ES2235378T3 - Gen de la hialuronan sintasa y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos una coincidencia del 80% con la SEQ ID NO: 1.

Description

Gen de hialuronan sintasa y usos del mismo.

Antecedentes 1. Campo

La presente solicitud se refiere a un segmento de ácido nucleico que tiene un segmento de región codificante que codifica para la hialuronan sintasa de Screptococcus equisimilis (seHAS) enzimáticamente activa y al uso de este segmento de ácido nucleico en la preparación de células recombinantes que producen hialuronan sintasa y su producto, el ácido hialurónico. También se conoce el hialuronato como ácido hialurónico o hialuronano.

2. Breve descripción de la técnica relacionada

La incidencia de infecciones estreptocócicas es un importante problema sanitario y económico en todo el mundo, particularmente en los países en desarrollo. Un motivo de esto se debe a la capacidad de las bacterias de Streptococcus para crecer sin que se detecten por las células fagocíticas del organismo, es decir, macrófagos y células polimorfonucleares (PMN). Estas células son responsables de reconocer y envolver microorganismos extraños. Una manera eficaz con la que las bacterias eluden la vigilancia es recubriéndose ellas mismas con cápsulas de polisacárido, tal como una cápsula de ácido hialurónico (HA). La estructura de HA es idéntica tanto en procariotas como en eucariotas. Puesto que HA es generalmente no inmunógeno, las bacterias encapsuladas no provocan una respuesta inmunitaria y, por tanto, no son diana para su destrucción. Además, la cápsula ejerce un efecto antifagocítico sobre las PMN in vitro y evita la unión de Streptococcus a macrófagos. Precisamente debido a esto, en los Streptococcus del grupo A y el grupo C, las cápsulas de HA son importante factores de virulencia en las infecciones naturales y experimentales. Los Streptococcus del grupo A son responsables de numerosas enfermedades humanas incluyendo faringitis, impétigo, infecciones del tejido profundo, fiebre reumática y un síndrome de tipo choque tóxico. Streptococcus equisimilis del grupo C es responsable de la osteomielitis, faringitis, abscesos cerebrales y neumonía.

Estructuralmente, HA es un polisacárido lineal de alto peso molecular de unidades de disacárido repetidas, que consisten en N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcA). El número de disacáridos repetidos en una molécula de HA puede superar los 30.000, un M_{r} > 10^{7}. HA es el único glucosaminoglucano sintetizado tanto por células de mamíferos como bacterianas, particularmente Streptococcus de los grupos A y C y Tipo 2 Pasturella multocida. Estas cepas hacen que se secrete HA en el medio, así como cápsulas de HA. El mecanismo mediante el cual estas bacterias sintetizan HA es de gran interés médico, puesto que la producción de la cápsula de HA es una manera muy eficaz e ingeniosa que utilizan los estreptococos para eludir la vigilancia por el sistema inmunitario.

HA se sintetiza por las células de mamíferos y bacterianas mediante la enzima hialuronato sintasa, que se ha localizado en la membrana plasmática. Se cree que la síntesis de HA en estos organismos es un proceso de múltiples etapas. El inicio supone la unión de un precursor inicial, UDP-GlcNAc o UDP-GlcA. Esto va seguido por elongación, que supone la adición alterna de los dos azúcares a la cadena de oligosacárido en crecimiento. El polímero en crecimiento se extruye a través de la región de la membrana plasmática de la célula y al espacio intracelular. Aunque el sistema biosintético de HA fue una de las primeras rutas sintéticas de heteropolisacáridos de membrana estudiadas, el mecanismo de la síntesis de HA todavía no se entiende bien. Esto puede deberse a que los sistemas in vitro desarrollados hasta la fecha son inadecuados porque no se ha conseguido la biosíntesis de novo de HA.

La dirección de crecimiento del polímero de HA es todavía un tema de desacuerdo entre los expertos habituales en la técnica. La adición de monosacáridos puede ser al extremo reductor o no reductor de la cadena de HA en crecimiento. Además, sigue habiendo dudas acerca de (i) si las incipientes cadenas se unen covalentemente a una proteína, a UDP o a un producto intermedio lipídico, (ii) si las cadenas se inician utilizando un cebador y (iii) el mecanismo mediante el cual se extruye el polímero maduro a través de la membrana plasmática del Streptococcus. Comprender el mecanismo de la biosíntesis de HA puede permitir el desarrollo de estrategias alternativas para controlar las infecciones estreptocócicas y por Pasturella interfiriendo en el proceso.

HA se ha identificado prácticamente en todos los tejidos en los vertebrados y ha obtenido un uso generalizado en diversas aplicaciones clínicas, más particular y apropiadamente como un complemento de matriz intraarticular y en la cirugía ocular. La bibliografía científica también ha mostrado una transición desde la percepción original de que HA es principalmente un componente estructural pasivo en la matriz de unos cuantos tejidos conjuntivos y en la cápsula de ciertas cepas de bacterias hasta el reconocimiento de que esta molécula ubicua está implicada dinámicamente en muchos procesos biológicos; desde la modulación de la migración y la diferenciación celulares durante la embriogénesis para la regulación del metabolismo y la organización de la matriz extracelular, hasta importantes papeles en los complejos procesos de metástasis, cicatrización de heridas e inflamación. Además, está quedando claro que HA es sumamente activo metabólicamente y que las células centran una gran atención en los procesos de su síntesis y catabolismo. Por ejemplo, la semivida de HA en los tejidos oscila de desde 1 hasta 3 semanas en cartílago a < 1 día en la epidermis.

Ahora está claro que una única proteína utiliza ambos sustratos de azúcar para sintetizar HA. La abreviatura HAS, para la HA sintasa, ha obtenido un apoyo generalizado para designar esta clase de enzimas. Markovitz et al. caracterizaron satisfactoriamente la actividad de HAS de Streptococcus pyogenes y descubrieron la localización en la membrana de las enzimas y sus requerimientos de precursores de nucleótido con azúcar y Mg^{2+}. Prehm encontró que el HA que se está elongando, producido por células B6, se digería por hialuronidasa añadida al medio y se propuso que HAS reside en la membrana plasmática. Phillipson y Schwartz también demostraron que la actividad de HAS se cofraccionaba con marcadores de la membrana plasmática en células de oligodendroglioma de ratón.

HAS ensambla HA de alto M_{r} que se extruye simultáneamente a través de la membrana al espacio extracelular (o para preparar la cápsula celular en el caso de bacterias) según avanza la síntesis del glucosaminoglucano. Este modo de biosíntesis es único entre las macromoléculas, puesto que los ácidos nucleicos, proteínas y lípidos se sintetizan en el núcleo, retículo endoplasmático / aparato de Golgi, citoplasma o mitocondria. La extrusión de la cadena en crecimiento al espacio extracelular también permite el crecimiento del polímero no constreñido, consiguiéndose así el tamaño excepcionalmente grande de HA, mientras que el confinamiento de la síntesis dentro de un compartimento de Golgi o post-Golgi podría limitar la cantidad o longitud total de los polímeros formados. Altas concentraciones de HA dentro de una luz limitada también producirían un entorno de alta viscosidad que podría ser perjudicial para las demás funciones del orgánulo.

Varios estudios intentaron solubilizar, identificar y purificar HAS de cepas de estreptococos que producían un recubrimiento capsular de HA, además de a partir de células eucariotas. Aunque las enzimas de oligodendroglioma murinas y estreptocócicas se solubilizaron en detergente y se estudiaron satisfactoriamente, los esfuerzos para purificar una HAS activa para su posterior estudio o clonación molecular han seguido siendo insatisfactorios durante décadas. Prehm y Mausolf utilizaron UDP-GlcA o UDP-GlcNAc oxidados con peryodato para marcar por afinidad una proteína de \sim 52 kDa en membranas estreptocócicas que se purificó conjuntamente con HAS. Esto condujo a un informe que reivindicaba que se había clonado la HAS estreptocócica del grupo C, lo que desgraciadamente era erróneo. Este estudio fracasa en demostrar la expresión de una sintasa activa y puede haber clonado realmente un transportados peptídico. Triscot y van de Rijn utilizaron digitonina para solubilizar HAS de membranas estreptocócicas en una forma activa. Van de Rijn y Drake radiomarcaron selectivamente tres proteínas de membrana estreptocócica de 42, 33 y 27 kDa con 5-azido-UDP-GlcA y sugirieron que la proteína de 33 kDa era HAS. Sin embargo, tal como se demostró posteriormente, HAS resultó ser realmente la proteína de 42 kDa.

A pesar de estos esfuerzos, el avance en la comprensión de la regulación y los mecanismos de la síntesis de HA esencialmente se paralizó, puesto que no había sondas moleculares para el ARNm para HAS o la proteína HAS. Se produjo un adelanto importante en 1993 cuando DeAngelis et al. informaron sobre la clonación molecular y la caracterización del gen estreptocócico del grupo A que codifica para la proteína HasA. Este gen se sabía que era parte de un operón requerido para la síntesis de HA bacteriano, aunque la función de esta proteína, que ahora se designa como spHAS (la HAS de S. pyogenes), era desconocida. Posteriormente, se demostró que spHAS era responsable del alargamiento de HA y fue la primera glucosaminoglucano sintasa identificada y clonada y luego expresada satisfactoriamente. El operón de síntesis de HA de S. pyogenes codifica para otras dos proteínas. HasB es una UDP-glucosa deshidrogenasa, que se requiere para convertir UDP-glucosa en UDP-GlcA, uno de los sustratos para la síntesis de HA. HasC es una UDP-glucosa pirofosforilasa, que se requiere para convertir glucosa-1-fosfato y UTP en UDP-glucosa. La cotransfección de ambos genes hasA y hasB en cepas de Streptococcus sin cápsula o Enteroccus faecalis les confirió la capacidad para sintetizar HA y formar una cápsula. Esto proporcionó la primera prueba contundente de que HasA es una HA sintasa.

El esquivo gen de la HA sintasa se clonó finalmente mediante un enfoque de mutagénesis por transposón, en el que se creó una cepa del grupo A mutante, sin cápsula que contenía una interrupción de transposón del operón de síntesis del HA. Secuencias conocidas de transposón permitieron que se identificara la región de la unión con el ADN estreptocócico y luego se clonó a partir de células de tipo natural. La spHAS codificada fue idéntica en un 5-10% a una familia de quitina sintasas de levaduras y idéntica en un 30% a la proteína DG42 (expresada con respecto al desarrollo durante la gastrulación) de Xenopus laevis, cuya función era desconocida en ese momento. DeAngelis y Weigel expresaron la spHAS recombinante activa en Escherichia coli y demostraron que este único producto de gen purificado sintetiza HA de alto M_{r} cuando se incuba in vitro con UDP-GlcA y UDP-GlcNAc, mostrando así que ambas actividades glucosiltransferasa requeridas para la síntesis de HA están catalizadas por la misma proteína, tal como se propuso por primera vez en 1959. Esto creó el marco para la identificación casi simultánea de ADNc para HAS eucariotas en 1996 por cuatro laboratorios revelando que HAS es una familia de genes múltiples que codifican para distintas isoenzimas. Dos genes (HAS1 y HAS2) se descubrieron rápidamente en los mamíferos (29-34) y posteriormente se ha descubierto un tercer gen HAS3. Ahora se ha encontrado que una segunda seHAS estreptocócica o hialuronato sintasa de Streptococcus equisimilis, y se describe en el presente documento.

Tal como se indicó, se ha identificado el auténtico gen para HAS de Streptococcus equisimilis del grupo C (seHAS); la proteína seHAS tiene un alto nivel de coincidencia (aproximadamente del 70 por ciento) con la enzima spHAS. Sin embargo, esta coincidencia es interesante debido a que el gen seHAS no se hibrida de forma cruzada con el gen spHAS.

Las membranas preparadas a partir de E. coli que expresan seHAS recombinante sintetizan HA cuando se suministran ambos sustratos. Estos resultados confirman que el informe previo de Lansing et al. que reivindicaba haber clonado HAS del grupo C era incorrecto. Desgraciadamente, varios estudios han empleado el anticuerpo contra esta proteína estreptocócica de 52 kDa sin caracterizar para investigar lo que se creía que era HAS eucariota.

Itano y Kimata utilizaron la clonación por expresión en una línea celular de carcinoma mamario de ratón mutante, que no puede sintetizar HA, para clonar el primer ADNc supuesto para HAS de mamífero (mmHAS1). Los subclones defectuosos en la síntesis de HA cayeron dentro de tres clases distintas que fueron complementarias para la síntesis de HA en experimentos de fusión de células somáticas, lo que sugiere que se requieren al menos tres proteínas. Dos de estas clases mantuvieron cierta actividad de síntesis de HA, mientras que una no mostró ninguna. Ésta última línea celular se utilizó en experimentos de transfección transitoria con ADNc preparado a partir de las células originales, para identificar una única proteína que restableció la actividad de síntesis de HA. Los análisis de la secuencia revelaron una estructura primaria deducida para una proteína de \sim 65 kDa con una topología de membrana pronosticada similar a la de spHAS. mmHAS1 es idéntica en un 30% a spHAS e idéntica en un 55% a DG42. El mismo mes que apareció este informe, otros tres grupos presentaron artículos que describían ADNc que codificaban lo que inicialmente se pensó que era la misma enzima humana y de ratón. Sin embargo, por una circunstancia extraordinaria, cada uno de los cuatro laboratorios había descubierto una isoenzima de HAS diferente en ambas
especies.

Utilizando un enfoque de clonación funcional similar al de Itano y Kimata, Shyjan et al. identificaron el homólogo humano de HAS 1. Se utilizó una biblioteca de ADNc de ganglio linfático mesentérico para transfectar linfocitos T de la mucosa murinos, que se revisaron entonces para determinar su capacidad para adherirse en un ensayo de rosetas. La adhesión de un transfectante se inhibió mediante antisueros contra CD44, una proteína conocida de unión a HA de la superficie celular y se suprimió directamente mediante pretratamiento con hialuronidasa. Por tanto, la formación de rosetas por este transfectante requirió la síntesis de HA. La clonación y secuenciación del ADNc responsable identificó hsHAS1. Itano y Kimata también informaron sobre un ADNc para HAS1 humano aislado a partir de una biblioteca de cerebros de feto. Sin embargo, los ADNc para hsHAS1 notificados por los dos grupos se diferenciaban en su longitud, codificaban para una proteína de 578 o 543 aminoácidos. Sólo se ha demostrado actividad HAS para la forma más larga.

Basándose en la identificación molecular de spHAS como una auténtica HA sintasa y las regiones de casi coincidencia entre DG42, spHAS y NodC (un factor de nodulación de \beta-GlcNAc transferasa en Rhizobium). Spicer et al. utilizaron un enfoque de RT-PCR degenerado para clonar un ADNc de embrión de ratón que codifica para una segunda enzima diferenciada, que se designa como mmHAS2. La transfección de ADNc para mmHAS2 en células COS dirigió la producción de novo de un recubrimiento celular de HA detectado mediante un ensayo de exclusión de partículas, proporcionando así una prueba contundente de que la proteína HAS2 puede sintetizar HA. Utilizando un enfoque similar, Watanabe y Yamaguchi rastrearon una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano para identificar hsHAS2. Fulop et al., utilizaron independientemente una estrategia similar para identificar mmHAS2 en ARN aislado de células de cúmulo prolígero que sintetizan activamente HA, un proceso crítico para la expansión normal del cúmulo prolígero en el folículo preovulatorio. Se aislaron complejos célula del cúmulo-ovocito de los ratones inmediatamente después de iniciarse un ciclo ovulatorio, antes de que empiece la síntesis de HA y, en los últimos momentos cuando justo está empezando la síntesis de HA (3 h) o ya es evidente (4 h). La RT-PCR mostró que el ARNm para HAS2 esta ausente inicialmente pero se expresaba en niveles elevados 3-4 h después, lo que sugiere que la transcripción de HAS2 regula la síntesis de HA en este proceso. Ambos hsHAS2 son de 552 aminoácidos de longitud y son idénticos en un 98%. mmHAS1 tiene 583 aminoácidos de largo y es idéntico en un 95% a hsHAS1, que tiene 578 aminoácidos de largo.

Más recientemente, Spicer et al. utilizaron un enfoque con PCR para identificar un tercer gen de HAS en los mamíferos. La proteína mmHAS3 tiene 554 aminoácidos de longitud y es idéntica en un 71, 56 y 28%, respectivamente, a mmHAS1, mmHAS2, DG42 y spHAS. Spicer et al. también han localizado los tres genes humanos y de ratón en tres cromosomas diferentes (HAS1 en hsChr (cromosoma humano) 19/mmChr (cromosoma murino) 17; HAS2 en hsChr 8/mmChr 15; HAS3 en hsChr 16/mmChr 8). La localización de los tres genes para HAS en diferentes cromosomas y la aparición de HA en toda la clase de vertebrados sugiere que esta familia génica es antigua y que las isoenzimas aparecieron pronto por duplicación en la evolución de los vertebrados. La elevada coincidencia (\sim 30%) entre las HAS bacterianas y eucariotas también sugiere que las dos tuvieron un gen ancestral común. Quizá, las bacterias primitivas usurparon el gen HAS de un primer ancestro de los vertebrados antes de que los productos génicos eucariotas se hicieran más grandes y complejos. Alternativamente, las bacterias podrían haber obtenido un gen HAS de vertebrado mayor y eliminar secuencias reguladoras no esenciales para la actividad de la enzima.

El descubrimiento de DG42 de X. laevis por Dawid y colaboradores desempeñó un papel significativo en estos desarrollos recientes, aun cuando no se sabía que esta proteína era una HA sintasa. No obstante, que DG42 y spHAS fuesen idénticos en un 30% era crítico para diseñar oligonucleótidos que permitiesen la identificación de HAS2 de mamífero. Irónicamente, sólo se notificó la prueba definitiva de que DG42 es una HA sintasa auténtica tras los descubrimientos de las isoenzimas de mamífero, cuando DeAngelis y Achyuthan expresaron la proteína recombinante en levaduras (un microorganismo que no puede sintetizar HA) y demostraron que sintetiza HA cuando se suministran con los dos sustratos membranas aisladas. Meyer y Kreil también demostraron que los lisados de células transfectadas con ADNc para DG42 sintetizan niveles elevados de HA. Ahora que se conoce su función, puede designarse DG42, por tanto, como XlHAS.

Existen características estructurales pronosticadas comunes compartidas por todas las proteínas HAS, incluyendo un gran dominio central y grupos de 2-3 dominios transmembrana o asociados a la membrana en ambos extremos amino y carboxilo de la proteína. El dominio central, que comprende hasta el \sim 88% de las secuencias de la proteína HAS intracelular pronosticadas, contiene probablemente las regiones catalíticas de la enzima. El dominio central pronosticado tiene 264 aminoácidos de longitud en spHAS (63% de la proteína total) y 307-328 residuos de longitud en los miembros de HAS eucariotas (54-56% de la proteína total). El número y la orientación exactos de los dominios de membrana y la organización topológica de los bucles extracelulares e intracelulares todavía no se ha determinado experimentalmente para ninguna HAS.

spHAS es un miembro de la familia de HAS que se ha purificado y caracterizado parcialmente. Los estudios iniciales que utilizaron proteínas de fusión de fosfatasa alcalina / spHAS indican que los extremos N-terminal y C-terminal y el gran dominio central de spHAS están, de hecho, dentro de la célula. spHAS tiene 6 cisteínas, mientras que HAS1, HAS2 y HAS3 tienen 13, 14 y 14 residuos de Cys, respectivamente. Dos de los 6 residuos de Cys en spHAS se conservan y son idénticos en HAS1 y HAS2. Sólo se encuentra un residuos de Cys conservado en la misma posición (Cys-225 en spHAS) en todos los miembros de la familia de HAS. Ésta puede ser una Cys esencial, cuya modificación por venenos con sulfhidrilo inhibe parcialmente la actividad enzimática. Todavía no se ha dilucidado la posible presencia de enlaces disulfuro o la identificación de residuos de Cys críticos necesarios para cualquiera de las múltiples funciones de HAS indicadas más adelante, para ningún miembro de la familia de HAS.

Además del único modo de síntesis propuesto en la membrana plasmática, la familia de la enzima HAS es bastante inusual en el gran número de funciones requeridas para la polimerización global de HA. Al menos seis actividades diferenciadas están presentes en la enzima HAS: sitios de unión para cada uno de los dos precursores de nucleótido con azúcar diferentes (UDP-GlcNAc y UDP-GlcA), dos actividades glucosiltransferasa distintas, uno o más sitios de unión que anclan el polímero de HA en crecimiento a la enzima (quizá relacionado con un motivo B-X_{7}-B) y una reacción de transferencia de tipo trinquete que mueve el polímero en crecimiento un azúcar cada vez. Ésta última actividad concuerda probablemente con el avance escalonado del polímero a través de la membrana. Todas estas funciones, y otras quizá todavía desconocidas, están presentes en una proteína relativamente pequeña que oscila de tamaño desde 419 aminoácidos (spHAS) hasta 588 (xHAS).

Aunque todas las pruebas disponibles apoyan la conclusión de que sólo se requiere la proteína spHAS para la biosíntesis de HA en bacterias o in vitro, es posible que los miembros de la familia de HAS eucariota más grandes sean parte de complejos de múltiples componentes. Puesto que las proteínas eucariotas son \sim 40% más grandes que spHAS, sus dominios proteicos adicionales podrían estar implicados en funciones más elaboradas tales como el tráfico y la localización intracelulares, la regulación de la actividad de la enzima y mediación de interacciones con otros componentes celulares.

El hallazgo inesperado de que existen múltiples genes para HAS de vertebrados que codifican para diferentes sintasas apoya totalmente el consenso emergente de que HA es un importante regulador del comportamiento celular y no simplemente un componente estructural de los tejidos. Por tanto, en menos de seis meses, el campo se trasladó desde una HAS clonada, conocida (spHAS) hasta el reconocimiento de una familia de múltiples genes que promete rápidos, numerosos e interesantes avances futuros en la comprensión de la síntesis y la biología de HA.

Por ejemplo, se describen posteriormente en el presente documento las secuencias de los dos genes para HAS: de Pasturella multocida y (2) virus de Chlorella Paramecium bursaria (PBCV-1). La presencia de hialuronan sintasa en estos dos sistemas y la purificación y uso de la hialuronan sintasa procedente de estos dos sistemas indica una capacidad para purificar y aislar secuencias de ácido nucleico que codifican para hialuronan sintasa enzimáticamente activa en muchas fuentes procariotas y virales diferentes.

La cepa D181 de Streptococcus equisimilis del grupo C sintetiza y secreta ácido hialurónico (HA). Los investigadores han utilizado esta cepa y cepas de Streptococcus pyogene del grupo A, tales como S43 y A111, para estudiar la biosíntesis de HA y para caracterizar la actividad de síntesis de HA en cuanto a su necesidad de catión divalente, utilización de precursor (UDP-Glc-NAc y UDP-GlcA) y pH óptimo.

Tradicionalmente, se ha preparado HA comercialmente mediante el aislamiento a partir de crestas de gallo o medios extracelulares procedentes de cultivos estreptocócicos. Un método que se ha desarrollado para preparar HA es mediante el uso de cultivos de bacterias estreptocócicas que producen HA. La patente de los EE.UU. número 4.517.295 describe un procedimiento tal, en el que se fermentan estreptococos que producen HA en condiciones anaerobias en un medio de crecimiento enriquecido con CO_{2}. En estas condiciones, se produce HA y puede extraerse del caldo. Generalmente, se piensa que el aislamiento de HA procedente de crestas de gallo es laborioso y difícil, ya que se parte de HA en un estado menos puro. La ventaja del aislamiento a partir de crestas de gallo es que el HA producido es de mayor peso molecular. Sin embargo, la preparación de HA mediante fermentación bacteriana es más sencilla, puesto que se parte de HA de mayor pureza. Normalmente, sin embargo, el peso molecular del HA producido de esta manera es menor que el procedente de crestas de gallo. Por tanto, una técnica que permitiera la producción de HA de alto peso molecular mediante fermentación bacteriana sería una mejora sobre los procedimiento exis-
tentes.

El HA de alto peso molecular tiene una amplia variedad de aplicaciones útiles, que comprenden desde cosméticos hasta cirugía ocular. Debido a su potencial de alta viscosidad y a su alta biocompatibilidad, el HA encuentra una aplicación particular en la cirugía ocular como un sustituto del humor vítreo. El HA también se ha utilizado para tratar la artritis reumatoide de caballos de carreras mediante inyecciones intraarticulares de HA, en espumas de afeitar como lubricante y en una variedad de productos cosméticos debido a sus propiedades fisioquímicas de alta viscosidad y a su capacidad para retener humedad durante largos periodos de tiempo. De hecho, en agosto de 1997 la Agencia de Fármacos y Alimentos de los EE.UU. aprobó el uso de HA de alto peso molecular en el tratamiento de artritis grave mediante la inyección de tal HA de alto peso molecular directamente en las articulaciones afectadas. En general, es mejor cuanto mayor es el peso molecular del HA que se emplea. Esto es debido a que la viscosidad de la disolución de HA aumenta con el peso molecular promedio de las moléculas de polímero de HA individuales en la disolución. Desgraciadamente, un HA de peso molecular muy elevado, tal como que oscila hasta 10^{7}, ha sido difícil de obtener mediante los procedimientos de aislamiento disponibles actualmente.

Para tratar estas y otras dificultades, existe la necesidad de nuevos métodos y constructos que puedan utilizarse para producir HA que tenga una o más propiedades mejoradas, tales como una mayor pureza o facilidad de preparación. En particular, existe la necesidad de desarrollar una metodología para la producción de mayores cantidades de HA de peso molecular relativamente alto y relativamente puro, que esté disponible comercialmente en la actualidad. Todavía existe otra necesidad de poder desarrollar una metodología para la producción de HA que tenga una distribución de tamaño (HA_{\Delta tamaño}) modificada, así como HA que tenga una estructura (HA_{\Delta mod}) modificada.

La presente solicitud trata una o más deficiencias de la técnica. Utilizando la tecnología de ADN recombinante, se describe un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para seHAS enzimáticamente activa y se reivindica junto con métodos para producir HA sintasa enzimáticamente activa, así como métodos para utilizar el segmento de ácido nucleico en la preparación de células recombinantes que produzcan HAS y su producto, el ácido hialurónico.

Por tanto, es un objeto de la presente solicitud proporcionar un segmento de ácido nucleico purificado que tenga una región codificante que codifique para HAS enzimáticamente activa.

Es otro objeto de la presente solicitud proporcionar un vector recombinante que incluya un segmento de ácido nucleico purificado que tenga una región codificante que codifique para HAS enzimáticamente activa.

Es todavía otro objeto de la presente solicitud proporcionar una célula huésped recombinante transformada con un vector recombinante que incluya un segmento de ácido nucleico purificado que tenga una región codificante que codifique para HAS enzimáticamente activa.

Es aún otro objeto de la presente solicitud proporcionar un método para detectar una célula bacteriana que expresa HAS.

Es otro objeto de la presente solicitud proporcionar un método para producir ácido hialurónico de alto y/o bajo peso molecular a partir de un gen para la hialuronato sintasa, tal como seHAS, así como métodos para producir HA que tenga una distribución de tamaño modificada y/o una estructura modificada.

Estos y otros aspectos de la presente solicitud resultarán evidentes a la luz de la memoria descriptiva, reivindicaciones y dibujos adjuntos.

Breve sumario

La presente invención describe una hialuronan sintasa según la reivindicación 1, que se adjunta con el presente documento. La presente invención describe un segmento de ácido nucleico según la reivindicación 9, que se adjunta con el presente documento. La presente invención describe un vector recombinante según las reivindicaciones 10 y 11, que se adjuntan con el presente documento. La presente invención describe una célula huésped recombinante según la reivindicación 12, que se adjunta con el presente documento. La presente invención describe un método para producir polímero de ácido hialurónico según la reivindicación 16, que se adjunta con el presente documento. En las reivindicaciones dependientes, se describen realizaciones adicionales de la invención.

La presente solicitud supone la aplicación de la tecnología del ADN recombinante para solucionar uno o más problemas de la técnica de preparación de ácido hialurónico (HA). Estos problemas se tratan junto con el aislamiento y uso de un segmento de ácido nucleico que tiene una región codificante que codifica para el gen para la hialuronato sintasa de Streptococcus equisimilis (seHAS) enzimáticamente activa, un gen responsable de la biosíntesis de la cadena de HA. El gen seHAS se clonó a partir de ADN de una fuente microbiana apropiada y se modificó por ingeniería genética para dar constructos recombinantes útiles para la preparación de HA y para la preparación de grandes cantidades de la propia enzima HAS.

La presente solicitud engloba un gen novedoso, seHAS. La expresión de este gen se correlaciona con la virulencia de las cepas de Streptococcus del grupo A y el grupo C, que proporcionan un medio de escape a la fagocitosis y la vigilancia inmunitaria. Los términos "ácido hialurónico sintasa", "hialuronato sintasa", "hialuronan sintasa" y "HA sintasa" se utilizan de manera intercambiable para describir una enzima que polimeriza una cadena de polisacárido de glucosaminoglucano compuesta por azúcares alternos de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina, unidos en \beta-1,3 y \beta-1,4. El término "seHAS" describe la enzima HAS derivada de Streptococcus equisimilis.

La presente solicitud se refiere al aislamiento y la caracterización de un gen para hialuronato o ácido hialurónico sintasa, ADNc y producto génico (HAS), tal como pueden utilizarse para la polimerización de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina para dar el glucosaminoglucano ácido hialurónico. La presente solicitud identifica el locus de seHAS y describe la secuencia de ácido nucleico que codifica para el gen seHAS enzimáticamente activo de Streptococcus equisimilis. El gen para HAS también proporciona una nueva sonda para evaluar el potencial de especies bacterianos para producir ácido hialurónico.

Mediante la aplicación de las técnicas y los conocimientos expuestos en el presente documento, los expertos en la técnica podrán obtener segmentos de ácido nucleico que tiene codifican para el gen seHAS. Como reconocerán los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, estas ventajas proporcionan la utilidad significativa de poder controlar la expresión del gen seHAS y controlar la naturaleza del producto génico de seHAS, la enzima seHAS, que se produce.

En consecuencia, la solicitud se refiere al aislamiento de un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa, ya de sea de fuentes procariotas o eucariotas. Esto es debido posiblemente a que la enzima, y por supuesto el gen, es una que se encuentra tanto en eucariotas como en algunos procariotas. También se sabe que los eucariotas producen HA y tienen, por tanto, genes para HA sintasa que pueden emplearse en relación con la descripción de esta solicitud.

Los segmentos de ácido nucleico que codifican para la HA sintasa de la presente solicitud se definen como habiéndose aislado libres del ADN genómico o cromosómico total, de tal manera que pueden manipularse fácilmente mediante las técnicas de ADN recombinante. En consecuencia, tal como se utiliza en el presente documento, la frase "un segmento de ácido nucleico purificado" se refiere a un segmento de ADN aislado libre de ADN genómico o cromosómico no relacionado y mantenido en un estado que lo hace útil para la práctica de técnicas recombinantes, tal como ADN en la forma de un fragmento diferenciado de ADN aislado o un vector (por ejemplo, plásmido, fago o virus) que incorpora tal fragmento.

La presente solicitud describe un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa. En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1.

La presente solicitud describe un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa y el segmento de ácido nucleico purificado puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

La presente solicitud también describe un vector natural o recombinante, que consiste en un plásmido, cósmido, fago o vector de virus. El vector recombinante también puede comprender un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa.

En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1. Si el vector recombinante es un plásmido, puede comprender además un vector de expresión. El vector de expresión puede incluir también un promotor unido operativamente a la región codificante para HAS enzimáticamente activa.

La presente solicitud describe una célula huésped recombinante, tal como una célula procariota transformada con un vector recombinante. El vector recombinante incluye un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa. En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1.

La presente invención también describe una célula huésped recombinante, tal como una célula eucariota transfectada con un vector recombinante que comprende un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa. En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1. El concepto es crear un gen seHAS modificado específicamente que codifica para una HAS enzimáticamente activa que puede producir un polímero de ácido hialurónico, que tiene una estructura modificada o una distribución de tamaño modificada.

La presente invención también describe una célula huésped recombinante que se somete a electroporación para introducir un vector recombinante en la célula huésped recombinante. El vector recombinante puede incluir un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa. En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1. La HAS enzimáticamente activa también puede ser capaz de producir un polímero de ácido hialurónico, que tiene una estructura modificada o una distribución de tamaño modificada.

La presente invención también describe una célula huésped recombinante que se transduce con un vector recombinante que incluye un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa. En particular, el segmento de ácido nucleico purificado codifica para seHAS de SEQ ID NO: 2 o el segmento de ácido nucleico purificado comprende una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1. La HAS enzimáticamente activa también puede ser capaz de producir un polímero de ácido hialurónico, que tiene una estructura modificada o una distribución de tamaño modificada.

Además, la presente solicitud describe una composición purificada, en la que la composición purificada comprende un polipéptido que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa y que tiene además una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2.

Además, la solicitud describe un método para detectar una especie de ADN, que comprende las etapas de: (1) obtener una muestra de ADN; (2) poner en contacto la muestra de ADN con un segmento de ácido nucleico purificado según la SEQ ID NO: 1; (3) hibridar la muestra de ADN y el segmento de ácido nucleico purificado, formándose así un complejo hibridado; y (4) detectar el complejo.

La solicitud también describe un método para detectar una célula bacteriana que expresa ARNm que codifica para seHAS, que comprende las etapas de: (1) obtener una muestra de célula bacteriana; (2) poner en contacto al menos un ácido nucleico de la muestra de célula bacteriana con un segmento de ácido nucleico purificado según la SEQ ID NO: 1; (3) hibridar el al menos un ácido nucleico y el segmento de ácido nucleico purificado, formándose así un complejo hibridado; y (4) detectar el complejo hibridado, en el que la presencia del complejo hibridado es indicativa de una cepa bacteriana que expresa ARNm que codifica para seHAS.

La solicitud describe además métodos para detectar la presencia de seHAS o spHAS en una célula. En particular, el método comprende utilizar los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NO: 3,8 como sondas. Estos oligonucleótidos permitirían a un profesional buscar y detectar la presencia de seHAS o spHAS en una célula.

Además, la presente solicitud describe un método para producir ácido hialurónico, que comprende las etapas de: (1) introducir un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa en un organismo huésped, en el que el organismo huésped contiene segmentos de ácido nucleico que codifican para enzimas que producen UDP-Glc-NAc y UDP-GlcA; (2) hacer crecer el organismo huésped en un medio para que secrete ácido hialurónico; (3) recuperar el ácido hialurónico secretado.

El método también puede incluir la etapa de extraer el ácido hialurónico del medio así como la etapa de purificar el ácido hialurónico extraído. Además, el organismo huésped puede secretar un ácido hialurónico modificado estructuralmente o un ácido hialurónico modificado en tamaño.

La presente solicitud describe una composición farmacéutica que comprende un fármaco preseleccionado y una cantidad eficaz de ácido hialurónico producido mediante una HAS recombinante. La composición farmacéutica puede tener un ácido hialurónico que tiene un peso molecular modificado, composición farmacéutica que puede eludir una respuesta inmunitaria. El peso molecular modificado también puede producir una composición farmacéutica que puede fijar como diana un tejido o tipo celular específico del paciente, que tenga afinidad por la composición farmacéutica de peso molecular modificado.

La presente solicitud también describe una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada que codifica para seHAS enzimáticamente activa, en la que la secuencia de ácido nucleico es (a) la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; (b) secuencias de ácido nucleico complementarias a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; (c) secuencias de ácido nucleico que se hibridarán con el ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1; y (d) secuencias de ácido nucleico que se hibridarán con las secuencias de ácido nucleico complementarias a las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

La presente solicitud describe además un segmento de ácido nucleico aislado y purificado que consiste esencialmente en un segmento de ácido nucleico que codifica para HAS enzimáticamente activa.

La presente solicitud describe también un segmento de ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en un segmento de ácido nucleico que codifica para seHAS que tiene un segmento de ácido nucleico suficientemente duplicativo del segmento de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1, para permitir la posesión de la propiedad biológica de codificar para HAS enzimáticamente activa. El segmento de ácido nucleico puede ser también una secuencia de ADNc.

Además, la presente describe un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa, en el que el segmento de ácido nucleico purificado puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 1.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

La figura 1 representa que no se produce la hibridación cruzada entre los genes seHAS y spHAS.

La figura 2 representa de manera figurada la relación de seHAS con las proteínas HAS bacterianas y eucariotas.

La figura 3 representa de manera figurada las relaciones evolutivas entre algunas de las hialuronan sintasas conocidas.

La figura 4 representa la distribución de tamaño de HA producida por diversas enzimas HAS estreptocócicas modificadas por ingeniería genética.

La figura 5 representa de manera figurada la sobreexpresión de seHAS y spHAS recombinantes en E. coli.

La figura 6 representa la purificación de HA sintasa estreptocócica.

La figura 7 representa un análisis de filtración en gel de la HA sintetizada mediante HAS estreptocócica recombinante expresada en membranas de levaduras.

La figura 8 es un análisis de Western blot (inmunotransferencia) de seHAS recombinante utilizando anticuerpos específicos.

La figura 9 es un análisis cinético de las distribuciones de tamaño de HA producidos por seHAS y spHAS recombinantes.

La figura 10 representa gráficamente los diagramas de hidropatía para seHAS y las regiones asociadas a membrana pronosticadas.

La figura 11 es un modelo gráfico de la organización topológica de seHAS en la membrana.

La figura 12 es una demostración de la síntesis de HA auténtico por seHAS recombinante.

La figura 13 representa el reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que codifican para seHAS, que codifican para spHAS o que codifican tanto para seHAS como para spHAS utilizando oligonucleótidos específicos y PCR.

La figura 14 representa los oligonucleótidos utilizados para la hibridación por PCR específica.

Descripción detallada

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención puede tener otras realizaciones o puede practicarse o llevarse a cabo de varias maneras. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología empleadas en el presente documento es con el fin de describir y no debe considerarse limitante.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "segmento de ácido nucleico" y "segmento de ADN" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por tanto, un segmento de ácido nucleico o ADN "purificado" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un segmento de ADN que contiene una secuencia que codifica para una hialuronato sintasa ("HAS") que todavía se aísla de, o se purifica libre de, ADN genómico no relacionado, por ejemplo, ADN total de Streptococcus equisimilis o, por ejemplo, ADN genómico de un huésped mamífero. Incluido dentro del término "segmento de ADN", se encuentran los segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de tales segmentos y también vectores recombinantes, incluyendo por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fago, virus y similares.

De manera similar, un segmento de ADN que comprende un gen seHAS aislado o purificado se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias que codifican para HAS aislado sustancialmente alejado de otros genes que se producen de manera natural o secuencias que codifican para proteínas. A este respecto, el término "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad que codifica para una proteína, polipéptido o péptido funcional. Tal como entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc o combinaciones de las mismas. "Aislado sustancialmente alejado de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés, en este caso seHAS, forma la parte significativa de la región codificante del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene partes grandes de ADN codificante que se produce de manera natural, tales como grandes fragmentos cromosómicos u otros genes funcionales o regiones codificantes de ADN. Naturalmente, esto se refiere al segmento de ADN tal como se aisló originalmente y no excluye genes o regiones codificantes añadidas posteriormente a, o dejadas a propósito en el segmento por la mano del hombre.

Debidas a ciertas ventajas asociadas con el uso de fuentes procariotas, es probable que se produzcan más ventajas con el aislamiento del gen HAS de procariotas tales como S. pyogenes, S. equisimilis o P. multocida. Una ventaja tal es que, normalmente, las enzimas eucariotas pueden requerir modificaciones postraduccionales significativas que sólo pueden conseguirse en un huésped eucariota. Esto tenderá a limitar la aplicabilidad de cualquier gen para HA sintasa eucariota que se obtenga. Además, los expertos habituales en la técnica probablemente se darán cuenta de ventajas adicionales en cuanto al tiempo y a la facilidad de manipulación genética cuando se busca emplear un gen para una enzima procariota. Estas ventajas adicionales incluyen (a) la facilidad de aislamiento de un gen procariota debido al tamaño relativamente pequeño del genoma y, por tanto, la cantidad reducida de rastreo de la correspondiente biblioteca genómica y (b) la facilidad de manipulación debido a que el tamaño global de la región codificante de un gen procariota es significativamente más pequeño debido a la ausencia de intrones. Además, si el producto del gen seHAS (es decir, la enzima) requiere modificaciones postraduccionales, éstas se conseguirán mejor en un entorno celular procariota similar (huésped) del que se deriva el gen.

Preferiblemente, las secuencias de ADN según la presente solicitud incluirán además regiones de control genético que permiten la expresión de la secuencia en un huésped recombinante seleccionado. Naturalmente, la naturaleza de la región de control empleada variará generalmente dependiendo de del uso particular (por ejemplo, clonación del huésped) previsto.

En particular, la solicitud se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen seHAS, que incluye, dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2. Además, en particular, la solicitud se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de un gen HAS o ADN, y en particular a un gen HAS o ADNc, correspondiente a HAS de Streptococcus equisimilis. Por ejemplo, cuando el segmento de ADN o vector codifica para una proteína HAS de longitud completa, o se destina para su uso en la expresión de una proteína HAS, se prefieren las secuencias que son esencialmente tal como se exponen en la SEQ ID NO: 2.

Los segmentos de ácido nucleico que tienen actividad HA sintasa pueden aislarse mediante los métodos descritos en el presente documento. El término "una secuencia esencialmente tal como se expone en la SEQ ID NO: 2" significa que la secuencia se corresponde sustancialmente con una parte de la SEQ ID NO: 2 y tiene relativamente pocos aminoácidos que no sean idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. El término "equivalente biológicamente funcional" se entiende bien en la técnica y se define adicionalmente en detalle en el presente documento, como un gen que tiene una secuencia esencialmente tal como se expone en la SEQ ID NO: 2, y que está asociado con la capacidad de los procariotas para producir HA o un recubrimiento de ácido hialurónico.

Por ejemplo, las secuencias que codifican para seHAS y spHAS son idénticas en aproximadamente un 70% y ricas en las bases adenina (A) y timina (T). El contenido de bases de seHAS es un 26,71% de A, un 19,13% de C, un 20,81% de G y un 33,33% de T (A/T = 60%). Mientras que en spHAS es de 31,34% de A, un 16,42% de C, un 16,34% de G y un 35,8% de T (A/T = 67%). Los expertos habituales en la técnica se sorprenderían de que la secuencia que codifica para seHAS no se hibride con el gen spHAS y viceversa, a pesar de ser idénticos en un 70%. Esta incapacidad inesperada para dar hibridación cruzada podría deberse a cortas interrupciones de bases no apareadas en todos los marcos de lectura abiertos. La incapacidad de spHAS y seHAS para dar hibridación cruzada se muestra en la figura 1. El fragmento más largo de nucleótidos idénticos comunes a ambas secuencias que codifican para seHAS y spHAS es de sólo 20 nucleótidos. Además, las secuencias muy ricas en A-T formarán complejos de hibridación menos estables que las secuencias ricas en G-C. Otra explicación posible podría ser que existen varios fragmentos de As o Ts en ambas secuencias que podrían hibridarse de una manera mal alineada e inestable. Esto pondría las secuencias génicas seHAS y spHAS fuera del marco con respecto a la otra, disminuyendo así la probabilidad de hibridación productiva.

Debido a estos fenómenos únicos de dos genes que codifican para proteínas que son idénticos en un 70% y no pueden dar hibridación cruzada con el otro, es beneficioso pensar en el segmento de ácido nucleico reivindicado en cuanto a su función; es decir un segmento de ácido nucleico que codifica para hialuronato sintasa enzimáticamente activa. Un experto ordinario en la técnica apreciaría que un segmento de ácido nucleico que codifica para hialuronato sintasa enzimáticamente activa puede contener sustituciones conservadas o semiconservadas a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1 y 2 y estar todavía dentro del alcance de la descripción de esta solicitud.

En particular, la técnica está repleta de ejemplos de la capacidad de los profesionales para realizar cambios estructurales a un segmento de ácido nucleico (es decir, sustituciones de aminoácidos conservados o semiconservados codificantes) y todavía conservar su actividad enzimática o funcional. Véase por ejemplo: (1) Risler et al. "Amino Acid Substitutions in Structurally Related Proteins. A Pattern Recognition Approach." J. Mol. Biol. 204:1019-1029 (1988) ["according to the observed exchangeability of amino acid side chains, only four groups could be delineated; (según la intercambiabilidad observada de las cadenas laterales de aminoácidos, sólo podrían delinearse cuatro grupos); (i) Ile y Val; (ii) Leu y Met, (iii) Lys, Arg y Gln, y (iv) Tyr y Phe."]; (2) Nicfind et al. "Amino Acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Aligment Derived from Main-Chain Folding Anoles." J. Mol. Biol. 219:481-497 (1991) [parámetros de similitud permiten que se diseñen sustituciones de aminoácidos]; y (3) Overington et al. "Environment-Specific Amino Acid Substitution Tables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folds", Protein Science 1:216-226 (1992) ["Analysis of the pattern of observed substitutions as a function of local environment shows that there are disctint patterns..." (El análisis del patrón de sustituciones observadas como una función del entorno local muestra que existen diferentes patrones...) Pueden realizarse cambios compatibles.]

Estas referencias y otras innumerables, indican que el experto habitual en la técnica, dada una secuencia de ácido nucleico, podría hacer sustituciones y cambios a la secuencia de ácido nucleico sin cambiar su funcionalidad. Además, un segmento de ácido nucleico sustituido puede ser sumamente idéntico y conservar su actividad enzimática con respecto al original puro, y todavía fracasar en hibridarse con el mismo.

La solicitud describe segmentos de ácido nucleico que codifican para hialuronato sintasa enzimáticamente activa, seHAS y spHAS. Aunque seHAS y spHAS son idénticos en un 70% y ambos codifican para hialuronato sintasa enzimáticamente activa, no dan hibridación cruzada. Por tanto, un experto ordinario en la técnica apreciaría que pueden realizarse sustituciones al segmento de ácido nucleico seHAS enumerado en la SEQ ID NO: 1 sin desviarse fuera del alcance y las reivindicaciones de la presente solicitud. En la tabla I, se presentan sustituciones de aminoácidos funcionalmente equivalentes, normalizadas y aceptadas.

TABLA I

1

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La presente solicitud describe un segmento de ácido nucleico purificado que codifica para una proteína según la SEQ ID NO: 2, definido adicionalmente como un vector recombinante. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector recombinante" se refiere a un vector que se ha modificado para contener un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteína HAS, o un fragmento de la misma. El vector recombinante puede definirse además como un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a dicho segmento de ácido nucleico que codifica para HAS.

La presente solicitud también describe una célula huésped, que se hace recombinante con un vector recombinante que comprende un gen HAS. La célula huésped recombinante preferida puede ser una célula procariota. Además, la solicitud describe que la célula huésped recombinante es una célula eucariota. Tal como se utiliza en el presente documento, el término célula "modificada por ingeniería genética" o "recombinante" pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifica para HAS. Por tanto, las células modificadas por ingeniería genética se pueden distinguir de las células que se producen de manera natural en que no contienen un gen introducido de manera recombinante. Por tanto, las células modificadas por ingeniería genética son células que tienen un gen con gen o genes introducidos. Por tanto, las células modificadas por ingeniería genética son células que tienen un gen o genes introducidos por la mano del hombre. Los genes introducidos de manera recombinante estarán en la forma de un gen de ADNc, una copia de un gen genómico o incluirán genes situados adyacentes a un promotor no asociado de manera natural con el gen introducido particular.

Cuando se desea utilizar un huésped distinto a los estreptococos, tal como puede utilizare para producir HA sintasa recombinante, puede ser ventajoso emplear un sistema procariota tal como E. coli, B. subtilis, Lactococcus sp., o incluso sistemas eucariotas tales como células de levaduras, de ovario de hámster chino o de riñón de mono verde africano, células VERO o similares, naturalmente, en el que esto se lleva cabo, generalmente será deseable llevar el gen para HA sintasa bajo el control de secuencias que son funcionales en el huésped alternativo seleccionado. Las secuencias de control de ADN apropiadas, así como su construcción y uso, generalmente se conocen bien en la técnica, tal como se trata con más detalle a continuación en el presente documento.

Los segmentos de ADN que codifican para HA sintasa incluyen además secuencias de ADN, conocidas en la técnica funcionalmente como orígenes de replicación o "replicones", que permiten la replicación de secuencias contiguas por el huésped particular. Tales orígenes permiten la preparación de segmentos o plásmidos de replicación y situados extracromosómicamente, a los que se ligan las secuencias de ADN para HA sintasa. En ejemplos más preferidos, el origen empleado es uno que puede realizar la replicación en huéspedes bacterianos adecuados para aplicaciones de biotecnología. Sin embargo, para una mayor versatilidad de los segmentos de ADN clonados, puede desearse emplear alternativa o incluso adicionalmente orígenes reconocidos por otros sistemas de huésped cuyo uso se contempla (tal como en un vector lanzadera, "shuttle").

El aislamiento y uso de otros orígenes de replicación tales como los orígenes de virus SV40, polioma o del papiloma bovino, que pueden emplearse para la clonación o expresión en varios organismos superiores, se conocen bien por los expertos habituales en la técnica. En ciertos casos, la descripción de la solicitud puede definirse, por tanto, en cuanto a un vector de transformación recombinante que incluye la secuencia del gen que codifica para HA sintasa junto con un origen de replicación apropiado y bajo el control de regiones de control seleccionadas.

Por tanto, los expertos en la técnica apreciarán que pueden utilizarse otros medios para obtener el gen HAS o ADNc, a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, pueden obtenerse fragmentos de ADN producidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa o RT-PCR, que contienen complementos completos de genes o ADNc procedentes de varias fuentes, incluyendo otras cepas de Streptococcus o procedentes de fuentes eucariotas, tales como bibliotecas de ADNc. Puede emplearse prácticamente cualquier enfoque de clonación molecular para la generación de fragmentos de ADN según la presente solicitud. Por tanto, la única limitación, en términos generales, en el método particular empleado para el aislamiento de ADN es que los ácidos nucleicos aislados deben codificar para una HA sintasa equivalente biológicamente funcional.

Una vez que se ha aislado el ADN, se liga junto con un vector seleccionado. Puede emplearse prácticamente cualquier vector de clonación para producir las ventajas según la solicitud. Vectores útiles habituales incluyen plásmidos y fagos para su uso en organismos procariotas e incluso vectores virales para su uso en organismos eucariotas. Los ejemplos incluyen virus pKK223-3, pSA3, lambda recombinante, SV40, polioma, adenovirus, del papiloma bovino y retrovirus. Sin embargo, se cree que se producirán finalmente ventajas particulares cuando se empleen vectores que puedan realizar la replicación tanto en cepas de Lactococcus o Bacillus como en E. coli.

Vectores tales como éstos, que se ilustran con el vector pSA3 de Dao y Ferretti o el vector pAT19 de Trieu-Cuot, et al., permiten que se realice la selección de colonias clonales en un huésped fácilmente manipulado tal como E. coli, seguido por posterior transferencia de nuevo a una cepa de Lactococcus o Bacillus de calidad para alimentos para la producción de HA. Éstos son microorganismos benignos y bien estudiados utilizados en la producción de ciertos alimentos y productos biotecnológicos. Son ventajosos porque se puede aumentar la capacidad de la cepa de Lactococcus o Bacillus para sintetizar HA a través de la dosificación génica (es decir, proporcionando copias extras del gen para HA sintasa mediante amplificación) y/o inclusión de genes adicionales para aumentar la disponibilidad de precursores de HA. La capacidad inherente de una bacteria para sintetizar HA también puede aumentarse mediante la formación de copias extra, o amplificación, del plásmido que porta el gen para HA sintasa. Esta amplificación puede explicar un aumento de hasta 10 veces en el número de copias del plásmido y, por tanto, el número de copias del gen para HA sintasa.

Otro procedimiento que aumentaría adicionalmente el número de copias del gen para HA sintasa es la inserción de múltiples copias del gen en el plásmido. Otra técnica incluiría integrar el gen HAS en el ADN cromosómico. Esta amplificación extra sería especialmente factible, puesto que el tamaño del gen bacteriano para HA sintasa es pequeño. En algunos escenarios, se emplea el vector ligado a ADN cromosómico para transfectar el huésped que se selecciona para los fines de selección clonal, tal como E. coli, mediante el uso de un vector que puede expresar el ADN insertado en el huésped elegido.

Cuando se emplea una fuente eucariota tal como fibroblastos dérmicos o sinoviales o células de cresta de gallo, se deseará proceder inicialmente preparando una biblioteca de ADNc. Esto se lleva a cabo, en primer lugar, mediante el aislamiento de ARNm de la células anteriores, seguido por la preparación de ADNc bicatenario utilizando una enzima con actividad transcriptasa inversa y ligado con el vector seleccionado. Están disponibles y se conocen en la técnica numerosas posibilidades para la preparación del ADNc bicatenario y se cree que todas estas técnicas son aplicables. Una técnica preferida implica la transcripción inversa. Una vez que se ha obtenido una población de ADNc bicatenario, se prepara una biblioteca de ADNc en el huésped seleccionado mediante técnicas aceptadas, tales como ligado en el vector apropiado y amplificación en el huésped apropiado. Debido al alto número de clones que se obtienen, y a la relativa facilidad de detección de grandes números de clones mediante las técnicas expuestas en el presente documento, puede desearse emplear vectores de expresión de fago, tales como \lambdagt11, \lambdagt12, \lambdaGem11 y/o \lambdaZAP para la detección del clonado y la expresión de clones de ADNc.

La solicitud también se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia, una secuencia de ácido nucleico esencialmente tal como la expuesta en la SEQ ID NO: 1. El término "esencialmente tal como la expuesta en la SEQ ID NO: 1" se utiliza en el mismo sentido que se describió anteriormente y significa que la secuencia de ácido nucleico se correlaciona sustancialmente con una parte de la SEQ ID NO: 1 y tiene relativamente pocos codones que no son idénticos, o funcionalmente equivalentes, a los codones de la SEQ ID NO: 1. El término "codón funcionalmente equivalente" se utiliza en el presente documento para referirse a codones que codifican para el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, expuestos en la tabla I, y también referidos como codones que codifican para aminoácidos biológicamente equivalentes.

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos en el extremo N o C-terminal o secuencias de ácido nucleico en 5' o 3', y todavía ser esencialmente tal como se expone en una de las secuencias descritas en el presente documento, siempre que la secuencia cumpla los criterios expuestos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad de la proteína biológica, en lo que se refiere a la expresión de proteínas y a la actividad enzimática. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificantes ("antisentido") que flanquean las partes 5' o 3' de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, que se sabe que aparecen dentro de los genes. En particular, la secuencia de aminoácidos del gen HAS en eucariotas parece ser un 40% más largo que el hallado en procariotas.

Permitiendo la degeneración del código genético así como sustituciones conservadas y semiconservadas, las secuencias que tienen entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 80%, o más preferiblemente, entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 90%, o incluso más preferiblemente, entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 99%; de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, serán secuencias que son "esencialmente tal como la expuesta en la SEQ ID NO: 1". Las secuencias que son esencialmente la misma que la expuesta en la SEQ ID NO: 1 también pueden definirse funcionalmente como secuencias que pueden hibridarse con un segmento de ácido nucleico que contiene el complemento de la SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación habituales o menos rigurosas. Los expertos en la técnica conocerán bien las condiciones de hibridación habituales adecuadas y se exponen claramente en el presente documento.

El término "condiciones de hibridación habituales" tal como se utiliza en el presente documento, se utiliza para describir aquellas condiciones en las que segmentos de ácido nucleico sustancialmente complementarios formarán apareamientos de bases de Watson y Crick habituales. Se conocen varios factores que determinan la especificidad de unión o hibridación, tales como el pH, temperatura, concentración salina, la presencia de agentes, tales como formamida y dimetilsulfóxido, la longitud de los segmentos que se están hibridando y similares. Cuando se considera que se utilizarán los segmentos de ácido nucleico más cortos para la hibridación, por ejemplo, fragmentos de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 100 nucleótidos, las condiciones preferidas de sal y temperatura incluirán 1,2-1,8 x HPB a 40-50ºC.

Naturalmente, la presente solicitud también engloba fragmentos de ADN que son complementarios, o esencialmente complementarios, a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias" son las que puede aparear las bases según las reglas de complementariedad de Watson y Crick habituales. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, tal como puede evaluarse mediante la misma comparación de nucleótidos expuesta anteriormente, o según se define como que puede hibridarse con el segmento de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

Los segmentos de ácido nucleico de la presente solicitud, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales para la enzima de restricción, múltiples sitios de clonación, colas de epítopo, regiones de polihistidina, otros segmentos codificantes y similares, de manera que su longitud global puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada preferiblemente la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Naturalmente, también se entenderá que esta solicitud no se limita a las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos particulares de SEQ ID NO: 1 y 2. Por tanto, los vectores recombinantes y segmentos de ADN aislados pueden incluir de forma variada las propias regiones que codifican para HAS, regiones codificantes que llevan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica o pueden codificar para polipéptidos mayores que, no obstante, incluyen regiones que codifican para HAS o pueden codificar proteínas o péptidos equivalentes, biológicamente funcionales, que tienen secuencias de aminoácidos alternativas.

Por ejemplo, se ha encontrado, caracterizado y purificado la hialuronato sintasa en dos sistemas: (a) las bacterias gram-negativas Pasturella multocida (SEQ ID NO: 19); y (2) virus de Chlorella PBCV-1 (SEQ ID NO: 7 y 8). La presencia de hialuronan sintasa en estos dos sistemas y la capacidad para purificar y utilizar la hialuronan sintasa procedente de estos dos sistemas diferentes indica la capacidad para purificar y aislar secuencias de ácido nucleico que codifican para hialuronan sintasa enzimáticamente activa.

Se sospechó durante mucho tiempo que la cápsula de P. multocida de tipo A de Carter (SEQ ID NO: 19) contenía ácido hialurónico, HA. La caracterización de HA sintasa de P. multocida condujo a interesantes diferencias enzimológicas entre ella y las proteínas seHAS y spHAS.

Las células de P. multocida producen una cápsula de HA extracelular fácilmente visible y, puesto que las dos HAS estreptocócicas son proteínas de membrana, se probaron preparaciones de membrana del patógeno del cólera aviar. En los ensayos iniciales, las fracciones de membrana bruta derivadas de ultrasonicación sola tenían niveles muy bajos de incorporación de UDP-[^{14}C]GlcA dependiente de UDP-GlcNAc en HA [\sim 0,2 pmol de transferencia de GlcA (\mug de proteínas)^{-1}h^{-1}] cuando se ensayó en condiciones similares a las utilizadas para medir la actividad de HAS estreptocócica. La enzima procedente de E. coli con el plásmido hasA recombinante también fue reacia al aislamiento al principio. Estos resultados fueron contrarios a las cantidades fácilmente detectables obtenidas a partir de Streptococcus mediante métodos similares.

Un protocolo de preparación alternativo que utilizaba tratamiento con lisozima enfriada en hielo en presencia de inhibidores de la proteasa junto con ultrasonicación permitió la recuperación sustancial de la actividad HAS de ambas especies de bacterias gram-negativas. De manera rutinaria, se obtuvieron actividades específicas para HAS de 5-10 pmol de GlcA transferido (\mug de proteína)^{-1}h^{-1} para membranas brutas de P. multocida de tipo natural con el nuevo método. En ausencia de UDP-GlcNAc, prácticamente no incorporó radiactividad (< 1% el ensayo idéntico con ambos precursores de azúcar) procedente de UDP-[^{14}C]GlcA en el material de peso molecular superior. Las membranas preparadas a partir del mutante sin cápsula, TnA, no tenían actividad HAS detectable cuando se complementó con ambos precursores de nucleótido con azúcar (datos no mostrados). El análisis por filtración en gel utilizando una columna de Sephacryl S-200 indica que la masa molecular de la mayoría del producto marcado con ^{14}C sintetizado in vitro es \geq 8 x 10^{4} Da, puesto que el material eluye en los volúmenes iniciales, un valor tal corresponde a una molécula de HA compuesta por al menos 400 monómeros. Este producto es sensible a la digestión por hialuronidasa de Streptomyces pero resistente al tratamiento con proteasa.

Los parámetros del ensayo de HAS se variaron para maximizar la incorporación de azúcares con UDP en el polisacárido por las membranas de P. multocida. spHAS estreptocócica requiere Mg^{2+} y, por tanto, se incluyó este ion metálico en los ensayos iniciales de las membranas de P. multocida. La HAS de P. multocida (pmHAS) era relativamente activa desde pH 6,5 hasta 8,6 en tampones de tipo Tris con un valor óptimo a pH 7. La actividad HAS era lineal con respecto al tiempo de incubación a pH neutro durante al menos 1 h. La pmHAS era aparentemente menos activa a mayores concentraciones iónicas debido a la adición de NaCl 100 mM a la reacción que contenía Tris 50 mM, pH 7, y MgCl_{2} 20 mM redujo la incorporación de azúcar en \sim 50%.

La especificidad por el ion metálico de pmHAS se evaluó a pH 7. En condiciones libres de metal, en presencia de EDTA, no fue detectable incorporación del precursor radiomarcado en el polisacárido (< 0,5% de la señal máxima). Mn^{2+} dio las mayores tasas de incorporación a las concentraciones iónicas inferiores para los metales probados (Mg, Mn, Co, Cu y Ni). Mg^{2+} dio aproximadamente el 50% de la estimulación con Mn^{2+} pero a concentraciones 10 veces superiores. Co^{2+}o Ni^{2+} a 10 mM mantuvieron niveles inferiores de actividad (20% o 9%, respectivamente, de los ensayos con Mn^{2+} 1 mM), pero las membranas a las que se suministró Cu^{2+} 10 mM fueron inactivas. En efecto, el mezclado de Cu^{2+} 10 mM y Mg^{2+} 20 mM con la preparación de membrana dio como resultado casi ninguna incorporación de marcador en el polisacárido (< 0,8% del valor sólo con Mg).

La caracterización inicial de la pmHAS se realizó en presencia de Mg^{2+}. La afinidad de unión de la enzima por sus precursores de nucleótido con azúcar se evaluó midiendo el valor de K_{M} aparente. Se monitorizó la incorporación de [^{14}C]GlcA o [^{3}H]GlcNAc en el polisacárido a concentraciones variables de UDP-GlcNAc o UDP-GlcA, respectivamente. En tampones que contenían Mg^{2+}, se determinaron los valores de K_{M} aparente de \sim 20 \muM para UDP-GlcA y \sim 75 \muM para UDP-GlcNAc utilizando diagramas de Hanes-Woolf ([S]/v frente a [S]) de los datos de la valoración. Los valores de V_{max} para ambos azúcares fueron los mismos debido a que las pendientes, correspondientes a 1/V_{max}, de los diagramas de Hanes-Woolf fueron equivalentes. En comparación con los resultados de los ensayos con Mg^{2+}, el valor de K_{M} para UDP-GlcNAc aumentó en aproximadamente el 25-50% hasta \sim 105 \muM y la V_{max} aumentó en un factor de 2-3 veces en presencia de Mn^{2+}.

Las enzimas Ha sintasa procedentes de P. multocida o S. pyogenes utilizan azúcares con UDP, pero tienen valores cinéticos óptimos algo diferentes con respecto al pH y la dependencia de ion metálico y valores de K_{M}. Las enzimas son más activas a pH 7; sin embargo, la pmHAS muestra según se informa más actividad a un pH ligeramente ácido y es relativamente inactiva por encima de pH 7,4. La pmHAS utiliza Mn^{2+} de manera más eficaz que Mg^{2+} en las condiciones de ensayo in vitro, pero se desconoce la coincidencia del cofactor de metal fisiológico en la célula bacteriana. En comparación, en estudios previos con la enzima estreptocócica, Mg^{2+} fue mucho mejor que Mn^{2+} aunque es cierto que el efecto menor de Mn^{2+} fue máximo a concentraciones \sim 10 veces inferiores que la concentración óptima de Mg^{2+}. La pmHAS se une aparentemente a los azúcares con UDP más fuertemente que spHAS. Los valores de K_{M} medidos para la pmHAS en las membranas brutas son aproximadamente 2-3 veces inferiores para cada sustrato que los obtenidos a partir de la HAS hallada en las membranas estreptocócicas: 50 o 39 \muM para UDP-GlcA y 500 o 100 \muM para UDP-GlcNAc, respectivamente.

Mediante análisis cinéticos, la V_{max} de la pmHAS fue 2-3 veces superior en presencia de Mn^{2+} que de Mg^{2+}, pero el valor de K_{M} para UDP-GlcNAc aumentó ligeramente en ensayos con el primer ion. Esta observación de aparente afinidad disminuida sugiere que el aumento de la tasa de polimerización no se debía a una mejor unión del complejo de ion Mn^{2+} / nucleótido con azúcar al (a los) sitio(s) activo(s) de la enzima. Por tanto, es posible que Mn^{2+} potencie alguna otra etapa de reacción, altere otro sitio / estructura de la enzima o modifique el entorno de la membrana fosfolipídica. La secuencia génica y la secuencia de la proteína de pmHAS se muestran en la SEQ ID NO: 19.

El virus de Chlorella PBCV-1 codifica para una glucosiltransferasa funcional que puede sintetizar un polisacárido, hialuronano [ácido hialurónico, HA]. Este hallazgo es contrario a la observación general de que los virus: (a) utilizan glucosiltransferasas de una célula huésped para crear nuevas estructuras de hidratos de carbono o (b) acumulan glucoconjugados de una célula huésped durante la maduración del virión. Además, HA se ha considerado generalmente limitada a animales y unos cuantos de sus virulentos patógenos bacterianos. Aunque se han caracterizado muchos hidratos de carbono vegetales, no se ha detectado previamente ni HA ni un análogo relacionado en células de plantas o protistas.

Las enzimas HAS de vertebrados (DG42, HAS1, HAS2, HAS3) y las enzimas HasA estreptocócicas (spHAS y seHAS) tienen varias regiones con similitud de secuencia. Mientras se secuenciaba el genoma de ADN bicatenario del virus PBCV-1 [virus de Chlorella Paramecium bursaria], se descubrió un ORF [marco de lectura abierto], A98R (Nº de registro 442580), que codificaba para una proteína de 567 residuos con una coincidencia del 28 al 33% de aminoácidos con las diversas HAS. Esta proteína se designó cvHAS (HA sintasa de virus de Chlorella). La secuencia génica que codifica para PBCV-1 y su secuencia de la proteína se muestran en las SEQ ID NO: 7 y 8.

PBCV-1 es el prototipo de una familia (Phycodnarviridae) de virus grandes (175-190 nm de diámetro), poliédricos, que forman placas, que se replican en ciertas algas verdes de tipo Chlorella, eucariotas y unicelulares. Los viriones de PBCV-1 contienen al menos 50 proteínas diferentes y un componente lipídico situado en el interior de la cápside de glicoproteína externa. El genoma de PBCV-1 es una molécula de ADNdc (ADN de doble cadena) lineal, no permutada de 330 kb con extremos en horquilla cerrados covalentemente.

Basándose en su secuencia de aminoácidos deducida, el producto génico A98R debe ser una proteína integral de membrana. Para probar esta hipótesis, se produjo A98R recombinante en Escherichia coli y se ensayó la fracción de membrana para determinar la actividad HAS. Se incorporaron UDP-GlcA y UDP-GlcNAc en el polisacárido mediante la fracción de membrana derivada de las células que contenían el gen A98R en un plásmido, pCVHAS, (actividad específica media de 2,5 pmoles de transferencia de GlcA/\mug de proteína/min) pero no mediante muestras procedentes de células control (< 0,001 pmoles de transferencia de GlcA/ /\mug de proteína/min). No se detectó actividad en la fracción soluble de las células transformadas con pCVHAS. Se requirieron simultáneamente UDP-GlcA y UDP-GlcNAc para la polimerización. La actividad fue óptima en tampón Hepes a pH 7,2 en presencia de MnCl_{2} 10 mM, mientras que no se detectó actividad si se omitió el ion metálico. Mg^{2+} y Co^{2+} fueron \sim 20% tan eficaces como Mn^{2+} a concentraciones similares. La pmHAS tiene un requerimiento de metal similar, pero otras HAS prefieren Mg^{2+}.

La enzima A98R recombinante sintetizó un polisacárido con un peso molecular promedio de 3-6 x 10^{6} Da, que es inferior al del HA sintetizado por spHAS recombinante o DG42 xlHAS in vitro (\sim 10^{7} Da y \sim 5-8 x 10^{6} Da, respectivamente; 13, 15). El polisacárido se degradó completamente por HA liasa de Streptomyces hyaluroniticus, una enzima que despolimeriza HA, pero no los glucosaminoglucanos relacionados estructuralmente tales como heparina y condroitina.

Se examinaron células de Chlorella infectadas por PBCV-1 para determinar la expresión génica de A98R. Apareció un transcrito de A98R de \sim 1.700 nucleótidos, a \sim 15 minutos después de la infección y desapareció a los 60 minutos después de la infección, lo que indica que A98R es un gen de expresión temprana. En consecuencia, se ensayaron fracciones de membrana de células de Chlorella infectadas con PBCV-1 y no infectadas a los 50 y 90 minutos después de la infección para determinar la actividad HAS. Las células infectadas, pero no las células no infectadas, tuvieron actividad. Como la enzima A98R recombinante derivada de bacterias, la incorporación radiomarcada de UDP-[^{14}C]GlcA en el polisacárido dependió tanto de Mn^{2+} como de UDP-GlcNAc. Este producto radiomarcado también se degradó por HA liasa. Los viriones de PBCV-1 rotos no tuvieron actividad.

Las células de Chlorella infectadas con PBCV-1 se analizaron para determinar el polisacárido de HA utilizando una proteína de unión marcada con ^{125}I, sumamente específica. Los extractos de células a los 50 y 90 minutos después de la infección contenían cantidades sustanciales de HA, pero no los extractos de algas no infectadas o viriones de PBCV-1 rotos. La proteína de unión a HA marcada también interactuó con células infectadas intactas a los 50 y 90 minutos después de la infección, pero no con células sanas. Por tanto, se inmovilizó una parte considerable del polisacárido de HA recién sintetizado en la superficie celular externa de las algas infectadas. El HA extracelular no desempeña ningún papel obvio en la interacción entre el virus y su huésped de alga debido a que no se alteró ni el tamaño de placa ni el número de placas al incluir hialuronidasa testicular (465 unidades/ml) o polisacárido de HA libre (100 \mug/ml) en el agar de la parte superior del ensayo en placa de PBCV-1.

El genoma de PBCV-1 también tiene genes adicionales que codifican para una UDP-Glc deshidrogenasa (UDP-Glc DH) y una glutamina:fructosa-6-fosfato aminotransferasa (GFAT). UDP-Glc DH convierte UDP-Glc en UDP-GlcA, un precursor requerido para la biosíntesis de HA. GFAT convierte la fructosa-6-fosfato en glucosamina-6-fosfato, un producto intermedio en la ruta metabólica de UDP-GlcNAc. Ambos de estos genes de PBCV-1, como el A98RHAS, se expresan de manera temprana en una infección y codifican para proteínas enzimáticamente activas. La presencia de múltiples enzimas en la ruta de biosíntesis de HA indica que la producción de HA debe servir en una importante función del ciclo vital de los virus de Chlorella.

Las HA sintasas de Streptococcus, vertebrados y PBCV-1 poseen muchos motivos de 2 a 4 residuos que aparecen en el mismo orden relativo. Estos motivos conservados probablemente reflejan dominios cruciales para la biosíntesis de HA, tal como se muestra en la figura 2. Las secuencias de proteína de seHAS del grupo C, spHAS del grupo A, HAS1, HAS2 y HAS3 murinas y HAS de rana se muestran alineadas en la figura 2. La alineación de la figura 2 se consiguió utilizando el programa de alineación múltiple DNASIS. Se indican mediante sombreado y asteriscos los residuos de seHAS idénticos en otros miembros conocidos de la familia de HAS (incluyendo HAS1 y 2 humanas, no mostrado). Los aminoácidos indicados mediante puntos se conservan en todos los miembros de la familia de \beta-glucosiltransferasa mayor. El símbolo del rombo indica el residuo de cisteína sumamente conservado que puede ser crítico para la actividad enzimática. Los puntos medios aproximados de los dominios de membrana pronosticados, MD1 a MD7, se indican con flechas. Xl indica Xeopus laevis y MM indica Mus muculis.

También se están descubriendo regiones con similitud entre las HAS y otras enzimas que sintetizan polisacáridos con enlaces \beta a partir de precursores de azúcar con UDP, según se secuencian más glucosiltransferasas. Los ejemplos incluyen celulosa sintasa bacteriana, quitina sintasas fúngicas y bacterianas y las diversas HAS. La importancia de estos motivos estructurales similares resultará más evidente cuando se acumulen las estructuras tridimensionales de las glucosiltransferasas.

La figura 3 representa las relaciones evolutivas entre las hialuronan sintasas conocidas. El árbol filogenético de la figura 3 se generó mediante el algoritmo de Higgins-Sharp utilizando el programa de alineación múltiple DNAsis. Los porcentajes de apareamiento calculados se indican en cada rama del dendrograma.

Los segmentos de ADN de la presente solicitud engloban péptidos y proteínas HAS equivalentes, biológicamente funcionales. Tales secuencias pueden surgir como una consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional, que se sabe que aparecen de manera natural dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Alternativamente, pueden crearse péptidos o proteínas funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de la tecnología de ADN recombinante, en la que pueden producirse cambios por ingeniería genética en la estructura de la proteína, basándose en las consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se están intercambiando. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras en la actividad enzimática o la antigenicidad de la proteína HAS o para probar mutantes de HAS con el fin de examinar la actividad HA sintasa a nivel molecular.

Además, cambios específicos en la secuencia codificante de HAS pueden dar como resultado un HA que tiene una distribución de tamaño o una configuración estructural modificada. Un experto ordinario en la técnica apreciaría que la secuencia codificante de HAS puede manipularse de una manera para producir una hialuronato sintasa alterada, que a su vez puede producir ácido hialurónico que tiene diferentes tamaños poliméricos y/o capacidades funcionales. Por ejemplo, la secuencia codificante de HAS puede alterarse de tal manera que la hialuronato sintasa tenga una especificidad por el sustrato de azúcar alterada, de modo que la hialuronato sintasa produzca un nuevo polímero de tipo ácido hialurónico, que incorpora una estructura diferente, tal como un derivado de azúcar o azúcar no incorporado anteriormente. Este azúcar recién incorporado podría dar como resultado un ácido hialurónico modificado que tiene diferentes propiedades funcionales, un ácido hialurónico que tiene un tamaño polimérico / peso molecular menor o mayor, o ambos. Tal como apreciará un experto habitual en la técnica dadas las secuencias codificantes de HAS, pueden realizarse cambios y/o sustituciones en la secuencia codificante de HAS, de tal manera que puedan obtenerse las modificaciones de tamaño y/o propiedad deseadas. La tabla II enumera la especificidad por el nucleótido con azúcar y el requerimiento de ion magnesio de seHAS recombinante.

TABLA II

2

El término "estructura modificada" tal como se utiliza en el presente documento indica un polímero de ácido hialurónico que contiene un azúcar o derivado que no se encuentra normalmente en el polisacárido de HA que se produce de manera natural. El término "distribución de tamaño modificada" se refiere a la síntesis de moléculas de ácido hialurónico de una distribución de tamaño que no se encuentra normalmente con la enzima nativa; el tamaño modificado por ingeniería genética podría ser mucho menor o mayor de lo normal.

Diversos productos de ácido hialurónico de diferente tamaño tienen aplicación en las áreas de administración de fármacos y la generación de una enzima de estructura alterada puede combinarse con un ácido hialurónico de diferente tamaño. Las aplicaciones en angiogénesis y cicatrización de heridas son potencialmente grandes si pueden prepararse polímeros de ácido hialurónico de aproximadamente 20 monosacáridos, en buena cantidad. Otra aplicación particular para oligosacáridos pequeños de ácido hialurónico es en la estabilización de proteínas humanas recombinantes utilizadas para fines médicos. Un problema principal con tales proteínas es su aclaramiento de la sangre y una corta semivida biológica. Una solución actual para este problema es acoplar una pequeña vaina molecular que evite que la proteína se elimine de la circulación demasiado rápido. El ácido hialurónico de muy bajo peso molecular es muy adecuado para este papel y sería no inmunógeno y biocompatible. El ácido hialurónico de mayor peso molecular unido a un fármaco o proteína pueden utilizarse para fijar como diana el sistema de células reticuloendoteliales, que tiene receptores endocíticos para el ácido hialurónico.

Dada esta descripción, un experto ordinario en la técnica apreciará que existen varias maneras en las que podría regularse la distribución de tamaño del polímero de ácido hialurónico preparado por la hialuronato sintasa, para dar diferentes tamaños. En primer lugar, puede alterarse el control cinético del tamaño del producto disminuyendo la temperatura, disminuyendo el tiempo de acción de la enzima y disminuyendo la concentración de uno o ambos sustratos de nucleótido con azúcar. Disminuyendo cualquiera o todas estas variables se facilitarán cantidades inferiores y tamaños menores del producto de ácido hialurónico. Las desventajas de estos enfoques son que el rendimiento de producto también disminuirá y puede ser difícil conseguir reproducibilidad de un día a otro o de un lote a otro.

En segundo lugar, la alteración de la capacidad intrínseca de la enzima para sintetizar un producto grande de ácido hialurónico. Pueden realizarse cambios en la proteína por ingeniería genética, mediante la tecnología de ADN recombinante, incluyendo sustitución, deleción y adición de aminoácidos específicos (o incluso la introducción de grupos prostéticos mediante el procesamiento metabólico). Tales cambios que pueden dar como resultado una enzima intrínsecamente más lenta, podrían permitir un control más reproducible del tamaño del ácido hialurónico mediante medios cinéticos. La distribución de tamaño final del ácido hialurónico está determinada por ciertas características de la enzima, que se basan en aminoácidos particulares de la secuencia. Entre el 20% de residuos absolutamente conservados entre las enzimas estreptocócicas y las hialuronato sintasas humanas, existe un conjunto de aminoácidos en posiciones únicas que controlan o influyen en gran medida en el tamaño del polímero de ácido hialurónico que la enzima puede producir. Cambios específicos en cualquiera de estos residuos pueden producir una HAS modificada que producen un producto de HA que tiene una distribución de tamaño modificada. Los cambios por ingeniería genética en seHAS, spHAS, pmHAS o cvHAS que disminuyen el tamaño intrínseco del ácido hialurónico que la enzima puede producir antes de que se libere el ácido hialurónico, proporcionarán medios poderosos para producir un producto de ácido hialurónico de tamaño menor o potencialmente mayor que el de la enzima nativa.

Finalmente, el ácido hialurónico de mayor peso molecular puede degradarse con hialuronidasas específicas para preparar ácido hialurónico de menor peso molecular. Sin embargo, con esta práctica es muy difícil conseguir reproducibilidad y se debe volver a purificar meticulosamente el ácido hialurónico para eliminar la hialuronidasa y los productos de digestión no deseados.

Tal como se muestra en la figura 4, la hialuronan sintasa puede modificarse por ingeniería genética para producir polímeros de ácido hialurónico de diferente tamaño, en particular más pequeños, que los de la enzima de tipo natural normal. La figura muestra la distribución de tamaños de HA (en millones de Dalton, una medida del peso molecular) para una serie de enzimas spHAS, cada una de las cuales se modificó por ingeniería genética mediante mutagénesis dirigida al sitio, para tener un cambio de un único aminoácido de la enzima nativa. Cada una tiene un residuo de cisteína diferente sustituido por alanina. El grupo de cinco curvas con símbolos vacíos representa las siguientes proteínas spHAS: natural, C124A, C261A, C366A y C402A. Los círculos llenos representan la proteína C225A poco expresada que es sólo parcialmente activa.

Los triángulos llenos es la proteína spHAS C280A, que se encuentra que sintetiza un intervalo mucho menor de polímeros de HA que la enzima normal o que las demás variantes mostradas. Llevar esto a la práctica muestra que es factible modificar por ingeniería genética la enzima hialuronato sintasa para sintetizar un intervalo deseado de tamaños del producto de HA. Los genes seHAS, pmHAS y cvHAS que codifican para hialuronato sintasa también pueden manipularse mediante mutagénesis dirigida al sitio para producir una enzima que sintetiza un intervalo deseado de tamaños del producto de HA.

El ácido hialurónico modificado estructuralmente no es diferente conceptualmente que la alteración de la distribución de tamaño del producto de ácido hialurónico cambiando aminoácidos particulares de la HAS o la spHAS deseada. Se esperan que sean particularmente útiles derivados de UDP-GlcNAc, en los que el grupo N-acetilo está ausente, UDP-GlcN, o está sustituido con otro grupo químicamente útil. La fuerte especificidad por el sustrato debe basarse en un conjunto particular de aminoácidos entre el 20% que se conservan. Los cambios específicos de uno o más de estos residuos producen una sintasa funcional que interactúa menos específicamente con uno o más de los sustratos que la enzima nativa. Esta enzima alterada podría utilizar entonces nucleótidos con azúcar especiales o naturales alternos para incorporar derivados de azúcar diseñados para permitir que se empleen diferentes químicas para los siguientes fines: (i) acoplar covalentemente fármacos, proteínas o toxinas específicos al ácido hialurónico modificado estructuralmente para la administración de un fármaco, procedimientos radiológicos, etc., generales o dirigidos a una diana, (ii) reticular covalentemente el propio ácido hialurónico o a otros soportes para obtener un gel, u otro biomaterial tridimensional con propiedades físicas más fuertes, y (iii) unir covalentemente ácido hialurónico a una superficie para producir una película o monocapa biocompatible.

Las bacterias también pueden modificarse por ingeniería genética para producir ácido hialurónico. Por ejemplo, se han creado cepas de B. subtilis que contienen el gen spHAS, así como el gen de uno de los precursores de nucleótido con azúcar. Se eligió esta bacteria ya que se utiliza frecuentemente en la industria de la biotecnología para la producción de productos para uso humano. Estas bacterias se concibieron como prototipos de primera generación para la generación de una bacteria que pueda producir ácido hialurónico en cantidades mayores que las disponibles actualmente, utilizando una cepa natural, de tipo natural. Se pone en múltiples copias de estos genes.

Por ejemplo, se construyeron tres cepas de Bacillus subtilis que contenían uno o ambos de los genes de Streptococcus pyogenes para hialuronan sintasa (spHAS) y UDP-glucosa deshidrogenasa, cuyos resultados se muestran en la tabla II-B. Basándose en un ensayo radiométrico comercial, sensible, para detectar y cuantificar HA, se determinó que la cepa con ambos genes (cepa nº 3) produce y secreta HA en el medio. La cepa original o la cepa sólo con el gen de la deshidrogenasa (cepa nº 1) no produce HA. La cepa nº 2, que sólo contiene el gen spHAS sólo produce HA, pero sólo el 10% de lo que produce la cepa nº 3. La electroforesis en gel de agarosa mostró que el HA secretado en el medio por la cepa nº 3 es de un peso molecular muy alto.

TABLA II-B

3

Estos experimentos utilizaron los promotores estreptocócicos hallados normalmente con estos genes para dirigir la expresión de proteínas. Se espera que la construcción de cepas con el marco de lectura de spHAS o seHAS bajo el control de un promotor de B. subtilis proporcionaría resultados incluso mejores. El vector utilizado es un vector lanzadera de E. Coli / gram-positivo que tiene un número de copias en el medio en B. subtilis y un gen para la resistencia a eritromicina (que permite resistencia frente a 8 \mug/ml en B. subtilis o 175 \mug/ml en E. coli). La cepa huésped de B. subtilis utilizada es 1A1 de BGSC ("Bacillus Genetic Stock Centre", Centro de Reserva Genética de Bacillus), que tiene un requerimiento de triptófano, pero que por lo demás es de tipo natural y puede esporular. El crecimiento celular y la producción de HA fue en medio mínimo de Spizizens más triptófano, glucosa, oilgoelementos y eritromicina (8 \mug/ml). El crecimiento fue a 32 grados Celsius con agitación vigorosa hasta que se agotó el medio (\sim 36 horas).

Esto demuestra que estas células modificadas por ingeniería genética, que normalmente no producirían ácido hialurónico, se vuelven competentes para hacerlo cuando se transforman con el gen spHAS. El seHAS también podría introducirse en una bacteria que no produce ácido hialurónico para crear una cepa bacteriana modificada por ingeniería genética que puede producir ácido hialurónico.

La presente solicitud también describe una composición purificada que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2. El término "purificado" tal como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una composición de proteína HAS, en la que la proteína HAS o la proteína HAS modificada apropiadamente (por ejemplo, conteniendo una cola de [His]_{6}) se purifica hasta cierto grado con respecto al estado que puede obtenerse de manera natural, es decir, en este caso, con respecto a su pureza dentro de un extracto de célula procariota. La proteína HAS puede aislarse de Streptococcus, Pasturella, virus de Chlorella, muestras del paciente, células recombinantes, tejidos infectados, subpoblación aislada de tejidos que contienen niveles elevados de hialuronato en la matriz extracelular y similares, tal como conocerán los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, la proteína seHAS o spHAS recombinante constituye aproximadamente el 10% de la proteína de membrana total de E. coli. Por tanto, una composición de proteína HAS purificada se refiere también a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, libre del entorno en que puede aparecer de manera natural

\hbox{(figura
5).}

Volviendo a la expresión del gen seHAS, ya sea procedente de ADN genómico o ADNc, se puede proceder para preparar un sistema de expresión para la preparación recombinante de la proteína HAS. La modificación por ingeniería genética de un(os) segmento(s) de ADN para su expresión en un sistema procariota o eucariota puede realizarse mediante técnicas conocidas generalmente por los expertos en la expresión recombinante.

HAS puede expresarse satisfactoriamente en sistemas de expresión eucariotas, sin embargo, los inventores afirman que los sistemas de expresión bacterianos pueden utilizarse para la preparación de HAS para todos los fines. Se cree que la expresión bacteriana tendrá en última instancia ventajas sobre la expresión eucariota en cuanto a la facilidad de uso, coste de producción y cantidad de material obtenido mediante la misma.

La purificación de hialuronan sintasa estreptocócica (seHAS y spHAS) se muestra en la tabla III y en la figura 6. Se analizaron fracciones procedentes de diversas fases del esquema de purificación mediante SDS-PAGE en un gel al 12,5%, que se tiñó luego con azul brillante de Coomassie R-250. Carriles: marcadores de peso molecular; 1, membranas completas de E. coli que contienen seHAS-H6 recombinante; 2, fracción insoluble tras la solubilización con detergente de las membranas; 3, fracción solubilizada con detergente; 4, material que ha fluido a través de la resina para cromatografía de Ni-NTA; 5-9, cinco lavados consecutivos de la columna (dos volúmenes de columna cada vez); 10, la HA sintasa pura eluida que es una única banda.

TABLA III

4

Se propone que la transformación de células huésped con segmentos de ADN que codifican para HAS proporcionará un medio conveniente para obtener una proteína HAS. También se propone que las secuencias de ADNc, genómicas y combinaciones de las mismas son adecuadas para la expresión eucariota, según procese la célula huésped, por supuesto, los transcritos genómicos para producir ARNm funcional para la traducción, para dar la proteína.

Además, la presente solicitud también describe un método para preparar una composición de proteína que comprende hacer crecer una célula huésped recombinante que comprende un vector que codifica para una proteína, que incluye una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 o es funcionalmente similar con cambios de aminoácido conservados o semiconservados. La célula huésped se hará crecer en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico y la producción de proteína seguido por la recuperación de la proteína así producida. La producción de HAS y en última instancia HA, incluyendo la célula huésped, las condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, la producción y recuperación de la proteína, los conocerán los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción del gen seHAS, y el producto de proteína del gen seHAS y mediante los métodos descritos en el presente documento.

Huéspedes preferidos para la expresión de ácido hialurónico son los procariotas, tales como S. equisimilis, y otros miembros adecuados de la especie Streptococcus. Sin embargo, también se sabe que HA puede sintetizarse por células huésped heterólogas que expresan HA sintasa recombinante, tales como miembros de la especie del género Bacillus, Enterococcus, o incluso Escherichia. Un huésped más preferido para la expresión de la HA sintasa de la presente solicitud es una bacteria transformada con el gen HAS de la presente solicitud, tal como de la especie Lactococcus, Bacillus subtilis o E. coli.

De manera similar, se cree que puede utilizarse casi cualquier sistema de expresión eucariota, para la expresión de HAS, por ejemplo podrían emplearse sistemas basados en baculovirus, basados en glutamina sintasa, basados en dihidrofolato reductasa, basados en SV-40, basados en adenovirus, basados en citomegalovirus, basados en levaduras y similares. Para la expresión de esta manera, se podrían colocar las secuencias codificantes adyacentes a y bajo el control del promotor. Se entiende en la técnica que para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor tal, se sitúa el extremo 5' del sitio de iniciación de la transcripción del marco de lectura transcripcional de la proteína entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "aguas abajo" del (es decir, en 3' de) promotor elegido. Además, los sistemas de vector de expresión de la levadura Saccharomyces cevevisiae, tal como pYES2, también producirán HAS bajo el control del promotor GAL, tal como se muestra en la figura 7. La figura 7 muestra que la enzima spHAS se produjo en una levadura recombinante utilizando el plásmido pYES2. Cuando se suministraron UDP-GlcA y UDP-GlcNAc, la enzima produce HA de alto peso molecular.

Cuando se considera la expresión eucariota, normalmente también se deseará incorporar en la unidad transcripcional, que incluye el gen HAS o ADN, un sitio de poliadenilación apropiado (por ejemplo, 5'-AATAAA-3') si no estaba contenido uno en el segmento clonado original. Normalmente, el sitio de adición de poli A se sitúa aproximadamente a de 300 a 2000 nucleótidos "aguas abajo" del sitio de terminación de la proteína en una posición anterior a la terminación de la transcripción.

Se considera que puede utilizarse prácticamente cualquiera de las células huésped empleadas comúnmente en relación con la expresión de HAS según el presente documento. Ejemplos de líneas celulares preferidas para expresar el ADNc para HAS de la presente solicitud incluyen líneas celulares empleadas comúnmente para la expresión eucariota, tales como las líneas celulares 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, Wi 38, BHK, COS-7, RIN y MDCK. Esto incluirá generalmente las etapas de proporcionar un huésped recombinante que lleve el segmento de ADN recombinante que codifica para la enzima HAS y que pueda expresar la enzima; cultivar el huésped recombinante en medios, en condiciones que permitirán la transcripción del gen HAS clonado o ADNc y apropiadas para la producción del ácido hialurónico; y separar y purificar la enzima HAS o el ácido hialurónico secretado del huésped recombinante.

Generalmente, las condiciones apropiadas para la expresión del gen HAS clonado o ADNc dependerán del promotor, el vector y el sistema huésped que se emplea. Por ejemplo, cuando se emplea el promotor lac, se deseará inducir la transcripción mediante la inclusión de un material que estimulará la transcripción de lac, tal como isopropiltiogalactósido. Por ejemplo, el gen seHAS clonado de la presente solicitud se expresa como una proteína que contiene HIS_{6} en E. coli, tal como se muestra en la figura 5. Cuando se emplean otros promotores, pueden necesitarse diferentes materiales para inducir o, de otra manera, regular por incremento la transcripción.

La figura 5 representa la sobreexpresión de seHAS y spHAS recombinantes en E. coli. Se fraccionaron proteínas de membrana (5 mg por carril) mediante SDS-PAGE utilizando un gel al 10% (p/v) en condiciones reductoras. El gel se tiñó con azul de Coomassie R-250, se fotografió, se exploró y se cuantificó utilizando un densitómetro personal de dinámica molecular (modelo PDSI P60). La posición de HA sintasa se marca mediante la flecha. El carril A es spHAS nativa (grupo A); el carril C es seHAS nativa; el carril E es seHAS recombinante; el carril P es spHAS recombinante; el carril V es el vector solo. Se utilizaron patrones de bajo Mr de Bio-Rad y se muestran en kDa.

Además de obtener la expresión de la sintasa, se deseará preferiblemente proporcionar un entorno que sea propicio para la síntesis de HA, incluyendo genes apropiados que codifiquen para enzimas necesarias para la biosíntesis de precursores de nucleótido con azúcar o utilizando medios de crecimiento que contienen sustratos para las enzimas que proporcionan precursores, tales como N-acetilglucosamina o glucosamina (GlcNAc o GlcNH_{2}) y glucosa (Glc).

Puede desearse además incorporar el gen en un huésped que es deficiente en la enzima hialuronidasa, de modo que no se degradará el producto sintetizado por la enzima en el medio. Además, podría elegirse un huésped para optimizar la producción de HA. Por ejemplo, un huésped adecuado sería uno que produjese grandes cantidades de los precursores de nucleótido con azúcar para soportar la enzima HAS y permitirle producir grandes cantidades de HA. Tal huésped puede encontrarse de manera natural o puede prepararse mediante una variedad de técnicas que incluyen mutagénesis o tecnología de ADN recombinante. Los genes para los nucleótidos con azúcar que sintetizan enzimas, particularmente la UDP-Glc deshidrogenasa requerida para producir UDP-GlcA, podrían también aislarse e incorporarse en un vector junto con el gen HAS o ADNc. La presente solicitud también describe un huésped que contiene estos genes recombinantes auxiliares o ADNc y la amplificación de estos productos génicos, permitiendo así un aumento de la producción de HA.

Los medios empleados para cultivar la célula huésped no se cree que sean particularmente cruciales. Para detalles útiles, se desea hacer referencia a las patentes de los EE.UU. números 4.517.295; 4.801.539; 4.789.990 o 4.780.414; todas incorporadas como referencia al presente documento. Cuando se emplea un huésped procariota, tal como S. equisimilis, puede desearse emplear una fermentación de la bacteria en condiciones anaerobias en medios de crecimiento de caldo enriquecido con CO_{2}. Esto permite una mayor producción de HA que en condiciones aerobias. Otra consideración es que las células estreptocócicas que se hicieron crecer de manera anaerobia no producen exotoxinas pirogénicas. Pueden adaptarse las condiciones de crecimiento apropiadas para otros huéspedes procariotas, tal como sabrán los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción.

Una vez que se ha construido el huésped apropiado, y cultivado en condiciones apropiadas para la producción de HA, se deseará separar el HA así producido. Normalmente, el HA se secretará o si no se liberará por el organismo recombinante en los medios circundantes, permitiendo el rápido aislamiento de HA desde los medios mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, HA puede separarse de las células y residuos filtrando y en combinación con separación de los medios mediante precipitación en alcoholes tales como etanol. Otros agentes de precipitación incluyen disolventes orgánicos tales como acetona o sales de amonio cuaternario orgánicas tales como cloruro de cetilpiridinio
(CPC).

Una técnica preferida para el aislamiento de HA se describe en la patente de los EE.UU. número 4.517.295 y que se incorpora como referencia al presente documento, en la que se añade el ácido carboxílico orgánico, ácido tricloroacético, a la suspensión bacteriana al final de la fermentación. El ácido tricloroacético hace que las células bacterianas se aglutinen y mueran, y permite mayor facilidad de separación de estas células, y residuos asociados, del HA, el producto deseado. El sobrenadante clarificado se concentra y dializa para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular incluyendo el ácido orgánico. El procedimiento mencionado anteriormente utiliza filtración a través de portafiltros ("filter cassettes") que contenían filtros de 0,22 \mum de tamaño de poro. Se continuó la diafiltración hasta que la conductividad de la disolución disminuyó hasta aproximadamente 0,5 megaohms.

El HA concentrado se precipitó añadiendo un exceso de etanol de calidad para reactivo u otro disolvente orgánico y luego se secó el HA precipitado mediante lavado con etanol y se secó a vacío, se liofilizó para eliminar el alcohol. Luego, el HA puede redisolverse en un tampón borato, pH 8 y se precipita con CPC o ciertas otras sales de amonio orgánicas tales como CETAB, una disolución mixta de bromuro de trimetilamonio a 4 grado(s) Celsius. El HA precipitado se recupera mediante filtración gruesa, se resuspendió en NaCl 1 M, se sometió a diafiltración y se concentró tal como se describe adicionalmente en la patente a la que se hizo referencia anteriormente. El HA resultante se esteriliza por filtración y está listo para convertirse en una sal, polvo seco o disolución estéril apropiados, dependiendo del uso final deseado.

A. Métodos de ingeniería genética típicos que pueden emplearse

Si se utilizan células sin barreras formidables de membrana celular como células huésped, la transfección se lleva a cabo mediante el método de precipitación con fosfato de calcio, bien conocido por los expertos en la técnica. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en las células, tales como inyección nuclear, lípidos catiónicos, electroporación, fusión de protoplastos o mediante el sistema de suministro de biopartículas Biolistic (MR) desarrollado por DuPont (1989). La ventaja de utilizar el sistema de DuPont es una alta eficacia de transformación. Si se utilizan células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, el método de transfección preferido es el tratamiento con calcio que utiliza cloruro de calcio para inducir competencia o electroporación.

La construcción de vectores adecuados que contengan las secuencias codificantes y de control deseadas emplea técnicas de ligado habituales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada para construir los plásmidos requeridos. La escisión se realiza mediante tratamiento con enzima (o enzimas) de restricción en un tampón adecuado. En general, se utiliza aproximadamente 1 \mug de plásmido o fragmentos de ADN con aproximadamente 1 unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de disolución tampón. Los tampones y cantidades de sustrato apropiados para enzimas de restricción particulares se especifican por el fabricante. Son viables tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC.

Tras las incubaciones, la proteína se elimina por extracción con fenol y cloroformo y se recupera el ácido nucleico de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol. Si se requieren extremos romos, la preparación se trata durante 15 minutos a 15ºC con 10 unidades de polimerasa I (Klenow), se extrae con fenol-cloroformo y se precipita con etanol. Para el ligado, se tratan cantidades aproximadamente equimolares de los componentes deseados, adaptados adecuadamente en el extremo para proporcionar un apareamiento correcto, con aproximadamente 10 unidades de ADN ligasa de T4 por 0,5 \mug de ADN. Cuando los vectores escindidos se utilizan como componentes, puede ser útil evitar un nuevo ligado del vector escindido mediante pretratamiento con fosfatasa alcalina bacteriana.

Para el análisis para confirmar la presencia de secuencias funcionales en los plásmidos construidos, la primera etapa fue amplificar el ADN del plásmido clonándolo en células SURE de E. coli (Stratagene) específicamente competentes, realizando la transformación a 30-32ºC. En segundo lugar, el plásmido recombinante se utiliza para transformar Bi8337-41 de la cepa K5 de E. coli, que pueden producir el precursor de UDP-GlcA, y transformantes satisfactorios seleccionados como apropiados por su resistencia a los antibióticos. Entonces se rastrean los plásmidos de la biblioteca de transformantes para determinar colonias bacterianas que muestren producción de HA. Estas colonias se cogen, se amplifican y los plásmidos se purifican y analizan mediante la obtención del mapa de restricción. Los plásmidos que muestran indicios de un gen HAS funcional se caracterizan entonces adicionalmente mediante cualquiera de varias técnicas de análisis de la secuencia que se conocen por los expertos habituales en la técnica.

B. Fuente y cultivos celulares huésped y vectores

En general, se utilizaron procariotas para la clonación inicial de las secuencias de ADN y la construcción de los vectores útiles de la solicitud. Se cree que una fuente adecuada pueden ser células gram-positivas, particularmente las derivadas de cepas estreptocócicas del grupo C. Las bacterias con una única membrana, pero una pared celular gruesa tales como Staphylococci y Streptococci son gram-positivas. Las bacterias gram-negativas tales como E. coli contienen dos membranas diferenciadas en lugar de una que rodea la célula. Los microorganismos gram-negativos tienden a tener paredes celulares más finas. La única membrana de los microorganismos gram-positivos es análoga a la membrana plasmática interna de las bacterias gram-negativas. Las células huésped preferidas son cepas de Streptococcus que se mutan para volverse hialuronidasa-negativas o si no inhibirla (documentos EP144019, EP266578, EP214757). Las cepas de Streptococcus que han sido particularmente útiles incluyen S. equisimilis y S. zooepidemicus.

También pueden utilizarse procariotas para la expresión. Para la expresión HA sintasa en una forma que es más probable que albergue la síntesis de HA de alto peso molecular, puede desearse emplear especies de Streptococcus tales como S. equisimilis y S. zooepidemicus. Podrían utilizarse las cepas mencionadas anteriormente, así como W3110 de E. coli (F-, lambda-, prototrófica, Nº de ATCC 273325), bacilos tales como Bacillus subtilis, u otras enterobacteriáceas tales como Serratia marcescens, para generar un huésped que contiene "super" HAS.

En general, se utilizan vectores de plásmido que contienen orígenes de replicación y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped, junto con estos huéspedes. El vector normalmente lleva un origen de replicación, así como secuencias de marcado que pueden proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma normalmente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona así un medio fácil para identificar células transformadas. Un plásmido pBR o un plásmido pUC, u otro plásmido microbiano o fago también debe contener, o modificarse para contener, promotores que puedan utilizarse por el organismo microbiano para la expresión de sus propias proteínas.

Los promotores utilizados más comúnmente en la construcción de ADN recombinante incluyen el promotor lacZ, promotor tac, el promotor del bacteriofago T7 y el sistema de promotor de triptófano (trp). Aunque éstos son los utilizados más comúnmente, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos, y se han publicado detalles referentes a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo a un profesional experto ligarlos funcionalmente con vectores de plásmido. También pueden utilizarse vectores de integración para su uso con la presente solicitud.

Además de los procariotas, pueden utilizare microbios eucariotas, tales como cultivos de levaduras. Saccharomyces ccrevisiae, o levadura de panadería común es la más utilizada comúnmente entre los microorganismos eucariotas, aunque están disponibles comúnmente otras cepas varias. Para la expresión en Saccharomyces, se utiliza comúnmente, por ejemplo, el plásmido YRp7. Este plásmido contiene ya el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura a la que le falta la capacidad para crecer sin triptófano, por ejemplo, nº de ATCC 44076 o PEP4-1. La presencia de la lesión de trpl como característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores para los genes para la utilización de galactosa, la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Al construir plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también se ligan en el vector de expresión en 3' de la secuencia deseada que se va a expresar para proporcionar poliadenilación del ARNm y terminación. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son la región promotora para alcohol deshidrogenasa 2, citocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa mencionada anteriormente, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector de plásmido que contenga un promotor, origen de replicación y secuencias de terminación compatibles con levaduras.

Además de microorganismos, también pueden utilizarse cultivos de células derivadas de organismos multicelulares como huéspedes. En principio, es factible cualquiera de tales cultivos celulares, ya sea un cultivo de vertebrado o invertebrado. Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años. Ejemplos de tales líneas celulares huésped útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y las líneas celulares WI38, BHK, COS y MDCK.

Para su uso en células de mamífero, las funciones de control en los vectores de expresión se proporcionan a menudo mediante material viral. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, virus de papiloma bovino y más frecuentemente de virus de simio 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus, como un fragmento que también contiene el origen de replicación viral de SV40. También pueden utilizarse fragmentos de SV40 menores o mayores, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BgI I localizado en el origen de replicación viral.

Además, es también posible, y a menudo deseable, utilizar secuencias de promotor o control normalmente asociadas con la secuencia génica deseada, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de célula huésped. Puede proporcionarse un origen de replicación mediante la construcción del vector que incluya un origen exógeno, tal como puede derivarse de SV40 u otra fuente viral (por ejemplo, polioma, Adeno, BPV) o puede proporcionarse mediante el mecanismo de replicación cromosómica de la célula huésped. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula huésped, este último mecanismo a menudo es suficiente.

C. Aislamiento de un gen auténtico para HA sintasa a partir de una cepa sumamente encapsulada de Streptococcus equisimilis del grupo C

La proteína codificada, designada como seHAS, es de 417 aminoácidos (peso molecular calculado de 47.778 y pI de 9,1) y es el miembro más pequeño de la familia de HAS identificado hasta ahora (figura 2). seHAS también migra de manera anómalamente rápida en SDS-PAGE (M_{r} \sim 42 kDa) (figuras 5 y 8).

La figura 8 es una representación gráfica de un análisis de Western Blot de seHAS recombinante utilizando anticuerpos específicos. Se fraccionaron membranas estreptocócicas del grupo C (C, carril 1) o el grupo A (A, carril 4) y membranas de E. coli (9 mg/carril) que contenían seHAS (E; carriles 2, 7 y 9) o spHAS (P; carriles 3, 6, 8 y 10) recombinantes mediante SDS-PAGE reductora y se electrotransfirieron a nitrocelulosa. En las tiras de nitrocelulosa se introdujo una sonda y se revelaron tal como se describe en la solicitud utilizando fracciones de IgG purificadas obtenidas para las siguientes regiones de spHAS: péptido del dominio central E^{147}-T^{161} (carriles 1-4); péptido del extremo C-terminal (carriles 5-6); la proteína completa (carriles 7 y 8); dominio central recombinante (carriles 9 y 10). IgG no inmune o las membranas de células transformadas con el vector solo no dieron tinción como en el carril 5.

Las secuencias que codifican para las proteínas seHAS y spHAS (identificadas previamente en el documento de los EE.UU. de nº de serie 08/899.940) son idénticas en un 72%. La secuencia de proteína deducida de seHAS se confirmó mediante su reactividad con un anticuerpo peptídico sintético (figura 8). Se recuperó seHAS recombinante expresada en E. coli en las membranas como una proteína principal (figura 5) y sintetizó HA de peso molecular muy grande en presencia de UDP-GlcNAc y UDP-GlcA in vitro (figura 9).

La figura 9 muestra un análisis cinético de las distribuciones de tamaño de HA producidas por seHAS y spHAS. Las membranas de E. coli que contenían cantidades iguales de proteína seHAS y spHAS se incubaron a 37ºC con UDP-[^{14}C]GlcA 1,35 mM (1,3 x 10^{3} dpm/nmol) y UDP-GlcA 3,0 mM, tal como se describe en la solicitud. Estas concentraciones de sustrato son superiores a 15 veces los valores de K_{M} respectivos. Se trataron muestras tomadas a los 0,5, 1,0 y 60 minutos con SDS y se sometieron a cromatografía sobre Sephacryl S400 HR. Los perfiles de HA en el intervalo de fraccionamiento de la columna (fracciones 12-24) se normalizaron con respecto al porcentaje de HA total en cada fracción. Los valores por encima de las flechas en el panel superior son los PM (en millones) de HA determinados directamente en un experimento separado utilizando un instrumento de dispersión de la luz de láser multiángulo Dawn (Wyatt Technology Corp.). Se muestran las distribuciones de tamaño del HA sintetizado por seHAS (\medbullet, \blacksquare, \ding{115}) y spHAS (\medcirc, \boxempty, _) a los 0,5 minutos (\medcirc, \medbullet), 1,0 minutos (\boxempty, \blacksquare) y 60 minutos (_, \ding{115}) tal como se indican. El análisis mostró que seHAS y spHAS son esencialmente idénticas en la distribución de tamaño de las cadenas de HA que sintetizan (figura 9). seHAS es el doble de rápida que spHAS en su capacidad para preparar HA.

C.1 Cepas bacterianas y vectores

Se obtuvo la cepa D181 del grupo C mucoide; (Streptococcus equisimilis) procedente de la Colección de la Universidad Rockfeller. Las cepas huésped de E. coli Sure y XL1-Blue MRF' procedían de Stratagene la cepa Top10 F' procedía de Invitrogen. A menos que se indique lo contrario, los estreptococos se hicieron crecer en THY y las cepas de E. coli se hicieron crecer en medio LB. El vector de expresión pKK-223 procedía de Pharmacia, el vector de clonación PCR 2.1 procedía de Invitrogen y el vector Bam HI/CIAP \lambda Zap Express MR predigerido procedía de Stratagene.

C.2 ADN recombinante y clonación

Se digirió parcialmente ADN genómico de alto peso molecular de Streptococcus equisimilis aislado mediante el método de Caparon y Scott (conocido por los expertos habituales en la técnica) con Sau3A1 hasta un tamaño medio de 2-12 kb. El ADN digerido se precipitó con etanol, se lavó y ligó al vector Bam HI/CIAP\lambda Zap Express. El ADN ligado se empaquetó en un fago con un extracto Packagene^{MR} obtenido de Promega. Se comprobó el título de la biblioteca del fago empaquetado utilizando XL1-Blue MRF' de E. coli como huésped.

C.3 Amplificación por PCR degenerada

Se diseñaron oligonucleótidos degenerados basándose en las secuencias conservadas entre spHAS (Streptococcus pyogenes), DG42 (HAS de Xenopus laevis; 19) y nodC (un factor de nodulación de Rhizobium meliloti; 20) y se utilizaron para la amplificación por PCR con ADN genómico de D181 como molde. Las condiciones de amplificación fueron 34 ciclos a: 94ºC durante 1 minuto, 44ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1,5 minutos seguido por una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. El oligonucleótido HADRF1. 5'-GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTF GG-3' (SEQ ID NO: 20; cadena codificante) corresponde a la secuencia D^{259}RCLTNYAIDL (SEQ ID NO: 9; spHAS). El oligonucleótido HACTR1, 5'-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3' (SEQ ID NO: 21; cadena no codificante) corresponde a la región C^{404}TIKNTEWGTR (SEQ ID NO: 10; spHAS). La degeneración de bases en las mismas posiciones se representa mediante la nomenclatura adoptada por la IUPAC en sus códigos para bases degeneradas enumerados en la tabla IV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

Estos dos oligonucleótidos dieron un producto de PCR de 459 pb, que se separaron en un gel de agarosa y se purificaron utilizando el kit Geneclean de BIO-101. Entonces, se clonó este fragmento en el vector PCR 2.1 utilizando células TOP 10 F' como huésped, según las instrucciones del fabricante. Se purificó ADN de plásmido bicatenario de E. Coli (Top 10 F') utilizando el kit QIAfilter Plasmid Midi (Qiagen). También se sintetizaron otros dos cebadores codificantes degenerados: HAVAF1, 5'-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA-3' (SEQ ID NO: 22, que corresponde a la región V^{66}AAVIPSYNE (SEQ ID NO: 11) de spHAS) y HAVDF1, 5'-GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3' (SEQ ID NO: 23, basada en V^{100}DDGSSNTD (SEQ ID NO: 12) de spHAS). Se sintetizaron dos cebadores no codificantes únicos basados en la secuencia del producto de PCR de 459 pb. Estos eran: D181.2, 5'-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3' (SEQ ID NO: 13) y D181.4, 5'-TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC-3' (SEQ ID NO: 14). Cada uno de los dos cebadores codificantes degenerados, cuando se utilizan con D181.2 o D181.4 para amplificar el ADN genómico de D181, dieron productos de PCR de tamaño esperado. Los cuatro productos de PCR se clonaron y secuenciaron utilizando la misma estrategia que anteriormente. Para cada producto de PCR, se compararon las secuencias obtenidas a partir de seis clones diferentes con el fin de obtener una secuencia consenso. Así, se obtuvo una secuencia de 1042 pb con un ORF continuo, con alta homología con spHAS.

C.4 Rastreo de la biblioteca

Se utilizaron dos sondas moleculares para rastrear la biblioteca; el producto de PCR de 459 pb clonado y el oligonucleótido D181.5 (5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3' (SEQ ID NO: 15); derivado de la secuencia de 1042 pb). El producto de PCR de 459 pb se radiomarcó utilizando el kit de marcado de cebador aleatorio Prime-It 11 (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos se marcaron mediante el kit Kinace-It Kinasing (Stratagene) utilizando [\gamma^{32}P]ATP. Los productos radiomarcados se separaron del material no marcado en columnas NucTrap Push (Stratagene). La oligosonda se hibridó específicamente con un digesto genómico de D181 en inmunotransferencias tipo Southern. Para rastrear la biblioteca del fago \lambda, se utilizó XLBLUE MRF' como huésped (3000 placas de lisis/placa) en membranas de nitrocelulosa que contienen el fago adsorbido, se hibridaron previamente a 60ºC y se hibridaron con el oligonucleótido marcado en el extremo 5', D181.5, en disolución de hibridación QuikHyb (Stratagene) a 80ºC, según las instrucciones.

Entonces, se lavaron las membranas con tampón 2x SSC y 0,1% de SDS (p/v) a temperatura ambiente durante 15 minutos, a 60ºC con tampón 0,1x SSC y 0,1% de SDS (p/v) durante 30 minutos, se secaron y expusieron a la película Bio-Max MS durante la noche a -70ºC. Las placas positivas se volvieron a cultivas en placa y se volvieron a detectar dos veces. Se almacenaron los fagos positivos puros en tampón SM con cloroformo. La PCR en estos fagos con cebadores del vector reveló tres tamaños de inserto diferentes.

La PCR con una combinación de cebadores del vector y cebadores de diferentes regiones de la secuencia de 1042 pb clonada reveló que sólo uno de los tres fagos diferentes tenía el gen HAS completo. El tamaño del inserto en este fago fue de 6,5 kb. Fallaron los intentos de subclonar el inserto en forma de plásmido mediante autoescisión a partir del clon seleccionado de la biblioteca del fago. Por tanto, se aplicó una estrategia de PCR de nuevo en el ADN de fago positivo puro para obtener el extremo 5' y 3' del ORF. Los cebadores oligonucleotídicos D181.3 (5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3' (SEQ ID NO: 16)) y T3 (cebador del vector) amplificaron un producto de 3 kb y los oligonucleótidos D181.5 y T7 (cebador del vector) amplificaron un producto de 2,5 kb. Las secuencias de los extremos 5' y 3' del ORF se obtuvieron secuenciando estos dos productos anteriores. El análisis de todas las secuencias de los productos de PCR permitió reconstruir el ORF del gen seHAS de 1254 pb.

C.5 Clonación de expresión de la seHAS

Se diseñaron cebadores en las regiones del codón de iniciación y de terminación de seHAS para que contuviesen un sitio de restricción EcoR1 en el oligonucleótido codificante (5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACC
TC-3' (SEQ ID NO: 17) y un sitio Pst1 en el oligonucleótido no codificante (5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTT
TTTACGTGT-3' (SEQ ID NO: 18)). Estos cebadores amplificaron un producto de PCR de 1,2 kb a partir de ADN genómico de D181 así como a partir de fago positivo frente a la hibridación puro. El producto de 1,2 kb se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se digirió con Pst1 y EcoR1 y se clonó direccionalmente en el vector pKK223 digerido con Pst1 y EcoR1. El vector ligado se transformó en células SURE de E. coli que se hicieron crecer entonces a 30ºC. Esta etapa fue importante en la práctica puesto que otras células huésped o temperaturas superiores dieron como resultado deleciones del inserto clonado. Se aislaron las colonias y se purificó su ADNp. De las seis colonias (denominadas a, b, c, d, e y f), cinco tuvieron el inserto de tamaño correcto, mientras que una no tenía inserto.

C.6 Actividad HA sintasa

Se ensayó la actividad HA sintasa en membranas preparadas a partir de los 5 clones anteriores. Se recogieron células nuevas en fase logarítmica a 3000 g, se lavaron a 4ºC con PBS y se aislaron las membranas mediante una modificación de un método de protoplastos conocido por los expertos habituales en la técnica. También se obtuvieron preparaciones de membranas de Streptococcus pyogenes y Streptococcus equisimilis mediante una modificación de un procedimiento de protoplastos diferente. Se incubaron las membranas a 37ºC en fosfato de sodio y potasio 50 mM, pH 7,0 con MgCl_{2} 20 mM, DTE 1 mM, UDP-GlcA 120 \muM y UDP-GlcNAc 300 \muM. se monitorizó la incorporación de azúcar utilizando UDP-[^{14}C]GlcA (318 mCi/mmol; ICN) y/o UDP-[^{3}H]GlcNAc (29,2 mCi/mmol NEN). Las reacciones se terminaron mediante la adición de SDS hasta una concentración final del 2% (p/v). El HA producto se separó de los precursores mediante cromatografía descendente en papel y se midió determinando la radiactividad en el origen.

C.7 Análisis por filtración en gel

Se analizó el HA radiomarcado producido in vitro por membranas que contenían seHAS o spHAS recombinantes mediante cromatografía en una columna (0,9 x 40 cm) de Sephacryl S500 HR (Pharmacia Biotech Inc.). Se eluyeron muestras (0,4 ml en NaCl 200 mM, Tris-HCl 5 mM, pH 8,0, más 0,5% de SDS) con NaCl 200 mM, Tris-HCl 5 mN y pH 8,0, y se ensayaron fracciones de 0,5 ml para determinar la radiactividad de ^{14}C y/o ^{3}H. Se evaluó la autenticidad del polisacárido de HA mediante el tratamiento de una muestra idéntica separada con la hialuronato liasa específica para HA de Streptomyces hyalurolyticus (EC 4.2.2.1) a 37ºC durante 3 horas. El digesto se sometió entonces a filtración en gel.

C.8 SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se realizó SDS-PAGE según el método de Laemmli. Se realizaron electrotranferencias a nitrocelulosa con el tampón de inmunotransferencia habitual con un 20% de metanol utilizando un dispositivo mini Transblot de Bio-Rad. Las inmunotransferencias se bloquearon con BSA al 2% en TBS. Se utilizaron para la detección el conjugado de proteína A/G-fosfatasa alcalina (Pierce) y la sal de p-toluidina del fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo / azul de p-nitrotetrazolio.

C.9 Secuencia de ADN y análisis

Se secuenciaron los plásmidos en ambas cadenas utilizando cebadores de vector marcados con fluorescencia. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando un kit Thermosequenase^{MR} para cebadores marcados con fluorescencia (con 7-desazaG). Las muestras se sometieron a electroforesis en un secuenciador de ADN ALF Express de Pharmacia y se analizaron los datos mediante el software ALF Manager v3.02. Se secuenciaron las regiones internas de los insertos con cebadores internos utilizando ABI Prism 377 (versión de software 2.1.1). Las regiones ambiguas se secuenciaron de forma manual utilizando Sequenase^{MR}, mezcla madre de 7-desaza-ADN polimerasa, 7-desaza-GTP (USB) y [\alpha-^{35}S]dATP (Amersham Life Sciences). Las secuencias obtenidas se reunieron y analizaron utilizando
DNASIS, v2.1 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). Se compararon las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos con otras secuencias en el Genbank u otras bases de datos.

C.10 Identificación de seHAS

La identificación de seHAS se consiguió utilizando un enfoque de PCR con los cebadores oligonucleotídicos basado en varias regiones de alta coincidencia entre spHAS, DG42 (que ahora se sabe que es una HAS de X. laevis regulada con respecto al desarrollo y designada como xlHAS) y NodC (una \beta-GlcNAc transferasa de Rhizobium). Las proteínas xlHAS y NodC son, respectivamente, idénticas en un \sim 50% y \sim 10% a spHAS. Esta estrategia produjo un producto de PCR de 459 pb cuya secuencia era idéntica en un 66,4% a spHAS, lo que indica que se había identificado un homólogo del grupo C (seHAS) del gen para la HA sintasa del grupo A (spHAS). La región codificante completa del gen se reconstruyó entonces utilizando una estrategia similar basada en PCR. Después, se utilizó un conjunto final de cebadores de PCR para amplificar el ORF completo del ADN genómico. Cuando se incorporó este fragmento de PCR de 1,2 kb en el vector de expresión pKK223 y se transformó en células SURE de E. coli, se demostró la actividad del HA sintético en las membranas aisladas a partir de 5 de las 5 colonias probadas.

El ORF del gen reconstruido codifica para una proteína pronosticada novedosa de 417 aminoácidos que no estaba en la base de datos y que es dos aminoácidos más corta que spHAS. Las dos proteínas bacterianas son idénticas en un 72% y las secuencias de ácido nucleico son idénticas en un 70%. El peso molecular pronosticado de la proteína seHAS es de 47.778 y el punto isoeléctrico pronosticado es a pH 9,1. Tres HAS de mamífero identificadas recientemente (muHAS1, muHAS2, muHAS3, figura 2) son similares a las proteínas bacterianas. La coincidencia global entre los dos grupos es de \sim 28-31% y además muchos aminoácidos en seHAS se conservan mucho en los de las HAS eucariotas (por ejemplo, sustituciones K/R o D/E). A98R, la HAS de PBCY-1 es idéntica en un 28-33 por ciento con respecto a las HAS de mamífero y se pronostica que tiene una topología similar en la membrana lipídica. Dentro de las especies de mamífero, los miembros de una misma familia son casi completamente idénticos (por ejemplo, muHAS1 y huHAS1 son idénticas en un 95%; muHAS2 y huHAS2 son idénticas en un 98%). Sin embargo, y tal como se muestra en la figura 3, incluso dentro de la misma especie los diferentes miembros de una familia de HAS son más divergentes (por ejemplo, muHAS1 y muHAS2 son idénticas en un 53%; muHAS1 y muHAS3 son idénticas en un 57%; muHAS2 y muHAS3 son idénticas en un 71%;).

La figura 10 muestra diagramas de hidropatía para seHAS y la topología de la membrana pronosticada. El diagrama de hidrofilicidad para la HAS estreptocócica del grupo C se generó mediante el método de Kyte y Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105, 1982) utilizando DNASIS. Se pronostica que la proteína es una proteína integral de membrana.

La figura 11 muestra un modelo de la organización topológica de seHAS en la membrana. La topología propuesta para la proteína cumple la regla de carga dentro ("charge-in") y sitúa al gran dominio central en el interior. Es probable que este dominio contenga la mayor parte de las propiedades de unión al sustrato y catalíticas de la enzima. Cys^{226} en seHAS, que se conserva en todos los miembros de la familia de HAS, así como las otras tres cisteínas, se muestran en el dominio central. Cys^{281} es un residuo crítico cuya alteración puede alterar drásticamente la distribución de tamaño del producto de HA sintetizado por la enzima.

La topología de la membrana global pronosticada para seHAS es idéntica a la de spHAS y las HAS eucariotas notificadas hasta ahora. La proteína tiene dos supuestos dominios transmembrana en el extremo amino-terminal y 2-3 dominios transmembrana o asociados a la membrana en el extremo carboxilo-terminal. Los diagramas de hidropatía para las dos enzimas estreptocócicas son prácticamente idénticos e ilustran la dificultad para predecir la topología de la región extremadamente hidrófoba de \sim 90 residuos en K^{313}-R^{406} en seHAS (K^{313}-K^{405} en spHAS).

seHAS se expresó de manera eficaz en células de E. coli. Aproximadamente el 10% de la proteína de membrana total fue seHAS tal como se evaluó mediante tinción en geles de SDS-PAGE (figura 5). La banda principal de seHAS a 42 kD está ausente de manera cuantitativa en el carril control sólo de vector. Este nivel inusualmente elevado de expresión para una proteína de membrana también se encuentra para spHAS, utilizando el mismo vector en células SURE. Aproximadamente el 8% de la proteína de membrana es spHAS en células SURE de E. coli. Por el contrario, la cantidad de seHAS en las membranas del grupo C es inferior al 1% de la proteína de membrana total. La spHAS en las membranas del grupo A es apenas detectable. La seHAS recombinante expresada en células SURE de E. coli no sintetiza HA in vivo, puesto que estas células carecen de UDP-GlcA, uno de los sustratos requeridos. Las membranas que, sin embargo, contienen la proteína seHAS recombinante sintetizan HA cuando se les proporcionan los sustratos UDP-GlcNAc y UDP-GlcA (figura 12).

La figura 12 muestra la síntesis de HA auténtico por seHAS recombinante. Se incubaron membranas de E. coli (69 \mug) preparadas a partir de células que contienen seHAS recombinante o vector solo, a 37ºC durante una hora con UDP-[^{3}H]GlcNAc 700 \muM (2,78 x 10^{3} dpm/nmol; \boxempty, \blacksquare) y UDP-[^{14}C]GlcA 300 \muM (3,83 x 10^{3} dpm/nmol; \medcirc, \medbullet) en un volumen final de 200 \mul tal como se describe en el presente documento. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 25 mM. La mitad de la mezcla de reacción se trató con hialuronidasa de Streptomyces a 37ºC durante 3 horas. Se añadió SDS (al 2%, p/v) a las muestras tratadas con hialuronidasa (\medcirc, \boxempty) y no tratadas (\medbullet, \blacksquare), que se calentaron a 90ºC durante 1 minuto. Las muestras se diluyeron hasta 500 \mul con tampón de la columna (Tris 5 mM, NaCl 0,2 mM, pH 8,0) se clarificaron mediante centrifugación y se inyectaron 200 \mul en una columna de Sephacryl S-500 HR. Se recogieron fracciones (1 ml) y se determinó la radiactividad. BD es la posición de elución del pico de azul dextrano (\sim 2 x 10^{6} DA; Pharmacia). V_{o} marca el volumen excluido y V_{1} el volumen incluido. La razón de [^{14}C]GlcA:[^{3}H]GlcNAc incorporado en la cantidad total de HA fraccionado en la columna es de 1,4, que es idéntica a la razón de actividades específicas de los dos sustratos. Por tanto, las razones molares de los azúcares incorporados en el producto es de 1:1 tal como se pronostica para el HA auténtico. Las membranas de las células transformadas con vector solo no sintetizaron HA.

Utilizando UDP-GlcA 120 \muM y UDP-GlcNAc 300 \muM, la síntesis de HA fue lineal con la proteína de membrana (a \leq 0,2 \mug) y durante al menos 1 hora. Además, las membranas preparadas a partir de células no transformadas o células transformadas con vector solo no tienen actividad HAS detectable. La síntesis de HA es insignificante si el Mg^{2+} se quela con EDTA (< 5% del control) o si se omite cualquiera de los dos sustratos (\sim 2% del control). seHAS recombinante también mostró la especificidad esperada por los sustratos de nucleótido con azúcar, no pudiendo copolimerizar UDP-GalA, UDP-Glc o UDP-GalNAc con cualquiera de los dos sustratos normales (tabla II).

Basándose en el análisis por filtración en gel, el peso medio del HA sintetizado por seHAS en las membranas aisladas es de 5-10 x 10^{6} Da. El producto de la seHAS recombinante se consideró que era HA auténtico basándose en la incorporación equimolar de ambos azúcares y su sensibilidad frente a la degradación por la hialuronidasa de Streptomyces específica (figura 12). Aunque las condiciones para la síntesis de HA total no fueron óptimas (ya que se incorporó en el producto \sim 90% de un sustrato), la enzima produjo una amplia distribución de longitudes de cadena de HA. La fracción del pico corresponde a un peso de HA de 7,5 x 10^{6} Da, que se un polímero que contiene aproximadamente 36.000 azúcares monoméricos. La distribución de tamaños de HA resuelta en esta columna osciló desde 2-20 x 10^{6} Da.

La secuencia de proteína deducida de seHAS se confirmó por la capacidad de los anticuerpos contra la proteína seHAS de dar reacción cruzada con la proteína del grupo C (figura 8). Los anticuerpos policlonales contra la proteína seHAS completa o contra sólo el dominio central de spHAS también reaccionaron con la proteína seHAS. El anticuerpo anti-péptido contra el extremo C-terminal de spHAS no dio reacción cruzada con esta región algo divergente en la proteína seHAS. Sin embargo, el anticuerpo anti-péptido dirigido contra la secuencia de spHAS E^{147}-T^{161} reconoció la misma secuencia pronosticada en seHAS. El anticuerpo anti-péptido también reacciona con las proteínas seHAS y spHAS nativas en membranas estreptocócicas y confirma que las enzimas nativas y recombinantes de ambas especies son de idéntico tamaño. Como la proteína spHAS, seHAS migra anomálamente rápido en SDS-PAGE. Aunque el peso calculado es de 47.778 Da, el M_{r} mediante SDS-PAGE es sistemáticamente de \sim 42 kDa.

Debido a la coincidencia de secuencia dentro de las regiones del dominio central y la estructura global idéntica pronosticada para las dos enzimas bacterianas, el anticuerpo específico para el péptido contra la región E^{147}-T^{161} puede utilizarse para normalizar la expresión de proteína HAS en las membranas preparadas a partir de células transformadas con genes para las dos enzimas diferentes. Utilizando este enfoque, se compararon las membranas con cantidades esencialmente idénticas de de spHAS o seHAS recombinantes con respecto a la tasa de síntesis de HA y la distribución de tamaño del producto de HA iniciales.

Tal como se muestra para spHAS, la síntesis de cadenas de HA por seHAS es continua. Las enzimas parecen estar asociadas con una cadena de HA en crecimiento hasta que se libera como un producto final. Por tanto, es posible comparar las tasas de elongación de HA por seHAS y spHAS monitorizando la distribución de tamaño de las cadenas de HA producidas en los momentos iniciales, durante la primera tanda de síntesis de cadenas de HA. Basándose en el análisis por filtración en gel de los tamaños del producto de HA en diversos momentos, se estimó que la tasa media de elongación por seHAS es de aproximadamente 9.000 monosacáridos/minuto a 37ºC (figura 9). En cinco minutos, las enzimas pueden polimerizar una cadena de HA de 5-10 x 10^{6} Da. Durante una incubación de 60 minutos, cada molécula de enzima podría potencialmente iniciar, completar y liberar del orden de 5-8 moléculas de HA tan grande. En los momentos iniciales (por ejemplo, \leq 1 minuto), que refleja la elongación de las primeras cadenas de HA, la distribución de tamaño del HA producido por seHAS se cambió a especies más grandes, comparado con spHAS. En 60 minutos, las dos distribuciones de tamaños del producto de HA eran indistingui-
bles.

La seHAS clonada representa la HA sintasa del grupo C auténtica. Por tanto, las proteínas del "grupo C" notificadas o descritas previamente no son las verdaderas HAS del grupo C. La proteína seHAS es homóloga a nueve de las HA sintasas conocidas actualmente procedentes de bacterias, vertebrados y un virus que ahora comprende esta familia de HA sintasa que crece rápidamente. Esta homología se muestra particularmente en la figura 2. En los mamíferos, se han identificado tres genes, designados HAS 1, HAS 2 y HAS3, y se han mapeado en tres cromosomas diferentes tanto en el ser humano como en ratón. En anfibios, la única proteína HAS identificada hasta ahora es la DG42 regulada con respecto al desarrollo, que se clonó en 1988 y se demostró recientemente que codifica para la actividad HA sintasa mediante análisis de la proteína recombinante en membranas de levaduras. Probablemente se identificarán pronto otros genes HAS de X. laevus.

Un modelo de evolución divergente sugiere que un precursor primitivo de HAS bacteriana puede haberse usurpado pronto durante el desarrollo de los vertebrados o se desarrolló la estrategia patógena bacteriana de producir una cápsula de HA cuando una bacteria primitiva se capturó en HAS primordial. La evolución convergente de las enzimas HAS bacterianas y eucariotas hasta una solución estructural común parece improbable, pero puede haber ocurrido.

Ninguna de las tres isoenzimas de mamífero para HAS se han caracterizado todavía enzimáticamente con respecto a su tamaño del producto de HA. Se pronostica que al menos diez proteínas HAS identificadas son proteínas de membrana con una topología similar. La síntesis de HA se produce en la membrana plasmática y el HA se libera al medio o permanece asociado a la célula para formar la cápsula bacteriana o un recubrimiento pericelular eucariota. Los sustratos de nucleótido con azúcar en el citoplasma se utilizan para ensamblar cadenas de HA que se extruyen a través de la membrana al espacio externo.

La topología de la proteína en la parte del carboxilo, muy hidrófoba, de la proteína HAS parece ser crítica en la comprensión de cómo las enzimas extienden la cadena de HA en crecimiento, según se extruye simultáneamente a través de la membrana. Por ejemplo, la actividad enzimática sin precedentes puede requerir interacciones inusuales y complejas de la proteína con la bicapa lipídica. Los resultados preliminares basados en el análisis de las proteínas de fusión spHAS-fosfatasa alcalina indican que los extremos amino y carboxilo-terminal y los grandes dominios centrales son todos intracelulares, tal como se muestra en las figuras 10 y 11. La proteína seHAS también contiene un gran dominio central (\sim 63% de la proteína total) que parece contener los dos sitios de unión a sustrato y las dos actividades de glucosiltransferasa necesarias para la síntesis de HA. Aunque los programas de software actuales no pueden predecir de manera fiable el número o la naturaleza de los dominios asociados a la membrana dentro del largo fragmento hidrófobo del C-terminal, la disposición topológica propuesta está de acuerdo con las pruebas actuales y se aplica también a las enzimas eucariotas, que son \sim 40% mas grandes debido principalmente a la extensión del extremo C-terminal de la proteína con 2 dominios transmembrana adicionales pronosticados.

Cuatro de los seis residuos de Cys en spHAS se conservan en seHAS. Sólo la Cys225 en ambas enzimas bacterianas se conserva en todos los miembros de la familia de HAS. Puesto que los agentes reactivos de sulfhidrilo, tales como benzoato de p-mercurio o NEM, inhiben enormemente la actividad HAS, es probable que esta Cys conservada sea necesaria o importante para la actividad enzimática. Sin embargo, los resultados iniciales a partir de los estudios de mutagénesis dirigida al sitio indican que un mutante C225S no es inactivo, retiene un 5-10% de la actividad de tipo natural.

El reconocimiento de las secuencias de ácido nucleico que codifican sólo para seHAS, sólo para spHAS o tanto para seHAS como para spHAS utilizando oligonucleótidos específicos se muestra en la figura 13. Se diseñaron tres pares de oligonucleótidos codificante-no codificante basados en la secuencia de ID SEQ NO. 1 y la secuencia codificante para spHAS. Los segmentos de ácido nucleico basados en seHAS (se1-se2 y sesp1-sesp2) se indican en la tabla 14. Estos tres pares de oligonucleótidos se hibridaron en reacciones de PCR habituales con ADN genómico de estreptococos del grupo C (seHAS) (carriles 2, 4 y 6) o del grupo A (spHAS) (carriles 3, 5 y 7). Los carriles 1 y 8 indican las posiciones de los patrones de PM en kb (kilobases). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando ADN polimerasa Taq (de Promega) durante 25 ciclos tal como sigue: 94 grados Celsius durante 1 minuto para conseguir la desnaturalización del ADN, 48 grados Celsius (42 grados Celsius para los cebadores sesp comunes más pequeños) durante 1 minuto para permitir la hibridación y 72 grados Celsius durante 1,5 minutos para la síntesis de ADN. Las mezclas de reacción de PCR se separaron entonces mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%.

El par de cebadores se1-se2 se diseñó para ser únicamente específico para la HAS del grupo C (seHAS). El par de cebadores sp1-sp2 se diseñó para ser únicamente específico para la HAS del grupo A (spHAS). El par de cebadores sesp1-sesp2 se diseñó para hibridarse con ambas secuencias de ácido nucleico de HAS del grupo C y del grupo A. Los tres pares de cebadores se comportaron tal como se esperaba, mostrando la capacidad apropiada para dar hibridación cruzada y soportar la generación de los productos de PCR que eran específicos y/o únicos.

Los oligonucleótidos utilizados para la PCR o hibridación específicas se muestran en la figura 14. Los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 3, 4, 5 y 6 se indican en las regiones correspondientes de la SEQ ID NO. 1. Estas regiones están en negrita y marcadas, respectivamente, como cebadores se1, se2, sesp1 y sesp2. El número 1 indica cebadores en el sentido codificante, mientras que el número 2 indica un cebador en el sentido no codificante. Cada uno de los cuatro oligonucleótidos se hibridará específicamente con la secuencia de seHAS y los pares apropiados de cebadores codificante / no codificante son adecuados para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa tal como se muestra en la figura 13.

La figura 7 es un análisis por filtración en gel de ácido hialurónico sintetizado por HAS recombinante expresada en membranas de levaduras. Se subclonó un fragmento de ADN que codifica para el marco de lectura abierto de 419 residuos de aminoácidos correspondiente a spHAS (con el codón Val original cambiado por Met) mediante métodos habituales en el vector de expresión de levadura pYES2 (de Invitrogen) para producir pYES/HA. Se prepararon membranas de las células con este constructo mediante agitación con perlas de vidrio. Las muestras derivadas de los constructos de pYES/HA contenían actividad HA sintasa sustancial y la proteína HAS de "42 kDa" se detectó mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos; las membranas de células con vector solo no poseían ni actividad ni la banda de inmunorreactividad (no mostrado). En primer lugar, se incubaron membranas (315 \mug de proteína) con UDP-[^{14}C]GlcA (1 \muCi de ^{14}C) libre del soporte y UDP-GlcNAc no marcado 900 \muM en Tris 50 mM, pH 7, MgCl_{2} 20 mM, DTT 1 mM y NaCl 0,05 M (volumen de reacción de 450 \mul) a 30 grados Celsius durante 1,5 minutos. Tras este periodo de marcado con impulsos, se añadió entonces UDP-GlcA no radiomarcado hasta una concentración final de 900 \muM. Se tomaron muestras (100 \mul) tras el impulso a los 1,5 minutos (círculo oscuro) y 15 (cuadrado negro) y 45 (cuadrado negro) minutos tras la "persecución". Las reacciones se terminaron mediante la adición de SDS hasta el 2% y calentando a 95 grados Celsius durante 1 minuto. Las muestras se clarificaron mediante centrifugación (10.000 x g, 5 minutos) antes de la inyección de la mitad de la muestra en una columna de filtración en gel Sephacryl S-500HR (Pharmacia; 1 x 50 cm) equilibrada con NaCl 0,2 M, Tris 5 mM, pH 8.

La columna se eluyó a 0,5 ml/min y se cuantificó la radiactividad en las fracciones (1 ml) mediante recuento por centelleo líquido tras añadir la mezcla Biosafell (4,5 ml, Research Products Intl.). El volumen inicial y los volúmenes totalmente incluidos estaban a volúmenes de elución de 14 ml y 35,5 ml, respectivamente. El pico de azul dextrano (media 2 x 10^{6} Da) eluyó a los 25-27 ml. La HAS recombinante expresada en las células de levadura eucariotas produce ácido hialurónico de alto peso molecular in vitro.

Por tanto, debería ser evidente que se ha proporcionado, según la presente invención, un segmento de ácido nucleico purificado que tiene una región codificante que codifica para HAS enzimáticamente activa, métodos de producción de ácido hialurónico a partir del gen seHAS y el uso del ácido hialurónico producido a partir de una HAS codificada por el gen seHAS, que satisface completamente los objetivos y ventajas expuestos anteriormente. Aunque se ha descrito la invención junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que serán evidentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones para los expertos en la técnica. En consecuencia, se pretende englobar todas tales alternativas, modificaciones y variaciones, que caen dentro del amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> EL CONSEJO RECTOR DE LA UNIVERSIDAD DE OKLAHOMA

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<120> GEN DE LA HIALURONAN SINTASA Y USOS DEL MISMO

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<130> 616782-6/JP/178.851

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<140> PCT/US98/23153

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<141> 30-10-1998

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<150> US 60/064.435

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<151> 31-10-1997

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<150> US 09/178.851

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<151> 26-10-1998

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<160> 23

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<170> ASCII

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<210> 1

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<211> 1254

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<212> ADN

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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<223>

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<400> 1

6

7

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<210> 2

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<211> 417

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<212> PRT

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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<223>

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<400> 2

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8

9

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<210> 3

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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<223>

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgatgaga caggtattaa gc

\hfill

22

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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<223>

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcaaattct ctgacattgc

\hfill

20

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<210> 5

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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<400> 5

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gactcagata cttatatcta

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20

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Streptococcus equisimilis

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<220>

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tttttacgtg ttcccca

\hfill

17

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<210> 7

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<211> 567

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<212> PRT

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<213> Virus de Chlorella PBCV-1

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<220>

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<223>

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<400> 7

10

11

12

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<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1740

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de Chlorella PBCV-1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Ile Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Thr Ile Lys Asn Thr Glu Trp Gly Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ala Ala Val Ile Pro Ser Tyr Asn Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Asp Gly Ser Asn Thr Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggacttg ttccagcggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaatgttcc gacacagggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttgatagg tcaccagtgt cacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccctgtgtc ggaacattca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggatccgaa ttcatgagaa cattaaaaaa cctc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pyogenes

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattctgc agttataata attttttacg tgt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2899

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasturella multicida

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

16

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS (secuencia codificante)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido HADRF1 (cadena codificante)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gay mga yrt ytn acn aat tay gct ath gay ttr gg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido HACTR1 (cadena no codificante)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acg wgt wcc cca ntc ngy att ttt nad ngt rca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido HAVAF1 (cebador codificante degenerado)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtn gct gct gtw rtn ccw wsn twt aay gar ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido HAVDF1 (cebador codificante degenerado)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtn rwt gay ggn wsn wsn ran gat gan gc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (18)

1. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos una coincidencia del 80% con la SEQ ID NO: 1.

2. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según la reivindicación 1, que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una coincidencia de entre el 80% y el 90% con la SEQ ID NO: 1.

3. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según la reivindicación 1, que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una coincidencia de entre el 90% y el 99% con la SEQ ID NO: 1.

4. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

5. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es un polipéptido de Streptococcus.

7. Hialuronan sintasa enzimáticamente activa aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que es un polipéptido de Streptococcus equisimilis.

8. Segmento de ácido nucleico aislado que codifica para la hialuronan sintasa enzimáticamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Segmento de ácido nucleico según la reivindicación 8, que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

10. Vector recombinante que comprende el segmento de ácido nucleico según la reivindicación 8 ó 9, en el que el vector recombinante es un plásmido.

11. Vector recombinante que comprende el segmento de ácido nucleico según la reivindicación 8 ó 9, en el que el vector recombinante es un plásmido de replicación o integración, cósmido, fago o vector de virus.

12. Célula huésped recombinante que comprende el vector recombinante según la reivindicación 10 u 11, en la que la célula huésped produce ácido hialurónico.

13. Célula huésped recombinante según la reivindicación 12, que comprende además al menos un gen precursor hallado en una ruta biosintética de ácido hialurónico.

14. Célula huésped recombinante según la reivindicación 12 ó 13, en la que la célula huésped es un huésped de Bacillus, E. coli, Lactococcus, Streptococcus o Enterococcus.

15. Célula huésped recombinante según la reivindicación 12 ó 13, en la que la célula huésped es Bacillus subtilis.

16. Método para producir un polímero de ácido hialurónico, que comprende:

(a)

hacer crecer la célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15 en un medio para que secrete ácido hialurónico; y

(b)

recuperar el ácido hialurónico.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la etapa de recuperar el ácido hialurónico comprende además la etapa de extraer el ácido hialurónico secretado del medio.

18. Método según la reivindicación 17, que comprende además la etapa de purificar el ácido hialurónico extraído.