로서 유용하다. HA는 또한 고 점성 및 수분을 장시간 동안 보유할 수 있는 그의 이화학적 특성으로 인하여 HA를 관절내 주사하거나, 윤활제로서 쉐이빙 크림이나 다양한 화장품 제품으로 경주용 말의 외상성 관절염을 치료하는데 사용되어 왔다. 실제로, 1997년 8월 미국 식품위생국(US FDA)은 고분자량의 HA를 직접적으로 감염 관절에 주사하는 것을 통하여 심각한 관절염 치료에 고분자량 HA를 사용하는 것을 인가하였다. 일반적으로 분자량이 더 높을수록 더 좋다. 이는 용액에서 개별 HA 중합체 분자의 평균 분자량이 증가함에 따라 HA 용액의 점도가 증가하기 때문이다. 그러나, 10⁷까지에 이르는 고분자량 HA는 현재의 분리 기술로는 얻기가 곤란하였다.

상술한 문제와 기타 난제를 해결하기 위하여, 보다 큰 순도 또는 제조의 용이성과 같은 하나 이상의 향상된 특성을 갖는 HA 제조에 이용될 수 있는 신규한 방법과 구조물이 필요로하게 되었다. 특히 상업적으로 얻을 수 있는 HA에 비하여 비교적 고분자량이고 비교적 순수한 HA를 다량 제조할 수 있는 방법의 개발이 요청되고 있다. 또한 변형된 구조(HA_Δmod)를 갖는 HA 뿐만 아니라 변형된 크기 분포(HA_Δsize)를 갖는 HA 제조방법을 개발할 필요가 있었다.

본 발명은 효소적으로 활성인 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소 (seHAS)를 암호화하는 코딩 영역 절편을 갖는 핵산 절편, 및 히알우로네이트 합성효소 및 그의 히알우론산 산물을 생성하는 재조합 세포의 제조시 상기 핵산 절편의 용도에 관한 것이다. 히알우로네이트는 또한 히알우론산 또는 히알우로난으로 공지되어 있다.

도 1은 seHAS와 spHAS 사이에 교차 혼성화가 일어나지 않는 것을 도시;

도 2는 세균성 및 진핵생물 HAS 단백질에 대한 seHAS의 관계를 도시;

도 3은 일부 공지 히알우로난 합성효소간의 진화 관계를 도시;

도 4는 다양하게 유전자조작된 연쇄상구균의 HAS 효소에 의해 생산된 HA 크기 분포를 도시;

도 5는 대장균에서 재조합 seHAS와 spHAS의 과발현을 도시;

도 6은 연쇄상구균 HA 합성효소의 정제를 도시;

도 7은 효모 막에서 발현된 재조합 연쇄상구균 HAS에 의해 합성된 HA의 겔 여과 분석을 도시;

도 8은 특정 항체를 사용한 재조합 seHAS의 웨스턴 블럿 분석도;

도 9는 재조합 seHAS와 spHAS에 의해 생산된 HA 크기 분포의 동적 분석;

도 10은 seHAS와 예상된 막-관련 영역에 대한 친수성 플럿을 도시;

도 11은 막에서 seHAS의 토폴로지 조직에 대한 그래픽 모델을 도시;

도 12는 재조합 seHAS에 의한 진짜 HA의 합성을 도시;

도 13은 seHAS를 코딩하거나 spHA를 코딩하거나 seHAS와 spHAS를 모두 암호화하는 핵산 서열을 특정 올리고뉴클레오티드 및 PCR을 이용하여 인식하는 것을 도시;

도 14는 특정 PCR 혼성화에 사용되는 올리고뉴클레오티드 도시.

본 발명은 당분야에서 1개 이상의 단점을 해결한다. 재조합 DNA 수법을 이용하여, 효소적으로 활성인 seHAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 개시하고 HAS 및 그의 히알우론산 생성물을 생산하는 재조합 세포의 제조에 상기 핵산 절편을 이용하는 방법뿐만 아니라 효소적으로 활성인 HA 합성효소의 제조방법을 특허청구범위로 하고 있다.

즉, 본 발명의 목적은 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HAS를 발현하는 세균 세포를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HAS와 같은 히알우로네이트 합성효소 유전자로부터 고분자량 및/또는 저분자량 히알우론산을 제조하는 방법 뿐만 아니라 변형된 크기 분포 및/또는 변형된 구조를 갖는 HA의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상술한 목적과 기타 다른 목적은 첨부한 명세서, 청구범위 및 도면을 참조하면 명백히 알 수 있을 것이다.

본 발명은 재조합 DNA 수법을 이용하여 히알우론산 (HA) 제조 분야에서 하나 이상의 문제를 해결하는 것을 포함한다. 상술한 문제는 HA 사슬 생합성에 관여하는 효소인 효소적으로 활성인 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) (seHAS) 히알우로네이트 합성효소 유전자를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 절편을 분리하여 사용하는 것과 관련하여 제기되었다. 적합한 미생물 공급원의 DNA로부터 seHAS 유전자를 클로닝하고, HA 제조용 및 HAS 효소 자체의 다량 제조용으로 유용한 재조합 작성물로 유전자조작하였다.

본 발명은 신규 유전자, seHAS를 포함한다. 상기 유전자의 발현은 식세포작용 및 면역 관리 수단을 제공하는 것에 의해 연쇄상구균 그룹 A 및 그룹 C 균주의 독성과 관련이 있다. 용어 ″히알우론산 합성효소″, ″히알우로네이트 합성효소″, ″히알우로난 합성효소″ 및 ″HA 합성효소″는 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민 당으로 구성된 글루코사미노글리칸 다당류 사슬을 β-1,3- 및 β-1,4-결합으로 중합시키는 효소를 기술하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 용어 ″seHAS″는 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis)로부터 유도된 HAS 효소를 지칭한다.

본 발명은 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민을 중합하여 글루코사미노글리칸 히알우론산으로 만드는데 사용될 수 있는 히알우로네이트 또는 히알우론산 합성효소 유전자, cDNA 및 유전자 산물(HAS)의 분리와 특징화에 관한 것이다. 본 발명은 seHAS 위치를 확인하고 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis)로부터 효소적으로 활성인 seHAS 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 개시하고 있다. 이 HAS 유전자는 또한 세균 시편이 히알우론산을 제조할 수 있는 가능성을 평가하기 위한 새로운 탐침을 제공한다.

이하에 기재된 수법과 지식을 이용함으로써, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람은 seHAS 유전자를 암호화하는 핵산 절편을 얻을 수 있을 것이다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람은 본 발명의 기재내용을 참조한다면 상술한 이점이 seHAS 유전자의 발현을 제어할 수 있고 또 생산된 seHAS 유전사 산물, 즉 seHAS 효소의 성질을 제어할 수 있는 중요한 유용성을 제공한다는 것을 알 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 원핵생물 또는 진핵생물 공급원으로부터 분리하는 것에 관한 것이다. 이것은 효소와 유전자는 진핵생물 및 일부 원핵생물에서 발견되는 것이기 때문에 가능하다. 진핵생물도 또한 HA를 생산하는 것으로 공지되어 있으므로 본 발명에서 적용될 수 있는 HA 합성효소 유전자를 갖고 있다.

본 발명의 HA 합성효소-코딩 핵산 절편은 재조합 DNA 수법에 의해 용이하게 조작될 수 있는 전체 염색체 또는 게놈 DNA가 존재하지 않게 분리되는 것으로 정의된다. 따라서, 본 명세서에서의 ″정제된 핵산 절편″이라는 용어는 관련되지 않은 염색체 또는 게놈 DNA가 존재하지 않게 분리되어 재조합 수법을 실시하기에 유용하게하는 상태로 존재하는 DNA 절편, 불연속하게 분리된 DNA 단편 형태의 DNA 또는 이러한 단편을 포함하는 벡터(예컨대, 플라스미드, 파아지 또는 바이러스)를 지칭한다.

본 발명의 바람직한 구체예는 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편이다. 특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하며 이 정제된 핵산 절편은 서열 1의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있다.

본 발명은 또한 플라스미드, 코스미드, 파아지 또는 바이러스 벡터로 구성된 천연 또는 재조합 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 또한 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함할 수 있다.

특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 재조합 벡터가 플라스미드이면, 발현 벡터를 더 포함할 수 있을 것이다. 발현 벡터는 효소적으로 활성인 HAS 코딩 영역에 작용가능하게 결합된 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 원핵생물 세포와 같은 재조합 숙주 세포를 포함한다. 재조합 벡터는 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함한다. 특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 진핵생물 세포와 같은 재조합 숙주 세포를 포함한다. 특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 개념은 변형된 구조 또는 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 특이하게 변형된 seHAS 유전자를 창제한다.

본 발명은 또한 재조합 벡터를 재조합 숙주 세포에 도입하도록 전기천공된 재조합 숙주 세포를 포함한다. 재조합 벡터는 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함할 수 있다. 특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 효소적으로 활성인 HAS는 변형된 구조 또는 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 본 발명은 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 숙주 세포를 포함한다. 특히, 정제된 핵산 절편은 서열 2의 seHAS를 암호화하거나 또는 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 효소적으로 활성인 HAS는 또한 변형된 구조 또는 변형된 크기 분포를 갖는 히알산 중합체를 생산할 수 있다.

본 발명은 또한 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 폴리펩티드를 포함하고 서열 2에 따른 아미노산 서열을 더 갖는 정제된 조성물을 포함한다.

다른 구체예로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, DNA 시편을 검출하는 방법을 제공한다: (1) DNA 시료를 수득하고; (2) 이 DNA 시료를 서열 1에 따른 정제된 핵산 절편과 접촉시키고; (3) DNA 시료와 정제된 핵산 절편을 혼성처리시킴으로써 혼성된 복합체를 형성하고; 또 (4) 상기 복합체를 검출한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, seHAS를 암호화하는 mRNA를 발현하는 세균성 세포를 검출하는 방법을 포함한다: (1) 세균성 세포 시료를 수득하고; (2) 세균성 세포 시료로부터 얻은 하나 이상의 핵산을 서열 1에 따른 정제 핵산 절편과 접촉시키고; (3) 상기 하나 이상의 핵산과 정제된 핵산 절편을 혼성화시킴으로써 혼성된 복합체를 수득하고; 또 (4) 혼성화된 복합체를 검출하며, 상기 혼성화된 복합체의 존재는 seHAS를 암호화하는 mRNA를 발현하는 세균 균주의 존재를 나타낸다.

본 발명은 또한 세포내에서 seHAS 또는 spHAS의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 특히, 이 방법은 서열 3 내지 8에 기재된 올리고뉴클레오티드를 탐침으로 사용하는 것을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 실험자로 하여금 세포내에서 seHAS 또는 spHAS의 존재를 조사하고 검출할 수 있도록한다.

본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 히알우론산의 제조방법을 포함한다: (1) 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 숙주 생물에 도입하고, 이때 숙주 생물은 UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA를 생산하는 효소를 암호화하는 핵산 절편을 함유하며; (2) 상기 숙주 생물을 배지에서 성장시켜 히알우론산을 분비시키고; 또 (3) 분비된 히알우론산을 회수한다.

상기 방법은 또한 추출된 히알우론산을 정제하는 단계 뿐만 아니라 배지로부터 분비된 히알우론산을 추출하는 단계를 포함한다. 또한 숙주 생물은 구조적으로 변형된 히알우론산 또는 크기 변형된 히알우론산을 분비할 수 있다.

본 발명은 또한 미리 선택된 제약학적 약물 및 재조합 HAS에 의해 생산된 유효량의 히알우론산을 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다. 상기 제약학적 조성물은 면역 반응을 피할 수 있는 변형된 분자량의 제약학적 조성을 갖는 히알우론산을 가질 수 있다. 변형된 분자량은 변형된 분자량 제약학적 조성에 대하여 친화성을 갖는 환자내에서 특정 조직 또는 세포 유형을 표적으로 할 수 있는 제약학적 조성물을 생산할 수 있다.

본 발명은 또한 효소적으로 활성인 seHAS를 암호화하는 정제되고 분리된 핵산 서열을 포함하며, 이 핵산 서열은 (a) 서열 1에 따른 핵산 서열; (b) 서열 1에 따른 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열; (c) 서열 1에 따른 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열; 및 (d) 서열 1에 따른 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열이다.

본 발명은 또한 주로 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 핵산 절편으로 구성된 정제되고 분리된 핵산 절편을 포함한다.

본 발명은 또한 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 생물학적 특성을 유지하도록 서열 1에 따른 핵산 절편의 충분히 복제성인 핵산 절편을 갖는 seHAS를 암호화하는 핵산 절편으로 본질적으로 구성되는, 분리된 핵산 절편을 포함한다. 이 핵산 절편은 cDNA 서열일 수 있다.

본 발명은 또한 효소적으로 활성인 HAS를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하며, 이때 정제된 핵산 절편은 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있다.

본 발명의 일개 구체예를 설명하기 전에, 본 발명은 이하에 기재된 상세한 설명이나 도면에 개시된 성분의 제조와 배열에 한정되지 않는다는 것을 알아야한다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하며 다양한 방식으로 실시할 수 있다. 또한 본 명세서에 사용된 표현이나 용어는 설명을 위한 것이므로 제한되어서는 안된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 ″핵산 절편″ 및 ″DNA 절편″은 상호 교환가능한 용어로서 특정 종의 전체 게놈 DNA를 갖지 않도록 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 그러므로, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 ″정제된″ DNA 또는 핵산 절편은 관련이 없는 게놈 DNA, 예컨대 전체 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 또는 포유류 숙주 게놈 DNA가 존재하지 않게 정제 분리된 히알우로네이트 합성효소(″HAS″) 코딩 서열을 함유하는 DNA 절편을 지칭한다. 용어 ″DNA 절편″은 DNA 절편과 이러한 절편의 작은 단편 그리고 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 등을 비롯한 재조합 벡터를 포괄하여 의미한다.

이와 유사하게, 분리되거나 정제된 seHAS 유전자를 포함하는 DNA 절편은 기타 천연 산출 유전자 또는 단백질 코딩 서열을 실질적으로 갖지 않도록 분리된 HAS 코딩 서열을 포함한 DNA 절편을 지칭한다. 이와 관련하여, 용어 ″유전자″는 간단히 하기 위해 기능적 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 암호화 단위를 지칭하기 위해 사용된다. 당업자가 잘 이해하고 있듯이, 상기 기능적 용어는 게놈 서열, cDNA 서열 또는 이들을 조합한 것을 포함한다. ″기타 코딩 서열이 존재하지 않도록 실질적으로 분리 제거된″이라는 표현은 관심을 두고 있는 유전자, 본 발명의 경우 seHAS가 DNA 절편의 코딩 영역의 중요한 부분을 형성하며 이 DNA 절편은 대형 염색체 단편이나 기타 기능적 유전자 또는 DNA 코딩 영역과 같은 천연산출의 대형 코딩 DNA를 함유하지 않는 것을 의미한다. 물론, 상기 표현은 애초에 분리된 상태의 DNA 절편을 가르키지만, 나중에 부가되거나 의도적으로 절편에 남겨진 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.

원핵생물 공급원의 사용과 관련된 특정 이점으로 인하여, 당업자는 화농연쇄상구균, 에스. 에쿠이시밀리스(S. equisimilis) 또는 피. 물토시다(P. multocida)와 같은 원핵생물로부터 HAS 유전자를 분리하는 것이 가장 유리하다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 그러한 이점중의 하나는 전형적으로, 진핵생물 효소는 진핵생물 숙주에서만 달성될 수 있는 번역후 수식공정을 필요로한다는 점이다. 이로 인하여 수득한 진핵생물 HA 합성효소 유전자의 용도가 제한되는 경향이 있다. 또한 당업자는 원핵생물 효소 유전자를 사용하려는 경우 유전자 조작 시간과 조작 용이성 면에서 부수적인 이점을 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 부수적 이점은 (a) 원핵생물 유전자의 게놈 크기가 비교적 작기 때문에 원핵생물 유전자의 분리가 용이하므로 상응하는 게놈 라이브러리의 스크리닝 양을 감소시키고 또 (b) 인트론이 존재하지 않음으로 인하여 원핵생물 유전자의 코딩 영역의 전체 크기가 현저히 작기 때문에 조작이 용이하다는 것이다. 또한 seHAS 유전자(즉, 효소) 산물이 번역후 수식공정을 필요로하는 경우, 이러한 수식공정은 그 유전자가 유래된 원핵생물 세포와 유사한 환경(숙주)에서 실시되어야 최선일 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 DNA 서열은 선택된 재조합 숙주에서 서열의 발현을 가능하게하는 유전자 제어 영역을 더 포함할 것이다. 물론, 사용된 제어 영역의 성질은 특정 용도(예컨대, 클로닝 숙주) 등에 따라서 다양할 것이다.

특정 구체예로서, 본 발명은 그 아미노산 서열내에 서열 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는, seHAS 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 혼입한 분리된 DNA 절편 및재조합 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명의 특정 구체예로서, 본 발명은 그 아미노산 서열내에 HAS 유전자 또는 DNA, 특히 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) HAS에 상응하는 HAS 유전자 또는 cDNA의 아미노산 서열을 포함하는 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 혼입한 분리 DNA 절편 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 예컨대, DNA 절편 또는 벡터가 전체 길이의 HAS 단백질을 코딩하거나 또는 HAS 단백질을 발현하기 위해 사용되는 경우, 바람직한 서열은 본질적으로 서열 2에 개시된 서열이다.

HA 합성효소 활성을 갖는 핵산 절편은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 분리할 수 있다. 용어 ″본질적으로 서열 2에 개시된 서열″이라는 용어는 그 서열이 실질적으로 서열 2의 부분에 상응하며 서열 2의 아미노산과 동일하지 않은 비교적 몇 개의 아미노산을 갖는 것 또는 서열 2의 아미노산과 생물학적 작용 등가물을 의미한다. ″생물학적 작용 등가물″이라는 용어는 당분야에서 잘 이해되는 용어로서 본 명세서에 더 자세히 본질적으로 서열 2에 개시된 서열을 갖고 원핵생물의 HA 또는 히알우론산 피복 생성능과 관련된 유전자로 정의되어 있다.

예컨대, seHAS 및 spHAS 코딩 서열은 거의 70% 상동이고 아데닌 (A)과 티민(T) 염기가 풍부하다. seHAS 염기 함량은 A-26.71%, C-19.13%, G-20.81% 및 T-33.33% (A/T = 60%)이다. spHAS의 염기 함량은 A-31.34%, C-16.42%, G-16.34% 및 T-35.8% (A/T = 67%)이다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람들이라면 seHAS와 spHAS가 70% 상동임에도 불구하고 seHAS 코딩 서열이 spHAS 유전자와 혼성되지 않고 또 반대로 spHAS 코딩 서열이 seHAS 유전자와 혼성되지 않는 것에 놀랄 것이다. 이 예상치 않은 교차-혼성되지 않는 특성은 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 통하여 매칭되지 않은 염기가 짧게 단절되는 것에 기인한 것일 수 있다. spHAS와 seHAS가 교차-혼성화되지 않는 것은 도 1에 도시되어 있다. seHAS와 spHAS 코딩 서열 모두에 공통인 동일한 뉴클레오티드의 최장 길이는 20 뉴클레오티드뿐이다. 또한 A-T가 풍부한 서열은 G-C가 풍부한 서열에 비하여 덜 안정한 혼성 복합체를 형성할 것이다. 다른 가능한 설명은 잘못 정렬되거나 불안정한 방식으로 혼성화될 수 있는 양쪽 서열에서 몇 개 As 또는 Ts가 존재할 수 있기 때문으로 볼 수 있다. 이것은 seHAS와 spHAS 유전자 서열을 각기 프레임 밖에 존재하게함으로써 혼성화의 가능성을 감소시킨다.

70% 상동인 단백질을 암호화하는 2개의 유전자가 서로 교차-혼성화되지 않는 이러한 독특한 현상으로 인하여, 청구된 핵산 절편을 그의 기능 면에서 생각하는 것, 즉 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 핵산 절편으로 생각하는 것이 유리하다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람이라면 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 핵산 절편은 서열 1 및 2에 기재된 서열에 대하여 보존되거나 반보존된 치환을 함유할 수 있지만 여전히 본 발명의 범위내에 든다는 것을 잘 알고 있을 것이다.

특히, 당업자는 핵산 절편에 구조적 변화를 유발(예컨대 보존되거나 반보존되는 아미노산 치환을 암호화하는) 하여도 여전히 그의 효소 활성 또는 작용을 보존할 수 있는 예를 다수 알고 있을 것이다. 예컨대 (1) 리슬러 일행, ″Amino acid Substitutions in Structurally Related Proteins. A Pattern Recognition Approach.″, J. Mol. Biol. 204: 1019-1029 (1988) [″....관측된 아미노산 측쇄의 상호교환성에 따르면 오직 4개의 그룹이 기재될 수 있다: (i) Ile 및 Val; (ii) Leu와 Met, (iii) Lys, Arg 및 Gln 그리고 (iv) Tyr 및 Phe.″]; (2) 니파인드 일행, ″Amino acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from Main-Chain Folding Anoles.″ J. Mol. Biol. 219: 481-497 (1991) [유사성 변수는 아미노산 치환 고안을 가능하게한다] 및 (3) 오버링톤 일행, ″Environment-Specific Amino Acid Substitution Tables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folds,″ Protein Science 1: 216-226 (1992) [″국부 환경의 작용으로서 관찰된 치환 패턴을 분석하면 분명한 패턴이 존재함을 나타낸다...″ 양립성 변화가 가능하다].

상술한 참조문헌과 헤아릴 수 없이 많은 기타 문헌에는 당업자라면 주어진 핵산 서열을 이용하여 그의 작용에 변화를 주지 않으면서 핵산 서열에 치환과 변경을 가할 수 있음이 개시되어 있다. 또한 치환된 핵산 절편은 고도의 상동성을 가지며 순수한 양친에 대하여 효소적 활성을 가지지만 서로 혼성화되지는 않는다.

본 발명은 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소-seHAS와 spHAS를 암호화하는 핵산 절편을 개시하고 있다. seHAS와 spHAS는 70% 상동이고 모두 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 코딩하고 있지만, 이들은 교차 혼성화되지 않는다. 따라서, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람이라면 본 발명의 범위와 청구범위에 벗어남없이 서열 1에 수록된 seHAS 핵산 절편에 치환을 가할 수 있음을 숙지하고 있을 것이다. 표준화되고 허용되는 기능적 등가의 아미노산 치환은 하기 표 I에 수록한다.

표 I

아미노산 기	보존되거나 반보존된 치환기
비극성 R 기	알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌,트립토판
극성이지만 하전되지 않은 R 기	글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민
음으로 하전된 R 기	아스파탐산, 글루탐산
양으로 하전된 R 기	리신, 아르기닌, 히스티딘

본 발명의 다른 바람직한 구체예는 재조합 벡터로 정의되는, 서열 2에 따른 단백질을 암호화하는 정제된 핵산 절편에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ″재조합 벡터″라는 용어는 HAS 단백질을 암호화하는 핵산 절편 또는 그의 단편을 함유하도록 변형된 벡터를 지칭한다. 재조합 벡터는 상기 HAS 코딩 핵산 절편과 작용가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로도 정의될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예는 재조합체가 HAS 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 갖도록 제조된 숙주 세포이다. 바람직한 재조합 숙주 세포는 원핵 생물 세포일 수 있다. 다른 구체예로서, 재조합 숙주 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, ″유전자 조작된″ 또는 ″재조합″ 세포는 세포에 HAS 코딩 유전자와 같은 재조합 유전자가 도입된 세포를 지칭하는 것이다. 따라서, 유전자 조작된 세포는 재조합적으로 도입된 유전자를 함유하지 않는 천연 산출 세포와 구별된다. 유전자조작된 세포는 사람의 손을 통하여 도입된 유전자 또는 유전자들을 갖는 세포이다. 재조합 도입된 유전자는 cDNA 유전자, 게놈 DNA의 복제 형태일 수 있거나 또는 도입된 특정 유전자와 천연적으로 결합되지 않은 프로모터에 인접하게 위치하는 유전자를 포함할 수 있다.

재조합 HA 합성효소를 생성하기 위해 연쇄상구균 이외의 숙주를 이용하려는 경우, 대장균, 고초균, 락토코커스 종과 같은 원핵생물 계를 이용하는 것이 유리하며, 또는 효모 또는 CHO(Chinese hamster ovary), 아프리카 녹색 원숭이 세포, VERO 세포 등과 같은 진핵생물 계도 이용가능하다. 물론, HA 합성효소 유전자를 선택된 숙주에서 작용가능한 서열 제어하에 두는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 DNA 제어 서열 뿐만아니라 이들의 작성과 용도는 이하에 자세히 논의한 바와 같이 일반적으로 당 분야에서 공지되어 있다.

바람직한 구체예로서, HA 합성효소 코딩 DNA 절편은 특정 숙주에 의해 연속적인 서열의 복제를 가능하게 하는 복제 기점 또는 ″레플리콘″으로 작용하는 것으로 공지된 DNA 서열을 추가로 포함한다. 이러한 복제 기점은 HA 합성효소 DNA 서열이 결찰되어 있는 키메라 절편 또는 플라스미드를 염색체밖에 위치시켜 복제성으로 제조하는 것을 가능하게한다. 보다 바람직한 예로서, 사용된 복제기점은 생명공학 분야에 적합한 세균 숙주에서 복제될 수 있는 것이다. 그러나, 클로닝된 DNA 절편의 편의를 위하여, 그의 사용이 고려될 수 있는 기타 다른 숙주계에 의해 인식되는 부가적 복제기점(셔틀 벡터와 같은)을 이용하는 것도 바람직할 수 있다.

다수의 고등 생물에서 클로닝 또는 발현하기 위해 적용될 수 있는 SV40, 폴리오마 또는 소 유두종 바이러스 복제기점과 같은 기타 복제 기점을 분리하여 사용하는 것은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 적합한 복제 기점과 함께 HA 합성효소 코딩 유전자 서열을 포함하고 선택된 제어 영역 제어하에 있는 재조합 형질전환 벡터 관점에서 정의될 수 있다.

따라서, 당업계의 통상의 지식을 가진 사람이라면 본 발명의 명세서를 참조하면 다른 방법으로도 HAS 유전자 또는 cDNA를 얻을 수 있을 것이다. 예컨대 연쇄상구균의 기타 균주를 비롯한 다수의 공급원으로부터 또는 cDNA 라이브러리와 같은 진핵생물 공급원으로부터 얻은 전체 유전자 또는 cDNA를 함유하고 PCR 또는 RT-PCR에 의해 제조된 DNA 단편을 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 단편의 생성에는 실질적으로 어떤 분자 클로닝법도 채용가능하다. 따라서, DNA 분리에 이용된 특정 방법에 대한 유일한 제한은 분리된 핵산이 HA 합성효소의 생물학적 기능 등가물을 코딩해야한다는 것이다.

일단 DNA를 분리하면 선택된 벡터와 함께 결찰시킨다. 본 발명에 따르면 어떤 클로닝 벡터라도 사용되어 유리하게 실시될 수 있다. 전형적으로 유용한 벡터는 원핵생물에 사용되는 플라스미드와 파아지 그리고 진핵생물에 사용되는 바이러스성 벡터까지 포함한다. 예로는, pKK223-2, pSA3, 재조합 람다(lambda), SV40, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 및 레트로바이러스를 포함한다. 그러나, 락토코커스 또는 바실루스 종과 대장균에서 복제를 할 수 있는 벡터가 사용될 때, 특별한 잇점이 궁극적으로 실현될 것으로 믿어진다.

다오(Dao) 및 페렛티(Ferretti)의 pSA3 벡터 또는 트리에우-쿠오트(Trieu-Cuot)의 pAT19 등으로 예시되는 이같은 벡터들은, 대장균과 같은 용이하게 다룰 수 있는 숙주에서 클론 군체 선택(clonal colony selection)을 형성하도록 하고, HA 제조를 위한 음식 등급의 락토코커스 또는 바실루스 종으로 연속적으로 도로 전달하는 것이 뒤따르도록 한다. 이들은 음식과 유전공학적 제품의 제조에 사용되는 잘 연구되어 있는 생물이다. 이들은 유전자 투여(즉, 증폭에 의해 HA 합성 효소 유전자의 여분의 복사물을 공급하는 것)를 통해 HA를 합성할 수 있는 락토코커스 또는 바실루스 종의 능력과 및/또는 HA 전구체의 유용성을 증대시키기 위하여 부가적인 유전자를 포함하는 것을 논의할 수 있다는 점에서 잇점이 있다. HA를 합성하는 세균의 내재적 능력은 HA 합성효소 유전자를 운반하는 플라스미드의 여분의 복사물의 형성 또는 증폭을 통해 또한 논의될 수 있다. 이러한 증폭은 플라스미드 복사 수 및 그에 따라서 HA 합성효소 유전자 복사 수에서 10배 증가에까지 이를 수 있다.

HA 합성효소 유전자 복사 수를 더 논의할 또 다른 공정은 유전자의 다중 복사물을 플라스미드에 삽입하는 것이다. 또 다른 기술은 HAS 유전자를 염색체 DNA에 혼입시키는 것을 포함한다. 이러한 여분의 증폭은 세균성 HA 합성효소 유전자 크기가 작기 때문에 특히 실행성이 있다. 몇몇 시나리오에서, 염색체 DNA 결찰 벡터는 선택된 숙주내에서 삽입된 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 사용을 통해 대장균과 같은 클론 스크리닝 목적을 위해 선택되는 숙주를 감염시키는데 이용된다.

피부 또는 활액 아세포 또는 수탉 볏 세포와 같은 진핵생물 공급원이 사용될 경우, 사람들은 cDNA 라이브러리를 준비하여 초기에 진행하는 것을 바라게 된다. 이것은, 우선 상기 세포로부터 mRNA를 분리하고, 선택된 벡터와의 역전사효소 활성 및 결찰 작용을 가진 효소를 사용하여 이중쇄 cDNA를 준비함으로써 실행된다. 이중쇄 cDNA의 준비를 위해 수많은 가능성이 당업계에 유용하고 공지되어 있으며, 모든 그러한 기술이 적용될 수 있다고 믿어진다. 바람직한 기술은 역전사와 관련이 있다. 일단 이중쇄 cDNA의 개체군이 얻어지면, 적당한 벡터내로의 결찰과 적당한 숙주에서의 증폭하는 것과 같은 수용가능한 기술에 의해 선택된 숙주내에서 cDNA 라이브러리가 준비된다. 얻어진 많은 수의 클론과, 여기 설명된 기술에 의해 수많은 클론을 상대적으로 용이하게 스크리닝하는 것에 기인하여, 사람들은 cDNA 클론의 클로닝과 발현 스크리닝을 위하여 λgt11, λgt12, λGem11 및/또는 λZAP와 같은 파아지 발현 벡터를 이용하는 것을 바랄 수도 있다.

임의의 다른 구체예로서, 본 발명은 서열내에 본질적으로 서열 1에 개시된 핵산 서열을 포함하는 분리 DNA 절편 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 용어 ″본질적으로 서열 1에 개시된″은 상기에 기재된 것과 동일한 의미로 사용되고 있고, 핵산 서열이 실질적으로 서열 1의 부분에 상응하며 서열 1의 코돈에 동일하지 않거나 또는 기능적으로 등가가 아닌 코돈을 상대적으로 거의 가지고 있지 않다는 것을 의미한다. 용어 ″기능적으로 등가인 코돈″은 표 1에 개시된 바와 같이, 아르기닌 또는 세린용 6개 코돈들과 같이 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 언급하고 생물학적으로 등가의 아미노산을 암호화하는 코돈을 또한 언급하기 위해 여기서 사용된다.

아미노산과 핵산은 부가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 핵산 서열과 같은 부가적인 잔기를 포함할 수도 있고, 서열이 단백질 발현과 효소 활성에 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하고 상기 기준을 만족하는 한 여전히 여기 개시된 서열 중의 하나에 본질적으로 개시된 바와 같은 것으로 또한 이해될 것이다. 말단 서열의 부가는 특히, 예를 들어 유전자내에서 발생하는 것이 알려져 있는, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부의 어느 하나에 접하는 다양한 비코딩 서열을 포함하거나 다양한 내부 서열을 포함할 수도 있는 핵산 서열에 가해진다. 특히, 진핵생물내의 HAS 유전자의 아미노산 서열은 원핵생물에서 발견되는 것보다 40% 큰 것으로 나타난다.

보존 및 반보존된 치환뿐만 아니라 유전자 암호의 축퇴 (degeneracy)를 허용함에 있어서, 서열 1의 뉴클레오티드와 약 40% 내지 약 80%; 또는 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%; 또는 더더욱 바람직하게는 약 90% 내지 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열은 ″본질적으로 서열 1에 개시된 바와 같은″ 서열일 것이다. 서열 1에 개시된 바와 본질적으로 동일한 서열은 또한, 표준적 또는 덜 혹독한 혼성 조건하에서 서열 1의 상보물을 함유하는 핵산 절편에 혼성화될 수 있는 서열로서 기능적으로 정의될 수도 있다. 적절한 표준적 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이고 여기에 명료하게 개시되어 있다.

여기 사용된 용어 ″표준적 혼성화 조건″은 실질적으로 상보적인 핵산 절편이 표준적 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하게 될 이들 조건을 기술하기 위해 사용된다. pH, 온도, 염 농도, 포름아미드 및 디메틸 술폭시드와 같은 물질의 존재, 혼성화하는 절편의 길이 등과 같은 결합 또는 혼성화의 특이성을 결정하는 수많은 요소들이 알려져 있다. 더 짧은 핵산 절편, 예를 들어, 약 14에서 100 사이의 뉴클레오티드 단편이 혼성화를 위해 사용된다고 고려할 때, 혼성화를 위한 바람직한 염과 온도 조건은 40 내지 50℃에서 1.2 내지 1.8 x HPB를 포함할 것이다.

자연적으로, 본 발명은 서열 1에 개시된 서열가 상보적이거나 본질적으로 상보적인 DNA 절편을 또한 포함한다. ″상보적(complementary)″ 핵산 서열은 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 이룰 수 있는 것들이다. 여기에 사용된 것과 같은 용어 ″상보적 서열″은 상기에 설명된 동일한 뉴클레오티드 비교에 의해 평가될 수도 있거나 또는 서열 1의 핵산 절편에 혼성화될 수 있는 것으로 정의되는 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 의미한다.

코딩 서열 그 자체의 길이에 관계없이 본 발명의 핵산 절편은 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 부가적 제한효소 자리, 다중 클로닝 자리, 에피토프 택 (epitope tag), 폴리 히스티딘 영역, 다른 코딩 절편 등과 같은 다른 DNA 서열과 결합될 수도 있으므로 전체 길이는 상당히 변할 수 있다. 따라서, 의도된 재조합 DNA 방법에서 준비 및 사용의 용이성에 의해 바람직하게 제한되는 전체 길이를 가진 거의 임의의 길이의 핵산 단편이 사용될 수도 있는 것으로 고려된다.

자연적으로, 본 발명은 서열 1 및 2의 특정 핵산 서열과 아미노산 서열에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 재조합 벡터와 분리 DNA 절편은 염기 코딩 영역에서 HAS 코딩 영역 자체, 선택된 교체 또는 변경을 내포하는 코딩 영역을 다양하게 포함할 수 있거나, 또는 HAS 코딩 영역을 여전히 포함하는 더 큰 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나 다양한 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 기능적 등가 단백질 또는 펩티드를 코딩할 수도 있다.

예를 들어, 본 발명자들은 두 개의 다른 계: (a) 그램-음성 세균 파스투렐라 물토시다 (Pasturella multocida)(서열 19)와 (b) 클로렐라 바이러스 PBCV-1(chlorella virus PBCV-1)(서열 7 및 8)에서 히알우로네이트(hyaluronate) 합성효소를 발견하고, 특징지웠으며 정제하였다. 이들 두 개 계에서 히알우로난 합성효소의 존재와, 이들 2개의 상이한 계로부터 히알우로난 합성효소를 정제하고 사용하는 본 발명자들의 능력은 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 핵산 서열을 정제하고 분리하는 본 발명자들의 능력을 가리킨다.

카터형 A 피. 물토시다(P. multocida)(서열 19)의 캡슐은 히알우론산-HA를 함유하는 것으로 오랫동안 추측되었다. 피. 물토시다의 HA 합성효소의 특징화는 그것과 seHAS 및 spHAS 단백질의 흥미로운 효소적 차이를 이끌었다.

피. 물토시다 세포는 쉽사리 볼 수 있는 세포외 HA 캡슐을 생산하고, 두 개의 연쇄상구균 HAS는 막 단백질이기 때문에 가금류 콜레라 병원균의 막 제작을 테스트하였다. 초기 시도에서, 연쇄상구균 HAS 활성을 측정하기 위한 것과 유사한 조건에서 분석할 때, 초음파로만 유도된 조막 분획(crude membrane fractions)은 HA[∼0.2 pmol의 GlcA 전이(단백질 ㎍)^-1h^-1]내로 매우 낮은 수준의 UDP-GlcNAc-의존 UDP-[¹⁴C]GlcA의 혼입을 내포하고 있었다. 재조합 hasA 플라스미드를 가지고 있는 대장균으로부터의 효소는 처음에는 또한 분리에 저항하였다. 이들 결과는 유사한 방법에 의해 연쇄상구균으로부터 얻어진 용이하게 검출가능한 량과는 대조적이었다.

초음파와 함께 단백질 분해효소 억제제의 존재하에서 얼음-냉각 리조자임 처리를 이용한 또 다른 제조 방법은 그램-음성 세균의 두 종 모두로부터 HAS 활성의 실질적인 재생을 가능케 하였다. 전달된 5 내지 10 pmol GlcA의 HAS(단백질 ㎍)^-1h^-1에 대한 특이적 활성은 새로운 방법으로 야생형 피. 물토시다의 조막에 일상적으로 얻어졌다. UDP-GlcNAc 부재하에서, UDP-[¹⁴C]GlcA로부터 실질적으로 아무런 방사선(두 개의 당 전구체들과 동일한 분석의 1% 이하)도 더 고분자량의 물질에 혼입되지 않았다. 무캡슐화(acapsular) 돌연변이 TnA로부터 제조된 막은 두 개의 당 뉴클레오티드 전구체가 추가되었을 때(데이타는 제시되지 않음) 검출가능한 HAS 활성을 내포하지 않았다. 세파크릴 S-200 칼럼를 사용하는 겔-여과 분석은, 물질이 공극내로 분산되기 때문에 시험관내에서 합성된¹⁴C로 표지된 생산물의 주요 분자량은 ≥8 x 10⁴Da임을 나타내고 있고, 그러한 값은 적어도 400개의 단량체로 구성된 HA 분자에 상응한다. 이 생성물은 스트렙토마이세스 히알우로니다제 분해에 민감하지만 단백질 분해효소 처리에는 내성을 나타낸다.

HAS 분석의 변수는 피. 물토시다 막에 의해 UDP-당의 다당류로의 혼입을 최대화하기 위하여 변화되었다. 연쇄상구균 spHAS는 Mg²⁺를 필요로 하며, 따라서 이 금속이온은 피. 물토시다 막의 초기 분석에 포함되었다. 피. 물토시다 HAS(pmHAS)는 pH 7에서 최적인 트리스형(Tris-type) 완충액내에서 pH 6.5에서 8.6까지 상대적으로 활성이었다. HAS 활성은 적어도 1 시간 동안 중성 pH에서 배양시간에 대하여 선형이었다. 50mM 트리스, pH7 및 20mM MgCl₂를 함유하는 반응물에 100mM NaCl을 부가하는 것은 당 혼입을 ∼50%까지 줄이기 때문에, pmHAS는 더 높은 이온 강도에서 외형상 덜 활성있었다.

pmHAS의 금속 이온 특이성은 pH 7에서 평가되었다. EDTA 존재하의 금속 부재조건에서, 방사선-표지된 전구체의 다당류내 혼입은 검출되지 않았다(최대 시그널의 0.5% 이하). Mn²⁺은 시험된 금속(Mg, Mn, Co, Cu 및 Ni)을 위한 가장 낮은 이온 농도에서 가장 높은 혼입 속도를 나타내었다. Mg²⁺은 약 50%의 Mn⁺²자극을 주었으나 10배 더 높은 농도에서였다. 10mM에서 Co²⁺또는 Ni²⁺은 더 낮은 활성 수준을 지지했으나(각각 1mM Mn²⁺분석의 20% 또는 9%), 10mM Cu²⁺가 제공된 막은 불활성이었다. 실제로, 10mM Cu²⁺와 20mM Mg²⁺를 막 제조물과 혼합하는 것은 다당류로의 혼입을 거의 초래하지 못했다(겨우 0.8% Mg 값 이하).

pmHAS의 초기 특징화는 Mg²⁺의 존재하에서 실행되었다. 당 뉴클레오티드 전구체에 대한 효소의 결합 친화성은 외형상 K_m값을 측정하여 평가하였다. 다당류내로의 [¹⁴C]GlcA 또는 [³H]GlcNAc의 혼입은 각각 UDP-GlcNAc 또는 UDP-GlcA의 변화된 농도에서 모니터링되었다. Mg²⁺함유 완충액에서, UDP-GlcA에 대한 ∼20μM과 UDP-GlcNAc에 대한 ∼75μM의 외형상 K_M값은 적정 데이터의 하네스-울프 플럿 (Hanes-Woolf plots)([S]/v 대 [S])을 사용하여 결정하였다. 하네스-울프 플럿의 1/V_max에 상응하는 기울기가 등가이기 때문에 두개 당의 V_max값은 같다. Mg²⁺와의 분석으로부터의 결과와 비교할 때, UDP-GlcNAc의 K_M값은 Mn²⁺존재하에서 약 25 내지 50%까지 증가되었고 V_max값은 2 내지 3배까지 증가되었다.

피. 물토시다, 에스. 에쿠이시밀리스(s. equismilis)이나 화농연쇄상구균으로부터의 HA 합성효소는 UDP-당을 사용하지만, pH와 금속 이온 의존도 및 K_M값에 대해 다소 다른 동역학 최적조건을 갖는다. 상기 효소는 pH 7에서 가장 활동적이지만 pmHAS는 약간 산성 pH에서 더욱 활성을 보이고 pH 7.4 이상에서 상대적으로 비활성이다. pmHAS는 시험관 분석 조건하에서 Mg²⁺보다는 Mn²⁺를 더욱 효율적으로 이용하지만, 세균 세포내에서의 생리학적 금속 보조 인자(cofactor)의 확인은 알려져 있지 않다. 종전의 연구에서 연쇄상구균 효소와 비교할 때, Mg²⁺가 Mn²⁺보다 훨씬 우수하지만 Mn²⁺의 비록 더 작은 효과가 최적 Mg²⁺농도보다 10 더 낮은 농도에서 최적이었다. pmHAS는 외견상으로 spHAS 보다 더 강력하게 UDP-당과 결합한다. 조막에서 pmHAS에 대해 측정된 K_M값은 연쇄상구균막에서 발견된 HAS로부터 얻어진 것보다 각각의 기질에 대해 약 2 내지 3배 낮다: 각각 UDP-GlcA에 대해 50 또는 39μM 및 UDP-GlaNAc에 대해 500 또는 150μM.

동역학적 분석에 의해, pmHAS의 V_max는 Mg²⁺보다는 Mn²⁺의 존재하에서 2 내지 3배 높았지만, UDP-GlcNAc K_M값은 앞 이온과의 분석에서 약간 증가되었다. 외형상 낮아진 친화성의 이러한 관찰은, 증가된 중합 속도가 효소 활성 자리에 대한 Mn²⁺이온/당 뉴클레오티드 복합체의 더욱 우수한 결합에 기인한 것이 아니었다. 따라서, Mn²⁺가 몇몇 다른 반응 단계를 증진시키고, 효소의 또 다른 자리/구조를 변경시키거나 또는 인지질 막 환경을 변경할 가능성이 있다. pmHAS의 유전자 서열 및 단백질 서열은 서열 19에서 나타나 있다.

클로렐라 바이러스 PBCV-1은 다당류 히알우로난[히알우론산: HA]을 합성할 수 있는 기능성 글리코실트랜스퍼라제를 코딩한다. 이러한 발견은, 바이러스가 (a) 숙주세포 글리코실트랜스퍼라제를 이용하여 새로운 탄수화물 구조를 생성한다거나 (b) 비리온(virion) 돌연변이화 동안에 숙주세포 글리코콘쥬게이트를 축적한다는 일반적인 관점에 반한다. 더욱이, HA는 동물이나 그들의 유독성 세균 병원균에 한정되는 것으로 간주되어 왔다. 많은 식물 탄수화물이 특성화되어 왔다고 하더라도, HA 및 그와 관련된 유사물 모두는 식물세포나 프로티스트(protist)에서 이전에 검출된 적이 없었다.

척추동물 HAS 효소 (DG42, HAS1, HAS2, HAS3)와 연쇄상구균 HasA 효소(spHAS 및 seHAS)는 서너개의 유사한 서열 영역을 가지고 있다. 바이러스 PBCV-1[Paramecium bursaria chlorella virus]의 이중쇄 DNA 게놈을 서열결정하는 동안, 다양한 HAS에 대하여 28 내지 33% 아미노산 상용성을 갖는 567 잔기 단백질을 암호화하는 것이 OR5[오픈 리딩 프레임], A98R (Accession #442580)이 발견되었다. 이러한 단백질은 cvHAS(클로렐라 바이러스 HA 합성효소)로 나타내었다. PBCV-1을 암호화하는 유전자 서열과 그것의 단백질 서열은 서열 7과 8에 나타나있다.

PBCV-1은 특정 단세포 진핵생물 클로렐라-유사 녹조에서 복제하는 거대(175 - 190㎚ 직경) 폴리헤드랄 플라크(plaque) 형성 바이러스 과(Phycodnarviridae)의 원형(prototype)이다. PBCV-1 비리온은 바깥쪽 당단백질 캡시드(capsid) 안쪽에 위치한 적어도 50개의 다른 단백질과 지질 성분을 포함한다. PBCV-1 게놈은 공유결합 밀폐 헤어핀 단부를 갖는 선형의 변경되지 않은 330-kb dsDNA 분자이다.

그것의 추론된 아미노산 서열에 기초할 때, A98R 유전자 생성물은 막내재성 단백질이어야 한다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 재조합 A98R을 대장균에서 제조하고 막 분획이 HAS 활성을 갖는지 분석하였다. UDP-GlcA와 UDP-GlcNAc는, 대조 세포로부터의 시료(〈0.001 pmoles GlcA 전달/단백질 ㎍/분)이 아닌 플라스미드 pCVHAS상에 A98R 유전자를 함유하는 세포로부터 유도된 막 분획 (평균 비활성 2.5pmol GlcA 전달/단백질 μg /분)에 의해 다당류내로 혼입되었다. pCVHAS로 형질전환된 세포의 가용성 분획내에서는 아무런 활성도 검출되지 않았다. UDP-GlacA와 UDP-GlcNAc은 중합이 동시에 요구되었다. 활성은 10 mM MnCl₂존재하의 pH 7.2의 헤페스(Hepes) 완충액에서 최적인 반면에, 금속 이온이 생략된다면 아무런 활성도 검출되지 않았다. Mg²⁺와 Co²⁺는 유사한 농도에서 Mn²⁺와 비교하여 ∼20%의 효과를 가졌다. pmHAS는 유사한 금속 요건을 가지지만 다른 HAS들은 Mg²⁺를 선호한다.

재조합 A98R 효소는 시험관내에서 재조합 spHAS 또는 DG42 xlHAS에 의해 합성된 HA의 분자량(각각 ∼10⁷Da와 ∼5 내지 8x10⁶Da; 13, 15)보다 작은 평균 분자량 3 내지 6x10⁶Da을 가진 다당류를 합성하였다. 이 다당류는, HA는 분해하지만 헤파린과 콘드로이틴과 같은 구조적으로 관련이 있는 글리코사미노글리칸은 분해하지 않는 효소인 스트렙토마이세스 히알우로니티쿠스 HA 용해효소에 의해 완전히 분해되었다.

A98R 유전자 발현 여부에 대해 PBCV-1 감염 클로렐라 세포를 조사하였다. 약 1,700 뉴클레오티드 A98R 전사물은 감염후 약 15분에서 나타났고, A98R이 초기 유전자인 것을 지시하는 감염 후 60분내에 사라졌다. 결과적으로, 미감염 클로렐라 세포 및 PBCV-1로 감염된 클로렐라 세포로부터의 막 분획은 감염후 50 및 90분에 HAS 활성 분석하였다. 감염 세포는 활성을 가졌지만 미감염 세포는 그렇지 않았다. 세균적으로 유도된 재조합 A98R 효소처럼, UDP-[¹⁴C]GlcA로부터 다당류로의 방사선 표지 혼입은 Mn²⁺과 UDP-GlcNAc에 의해 좌우되었다. 이러한 방사선표지된 생산물은 또한 HA 용해효소에 의해 분해되었다. 분쇄된 PBCV-1 비리온은 HAS 활성을 갖지 않았다.

매우 특이적으로¹²⁵I-표지된 HA 결합 단백질을 사용하여 PBCV-1로 감염된 클로렐라 세포를 HA 다당류 분석하였다. 감염후 50 및 90분에 세포로부터의 추출물은 실질적인 양의 HA를 포함하였지만, 미감염 조류(algae) 또는 분쇄 PBCV-1 비리온으로부터의 추출물은 그렇지 않았다. 또한 표지된 HA 결합 단백질은 감염후 50 및 90분에 본래의 감염된 세포와 상호반응하였지만, 건강한 세포는 그러하지 않았다. 따라서, 새로이 합성된 HA 다당류의 상당한 부분은 감염된 조류의 세포 표면 외부에 고정되었다. 플라크 크기와 플라크 수는 PBCV-1 플라크 분석에서의 상부 한천상에 고환 히알우로니다제(testicular hyaluronidase: 465 유닛/㎖)이나 유리 HA 다당류(100㎍/㎖)를 포함시켜도 변경되지 않았기 때문에, 세포외 HA는 바이러스와 그것의 조류 숙주 사이의 상호작용에 어떤 분명한 역할을 하지 않는다.

PBCV-1 게놈은 UDP-Glc 탈수소효소(UDP-Glc DH)와 글루타민:프럭토오스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(GFAT)를 암호화하는 부가적인 유전자를 가진다. UDP-Glc DH는 UDP-Glc를 HA 생합성에 요구되는 전구체인 UDP-GlcA로 전환시킨다. GFAT는 프럭토오스-6-포스페이트를 UDP-GlcNAc 대사 과정의 중간체인 글루코사민-6-포스페이트로 전환시킨다. A98R HAS 처럼 이들 PBCV-1 유전자 둘 모두는 감염시 초기에 발현되고 효소적으로 활성인 단백질을 코딩한다. HA 생합성 과정에서 다수 효소의 존재는 HA 생성물이 클로렐라 바이러스의 생활환에서 중요한 역할을 해야하는 것을 지적하고 있다.

연쇄상구균, 척추동물 및 PBCV-1의 HA 합성효소는 동일한 상대적인 순서로 발생하는 2 내지 4 잔기의 많은 변형을 포함한다. 이들 보존적 변형체는 아마도 도 2에 개시된 HA 생합성에 중요한 도메인을 반영한다. 그룹 C seHAS, 그룹 A spHAS, 쥐 HAS1, HAS2, HAS3 및 개구리 HAS의 단백질 서열은 도 2에 열거되어 개시되어 있다. 도 2의 정렬은 DNAsis 다중 정렬 프로그램을 사용하여 이뤄졌다. 다른 공지 HAS 군 막(인간 HAS1 및 2를 포함, 도시되지 않음)에서와 동일한 seHAS내의 잔기는 명암처리 및 에스테리스크로 표시하였다. 점선으로 나타낸 아미노산은 더 큰 β-글리코실 트렌스퍼라제 군의 모든 막내에서 보존된다. 다이아몬드 표시는 효소 활성에 중요할 수 있는 고도로 보존된 시스테인 잔기를 나타낸다. 예상되는 막 도메인 MD1 내지 MD7의 대략적 중간 지점은 화살표로 지적되어 있다. X1은 제노푸스 라애비스(Xeopus laevis)를 나타내고 MM은 무스 무스쿨리스(Mus musculis)을 나타낸다.

UDP-당 전구체로부터 β-결합된 다당류를 합성하는 HAS와 다른 효소들 사이의 유사 영역은 더 많은 글리코실트랜스퍼라제가 서열결정됨에 따라 또한 발견되고 있다. 그러한 예에는 세균성 셀룰로오스 합성효소, 곰팡이성 및 세균성 키틴 합성효소 및 다양한 HAS가 포함된다. 이들 유사 구조적 변형체의 중요성은 글리코실트랜스퍼라제의 3차원 구조가 축적됨에 따라 더욱 분명하게 될 것이다.

도 3은 공지 히알우로난 합성효소들 사이의 진화적 관계를 도시하고 있다. 도 3의 계통발생도는 DNAsis 다중 정렬 프로그램을 사용한 히긴스-샤프(Higgins-Sharp) 알고리즘에 의해 만들어졌다. 계산된 합치 백분율은 수상도(dendrogram)의 각각의 가지에 위치해 있다.

본 발명의 DNA 절편은 생물학적으로 작용 등가인 HAS 단백질 및 펩티드를 포함한다. 그러한 서열은 핵산 서열 및 그에 의해 코딩되는 단백질에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있는 코돈 중복 및 기능적 등가물로 인하여 발생할 수 있다. 다르게는, 변경될 아미노산의 특성을 고려하여 단백질 구조에서의 변화가 처리될 수 있는 재조합 DNA 수법을 이용함으로써 기능적으로 등가인 단백질과 폴리펩티드를 만들 수 있다. 인간에 의해 고안된 변화는 부위 특이적 돌연변이 수법을 채용하는 것에 의해 도입되며, 예를 들어, 분자 수준에서 HA 합성효소 활성을 조사하기 위하여 HAS의 효소 활성 또는 항원성을 향상시키거나 HAS 돌연변이를 시험할 수 있다.

또한, HAS 코딩 서열에 대한 특이적 변화는 변경된 크기 분포 또는 구조적 구성을 가진 HA의 생성을 초래할 수 있다. 당업자는, 상이한 중합체 크기 및/또는 기능적 능력을 갖는 히알우론산을 생산할 수 있는 변경된 히알우로네이트 합성효소를 생산하는 방법으로 HAS 코딩 서열이 조작될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, HAS 코딩 서열은, 히알우로네이트 합성효소가 변형된 당 기질 특이성을 가져서 히알우로네이트 합성효소가 이전에는 혼입되지 않던 당 또는 당 유도체와 같은 다른 구조를 혼입한 새로운 히알우론산 유사 중합체를 생성하는 방법으로 변경될 수 있다. 이렇게 새로이 혼입된 당은 다른 기능적 성질, 더 작거나 또는 큰 중합체 크기/분자량을 갖는 히알우론산 또는 이들 모두를 갖는 변형 히알우론산을 초래할 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 주지된 바와 같이, HAS 코딩 서열에 변화 및/또는 치환이 행해질 수 있게 되어 이들 소망하는 특성 및/또는 크기 변형이 이뤄질 수 있다. 하기 표 II는 재조합 seHAS의 당 뉴클레오티드 특이성 및 마그네슘 이온 요구성을 수록하고 있다.

표 II

^*120μM UDP-[¹⁴C] GlcA (2.8 x 10⁴dpm) 또는 300μM UDP-[³H]GlcNAc (2 x 10⁴dpm)을 사용하여 막(324ng 단백질)을 37℃에서 배양하였다. 지시된 표지되지 않은 제2 당 뉴클레오티드 존재하에서 방사선표지된 당 뉴클레오티드를 사용되었다. HA 합성효소 활성은 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이 측정하였다.

여기서 사용된 용어 ″변형된 구조″는 자연적으로 발생하는 HA 다당류에서 보통은 발견되지 않는 당 또는 유도체를 함유한 히알우론산 중합체를 의미한다. 용어 ″변경된 크기 분포″는 천연 효소에서는 보통 발견되지 않는 크기 분포의 히알우론산 분자의 합성을 지칭한다; 조작된 크기는 보통보다는 훨씬 작거나 클 수 있다.

크기를 달리하는 다양한 히알우론산 생성물은 의약 전달 분야에서 응용성을 가지며, 변형된 구조의 효소를 제조하는 것은 크기를 달리하는 히알우론산과 결합될 수 있다. 20개 단당류의 히알우론산 중합체를 다량 제조할 수 있다면, 맥관형성 및 상처 치료에 대한 응용성이 크다. 작은 히알우론산 올리고당에 대한 또 다른 특별한 응용은 의학적 목적으로 사용된 재조합 인간 단백질의 안정화에 있다. 그러한 단백질의 주요 문제점은 혈액으로부터 제거(clearance)와 짧은 생물학적 반감기이다. 이러한 문제점에 대한 현재 하나의 해결책은 순환과정으로부터 단백질이 너무 빨리 제거되는 것을 방지하는 작은 분자 차폐물을 결합시키는 것이다. 매우 작은 분자량의 히알우론산은 이러한 역할에 최적이고 비항원성이고 생체적합할 것이다. 약물 또는 단백질에 부착되는 더 큰 분자량의 히알우론산은 히알우론산에 대한 엔도시틱(endocytic) 수용체를 가진 망내세포(reticuloendothelial cell) 계를 표적으로 사용될 수 있다.

이러한 개시 내용을 본 당업자는 히알우로네이트 합성효소에 의해 만들어진 히알우론산 중합체의 크기 분포를 상이한 크기로 조절하는 몇가지 방법이 있음을 잘 알 것이다. 우선, 생성물 크기의 동역학적 조절은 온도를 낮추고 효소 반응시간을 줄임으로써 그리고 하나 또는 두개의 당 뉴클레오티드 기질의 농도를 줄임으로써 변경될 수 있다. 이들 변수중 어느 하나 또는 모두를 줄이는 것은 더 적은 량 그리고 더 작은 크기의 히알우론산 생성물을 제공할 것이다. 이러한 방법의 단점은 생성물의 수율이 또한 줄어들 것이고 날짜마다 또는 뱃치마다(batch by batch) 재현성을 이루기가 어려울 수 있다는 것이다.

둘째, 큰 히알우론산 생성물을 합성하는 효소의 내재적 능력의 변경. 단백질에 대한 변경은 특정 아미노산의 치환, 결실 및 부가(또는 물질대사 과정을 통한 보철기(prosthetic groups)의 도입)를 포함하는 재조합 DNA 수법에 의해 조작될 수 있다. 내재적으로 느린 효소를 초래하는 그러한 변화는 동역학적 수단에 의해 히알우론산 크기의 재현가능한 조절을 가능하게한다. 최종 히알우론산 크기 분포는 서열내 특정 아미노산에 의존하는 효소의 어떤 특성에 의해 결정된다. 연쇄상구균 효소와 진핵생물 히알우론산 합성효소 사이에서 완전히 보존되는 잔기 20% 중에, 효소가 만들 수 있는 히알우론산 중합체의 크기를 조절하거나 크게 영향을 미치는 특정 위치에 한 세트의 아미노산이 있다. 이들 잔기중 어떠한 것에서의 특이적 변경은 변경된 크기 분포를 가진 HA 생성물을 생산하는 변경된 HAS를 생산할 수 있다. 히알우론산이 방출되기 전에 효소가 만드는 히알우론산의 내재적 크기를 줄이는 seHAS, spHAS, pmHAS 또는 cvHAS에 대한 유전자조작된 변화는, 천연 효소보다 작거나 또는 잠재적으로 큰 크기의 히알우론산 생성물을 생산할 강력한 수단을 제공할 것이다.

끝으로, 더 큰 분자량의 히알우론산을 특정 히알우로니다제에 의해 분해되도록 하여 더 작은 분자량의 히알우론산을 만든다. 그러나, 이러한 실행은 재현성을 이루기가 매우 어렵고, 히알우론산을 매우 세심하게 재정제하여 히알우로니다제와 원치않는 분해 산물을 제거해야 한다.

도 4에 도시된 바와 같이, 히알우로난 합성효소는 특히 보통 야생형 효소와 다른, 특히 작은 크기의 히알우론산 중합체를 생산하기 위해 조작될 수 있다. 도면은, 일련의 spHAS 효소에 대한 HA 크기(백만 달톤으로, 분자량 측정)의 분포를 보여주고 있고, 이들 효소의 각각은 천연 효소와 하나의 아미노산 변경을 갖기 위하여 부위 특이적 돌연변이에 의해 조작되었다. 각각은 알라닌으로 대체된 다른 시스테인 잔기를 가지고 있다. 개방(채워지지 않은) 표시를 가진 다섯 개 곡선의 집단은 이하의 spHAS 단백질을 나타낸다: 야생형, C124A, C261A, C366A 및 C402A. 채워진 둥근 모양(흑색 원)은 오직 부분적으로 활성인 빈약하게 발현된 C225A 단백질을 나타낸다.

채워진(흑색) 삼각형은 C280A spHAS 단백질이고 이것은 보통의 효소 또는 다른 변종보다 더 작은 범위의 HA 중합체를 합성하는 것으로 확인된다. 이러한 감축 실행은 다양한 크기의 HA 생성물 크기를 합성하기 위하여 히알우로네이트 합성효소를 조작하는 것이 용이함을 보여준다. 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 seHAS, pmHAS 및 cvHAS 유전자는, 소망하는 범위의 HA 생성물 크기를 합성하는 효소를 생산하기 위해 부위 특이적 돌연변이에 의해 조정될 수 있다.

구조적으로 변형된 히알우론산은, 소망하는 HAS 또는 spHAS에서 특정 아미노산을 변화시킴으로써 히알우론산 생성물의 크기 분포를 변경하는 것과 개념적으로 차이가 없다. N-아세틸기가 UDP-GlcN을 결실하고 있거나 또는 다른 화학적으로 유용한 기로 치환된 UPD-GlcNAc의 유도체가 특히 유용한 것으로 예상된다. 강한 기질 특이성은 보존되는 20%중 특정 집합의 아미노산에 좌우되어야만 한다. 하나 또는 그 이상의 이들 잔기에 대한 특이적 변경은 천연 효소보다 하나 또는 그 이상의 기질로 덜 특이적으로 상호작용하는 기능적 합성효소를 만들어낸다. 그런 다음, 이들 변형된 효소는, 다른 화학들이 하기 목적을 위해 고용되도록 설정된 당 유도체를 혼입하기 위하여 천연 또는 특정한 당 뉴클레오티드를 번갈아 이용할 수 있다: (i) 일반적인 또는 표적으로 하는 약물 전달, 방사능적 과정 등을 위해 구조적으로 변형된 히알우론산에 특정 약물, 단백질 또는 독소를 공유적으로 결합시키고; (ii) 더 강한 물리적 특성을 가진 겔 또는 다른 3차원 생물질을 이루기위해 히알우론산 그 자체 또는 다른 지지체(supports)에 공유적으로 교차 결합시키며; 또 (iii) 히알우론산을 표면에 공유적으로 결합시켜 생체적합성 필름 또는 단막(monolayer)을 제조.

세균도 히알우론산을 제조하기 위해 또한 조작될 수 있다. 일 예로, 본 발명자들은 당 뉴클레오티드 전구체들의 하나를 위한 유전자 뿐만 아니라 spHAS 유전자를 함유하는 고초균 균주를 창제하였다. 본 발명자들은 이 세균이 인간 용도용 생성물의 생산을 위해 유전공학 산업계에서 자주 사용되기 때문에 선택했다. 이들 세균은 야생형 천연 종을 사용하여 현재 얻을 수 있는 것보다 더 많은 양으로 히알우론산을 생산할 수 있는 세균 세대를 위한 1세대 원형(prototype)으로 의도되었다. 본 발명자는 이들 유전자의 다중 복제물을 제출한다.

예컨대, 3개의 고초균 균주가 화농연쇄상구균의 히알우로난 합성효소 (spHAS) 및 UDP-글루코오스 탈수소효소 유전자 1 또는 2개 모두를 함유하도록 제조하고, 그 결과를 표 Ⅱ-B에 나타낸다. HA를 검출하고 정량하기 위한 민감성 상업적 방사분석을 기초로하여, 상기 2개 유전자 모두를 갖는 균주 (균주 #3)가 HA를 만들어 배지속으로 분비하는 것으로 측정되었다. 양친 균주 또는 탈수소효소 유전자만을 갖는 균주 (균주 #1)는 HA를 만들지 않는다. spHAS 유전자만을 함유하는 균주 #2는 균주 #3이 만들어 내는 양의 단지 10%의 HA를 만든다. 아가로오스 겔 전기영동에 의하면 균주 #3에 의해 배지속으로 분비된 HA는 매우 고분자량인 것으로 나타났다.

표 Ⅱ-B

(*) 대부분의 HA는 배지 중에 있지만, 일부는 세포와 결합되어 있었다; HA는 파마시아사로부터 구입한 HA 시험 50 키트를 이용하여 측정하였다.

이 실험에서는 단백질 발현을 유도하기 위해 흔히 상기 유전자와 함께 발견되는 연쇄상구균의 프로모터를 이용하였다. 고초균 프로모터의 조절 하에 spHAS 또는 seHAS 리딩 프레임 (reading frame)을 갖는 균주를 작성한다면 보다 우수한 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 사용된 벡터는 고초균 중에서 중간 정도의 복제수 및 에리쓰로마이신 내성 (고초균에서 8㎍/㎖ 또는 대장균에서 175㎍/㎖에 대해 내성을 가능케 함) 유전자를 갖는 그램 양성/대장균 셔틀 벡터이다. 사용된 고초균 숙주 균주는 트립토판을 필요로 하거나 그렇지 않은 경우 야생형인 BGSC로부터의 1Al이며, 이는 포자 형성할 수 있다. 세포 성장 및 HA 생산은 트립토판, 글루코오스, 미량 원소 및 에리쓰로마이신 (8㎍/㎖)이 첨가된 스피지젠스 미니멀 (Spizizens Minimal) 배지에서 실시하였다. 성장은 배지가 고갈될 때까지 (~36 시간) 급격한 교반 하의 32℃에서 일어났다.

상기 내용은 보통 히알우론산을 만들지 않았던 생물공학 처리된 세포가 spHAS 유전자를 갖도록 형질전환되면 히알우론산을 생산하도록 수용능을 갖는 것을 나타낸다. seHAS는 또한 비-히알우론산 생산 세균속으로 도입되어 히알우론산을 생산할 수 있는 생물공학 처리된 세균 균주를 생성할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 서열 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 정제된 조성물이다. 본 발명에서 사용된 ″정제된″이란 용어는 HAS 단백질 또는 적당하게 변형된 HAS 단백질 (예컨대, [HIS]₆꼬리를 함유함)이 자연적으로 얻을 수 있는 상태에 비해, 즉 이 경우 원핵생물 세포 추출물에서 그의 순도와 비교하여 어느 정도 정제되어 있는 HAS 단백질 조성물을 의미한다. HAS 단백질은 본 발명에 비추어 당업자에게 알려진 바와 같이, 연쇄상구균, 파스투렐라 (pasturella), 클로렐라 (chlorella) 바이러스, 환자 시편, 재조합 세포, 감염된 조직 및 세포외 매트릭스 중에 고 수준의 히알우로네이트를 함유하는 조직의 분리된 부차 집단 (subpopulation) 등으로부터 분리될 수 있다. 예컨대, 재조합 seHAS 또는 spHAS 단백질은 대장균 전체 막 단백질의 약 10%를 구성한다. 따라서, 정제된 HAS 단백질 조성물은 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 아닌 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (도 5 참조)를 의미한다.

게놈 DNA 또는 cDAN로부터 seHAS 유전자를 발현하기 위해서, HAS 단백질의 재조합을 위한 발현계를 준비하도록 추진할 수 있다. 원핵생물계 또는 진핵생물계에서 발현하기 위한 DNA 절편을 제조하는 것은 재조합 발현 분야의 당업자에게 일반적으로 알려진 기술로써 실시할 수 있다.

HAS는 진핵생물 발현계에서 성공적으로 발현될 수 있으나, 본 발명자들은 세균 발현계가 모든 용도를 위한 HAS 제조에 사용될 수 있다는 것을 단언한다. 세균에서의 발현은 효용, 생산 비용 및 그에 의해 얻어진 물질의 양 면에서 진핵생물에서의 발현에 비하여 훨씬 유익할 것이라고 여겨진다.

연쇄상구균 히알우로난 합성효소 (seHAS 및 spHAS)의 정제는 표 3 및 도 6에 나타낸다. 정제 도식의 각종 단계로부터의 분획을 12.5% 겔 상의 SDS-PAGE에 의해 분석한 후, 쿠마씨 브릴리언트 블루 R-250로 염색하였다. 레인: 분자량 마커; 1, 재조합 seHAS-H6을 함유하는 전체 대장균 막; 2, 막의 세제 용해 후 불용성 분획; 3, 세제 용해된 분획; 4. Ni-NTA 크로마토그래피 수지로부터의 분획; 5 내지 9, 칼럼의 5개 연속적인 세척액 (각각 2개의 칼럼 부피); 10, 단일 밴드인 순수한 HA 합성효소 용출액.

표 Ⅲ

HAS를 암호화하는 DNA 절편을 갖는 숙주 세포를 형질전환하는 것이 HAS 단백질을 얻기 위한 편리한 방법이다. 물론, 숙주 세포가 게놈 전사물을 가공하여 작용성 mRNA을 얻어 이를 단백질로 번역하므로, cDNA, 게놈 서열 및 이들의 조합물은 진핵생물 발현에 적당하다.

본 발명의 다른 구체예는 서열 2에 따른 또는 보존되거나 반-보존된 아미노산 변화를 갖고 기능적으로 서열 2와 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 성장시키는 것을 포함하는 단백질 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 숙주 세포는 핵산 발현 및 단백질 생성 후, 이렇게 생성된 단백질을 회수하는 조건하에서 성장될 것이다. 숙주 세포를 포함한 HAS 및 궁극적으로 HA의 생산, 핵산 발현을 위한 조건, 단백질 제조 및 회수는 seHAS 유전자 및 seHAS 유전자 단백질 산물 HAS에 대한 본 발명 및 본 발명에 기재된 방법을 참고한다면 당업자자가 잘 알 수 있을 것이다.

히알우론산 발현을 위한 바람직한 숙주는 에스. 에쿠이시밀리스 (S. equisimilis) 및 다른 적당한 연쇄상구균 종과 같은 원핵생물이다. 그러나, HA는 간균속, 장구균속 또는 대장균속과 같은 재조합 HA 합성효소를 발현하는 이중 숙주세포에 의해 합성될 수 있다고 알려져 있다. 본 발명의 HA 합성효소 발현을 위한 가장 바람직한 숙주는 락토쿠커스 (Lactococcus) 종, 고초균 또는 대장균과 같은 본 발명의 HAS 유전자로 형질전환된 세균이다.

이와 유사하게, 대부분의 진핵생물 발현 계 예컨대, 바큘로바이러스 (baculovirus) 계, 글루타민 합성효소 계, 디히드로폴레이트 환원 효소 (dihydrofolate reductase) 계, SV-40 계, 아데노바이러스 (adenovirus) 계, 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 계, 효모 계 등이 HAS의 발현을 위해 이용될 수 있다고 여겨진다. 이 방법으로 발현하기 위해서 코딩 서열을 프로모터 부근이나 또는 프로모터 제어 하에 위치시킬 수 있다. 그러한 프로모터의 제어하에 코딩 서열을 위치시키는 것 즉, 선택된 프로모터의 약 1 및 약 50 뉴클레오티드 ″하류″ 사이 (즉, 3')인 단백질의 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위인 5' 말단에 위치시키는 것은 당분야에 알려져 있다. 또한, pYES2와 같은 사카마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 효모 발현 벡터 계는 도 7에 나타난 바와 같이 GAL 프로모터 제어하에서 HAS를 생산한다. 도 7은 pYES2 플라스미드를 이용한 재조합 효모에서 spHAS 효소가 생산되는 것을 나타낸다. UDP-GlcA 및 UDP-GlcNAc를 공급할 때, 효소는 고분자량의 HA를 제조한다.

진핵생물 발현의 경우, 원래 클로닝된 절편 내에 함유되어 있지 않다면, HAS 유전자 또는 DNA를 포함하는 전사 유닛에 적당한 폴리아데닐화 부위 (예컨대, 5'-AATAAA-3')를 혼입시키는 것이 바람직하다. 전형적으로, 폴리 A 부가 부위는 전사 종결 전 위치에 있는 단백질의 종결 부위의 약 30 내지 2000 뉴클레오티드 ″하류″에 존재한다.

사실상 보통 사용되고 있는 숙주 세포가 본 발명의 HAS 발현과 관련하여 사용될 수 있다. 본 발명의 HAS cDNA 발현을 위한 바람직한 세포주의 예는 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7, RIN 및 MDCK 세포주와 같은 진핵 세포 발현에 전형적으로 이용되는 세포주를 들 수 있다. 이는 일반적으로 HAS 효소를 코딩화하고, 효소를 발현할 수 있는 재조합 DNA 절편을 포함하는 재조합 숙주를 제공하는 단계; 클로닝된 HAS 유전자 또는 cDNA의 전사와 히알우론산 생산을 허락하는 조건하의 배지에서 재조합 숙주를 배양하는 단계; 재조합 숙주로부터 HAS 효소 또는 분비된 히알우론산을 분리하고 정제하는 단계를 포함한다.

일반적으로, 클로닝된 HAS 유전자 또는 cDNA의 발현을 위한 적당한 조건은 사용된 프로모터, 벡터 및 숙주 계에 의존한다. 예컨대, lac 프로모터가 사용된 경우, 이소프로필티오갈락토사이드와 같은 lac 전사를 자극하는 물질을 삽입시킴으로써 전사를 유발하는 것이 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 클로닝된 seHAS 유전자는 도 5에 나타난 바와 같이, 대장균에서 HIS₆함유 단백질로 표현된다. 다른 프로모터가 사용될 경우, 전사를 유발하거나 상승 조절하기 위해 다른 물질을 필요로할 수 있다.

도 5는 대장균에서 재조합 seHAS 및 spHAS의 과발현을 도시한다. 막 단백질 (5mg/레인)은 환원 조건하에 10% (w/v) 겔을 이용한 SDS-PAGE에 의해 분획처리하였다. 쿠마시 블루 R-250으로 염색한 겔을 염색하고, 촬영하고, 스캔하며, 분자 역학 퍼스널 농도계 (모델 PDSI P60)를 이용하여 정량하였다. HA 합성효소의 위치를 화살표로 표시하였다. 레인 A는 천연 spHAS (그룹 A); 레인 C는 천연 seHAS; 레인 E는 재조합 seHAS; 레인 P는 재조합 spHAS; 레인 V는 벡터만이다. 사용된 표준은 Bio-rad low Mr이고, kDa로 나타내었다.

합성효소의 발현을 얻는 것 외에, 당 뉴클레오티드 전구체의 생합성에 필요한 효소를 코딩화하는 적당한 유전자를 포함하거나, N-아세틸글루코사민 또는 글루코사민 (GlcNAc 또는 GlcNH₂) 및 글루코오스 (Glc)와 같은 전구체 공급 효소를 위한 기질을 함유하는 성장 배지를 사용함으로써 HA 합성에 도움이 되는 환경을 제공하는 것이 바람직하다.

또한, 히알우로니다제 효소에 결함이 있는 숙주에 상기 유전자를 혼입함으로써, 효소에 의해 합성된 생성물이 배지에서 분해되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한 HA 산물을 최적화하도록 숙주를 선정해야 한다. 예컨대, 적당한 숙주는 HAS 효소를 보조하여 다량의 HA를 생산하게 하는 다량의 당 뉴클레오티드 전구체를 생산하는 것이다. 그러한 숙주는 자연적으로 발견되거나 또는 돌연변이나 재조합 DNA 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 당 뉴클레오티드 합성효소, 특히 UDP-GlcA 생산에 필요한 UDP-Glc 탈수소효소를 위한 유전자는 분리되거나 HAS 유전자 또는 cDNA와 함께 벡터에 혼입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 이러한 보조적 재조합 유전자 또는 cDNA 및 HA 생산을 증가시키는 유전자 산물 증폭제를 함유하는 숙주에 관한 것이다.

숙주 세포의 배양 방법은 특별히 한정되지는 않는다. 유용한 방법으로는 본 발명에 참고 문헌으로 포함된 미국 특허 제4,517,295호; 제4,801,539호; 제4,784,990호 또는 제4,780,414호가 있다. 에스 에쿠이시밀리스 (S. equisimilis)와 같은 원핵생물 숙주를 사용하는 경우, CO₂-풍부한 육즙 성장배지 중, 혐기성 조건하에 세균을 발효시키는 것이 바람직하다. 이는 호기성 조건하에서 보다 HA를 더 많이 생성하게 한다. 혐기성 환경에서 성장된 연쇄상구균 세포는 발열성 외독소를 생성하지 않는다. 다른 원핵생물 숙주에 사용될 수 있는 적당한 성장 조건은 본 발명에 비추어, 당업자에게 알려져 있다.

적당한 숙주가 작성되고 HA 생성을 위한 적당한 조건하에서 배양한 경우, 생성된 HA를 분리하는 것이 바람직하다. 전형적으로, HA는 분비되거나 그렇지 않으면 재조합 유기체에 의해 주변 배지속으로 흘러들어가므로 공지의 방법에 의해 배지로부터 쉽게 분리될 수 있다. 예컨대, HA는 에탄올과 같은 알코올에 의해 석출함으로써 배지로부터 분리함과 동시에 여과에 의해 세포 및 부스러기로부터 분리될 수 있다. 다른 석출제의 예로는 아세톤 또는 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC)와 같은 4차 유기 암모늄염을 들 수 있다.

HA를 분리하기 위한 바람직한 기술은 본 발명에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허 제4,517,295호에 기재되어 있으며, 발효의 마지막 단계에서 유기 카르복시산 및 트리클로로아세트산을 세균 현탁액에 부가하는 것을 개시하고 있다. 트리클로로아세트산은 세균 세포를 응집 및 괴사시켜 이들 세포 및 부스러기를 HA로부터 쉽게 분리시켜 바람직한 생성물을 얻을 수 있다. 청정한 상청액을 농축하고 투석하여 유기산을 포함한 저 분자량의 오염 물질을 제거하였다. 상기 방법은 0.22㎛ 기공 크기 필터를 함유하는 필터 카세트를 통한 여과법을 이용한다. 용액의 도전성이 약 0.5 ㏁으로 감소될 때까지 다이아필트레이션 (diafiltration)을 계속하였다.

농축시킨 HA는 과량의 시약 등급 에탄올 또는 기타 유기 용매를 부가함으로써 석출하고, 석출된 HA를 에탄올로 세척하고, 진공하에 건조하며, 동결건조시켜 에탄올을 제거하였다. 이어 HA를 pH 8의 붕산염 완충액에 재용해시키고, 4℃에서 CPC 또는 CETAB와 같은 다른 유기 암모늄염 혼합 트리메틸 암모늄 브로마이드 용액으로 석출하였다. 석출된 HA는 상기 참고 특허에 기재되어 있는 바와 같이 거친 여과법으로 회수하고, 1M NaCl에 재현탁시키며, 다이아필트레이션 및 농축시켰다. 얻어진 HA는 원하는 사용 목적에 따라 필터 살균되거나 적당한 염, 건조 분말 또는 멸균 용액으로 변환된다.

A. 사용될 수 있는 전형적인 유전자 조작 방법

심각한 세포막 장해가 없는 세포가 숙주 세포로서 사용되면, 당업자에게 잘 알려진 인산 칼슘 석출법에 의해 형질감염을 실행한다. 그러나, DNA를 세포속으로 주입하는 다른 방법, 즉 핵 주입법, 양이온 지질, 전기천공법, 원형질 융합법 또는 듀퐁 (1989)에 의해 개발된 바이소리스틱 (Biolistic)(tm) 바이오입자 전달 시스템과 같은 방법을 이용할 수 있다. 듀퐁 시스템의 이용시 장점은 형질전환 효율이 높은 것이다. 원핵생물 세포 또는 실질적인 세포벽 구조를 함유하는 세포가 이용된다면, 형질감염의 바람직한 방법은 염화 칼슘을 사용하여 칼슘 처리함으로써 수용능 또는 전기천공을 유발하는 것이다.

바람직한 코딩 서열 및 제어 서열을 함유하는 적당한 벡터의 제조는 표준 결찰법을 이용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 분해하고, 맞추며, 원하는 플라스미드를 제조하도록 하는 형태로 재결찰하였다. 분해는 적당한 완충액 중의 제한 효소로 처리함으로써 실시하였다. 일반적으로, 약 20㎖의 완충 용액 중에 약 1 유닛의 효소와 함께 약 1μg의 플라스미드 또는 DNA 분획을 사용하였다. 특별한 제한 효소를 위한 적당한 완충액 및 기질량은 제조업자에 의해 규정되어 있다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 걸린다.

배양 후, 페놀 및 클로로포름으로 추출함으로써 단백질을 제거하고, 에탄올로 석출함으로써 수성 분획으로부터 핵산을 회수하였다. 비접착 말단이 필요하다면, 제제물을 15℃에서 15분간 10 유닛의 중합효소 Ⅰ (Klenow)로 처리하고, 페놀-클로로포름으로 추출하며, 에탄올로 석출하였다. 결찰을 위해, 정확한 결합을 제공하도록 맞춰진 대략 동몰량의 성분을 0.5μg DNA당 약 10 유닛 T4 DNA 리가제를 사용하여 처리하였다. 분해된 벡터를 성분으로서 사용할 때, 세균의 알칼리성 포스파타제로 예비처리하는 것에 의해 절단된 벡터의 재결합을 방지할 수 있다.

제조된 플라미스에서 작용성 서열을 확인하기 위한 분석을 위해, 제 1 단계는 30 내지 32℃에서 형질전환하여 특별한 수용능을 갖는 대장균 SURE 세포 (Stratagene 제조) 제조에 클로닝함으로써 플라스미드 DNA를 증폭하였다. 둘째, 이 재조합 플라스미드를 사용하여 UDP-GlcA 전구체를 생산할 수 있는 대장균 K5 균주 Bi8337-41를 형질전환시키고, 적당한 항생제 내성으로 성공적인 형질전환체를 선택하였다. 이어, 형질전환체의 라이브러리로부터의 플라스미드를 HA 생산을 나타내는 세균 콜로니에 대해 스크리닝하였다. 이러한 콜로니를 선택하여 증폭하며, 플라스미드를 정제하고 제한 지도화로 분석하였다. 이어, 작용성 HAS 유전자를 나타내는 플라스미드를 당업자에게 알려진 다수의 서열 분석 방법으로 특성화하였다.

B. 수크로스와 숙주 세포 배양 및 벡터

일반적으로, 원핵생물을 DNA 서열의 초기 클로닝 및 본 발명에 유용한 벡터의 제조에 사용하였다. 적당한 공급원은 그램-양성 세포, 특히 그룹 C 연쇄상구균 균주로부터 유도된 것이다. 단일막이지만 스타필로코시 (Staphylococci) 및 스트렙토코시 (Streptococci)와 같은 두꺼운 세포벽을 갖는 세균은 그램-양성이었다. 대장균과 같은 그램-음성 세균은 하나의 세포 주위의 벽 보다는 두 개로 분리된 막을 함유한다. 그램-음성 생물은 얇은 세포벽을 가지려는 경향이 있다. 그램-양성 생물의 단일막은 그램-음성 세균의 내부 플라즈마 막과 유사하다. 바람직한 숙주 세포는 히알우로니다제 음성으로 돌연변이되거나 그렇지 않으면 억제된 연쇄상구균 균주이다 (EP144019, EP266578, EP244757). 특히 바람직한 연쇄상구균 균주의 예는 에스. 에쿠이시밀리스 및 에스. 주에피데미쿠스이다.

또한, 원핵생물이 발현에 이용될 수 있다. 고분자량을 갖는 HA 합성을 수반하는 형태로 HA 합성 효소를 발현시키기 위해, 에스. 에쿠이시밀리스 또는 에스. 주에피데미쿠스와 같은 연쇄상구균 종을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 균주 뿐만 아니라 대장균 W3110 (에프-, 람다-, 원영양주 ATCC No. 273325), 고초균과 같은 바실리 (bacilli) 또는 세라티아 마르세센스 (Serratia marcesscens)과 같은 엔테로박테리아세아애 (enterobacteriaceae) 는 ″수퍼″ HAS 함유 숙주를 생성하는데 이용할 수 있다.

일반적으로, 숙주 세포와 양립성이 있는 종으로부터 유래된 복제 기점 및 제어를 함유하는 플라스미드 벡터가 이러한 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 보통 복제 기점 뿐만 아니라 형질전환된 세포 중의 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 예컨대, 대장균은 전형적으로 pBR322 즉, 대장균 종으로부터 유도된 플라스미드를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하며, 따라서 형질전환된 세포를 분별하는 좋은 수단을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 pUC 플라스미드, 또는 다른 미생물의 플라스미드나 파아지는 자신의 단백질을 발현하기 위한 미생물에 의해 이용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.

재조합 DNA 제조에 가장 흔히 사용되는 이러한 프로모터는 lacZ 프로모터, tac 프로모터, T7 박테리오파아지 프로모터 및 트립토판 (trp) 프로모터 계를 포함한다. 이들은 가장 보편적으로 사용되지만, 다른 미생물 프로모터가 발견되고 이용되어 왔으며, 이들의 뉴클레오티드 서열과 관련된 세부 사항은 당업자가 이들을 플라스미드 벡터에 결찰할 수 있도록 공개되어 왔다. 또한 본 발명으로부터 통합된 벡터를 이용할 수 있다.

원핵생물 이외에, 효모 배양액과 같은 진핵 미생물도 이용될 수 있다. 다수의 다른 균주가 구입가능하지만, 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 베이커 효모가 가장 흔히 사용되는 진핵 미생물이다. 사카로마이세스 발현에 있어서, 예컨대 플라스미드 YRp7이 보통 사용된다. 이 플라스미드는 항상 트립토판 없이 성장할 수 있는 효모 결핍 돌연변이 균주의 선택 마커를 제공하는 trpl 유전자, 예컨대 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1을 함유한다. 이어, 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trpl 장애의 존재는 트립토판 부재의 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 효모 벡터 내의 적당한 프로모터 서열의 예는 갈락토오스 이용 유전자, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소 (예컨대, 에놀라제, 글리세알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 돌연변이 효소, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코오스 아이소머라제 및 글루코키나제)를 위한 프로모터를 들 수 있다.

적당한 발현 플라스미드 제조시, 이러한 유전자와 결합된 종결 서열은 또한 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공하도록 발현시키고자 하는 3' 서열의 발현 벡터 속으로 결찰된다. 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 장점을 갖는 다른 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 신진 대사와 관련된 분해성 효소 및 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 및 말토오스와 갈락토오스 이용과 관련된 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 혼화성 프로모터, 복제 기점 및 종결 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 적당하다.

미생물 외에, 다세포성 생물로부터 유도된 세포 배양액이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 그러한 세포 배양액은 척추생물 또는 비척추생물 배양액 어느 것으로부터도 작용가능하다. 그러나, 척추생물 세포의 배양액이 가장 관심을 끌고 있고, 배양액 중의 척추생물 세포 증식은 최근 통상적인 방법으로 되어 있다. 그러한 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, CHO 세포주 및 WI38, BHK, COS 및 MDCK 세포주를 들 수 있다.

포유동물 세포에 사용하기 위해, 바이러스성 물질에 의해 발현 벡터 상에 제어 기능이 제공된다. 예컨대, 흔히 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 소 유두종 바이러스이고, 가장 흔히 사용되는 것은 시미안 (Simian) 바이러스 40 (SV40)이다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 모두 바이러스성 복제 기점 SV40을 함유하는 분획으로서 바이러스로부터 쉽게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다. 또한 Hind Ⅲ 부위로부터 바이러스성 복제 기점에 위치된 Bg1Ⅰ부위까지의 약 250 bp 서열이 포함되어 있다면, 그 보다 작거나 큰 SV40 분획도 사용될 수 있다.

또한, 바람직한 유전자 서열과 보통 잘 결합되는 프로모터 또는 숙주 세포 계와 양립성이 있는 제어 서열을 이용할 수 있다. 복제 기점은 SV40 또는 다른 바이러스성 (아데노, BPV) 공급원으로부터 유도될 수 있는 외인성 기점을 포함하는 벡터를 제조하거나 또는 숙주 세포 염색체상 복제 메커니즘에 의해 제공될 수 있다. 만약 벡터가 숙주 세포 염색체 속으로 통합되면, 후반부 메커니즘이 충분하다.

C. 고도로 캡슐화된 그룹 C 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스가 (Streptococcus equisimilis)의 균주로부터 HA 합성효소 유전자의 분리

seHAS로 표시된 암호화된 단백질은 417개의 아미노산 (47,778의 분자량 및 9.1의 pI)이고, 지금까지 확인된 HAS류중 가장 적은 것이었다 (도 2). 또한 seHAS는 SDS-PAGE (M_r~42kDa)에서 매우 이례적으로 빨리 이동한다 (도 5 및 도 8).

도 8은 특정 항체를 이용한 재조합 seHAS의 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 그래프이다. 재조합 seHAS (E; 레인 2, 7 및 9) 또는 spHAS (P; 레인 3, 6, 8 및 10)을 함유하는 그룹 C (C; 레인 1) 또는 그룹 A (A; 레인 4) 연쇄상구균 막 및 대장균 막 (9mg/레인)을 SDS-PAGE에 의해 분획처리하고 니트로셀룰로오스로 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 스트립을 탐침하고, 하기 영역의 spHAS에 대해 유발된 정제된 IgG 분획을 이용하여 본 발명에 기재된 바와 같이 개발하였다: 중앙 도메인 펩티드 E¹⁴⁷-T¹⁶¹(레인 1-4); C-말단 펩티드 (레인 5-6); 수용능 단백질 (레인 7 및 8); 재조합 중앙 도메인 (레인 9 및 10). 벡터만으로 형질전환된 세포로부터의 면역성이 없는 IgG 또는 막은 레인 5와 같이 얼룩이 없었다.

seHAS 및 spHAS 단백질을 암호화하는 서열 (미국 특허 제08/899,940호에서 이미 밝혀짐)은 72% 상동이다. seHAS의 추론 단백질 서열은 합성 펩티드 항체와의 반응성에 의해 확인하였다 (도 8). 대장균에 발현된 재조합 seHAS를 주요 단백질로서 막에 회수하고 (도 5), 시험관 내에서 UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA 존재하에 다량의 HA를 합성하였다 (도 9).

도 9는 seHAs 및 spHASdp 의해 생성된 HA 크기 분포에 대한 동력학 분석을 나타낸다. 동량의 seHAS 또는 spHAS 단백질을 함유하는 대장균 막을 본 발명에 기재되어 있는 바와 같이 1.35mM UDP-[¹⁴C] GlcA (1.3 ×10³dpm/nmol) 및 3.0mM UDP-GlcNAc와 37℃에서 배양시켰다. 이들 기질의 농도는 각각의 Km값보다 15배 진했다. 0.5, 1.0 및 60분후 얻은 시료를 SDS로 처리하고 Sephacryl S400 HR 상에서크로마토그래피하였다. 칼럼의 분회 범위 (분획 12 내지 24)에 있는 HA 프로필을 각각의 분획 중의 전체 HA의 퍼센트로 표준화하였다. 상부 패널 중 화살표 이상의 값은 다운 다각 (Dawn multiangle) 레이저 광 분산 장치 (Wyatt Technology Corp. 제조)를 이용하여 각각 실험함으로써 직접 얻은 HA의 MWs (백만 단위)이다. 0.5분 (○,●), 1.0분 (□,■) 및 60분 ( , ▲)에서 seHASdp (●,■,▲) 및 spHAS (○,□, )에 의해 합성된 HA의 크기 분포를 상기와 같이 표시하였다. 이 분석은 seHAS 및 spHAS가 그들이 합성한 HA 사슬의 크기 분포 면에서 실질적으로 동일하다는 것을 나타낸다 (도 9). seHAS는 HA 생성능면에서 spHAS의 2배 빠르다.

C.1 세균 균주 및 벡터

점액성 그룹 C 균주 D181; (스트렙토코커스 에쿠이시밀리스)는 록펠러 대학 콜렉션으로부터 얻었다. 대장균 숙주 균주 슈어 (Sure) 및 XL1-블루 MRF'는 스트라타겐사로부터 구입하였고 균주 Top10F'는 인비트로젠사로부터 구입하였다. 특별히 언급하지 않으면, 연쇄상구균은 THY에서 성장시키고, 대장균 균주는 LB 배지에서 성장시켰다. pKK-223 발현 벡터는 파마시아사로부터 구입하였고, PCR 2.1 클로닝 벡터는 인비트로젠사로부터 구입하였으며, 예비 분해된 λZap 발현 TM Bam HI/CIAP 벡터는 스트라타겐사로부터 구입하였다.

C.2 재조합 DNA 및 클로닝

카파론 (Caparon) 및 스코트 (Scott) 방법을 이용하여 분리된 (당업자에게 공지된 기술) 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스로부터 얻은 고 분자량의 게놈 DNA를 Sau3Al을 이용하여 부분적으로 분해시켜 2 내지 12 kb의 평균 크기로 만들었다. 분해된 DNA를 에탄올로 석출하고, 세척하며, Bam HI/CIAPλ Zao 발현 벡터에 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 프로메가사로부터 얻은 Packagene TM 추출물로 파아지에 패키징하였다. 패키징된 파아지 라이브러리의 적정 농도를 숙주로서 XL1-블루 MRF' 대장균을 이용하여 확인하였다.

C.3 변형 PCR 증폭

spHAS (화농연쇄상구균), DG42 (제노푸스 라에비스 (Zenopus laevis) HAS; 19) 및 nodC 리조비움 멜리오터 (Rhizobium meliloti 소결절형성 인자;20) 중의 보존된 서열을 기초로 변형 올리고뉴클레오티드를 디자인하고, 주형으로서 D181 게놈 DNA를 이용하여 PCR 증폭에 사용하였다. 증폭 조건은 94℃에서 1분, 44℃에서 1분, 72℃에서 1.5분 후 마지막으로 72℃에서 10분의 34주기였다. 올리고뉴클레오티드 HADRF1.5'-GAY MGA YRT VTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG-3' (서열 20; 센스 가닥)는 서열 D²⁵⁹RCLTNYAIOL (서열 9; spHAS)에 상응한다. 올리고뉴클레오티드 HACTR1.5'-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3' (서열 21; 안티센스 가닥)는 영역 C⁴⁰⁴TIKNTEWGTR (서열 10; spHAS)에 상응한다. 특정 위치에서 염기의 축퇴는 표 Ⅳ에 열거된 축퇴 염기에 대한 코드로 IUPAC에 의해 인정된 명칭법으로 표시하였다.

표 Ⅳ

이러한 두 개의 올리고뉴클레오티드는 459 bp PCR 산물을 제공하고, 이는 아가로오스 겔 상에서 분리하여 BIO-101 Seneclean 키트를 이용하여 정제하였다. 이 단편을 제조업자의 지시에 따라 숙주로서 TOP 10 F' 세포를 이용하여 PCR 2.1 벡터에 클로닝하였다. 이중 가닥의 플라스미드 DNA를 QIAfilter plasmid Midi 키트 (Qiagen 제조)를 이용하여 대장균 (TOP 10F')으로부터 정제하였다. 2개의 기타 변성 센스 프라이머도 또한 합성하였다: HAVAF1, 5'-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA-3'(서열 22, spHAS의 영역 V⁶⁶AAVIPSYNE (서열 11)에 해당) 및 HAVDF1, 5'-GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3'(서열 23, spHAS의 V¹⁰⁰DDGSSNTD (서열 12)를 기본으로 함). 2개의 독특한 안티센스 프라이머는 459 bp PCR 산물의 서열을 기본으로 합성되었다. 이들 두 프라이머는 다음과 같다: D181.2, 5'-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3'(서열 13) 및 D181.4, 5'-TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC-3'(서열 14). 2개의 변성 센스 프라이머의 각각은 D181 게놈 DNA를 증폭하기 위해 D181.2 또는 D181.4와 함께 사용될 때 예상된 크기의 PCR 산물을 얻는다. 4개의 PCR 생성물은 상기와 동일한 방법을 이용하여 클로닝 및 서열결정하였다. 각각의 PCR 산물에 대하여, 콘센서스 서열을 유도하기 위해, 서로 다른 6개의 클론으로부터 얻어진 서열을 비교하였다. 이와 같이 하여 본 발명자들은 spHAS에 대해 높은 상동성을 갖는 연속상 ORF와 함께 1042 bp 서열을 얻었다.

C.4 라이브러리 스크리닝

라이브러리를 스크리닝하기 위해서 2개의 분자 탐침을 사용하였다: 클론된 459 bp PCR 산물과 올리고뉴클레오티드 D181.5(5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3' (서열 15); 1042 bp 서열로부터 유도). 459 bp 산물은 제조자 지침에 따라 Prime-It 11 랜덤 프라이머 라벨링 키트(스트라타겐사 제조)을 사용하여 방사능표지시켰다. 올리고뉴클레오티드는 [Υ³²P]ATP를 사용하는 Kinace-It Kinasing 키트(스트라타겐사 제조)에 의해 표지되었다. 방사능표지된 생성물은 NucTrap Push 칼럼(스트라타겐사 제조) 상에서 표지되지 않은 물질로부터 분리시켰다. 올리고탐침은 서던(Southern) 블롯 상에 d181 게놈 분해물로 특이적으로 혼성시켰다. λ파아지 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 흡수된 파아지를 함유하는 니트로셀룰로오스 막 상에 숙주 (3000 플라크/플레이트)로서 XLBLUE MRF'를 사용하고, 60℃에서 예비 혼성화시킨 다음, 제조자의 지시에 따라 80℃에서 QuikHyb 혼성화 용액(스트라타겐사 제조)중에서 5'-말단 표지된 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켰다.

실온에서 15분 동안 2x SSC 완충액 및 0.1%(w/v) SDS를 사용하여 막을 세척하고, 60℃에서 30분동안 0.1xSSC 완충액 및 0.1%(w/v) SDS로 세척한 후, -70℃에서 Bio-Max MS 필름에 철야 노출시켰다. 양성 플라크를 다시 플레이트에 다시 가한 후 2번 재스크리닝하였다. 벡터 프라이머를 갖는 순수 양성 파아지는 서로 다른 3개의 삽입물 크기를 나타냈다.

벡터 프라이머 및 클론된 1042 bp 서열의 서로 다른 영역으로부터 얻어진 프라이머의 조합물을 사용한 PCR은 3개의 서로 다른 파아지중 하나만이 완전한 HAS 유전자를 가지고 있음을 나타내었다. 이 파아지내 삽입물 크기는 6.5 kb이었다. 선택된 파아지 라이브러리 클론으로부터 자동절제에 의해 삽입물을 플라스미드 형태로 서브클로닝하려고 시도하였으나 실패하였다. 그러므로, 순수한 양성 파아지 DNA에 PCR 법을 다시 적용하여 ORF의 5' 및 3' 말단을 얻었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 D181.3 (5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3' (서열 16)) 및 T3(벡터 프라이머)는 3kb 생성물을 증폭하였으며, 올리고뉴클레오티드 프라이머 D181.5 및 T7(벡터 프라이머)는 2.5kb 생성물을 증폭하였다. ORF의 5' 및 3'-말단 서열은 상기 2개 생성물을 서열결정함으로써 얻어졌다. 모든 PCR 생성물 서열을 분석하여 1254 bp seHAS 유전자의 ORF를 재작성하였다.

C.5 seHAS의 발현 클로닝

seHAS의 개시 및 정지 코돈 영역에서 센스 올리고뉴클레오티드 (5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3' (서열 17))에서의 EcoR1 제한 부위와 안티센스 올리고뉴클레오티드(5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3'(서열 18))에서의 Pst1 부위를 함유하도록 프라이머를 고안하였다. 이들 프라이머는 D181 게놈 DNA 뿐만 아니라 순수한 혼성화-양성 파아지로부터 1.2 kb PCR 생성물을 증폭하였다. 1.2 kb 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제한 후, Pst1 및 EcoR1으로 분해시킨 다음, Pst1- 및 EcoR1-분해된 pKK223 벡터에 클로닝하였다. 결찰된 벡터는 30℃에서 성장한 대장균 SURE 세포로 형질전환시켰다. 이 단계는, 다른 숙주 세포나 더 높은 온도가 클로닝된 삽입물의 삭제를 유발하게 되기 때문에, 실제적으로 중요하다. 콜로니를 분리하여 그들의 pDNA를 정제하였다. 6개의 콜로니(즉, a,b,c,d,e 및 f) 중에서 5개가 정확한 크기의 삽입물을 가졌으나, 하나는 삽입물을 갖지 않았다.

C.6 HA 합성효소 활성

5개의 상기 클론으로부터 제조된 막에 대하여 HA 합성효소 활성을 분석하였다. 새로운 로그(log)상 세포 3000g를 수집하여 4℃의 PBS로 세척하고, 막을 공지의 변형된 원형질법에 의해 분리하였다. 화농연쇄구균 및 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis)로부터 얻은 막 제제는 또한 서로 다른 변형된 원형질법에 의해 얻었다. 20 mM MgCl₂, 1 mM DTE, 120 μM UDP-GlcA 및 300μM UDP-GlcNAc와 함께 37℃ 및 pH 7.0의 인산나트륨 및 칼륨 50 mM중에서 막을 배양하였다. UDP-[¹⁴C]GlcA (318 mCi/mmol; ICN) 및/또는 UDP-[³H]GlcNAc (29.2 Ci/mmol NEN)을 사용하여 당의 도입을 모니터링하였다. 반응은 최종 농도가 2%(w/v)로 될 때까지 SDS를 첨가함으로써 종결되었다. 생성물 HA는 종이 크로마토그래피를 전개시킴으로써 전구체로부터 분리되어 공급원에서 도입된 방사능을 측정함으로써 결정되었다.

C.7 겔 여과 분석

재조합 seHAS 또는 spHAS를 함유하는 막에 의해 시험관에서 제조된 방사능표지된 HA는 Sephacryl S500 HR(파마시아 바이오텍 인코포레이티드 제조)의 칼럼(0.9 x 40 cm) 상의 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 시료(0.4ml, 200 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 8.0, + 0.5% SDS)을 200 mM의 NaCl, 5 mM Tris-HCl 및 pH 8.0으로 용출시킨 후, 0.5 ml 분획을¹⁴C 및/또는³H 방사능에 대해 평가하였다. HA 다당류의 진위는 스트렙토마이세스 히알우로리티쿠스(EC 4.2.2.1)의 HA-특이 히알우로네이트 융해효소로 37℃에서 3시간동안 별도의 동일한 시료를 처리함으로써 평가하였다. 분해물을 겔 여과시켰다.

C.8 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅

SDS-PAGE를 라엠리 (Laemmli)법에 따라 실시하였다. ″Bio-Rad mini Transblot″ 장치를 사용하여 표준 블로팅 완충액 내에서 20% 메탄올로 니트로셀룰로오스에 대한 전기전달(electrotransfer)을 실시하였다. 블롯을 TBS 내의 2% BSA로 블로킹시켰다. 단백질 A/G 알칼리성 포스파타제 콘주게이트(Pierce 제조) 및 p-니트로블루 테트라졸리움/5-브로모-4-클로로-3 인돌일 포스페이트 p-톨루이딘 염을 검출에 사용하였다.

C.9 DNA 서열 및 분석

형광표지된 벡터 프라이머를 사용하여 양쪽 가닥상에 플라스미드의 서열을 결정하였다. 서열결정 반응은 형광표지된 프라이머 (7-deazaG와 함께)용 Thermosequenase^TM키트를 사용하여 실시하였다. 시료를 Pharmacia ALP Express DNA 서열결정기 상에서 전기영동시켜 ALF Manager Software v3.02로 데이터를 분석하였다. 삽입물의 내부 영역은 ABI Prism 377 (Software version 2.1.1)을 사용하여 내부 프라이머로 서열이 결정되었다. 불명확한 영역의 서열은 Sequenase^TM7-deaza-DNA 중합효소, 7-deaza GTP 마스터 믹스(USB) 및 [α-³⁵S] dATP(Amersham Life Sciences 제조)를 수동으로 이용하여 결정하였다. 얻어진 서열은 DNASIS, v2.1 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd. 제)를 사용하여 집계 및 분석되었다. 이 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 Genbank 및 기타 데이터베이스 내의 기타 서열과 비교하였다.

C.10 seHAS의 상동성

seHAS의 상동성은 spHAS, DG42 (지금은 발생적으로 조절되는 엑스. 라애비스(X. laevis) HAS로 공지되어 있고 x1HAS로 표시함) 및 NodC (리조븀 β-GlcNAc 트랜스퍼라제) 중에서 높은 상동성의 수개 영역을 기본으로한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR법에 의해 확인되었다. x1HAS 및 NodC 단백질은 각각 spHAS 와 약 50% 및 약10% 상동이다. 이러한 방법에 의하면 서열이 spHAS와 약 66.4% 상동인 459 bp PCR 생성물을 얻었는 데, 이는 그룹 A(spHAS) HA 합성효소 유전자의 그룹 C 동족체(seHAS)가 확인되었다는 것을 나타낸다. 유전자의 완전한 코딩 영역은 유사한 PCR을 기본한 방법을 이용함으로써 재작성되었다. PCR 프라이머의 최종 세트는 게놈 DNA로부터 완전한 ORF를 증폭시키는 데 사용되었다. 이 1.2 kb PCR 단편이 발현 벡터 pKK223에 혼입되어 E. coli SURE 세포로 형질전환되었을 때, HA 합성 활성은 시험된 5개 콜로니의 5개로부터 분리된 막에서 입증되었다.

재작성된 유전자의 ORF는 데이터베이스에 없는 417 아미노산의 새로운 예상 단백질을 암호화하고, spHAS보다 2개의 아미노산이 더 짧다. 2개의 세균성 단백질이 72% 상동이고 핵산 서열은 70% 상동이다. seHAS 단백질의 예상된 분자량은 47,778이고, 예상된 등전점은 pH 9.1이다. 최근에 확인된 3개의 포유동물 HAS (muHAS1, muHAS2, muHAS3, FIG.2)는 세균성 단백질과 유사하다. 2 그룹들 사이의 전체적인 상동성은 약 28∼31%이고, seHAS에서 수많은 아미노산은 진핵생물 HAS(예, K/R 또는 D/E 치환)의 것들과 함께 매우 많이 보존된다. A98R, PBCY-1 HAS는 포유동물 HAS와 28∼33% 상동이고 지질 막 내에서 유사한 토폴로지를 갖는 것으로 예상된다. 포유동물종 내에서 동일한 군의 HAS는 거의 상동이다(예를 들면, muHAS1과 huHAS1은 95% 상동이고, muHAS2 및 huHAS2는 98% 상동이다). 그러나, 도3에서 나타낸 바와 같이, 동일한 종내에 일을지라도 서로 다른 HAS 군은 더 다르다(예를 들면, muHAS1과 muHAS2은 53% 상동이고, muHAS1 및 muHAS3는 57% 상동이고, muHAS2과 muHAS3은 71% 상동이다).

도 10은 seHAS에 대한 친수성과 예상된 막 토폴로지를 도시한다. 연쇄상구균의 그룹 C HAS에 대한 친수성 플럿은 DNAs_Is를 이용하는 Kyte 및 Doolittle 법(J.Mol. Biol. 157, 105, 1982)에 의해 작성되었다. 이 단백질은 막내재 단백질로 예상된다.

도 11은 막에서 seHAS의 토폴로지 기관에 대한 모델을 나타낸다. 단백질의 제안된 토폴로지는 차지-인(charge-in) 규정과 일치하고 큰 중앙 도메인을 내부에 놓는다. 이 도메인은 효소의 촉매적 기능과 기질 결합을 대부분 포함하는 것 같다. 모든 HAS 군 멤버에 보존되는 seHAS 내의 Cys²²⁶뿐만아니라 기타 3개의 시스테인들은 중앙 도메인에 나타난다. Cys²⁸¹은 효소에 의해 합성된 HA 생성물의 크기 분포를 현저하게 바꿀 수 있는 중요한 잔류물이다.

seHAS에 대해 예상된 전체적인 막 토폴로지는 지금까지 보고된 진핵생물 spHAS 및 HASs의 토폴로지와 동일하다. 단백질은 아미노 말단에 2개의 예상되는 막내외 도메인과 카르복시 말단에 2∼3개의 막-결합 또는 막내외 도메인을 갖는다. 2개의 연쇄상구균 효소에 대한 친수성 플롯은 사실상 동일하고, seHAS내의 K³¹³-K⁴⁰⁶(spHA내의 K³¹³-K⁴⁰⁵)에서 약 90 잔류물의 극히 소수성인 영역의 토폴로지를 예상하기가 어렵다는 것을 나타낸다.

seHAS는 대장균 세포에서 효과적으로 발현되었다. 총 막 단백질의 약 10%는 SDS-PAGE 겔을 염색시킴으로써 평가된 바와 같이 seHAS 이었다(도 5 참조). 42 kD에서 눈에 띄는 seHAS 밴드는 벡터만 있는 대조용 레인에서 양적으로 손실된다. 이렇게 예상 외로 높은 수준의 막 단백질의 발현은 또한 SURE 세포에서 동일한 벡터를 사용함으로써 spHAS에 대해서도 확인되었다. 막 단백질의 약 8%는 E. coli SURE 세포에서 spHAS이다. 반면에, 그룹 C 막에서 seHAS의 양은 총 막 단백질의 1% 이하이다. 그룹 A 막에서 spHAS는 거의 검출될 수 없다. E. coli SURE 세포에서 발현된 재조합 spHAS는 생체내에서 HA를 합성하지 않는다. 왜냐하면 이들 세포는 요구되는 기질의 하나인 UDP-GlcA가 부족하기 때문이다. 그러나, 재조합 seHAS 단백질을 함유하는 막은 기질 UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA가 제공될 때 HA를 합성한다(도 12 참조).

도 12는 재조합 seHAS에 의해 진짜 HA의 합성을 나타낸다. 재조합 seHAS 또는 벡터만을 함유하는 세포로부터 제조된 대장균 막(69 μg)은 본 명세서에서 기재한 바와 같이 총 부피 200 μl에서 700 μM UDP-[³H]GlcNAc (2.78 x 10³dpm/n몰; □, ■) 및 300 μM UDP-[¹⁴C]GlcA (3.83 x 10³dpm/n몰; ○, ●)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. EDTA를 최종 농도 25mM로 될 때까지 첨가하여 효소반응을 중지시켰다. 반응 혼합물의 반을 37℃에서 3시간 동안 스트렙토마이세스 히알우로니다제로 처리하였다. SDS (2%, w/v)를 90℃에서 1분 동안 가열된 히알우로니다제-처리된 시료(○,□) 및 미처리된 시료(●,■)에 첨가하였다. 시료를 칼럼 완충액(5 mM 트리스, 0.2 M NaCl, pH 8/0)으로 500 ㎕까지 희석시킨 후, 원심분리한 다음, 200 ㎕를 세파크릴 S-500 HR 칼럼에 주입하였다. 분획(1 ml)을 수집하여 방사능을 측정하였다. BD는 블루 덱스트란(약2 x 10⁶DA; Pharmacia 제조)의 피크 용출 위치이다. V₀는 배제 부피를 나타내고, V_i는 포함된 부피를 나타낸다. 칼럼 상에 분류된 HA의 총 양에 혼입된 [¹⁴C] GlcA : [³H]GlcNAc의 비율은 1.4인 데, 이는 2개 기질의 특이 활성의 비와 동일하다. 그러므로, 생성물에 혼입된 당의 몰비는 진짜 HA에 대해 예상한 바와 같이 1:1이다.

120 μM UDP-GlcA 및 300 μM UDP-GlcNAc를 사용할 때, HA 합성은 적어도 1시간 동안 막 단백질 (≤0.2 μg에서)과 선형이었다. 벡터만으로 형질전환된 세포나 형질전환되지 않은 세포로부터 제조된 막은 또한 검출 불가능한 HAS 활성을 갖는다. Mg⁺²가 EDTA로 킬레이트(대조물의 5% 미만)되거나 두 기질중 하나가 생략된다면(대조물의 약2%), HA 합성은 무시할만 하다. 재조합 seHAS는 또한 당 뉴클레오티드 기질에 대해 예상된 특이성을 나타냈는데, 이는 2개의 정상 기질의 어느 하나와 UDP-GalA, UDP-Glc 및 UDP-GalNAc중 하나를 공중합할 수 없다(표 II 참조).

겔 여과 분석을 근거로 할 때, 분리된 막의 seHAS에 의해 합성된 HA의 평균 질량은 5-10 x 10⁶Da 이다. 재조합 seHAS의 생성물은 특이 스트렙토마이세스 히알우로니다제에 의한 감도 저하와 당의 동몰량 혼입을 근거로 할 때 진짜 HA로 판단된다(도 12 참조). 모든 HA 합성 조건이 최적이 아닐지라도(한 기질의 약 90%가 생성물에 혼입되었기 때문), 효소는 HA 사슬 길이의 넓은 분포를 형성하였다. 피크 부분은 약 36,000 단당류를 함유하는 중합체인 7.5 x 10⁶DA의 HA 질량에 해당한다. 이 칼럼상에서 확인된 HA 크기의 분포는 2-20 x 10⁶DA 이었다.

seHAS의 예상된 단백질 서열은 그룹 C 단백질과 교차-반응하도록 spHAS 단백질에 대한 항체의 활성에 의해 확인되었다. 총 spHAS 단백질이나 중앙 도메인의 spHAS에 대한 폴리클로날 항체는 seHAS 단백질과 반응하였다. spHAS의 C-말단에 대한 안티펩티드 항체는 seHAS 단백질내에서 이러한 다소 다른 영역과 교차 반응하지 않았다. 그러나, spHAS 서열 E¹⁴⁷-T¹⁶¹에 대한 안티펩티드 항체는 seHAS에서 동일하게 예상된 서열을 확인하였다. 안티펩티드 항체는 또한 연쇄상구균의 막에서 본래의 seHAS 및 spHAS 단백질과 반응하고 양쪽 종으로부터의 천연 및 재조합 효소가 동일한 크기임을 확인한다. spHAS 단백질처럼, seHAS는 SDS-PAGE 상에서 비정상적으로 빠르게 이동한다. 계산된 질량이 47,778 Da 일지라도, SDS-PAGE에 의한 M_r은 일관되게 약 42 kDa이다.

중앙 도메인 영역 내에서의 서열 상동성 및 2개 세균 효소에 대해 예상된 전체적인 서열 상동때문에, 영역 E¹⁴⁷-T¹⁶¹에 대한 펩티드-특이 항체는 2개의 서로 다른 효소에 대한 유전자로 형질전환된 세포로부터 제조된 막에서 HAS 단백질 발현에 대해 정상화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, 거의 동일한 양의 재조합 spHAS 또는 seHAS의 막들을 초기 HA 합성률 및 HA 생성물 크기 분포에 대해서 비교하였다.

spHAS에 대해 나타낸 바와 같이, seHAS에 의한 HA 사슬의 합성은 가능하다. 효소는 최종 생성물로서 방출될 때까지 성장하는 HA 사슬과 결합된 채 잔존하는 것 같다. 그러므로, HA 사슬 합성의 제 1라운드 동안 초기에 생성된 HA 사슬의 크기 분포를 모니터링함으로써 seHAS 및 spHAS에 의해 HA 연장의 속도를 비교할 수 있다. 여러 시간에서 HA 생성물 크기의 겔 여과 분석을 기본으로, 본 발명자들은 seHAS에 의한 평균 연장 속도는 37℃에서 약 9,000 단당류/분임을 예상하였다(도 9 참조). 5분 내에 효소는 5-10 x 10⁶Da의 HA 사슬을 중합할 수 있다. 그러므로, 60분간 배양하는 동안 각 효소 분자는 상기와 같이 큰 5-8 HA 분자의 순서로 잠재적으로 개시, 완성 및 방출할 수 있다. 초기(예, 1분 이내)에, 제1 HA 사슬의 연장을 반영할 때, seHAS에 의해 생성된 HA의 크기 분포는 spHAS에 비해 더 큰 종으로 변형되었다. 60분까지 HA 생성물 2개의 분포는 분간할 수 없다.

클로닝된 seHAS는 확실한 그룹 C HA 합성효소를 나타낸다. 그러므로, 전에 보고되거나 기재된 ″그룹 C″ 단백질은 진정한 그룹 C HAS가 아니다. seHAS 단백질은 이와 같이 급속히 성장하는 HA 합성효소 군을 포함하는 세균, 척추동물류 및 바이러스로부터 공지된 9개의 HA 합성효소와 상동이다. 이러한 상동성은 특히 도 2에 나타냈다. 포유동물에서 HAS 1, HAS 2 및 HAS 3으로 표시된 3개 유전자가 확인되었고, 인간과 쥐 모두에서 3개의 서로 다른 염색체로 지도화하였다. 양서류에서, 현재까지 확인된 유일한 HAS 단백질은 발생적으로 조절된 DG42로서, 이것은 1988년 클로닝되었고 또 최근 효모 막에서의 재조합 단백질의 분석에 의해 HA 합성효소 활성을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. 기타 X. 라애부스(X. laevus) HAS 유전자는 곧 확인될 것이다.

유사한 진화 모델은, 원시 세균 HAS 전구체가 척추동물류의 발달 초기 동안 침범하거나 또는 원시 세균이 초생의 HAS에 포획될 때 HA 캡슐을 제조하는 세균의 병원성이 개발된 것으로 제시하고 있다. 세균 및 진핵생물 HAS 효소가 보통 구조의 용액으로의 유사한 진화가 발생할 것 같지 않으나 발생하였다.

HAS에 대한 3개의 포유동물 동위효소의 어느것도 HA 생성물 크기와 관련하여 효소적으로 특징을 갖지 않았다. 적어도 10개의 확인된 HAS 단백질이 유사한 토폴로지를 갖는 막 단백질로 예상된다. HA 합성은 플라즈마 막에서 발생하며, HA는 세균 캡슐이나 진핵생물의 세포주위 코팅을 형성하도록 결합된 세포로 남아있거나 배지에 흘려진다. 세포질 내의 당 뉴클레오티드 기질은 막으로부터 외부 공간으로 압출되는 HA 사슬을 조립하는데 이용된다.

HAS 단백질의 소수성이 매우 높은 카르복시 부분에서 단백질 토폴로지는 효소가 막을 통해 동시에 압출됨에 따라 성장하는 HA 사슬을 연장하는 방법을 이해하는 데 중요한 것 같다. 예를 들면, 새로운 효소 활성은 지질 2중층을 갖는 단백질의 특수한 복합적 상호작용을 요할 수 있다. spHAS-알칼리성 포스파타제 융합 단백질의 분석을 기초로 한 예비 결과에 의하면, 아미노 및 카르복시 말단 및 큰 중앙 도메인은 모두 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이 세포내이다. seHAS 단백질은 또한 HA 합성에 필요한 2개의 글리코실트랜스퍼라제 활성과 2개 기질 결합 부위를 포함하는 것 처럼 보이는 큰 중앙 도메인(총 단백질의 약 63%)을 함유한다. 최근의 소프트웨어 프로그램이 긴 C-말단 소수성 스트레치 내에서 막-결합 도메인의 갯수나 성질을 신뢰할 정도로 예상할 수 없을지라도, 제안된 토폴로지 배열은 본 증거와 일치하며 또한 진핵생물 효소에도 적용되는데, 이들은 2개의 추가적인 예상 막내외 도메인으로, 주로 단백질의 C-말단의 연장으로 인해 약 40% 더 크다.

spHAS 내의 6개 Cys 잔류물중 4개는 seHAS와 함께 보존된다. 2개의 세균 효소에서 Cys225 만이 HAS 군의 모든 멤버에 보존된다. p-머큐로벤조에이트나 NEM과 같은 술프히드릴 반응제가 HAS 활성을 크게 억제하기 때문에, 상기 보존된 Cys는 효소 활성에 필요하거나 중요한 것 같다. 그러나, 부위-특이적 돌연변이의 초기 연구 결과, spHAS의 C225S 돌연변이체는 불활성이 아니며, 야생형 활성의 5∼10%를 차지한다.

오직 seHAS, 오직 spHAS, 또는 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하는 seHAS 및 spHAS 모두를 암호화하는 핵산 서열의 확인은 도 13에 나타냈다. 센스-안티센스 올리고뉴클레오티드의 3쌍은 서열 1의 서열 및 spHAS의 코딩 서열을 기본으로 고안되었다. seHAS계 핵산 절편(se1-se2 및 sesp1-sesp2)은 도 14에 나타냈다. 이들 3쌍의 올리고뉴클레오티드는 그룹 C(seHAS) (레인 2, 4 및 6) 또는 그룹 A (spHAS) (레인 3, 5 및 7) 연쇄상구균으로부터 얻은 게놈 DNA와 전형적인 PCR 반응 하에서 혼성화되었다. 레인 1과 8은 kb(킬로베이스)에서 MW 표준의 위치를 나타낸다. PCR 반응은 다음과 같이 25 주기에 대해 Taq DNA 중합효소(Promega 제)를 사용하여 시행되었다: DNA 변성을 달성하기 위해서 94℃에서 1분, 혼성화시키기 위해 48℃(더 작은 일반 sesp 프라이머에 대해서는 42℃) 및 DNA 합성을 위해 72℃에서 1.5분. PCR 반응 혼합물은 1% 아가로오스 겔 상에서의 전기영동에 의해 분리되었다.

se1-se2 프라이머 쌍은 그룹 C HAS(seHAS)에 대해 특이적으로 고안되었다. sp1-sp2 프라이머 쌍은 그룹 A HAS(spHAS)에 대해 특이적으로 고안되었다. sesp1-sesp2 프라이머 쌍은 그룹 A 및 그룹 C HAS 핵산 서열 모두와 혼성화되도록 고안되었다. 3 프라이머 쌍 모두는 예상한 대로 작용하였으며, 교차-잡종화 능력을 나타내고 또 특이적인 PCR 생성물의 발생을 지지한다.

특이 PCR 또는 혼성화에 사용된 올리고뉴클레오티드는 도 14에 나타냈다. 서열 3, 4, 5 및 6의 합성 올리고뉴클레오티드들은 서열 1의 대응 영역에 나타내진다. 이들 영역은 진한 글씨체로 표시되며, 각각 프라이머 se1, se2, sesp1 및 sesp2로 표시된다. #1은 센스 방향의 프라이머를 나타내는 반면, #2는 안티센스 방향의 프라이머를 나타낸다. 4개 올리고뉴클레오티드의 각각은 seHAS 서열과 특이적으로 혼성화하고, 센스/안티센스 프라이머의 적절한 쌍들은 도 13에 나타낸 바와 같이 중합효소 사슬 반응에 사용하는 데 적합하다.

도 7은 효모 막에서 발현된 재조합 HAS에 의해 합성된 히알우론산의 겔 여과 분석을 나타낸다. spHAS에 해당하는 419 아미노산 잔류물(Met로 전환된 본래의 Va1 코돈으로)의 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 DNA 단편은 pYES2 효모 발현벡터(Invitrogen사 제)에서 표준 방법으로 서브클론되어 pYES/HA를 생성하였다. 이러한 구조를 갖는 세포로부터 얻어진 막은 유리 구슬과 함께하는 교반에 의해 제조되었다. pYES/HA 구조물로부터 유도된 시료는 사실상의 HA 합성효소 활성을 함유하였고, ″42 kDa″ HAS 단백질은 특이 항체를 사용하는 웨스턴(Western) 분석에 의해 조사되었으며, 벡터만을 갖는 세포로부터 얻어진 막은 활성이나 면역반응 밴드(도시되지 않음)를 갖지 않았다. 막(315 ㎍ 단백질)을 먼저 50 mM 트리스, pH 7, 20 mM MgCl₂, 1mM DTT, 및 0.05 M NaCl(450 ㎕ 반응 체적)중의 캐리어를 갖지 않는 UDP-[¹⁴C]GlcA (1 uCi¹⁴C) 및 900 uM 미표지된 UDP-GlcNAc와 함께 30℃에서 1.5분 동안 배양하였다. 이러한 펄스-표지 기간 후에, 방사능표지되지 않은 UDP-GlcA를 최종 농도 900 uM까지 첨가하였다. 펄스를 가한지 1.5분후(흑색 원) 및 15분후(흑색 사각형) 그리고 방사능추적한지 45분후(흑색 삼각형)에 시료(100 uL)를 취하였다. SDS를 2%까지 첨가하고 95℃에서 1분 동안 가열함으로써 반응을 종료하였다. 0.2 M NaCl, 5 mM 트리스, pH 8에서 평형화된 Sephacryl S-500HR 겔 여과 칼럼(Pharmacia 제; 1 x 50 cm) 상에 시료의 반을 주입하기 전에 원심분리(10,000 x g, 5분)에 의해 시료를 분류하였다.

칼럼을 0.5 ml/분으로 용출시키고, 분획(1 ml)의 방사능은 BioSafeII 칵테일(4.5 ml, Research Products Intl. 제조)을 첨가한 후 액체 신틸레이션 계수기에 의해 측정되었다. 공극 부피 및 전체 함유된 부피는 각각 14 ml 및 35.5 ml의 용출 부피이었다. 블루 덱스트란(평균 2 x 10⁶Da)의 피크는 25-27 ml에서 형성되었다. 진핵생물 효모 세포에서 발현된 재조합 HAS는 시험관에서 고분자 히알우론산을 만든다.

이상에서와 같이, 본 발명에서는 효소적 활성 HAS를 암호화는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편, seHAS 유전자로부터 히알우론산을 제조하는 방법, 및 seHAS 유전자에 의해 암호화된 HAS로부터 제조된 히알우론산의 용도를 제공함으로써 상기의 목적 및 장점을 충분히 만족시킨다. 본 발명을 특정 실시예를 들어 설명하였을지라도, 당해 업자라면 본 발명을 수없이 변경할 수 있다. 따라서, 그러한 모든 변경은 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위 내에 속하게 된다.

Claims (59)

1. 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 포함하는 정제된 핵산 절편.
2. 제1항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 정제된 핵산 절편.
3. 제1항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 핵산 절편.
4. 서열 1의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는, 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소의 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편.
5. 서열 1의 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 반보존적 또는 보존적 아미노산 코돈 변화를 갖는, 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편.
6. 플라스미드, 코스미드, 파아지 또는 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택되고, 또 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
7. 제5항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소를 암호화하는 재조합 벡터.
8. 제6항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
9. 제6항에 있어서, 플라스미드가 발현 벡터를 더 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항에 있어서, 발현 벡터가 효소적으로 활성인 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소 코딩 영역에 작용가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
11. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 원핵생물 세포인 재조합 숙주 세포.
12. 제11항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소를 암호화하는 재조합 숙주 세포.
13. 제11항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 숙주 세포가 히알우론산을 생산하는 재조합 숙주 세포.
15. 제11항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 구조를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
16. 제11항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
17. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 진핵생물 세포인 재조합 숙주 세포.
18. 제17항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소를 암호화하는 재조합 숙주 세포.
19. 제17항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
20. 제19항에 있어서, 숙주 세포가 히알우론산을 생산하는 재조합 숙주 세포.
21. 제17항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 구조를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
22. 제17항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
23. 재조합 벡터가 전기 천공법에 의해 도입되어있고, 상기 재조합 벡터는 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 숙주 세포.
24. 제23항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소를 암호화하는 재조합 숙주 세포.
25. 제23항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
26. 제25항에 있어서, 숙주 세포가 히알우론산을 생산하는 재조합 숙주 세포.
27. 제23항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 구조를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
28. 제23항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
29. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 숙주 세포.
30. 제29항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로난 합성효소를 암호화하는 재조합 숙주 세포.
31. 제29항에 있어서, 정제된 핵산 절편이 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
32. 제31항에 있어서, 숙주 세포가 히알우론산을 생산하는 재조합 숙주 세포.
33. 제29항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 구조를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
34. 제29항에 있어서, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소가 변형된 크기 분포를 갖는 히알우론산 중합체를 생산할 수 있는 재조합 숙주 세포.
35. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소 폴리펩티드를 포함하는 정제된 조성물.
36. 서열 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 정제된 조성물.
37. DNA 시료를 수득하고;

    DNA 시료를 서열 1에 따른 정제된 핵산 절편과 접촉시키며;

    DNA 시료와 정제된 핵산 절편을 혼성화시켜 혼성 복합체를 형성하고; 또

    상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 DNA 종을 검출하는 방법.
38. 세균 세포 시료를 수득하고;

    세균 세포 시료로부터 얻은 하나 이상의 핵산을 서열 1에 따른 정제된 핵산 절편과 접촉시키며;

    상기 하나 이상의 핵산과 정제된 핵산 절편을 혼성화시켜 혼성 복합체를 형성하고; 또

    혼성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,

    상기 혼성 복합체의 존재는 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 mRNA를 발현하는 세균 균주의 표시인 것을 특징으로 하는,

    스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 mRNA를 발현하는 세균 세포의 검출방법.
39. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편을, UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcA 생산 효소를 암호화하는 핵산 절편을 함유하는 숙주 생물에 도입하고;

    숙주 생물을 배지에서 성장시켜 히알우론산을 분비시키며; 또

    분비된 히알우론산을 회수하는 단계를 포함하는 히알우론산의 제조방법.
40. 제39항에 있어서, 히알우론산을 회수하는 단계는 분비된 히알우론산을 배지로부터 추출하는 것을 포함하는 제조방법.
41. 제40항에 있어서, 추출된 히알우론산을 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
42. 제39항에 있어서, 숙주 생물을 성장시키는 단계에서, 숙주 생물이 구조적으로 변형된 히알우론산을 분비하는 방법.
43. 제39항에 있어서, 숙주 생물을 성장시키는 단계에서, 숙주 생물이 변형된 크기를 갖는 히알우론산을 분비하는 방법.
44. 미리 선택된 제약학적 약물 및 히알우로난 합성효소에 의해 생산된 유효량의 히알우론산을 포함하는 제약학적 조성물.
45. 제44항에 있어서, 히알우론산은 서열 2의 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소에 의해 생산되는 제약학적 조성물.
46. 제44항에 있어서, 히알우론산의 분자량을 변형시킴으로써 면역 반응을 피할 수 있는 변형된 분자량의 제약학적 조성물을 생산하는 제약학적 조성물.
47. 제44항에 있어서, 히알우론산의 분자량을 변형시킴으로써 변형된 분자량의 제약학적 조성물에 대한 친화성을 갖는 환자내의 특정 조직 또는 세포 유형을 표적으로 할 수 있는 변형된 분자량의 제약학적 조성물을 생산하는 제약학적 조성물.
48. (a) 서열 1에 따른 핵산 서열;

    (b) 서열 1에 따른 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열;

    (c) 서열 1에 따른 핵산과 혼성화되는 핵산 서열;

    (d) 서열 1의 상보적 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열; 및

    (e) 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6의 PCR 탐침으로 구성된 군으로부터 선택된 PCR 탐침과 혼성화되는 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는, 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 정제되고 분리된 핵산 서열.
49. 본질적으로 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 핵산 절편으로 구성되는, 정제되고 분리된 핵산 절편.
50. 숙주 세포가 히알우론산을 발현하도록 제1항, 제2항 또는 제3항에 따른 분리 된 핵산 절편으로 형질전환되거나 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
51. 스트렙토코커스 에쿠이시밀리스(Streptococcus equisimilis) 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 생물학적 특성을 갖도록 서열 1에 따른 핵산 절편의 충분히 복제성인 핵산 절편을 갖는 히알우로난 합성효소를 암호화하는 핵산 절편으로 본질적으로 구성되되는, 분리된 핵산 절편.
52. 제51항에 따른 cDNA 서열.
53. 숙주 세포가 히알우론산을 발현하도록 제51항에 따른 핵산 절편으로 형질전환되거나 형질감염된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
54. 효소적으로 활성인 히알우로난 합성효소를 암호화하는 코딩 서열을 갖고, 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 분리된 핵산 절편.
55. 서열 1과 혼성화될 수 있는 서열 3에 따른 정제된 핵산 절편.
56. 서열 1과 혼성화될 수 있는 서열 4에 따른 정제된 핵산 절편.
57. 서열 1과 혼성화될 수 있는 서열 5에 따른 정제된 핵산 절편.
58. 서열 1과 혼성화될 수 있는 서열 6에 따른 정제된 핵산 절편.
59. (A) 서열 2에 따른 핵산 절편;

    (B) 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열;

    (C) (A) 또는 (B)에 정의된 핵산 절편과 혼성되는 핵산 절편 또는 그의 단편; 및

    (D) 유전 암호의 축퇴를 제외하고 기능적으로 동등한 아미노산을 코딩하며 상기 (A), (B) 및 (C)에 정의된 핵산 절편과 혼성되는 핵산 절편;

    으로 구성된 군으로부터 선택되며, 효소적으로 활성인 히알우로네이트 합성효소를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 정제된 핵산 절편.