WO2005012529A1

WO2005012529A1 - ヒアルロン酸生産植物

Info

Publication number: WO2005012529A1
Application number: PCT/JP2004/011306
Authority: WO
Inventors: Shigeo Shibatani; Shuhei Misawa; Izumi Ihara; Hiroaki Kitazawa
Original assignee: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2005-02-10
Also published as: JP4816082B2; CA2533925A1; CA2533925C; BRPI0412582A; CN1833026A; JPWO2005012529A1; EP1652928A4; ES2354696T3; US20060168690A1; EP1652928A1; DE602004030345D1; EP1652928B1; ES2354696T8; US7547819B2

Abstract

本発明は、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするDNA又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNAで植物細胞又は植物体を形質転換する工程、（２）該形質転換した形質転換体を生育する工程、（３）生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の合成方法に関する。

Description

明細書

ヒアルロン酸生産植物

謹分野

本発明は、植物によりヒアルロを製造する方法、ヒアルロ «0能を有する形爾云嫌物細胞又は形 ¾|云«物およれらの法に主に関する。

背景赚

植物は、光合成用して水と二酸化炭素から糖を合成する、レギ^ 6荷の低ぃ繊的な難生産系である。一部の生物を除いて、他の生物でを自合成することができずに、植物由来の糖 lj用してレ、る。一方、植物由来の糖を原料として、糖をしたり、を伸長しを合成する能力は動物'微生物そ^; 虫自に有しており、植物が生産することがでなレ、動物 ·微生物由来の!^導体^ Κ¾ある。植物において生産不可能とされ、動物 '微生物カ生産し X、る髓としアル口が挙げら; η¾。

ヒアルロ ^は、 1934年に Meyerと Palmer力牛の眼球の硝子も単離したグリコ 1 ^ノグリカン (ムコ多糖)で ¾5(Meyer, and Palmer, J. W. (1934) J. BioL Chem., 107, 629-63 彼らは、この物質がダルクロ^と TVァセチルダルコンが -1,3および β -1,4結合した mの繰り返し

B. and Meyer, K (1954) J.Am. Chem. Soc., 76, 1753-1757)。

その後、 1950〜1960年代に、ヒアルロ ^生合成に関す »究が A群連鎖球菌を用レヽた無細胞系実験により行われ、ヒアルロ>¾の伸長にゥリジン- 5，·»スホ -グルクロ (以下、 UDP- グンレクロ^また〖ま UDP-GlcAとすることがある)およびウジジン- 5' -、^スホ _N_ァセチルグンレ =! ン (以下、 UDP-N-ァセチルダルコ^^たは UDP-GlcNAcとすることがある)の 2 の糖ヌクレドを用レ、ることにより、連鎖球菌細胞膜に局在するヒアルロ成赚の活性が示された (Markovitz, M.， Cifonelli, J. A and Dorfiiian, A (1959) J. BioL Chem., 234, 2343-2350)。

ヒアル口/^成酵素を安定な活圍として、可溶化して高鍵製することは鮮の間、困 ITeあったが、 1993年に、連鎖球菌のヒアルロ成歸遺 ^fOza^が単離され

14571)、それ以来、難生物のヒアルロ成酵素遺ィ 5÷のクローニングが報告され dtano, N. andEimata, K (1996) J. BioL Chem, 271, 9875-9878； Itano, N. andEimata, (l996)Biochem.

Biophys. Res. CommurL, 222, 816-820； Spicer, A P., Augustine, M. L. and McDonald, J. A (1996) J. BioL Chem., 271, 23400-23406； Spicer, A P., Olson, J. S. and McDonald, J. A (1997) J.

BioL Chem., 272, 8957-8961； ShyjanAM., Heldin, P., Butcher E. C" YoshinoT. andBriskm,M.

J. (1998) J. BioL Chem., 271, 23395-23399； Watanabe, K andYamaguchi, Y. (1996) J. BioL

Chem., 271， 22945-22948),さらに、クロウィルス PBCV-l(DeAnge]is, P. L.， Jing, W. Graves,

M. V., Burbank, D. E. and vam Etten, J. L. (1998) Science, 278, 1800-1804)やパスチュ Λレトシダ由来 (DeAngelis, P. L, Jing, W. Drake, R R andAchyuthan, A M. (1998) J. BioL Chem.,

273,腿- 8458)のヒアルロ ^成瞧遺伝子が見出され、活醒の繊ぇ酵素が得ら;^ようになつ Co

これらの研究の進展と共に、ヒアルロン酸の広範囲の生編能が解明され、ユニークな物理化学的樹生と生物学的な機能が明らかにされてきた。高好のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用亍補助剤、癒着防止傷治癒鍵に使用されている。また、低のヒアル口ン酸は生理活性効果があること力 S報告されてレ、る。そして、ノィれテ

Vァノレ素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。

まで、ヒアルロま、動物維らの抽出また ί纖生物発酵により生産されてき, ^しかしながら、動物組鶴もの抽出は、例えば狂 ¾におけるプリオン、ウィルス等のの危険性が懸念されている。また、動物細胞は、細胞の維持管理が困！!^高価な培地を必要とする上曽碰度も遅い。一方、微生物発酵は、糖有する培地や設備投資のコストが問題である。また、大腸菌などでは、タンパク質のプロセッシングが起こらなレヽ、インクルージョ^ディ (封入体) 成する可能性があり、プロテアーゼによる:^が生 ¾などの問題がある (Petrides, D. et aL (1995)

529)₀また、治療用物質を微生物で生産するは、ドシンのなどを方ぐめ ίΰ^ ^ストが常に高くなる。

このような理由力、ら、光合成により原料である糖を植物内で合成し、それらの糖を用いて、ヒアル口を植物に生産させることができれば、面、コスト面等の点から、産業上特に棚と考えらしかし、植物で、動物およ敷生物由来のタンパク質を発現させた例はあるものの (Giddings, G. et aL (2000) Nat. BiotecnoL, 18, 1151-1155; Daniel], H etaL (2001) Trends Plant ScL, 6, 219-226)、タンパク質カ穩を持っために必要な高次; が由来生物と歡るため、生産されるタンパク質が本来の機能を持たなレ、ことも多力例えば、タバコ培養細胞 BY-2でエリスロボェチンを発現さこが in vivoで生理活性を持たな力た例などがある (Matsumoto, S. et al (1995) Plant MoL BioL, 27, 1163-1172)。

また、従来の技術は、動物^敷生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンパク質自体を抽出し Tflj用することが主に行われており、植物に動物敷生物由来のタンパク質を発現させ、なおかつ植物内で発現してレ、るタンパク質 ¾^IJ用して植物内で物質^ ¾を行った例はほとんどな力

植物内での物質生産として、ヒト由来 j3 1,4-ガラクトー; « ^酵素をタバコ培養細胞 BY-2に導入し^;結果、従来からしてレ、た糖タンパク質の «に新たに j3 1,4結合でガラクトースを結合この威は、髒潘酵素を用レヽて 1觀の糖ヌクレ^^ドから 1個の糖を車させる S ^であって、ヒアルロのような 2觀の糖ヌクレド定の順序で数十個あるいは数百個もさせて高を «するとは全く^ ¾ってレ、る。

また、ヒアルロ ^成酵素は、一般的に複数の I鎮通領域および膨佶^ IS域を^ てレヽる。ヒアルロ ^成酵素のような膨诘合型タンパク質を、遺ィ好を発現させる宿主と敷る由来の遺を発現する齢は、類通領域および離 "^域が正しレ、構造を維持できなレが多！/、。例えば、活麵ヒアル口 ^成瞧ま、 1つのヒアルロン酉給成酵素と膜に被するリン脂ある力ノレ: ^リピン約 14〜： 18 とが複合体 ¾ ^成し、ヒアルロ給成酵素活 [4に影響することが示唆されている ( lapak-Simmons, V.L. (1999) J. Biol. Chem., 274, 4239-4245) ₀このように、植物内で植物が本来有してレ、なレ、ヒアルロ^給成歸遺を発現すること自体、想到困難であることが予測さ。

このように、ヒアルロ^を植物により生産する擁は有用性が高いと期待さものの、ヒアル口は； ft i力 ^s^<ife してレヽなレヽ¾ ^あり、このお c力 ¾とちと ife L¾レ -^m^ r^ 生産すること、しかも、ヒアルロのような高分子の物質を確することは、従来の技鶴もは到底困難と考えられ Tヽ

本発明は、ヒアルロ成酵素を植物内で発現し、植物で来さ ci、ヒアルロを、植物細胞又は植物を用!/、て生産させることを主な誦とする。図面の簡^¾説明

図 1は、ヒアルロニダーゼ処理液の HPLCの測果を示す。

図 2は、 RT-PCRの Si¾液のァガロース電気泳動の結果を示す。発明の開示

本発明者は、上記翻決するために鋭意検討を重ね結果、ヒアルロ ^成薩をコ一ドする DNA又はヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNAで、植物細胞又は植物質転換することにより、植物細胞又は植物にぉレヽアルロン成活性酵素が発現し、更に、植物内でヒアルロが生産さ; ½ことを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を就するに至つ

すなわち、本発明は、次の事頁に係るもので ¾¾。

項 1. (1) (i)ヒアルロ成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ成 ^のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ合成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発觀繊ぇベクターを用!/、て植物細胞質転換する工程、（2)形難換して得られた形質転換体を生育する工程、（3)該形爾云換体により生産されたヒアルロ mを分离 t る工程を有する、ヒアルロ^の製法。

項 2. (1) (i)ヒアルロ^^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ^^成,のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ成活性を有するポリペプチドをコードする DNA ¾ ^む発糊繊えベクターを用レ、て植物体

云換する工程、（2)形 «$云換して得られた形 ¾云換体を生育する工程、（3)該形質転換体によ继されたヒアルロを分离 ft"る工程を有する、ヒアルロの製 ^法。

項 3. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活 I·生を有するポリペプチドをコードする DNA む発觀繊えべクタ一を用レ、て植物細胞爾云換する工程を有する、ヒアルロ生産能を有する形爾云赚物細胞の^ ^法。

項 4. (i)ヒアルロ ^成 ^^をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成,のアミノ酸酉』において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊繊えベクターを用レ、て植物体須転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形難鎌物の去。

項 5.発 , §^えベクターが、 (1) (i)ヒアルロ ^成,をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成纏のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは揷入され且つヒアルロ成活性を有するポリペプチドをコードする DNA及び (2)器官特異的又は紙織特異的プロモーター ¾ ^む発画組換えべクタ一であって、得ら形爾云灘物が、器官特異的又は繊特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転赚物である、項 4に記載の方法。項 6.ヒアルロ成酵素カ^ t¾物由来又¾¾生物由来ヒアルロ ^成,で ¾¾、項 1 〜5のレ、ずれかに記載の方法。

項 7.ヒアノレ口 ^成酵素がクロウィルス由来ヒアルロ^^成藤で項:!〜 5のレ、ずれかに記載の方法。

項 8. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ^^成活 14を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊繊えべクタ一を用レ、て植物細胞爾云換することにより得ら; ½ヒアルロ雖能を有する形辯云鎌物細

項 9. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ^^成^ *のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ^^成活 1·生を有するポリペプチドをコードする DNA ¾ ^む発糊繊えベクターを用レ、τ¾物体 ¾?須転換することにより得ら; ½、ヒアル口生産能を有する形赚赚物又はそれと同じ性質を有する ¾又はそれらの器官又はそれらの滅

項 10.植物体が、被子植物、裸子植物、シダ植物及 Ό¾=^¾物からなる微ち選ばいずれ力の植物ある、項 9に記載の形質転«物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの織

項 ii.器官が、根、茎、 ¾¾、葉、 m猶良、種子及ひ頂からなる群から選ば^) ι¾χは 2 種以上の器官である、項 9に記載の形爾云赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの繊

項 12·繊が、表皮、師部、藤織、木部及ひ爾赖もなる微も選ば; ½1觀纖以上の繊である、項 9に記載の形難赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組

項 13.発糊糸纖ぇベクターが、（l) (i)ヒアルロ ^成瞧をコードする D A又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNA及び (2)器官特異的又は紙織特異的プロモーターむ発應ぇベクターであって、得ら ^形爾云誰物が、器官特異的又織特異的ヒアルロ^生産能を有する形露云嫌物である、項 9に記載の形赚賺物又はそれと同じ性質を有する系又はそれらの器官又はそれらの織

項 14. (i)ヒアルロン ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列におレ、て、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活生を有するポリペプチドをコードする DNA ¾ ^む発糊繊えベクターを用レ、て植物細胞質転換することにより得ら、ヒアル口:/^成瞧を生産する形藤鎌物細

項 15. (i)ヒアル口;/^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロン^成^ *のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊糸雕ぇベクターを用レヽて植物体¾ ^質転換することにより得ら L¾、ヒアルロ成酵素を生産する形爾云赚物又はそれと同じ瞎を有する ¾又はそれらの器官又はそれらの繊

項 16.ヒアルロ ^成酵素カ^ |¾)物由来又敷生物由来ヒアルロ^^成酵素である、項 8又は 14に記載の形辦云赚物細胞。項 17.ヒアルロ ^成^ *力鶴物由来又 [生物由来ヒアル口/^成酵素である、項 9〜13、 15のレ、ずれかに記載の形鍵云嫌物又はそれと同じ性質を有する又はそれらの器官又はそれらの繊

項 18.ヒアルロ ^成難力クロウィルス由来ヒアルロ^^成酵素である、項 8又は 14に記載の形難赚物細胞。

項 19.ヒアルロ ^成酵素; ^クロウィルス由来ヒアルロ成酵素で fe¾、項 9〜13、 15 のいずれかに記載の形 ®云^ it物又はそれと同じ生質を有する系又はそれらの器官又はそれらの紙紘

項 20,項 8又は 14に記載の形，云物細胞或レ、は項 9〜13、 15のいずれかに記載の形質転赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの繊によって生産されたヒアル口以下、本発明にっレヽ T 細に説明する。

本発明にぉレヽては、ヒアルロ^^成酵素をコードする DNA又はヒアルロ成酵素のアミノ酸配列にぉレ、て、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNAを用レ、て、植物細胞又赚物体の形難換を行う。

ヒアルロ^^成瞧としては、 UDP—ダルク口と UDP—N—ァセチルダルコンを基質として、ダルク口^とダルコンの繰り返 Ui^からなるポリマーキ髓のヒアルロ^を合成するものであれば、その由来は特に限定さ l¾レ、。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニヮトリ、ゥシ、 7J、力ッメガエノの物由来のヒアルロ ^成瞧、ストレブトコッカス属、パスチュ属、クロウィルス等の微生物由来のヒアルロ^^成藤などを用いることがでる。

らのヒアルロ^ ^成酵素のなかでも、クロウィルス由来のヒアルロ ^成^ ¾が特に好ましい。

ヒアルロ^ ^成,の 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付力 P¾しく〖¾ 人され且つヒアル口 ^成活性を有するポリペプチドは、ヒアルロ ^成活性を失わなレ職の変異がなされたポリペプチドであり、ヒアルロ成瞧の一部且つヒアルロ ^成活性を有するポリべプチドと、ヒアルロ成赚の欠失、付加、挿入又は置換 #rc 'あって且つヒアルロ^^成活性を有するポリペプチドの両方む。

ヒアルロ ^成酵素の一部であって、且つヒアルロ成活性を有するポリペプチドとは、上記のようなヒアルロ ^成酵素におい Ttアル口 ^成活性綠するために必須となるアミノ立み、必須でない部分の一部は欠失し、かつヒアル口:/^成活性を有するポリぺプチドである。

ヒアルロ ^成赚の 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく ί彌入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドの一例として、ノスチュ^ 9 ;レトシダ由来ヒアルロン ^^成酵素は、膨桔^!！域および麟通領域と思わ約 270アミノ酸を欠失し Tfeヒアルロン酉給成酵素活性をもつことが報告されてレ、る (Jinget aL, 2000, Glycobiology, 10, 883-889)。このような変異は、自然界において生まかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロ ^成活性を失わない限り、その個数は制限さよい。本発明におけるヒアルロ成酵素をコードする DNA又はヒアルロ^^成^ *のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく入され且つヒアルロ合成活性を有するポリペプチドをコードする DNAとしては、上記ヒアルロ成酵素又はポリべプチドをコードするものであれば特に限定されず、コドンの縮重により配列がるものも含 ¾ L¾。このような DNAとして、 ^のヒアルロ成酵素遺レヽることができる。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニヮトリ、ゥシ、アフリカッメガエル、ストレフ。トコッカス属、ノスチュ属、クロレラウィルス由来のヒアルロ ^成酵素遺伝子を用いることがでさる。

より具体的には、ヒト由来のヒアルロ ^成酵素 (HHAS)遺の HAS1、 HAS2および HAS3、マウス由来のヒアルロ^^成酵素 (mHAS)遺イ^? "の HAS1、 HAS2および HAS3、ニヮトリ由来のヒアルロ ^成酵素 (gHAS)遣の HAS1、 HAS2および HAS3,ラット由来のヒアルロ成, (rHAS)遺イ^"の HAS2、ゥシ由来のヒアルロ ^成酵素 (bHAS)遺伝子の HAS2、 T リカッメガエル由来のヒアルロ成酵素 (xHAS)遺の HAS1、 HAS2および HAS3、パスチュ Λ;レトシダ由来のヒアルロ ^成酵素 (pmHAS)遺^、ストレフッカスピ才ゲネス由来のヒアルロ ^成 (spHAS)遺^、ストレブトコッカスエタイリ、；^リス由来のヒアルロ ^成酵素 (seHAS)遺伝子、クロウィルス PBCV-1 (cvHAS)由来の HAS遺伝子などを用!/、ること力 Sできる。

ヒアルロ ^成酵素 (HAS)遺ィ好には、 HAS1、 HAS2、 HAS3などの各種タイフ。を有するものがあるが、タイプの種類は特に限定さ、。

このうち、クロ 1/9ウィルス由来の HAS遺伝子が特に好ましレ、。

上記 (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ麵己列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活 t "生を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊組み換えベクターを用レ、て植物細胞又は植物体¾ ^質転換することによって、本発明の形質転換体、換言すると、形爾云賺物細胞又は形爾云謹物がさ。

本発明の形辦云灘物細胞又は形爾云赚物は、（i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成のアミノ酸配列にぉレ、て、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする匪を挿入した発糊糸难ぇベクターを、目的遺伝子が発現 Uf#¾ように宿主中に導入し、形難換することにより ¾ことができる。

ここで、宿主とは、植物全体、種子、植物器官 (例えば葉、花弁、茎、根、根茎等)、植物紙衞例えば表皮、師部、飄織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいず; も意味するものである。本明細書にぉレヽて、植物とは、種子植物、シダ植物、コ物、： tfefeflt物等 ¾ ^む、多細胞の植物を意味し、植物全体、種子、植物器官 (例えば葉、花弁、茎、根、根茎等)、植物組徽例えば表皮、師部、鹚織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずも包針るものである。また、該形爾云換して得られた形辯云換体お咅養し、該形辯云換体により雖されたヒアルロン酸を分离 f ることにより、ヒアルロ^が製造さ。

発翻繊えべクタ一としては、形難維物細胞又は形露云鎌物體のために通常用レ、られてレ、るベクターを用レ、ることができる。このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデ-レーシヨン咅啦むターミネータ一配列んでレヽれば特に制限はな！/、。例えばプラスミド「pBI121」、「pBI221J、「pBI101」、「pIG121Hm」などを用レヽることができる。

植物培養細胞を宿主として用レヽる ¾ ^は、形雷云換は、植物培養細胞に、エレクト口ポレーション法又はァグロバクテリウムの/ ナリーべクタ一法もしくはパーティクルガン法で (i)ヒアルロ^ 合成酵素をコードする DNA又は (ΪΪ)ヒアル口^ T成,のアミノ酸配列にお！/ヽて、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ^ ^成活性を有するポリぺプチドをコードする DNAを挿入した発糊糸纖えべクタ一を導入することにより行うことができる。発現ベクター溝入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択さ。形傳云れた植物細胞は、細胞培養、紙 mt咅養、器官培養に用!ヽることができ、また従細られ Tヽ¾物讓咅養法等を用レ、て、植物体を再生することもできる。

形歸云換の通とな物細胞の例としては、例えば、タバコ由来 BY-2細胞や T-13細胞、二ンジン由来 kurodagosun糸田胞、ブドゥ由来 VR糸田胞ゃ VW細胞、ヨウシュゴポゥ由来 PAR糸田胞や PAP糸田胞ゃ PAW細胞、、 ^ィヌナズナ由来 T87細胞、ァ；ガス由来 86細胞や Aper 糸田胞ゃ Apas細胞や Aplo細胞、 W力由来 Cba - 1細胞、トマト由来 ¾ 細胞、ハツ力由来 l-Mar 細胞、ニチニチソゥ由来 CRA細胞や V208糸田胞や、ホウレンソゥ由来 SphWT細胞や SpH-1細胞や Spi~12F細胞、へチマ由来 Lcy~l細胞や LcyD6細胞や LcyD7細胞や、イネ由来 OS - 1細胞、ツルニチニチソゥ由来 Vma - 1細胞、ゴマ由来 PSB細胞や PSW細胞や PSG糸田胞、ヒャクニチソゥ由来 ZE3細胞などが挙げら l¾。

植物体、植物器官又は植物繊を宿主とする齢、形爾云換は、採取した植物切片に、ァグロバクテリウムのノナリーべクタ一法又はパーティクルボンバードメント法によって、 ¾¾レ、はプロトフ。ラストにエレクト口ポレーショ ¾によって、 (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ成鐘のアミノ麵列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNAを揷入した発翻糸雕ぇベクターを導入し、形傳云換の結果得ら; Μ麵且ンュート、毛状根などを分离 ϋ~ることにより行わ L¾。

こうして得ら麵且ンュート、毛状根などは、そのま纖包培養、讓咅養又は器官培養に用いることが可能である。また従^]られてぃ物紙膨咅養法を用い、適当な濃度の植物ホノンの投与などにより植物体に再生させることができる。

ヒアルロン合成隨遺^"が導入された植物細胞か物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホノリーの MS培地などは咅養すればよい。発根した幼植物体は、土衝^ Itして咅することにより植物体とすることができる。 (再分化)の方法は植物細胞の觀により歡るが、従細られ T、嫌 »肅咅養法 ¾1細レ、ることができる。

例えばイネでは Fujimuraら (Fujmuraら（1995)、 Plant Tissue Culture Lett., vol.2 :p74)の方法を用レ、ることができる。トウモロコ、は、 Shltoら (S魔 0ら (1989)、 Bio/Technology, vol.7p581、 Gorden -Kamm, 1990， Plant Cell 2, 603)の方法を用レ、ることができる。ジャガイモでは、 Visserら (Visserら (1989)、 T¾eor,Appl.Genet.、 vol.78:p589)の方法を用レ、ることができる。タバコでは、 Nagata ら (Nagata, 1971， Planta 99, 12)の:^去を用レヽることができる。シロイヌナズナでは Ak謹ら (Akamaら (1992)、 Plant Cell Rep., vol.l2:p7)の方法を用レ、ることができる。らの方法により體された植物体、または同じ性質を有するその子孫 (灘媒体、例えば观子、塊茎、などから得た植物体)も本発明の ^である。

植物内で、ヒアルロ ^成活性を持つ隨を発現させ、更に植物内でヒアル口:^を继、難または分泌させる際には、植物の適切な組織および器官で特異的に発現するようにヒアルロ ^成歸遺卸することが好ましい。

そのような制御を行うためには繊特異的又は器官特異的プロモーターを更に発糊組み換えベクターに挿入して用レ、るとょレ、。

器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、靈特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーターなどがある。

貌、繊特異的プロモーターとしては、例えば、糸翻且織特異的プロモーターなどがある。より具体的に、使用 L ¾プロモーターの例としては、例えば、構成的高発現プロモーターとして、カリフラワーモザイクウィルスの 35SE A遺伝子のプロモーターで fc¾ CaMV35Sプロモータ一等が挙げら ^5。纖特異的プロモーターとしては、リブロース 1,5-ビスリ ^ルポキ、一ゼの小サブッ!^ンパク質をコードする rbs遺ィのプロモーターやクロロフィル a/b結合タンパク質をコードする CAB遺のプロモーター、グノ Mrルァノ、ヒド 3-リ ¾デヒドロゲナーゼ Aサブ^^ッ!^ンパク質をコードする GapA遺伝子プロモーター等が挙げら; ½»。また種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーぜ遺伝子の LOXプロモーター、レクチン遺伝子の Pslプ口モーター、アミラーゼ遺の AmylAプロモーター等が挙げら。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン 6b七ドロキラーゼ遺伝子の Α6Η6Ηプロモーター、プトレシン N-メチルトランスフエラーゼの PM プロモーター等が挙げら ½>。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼの Sus4遺伝子プロモーター、クコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げら

また、ヒアルロ ^成酵素遺ィ 5÷の発現を誘導性プロモーターで霸することも考えら ½>。誘導 I·生プロモーターの例を以下に記る。

傷害リチル酸の添口により発現が増加する耐病國連遺プロモーターである PRlaプ口モーターや、乾燥、低温、高塩濃度、アブシジ ^の転発現が増加する rf29A遺 ^"プロモーター等が挙げら^^。農薬として用レヽられてレ、る化合物により発現が誘導さ ¾プロモーターとしては、除草剤のセーフナ一により誘導さ; 1x5ダルタチオン- S-トランスフェラーゼの 27KDaサブュニッンパク質をコードする GST-27遺伝子プロモーター、 -0 / (1,2,3)ーチアジ V—ノ 7_力ルポ、; イツク酸 S—メチルエステル (ΒΤΉ)により誘導さ b§キチナ一ゼ遺ィ好プロモーターや PR 遺ィ 5÷タンパク © °口モーター等がある。さらに、植物細胞内でヒアルロ^ ^成遺伝子をより安定に発現させるためにインスレーターの利用や目的の細胞内/ j ^; ^ヒアルロ^^成酵素を局在させるためにシグナルペプチドを付加したり、ヒアルロン成瞧の一部 ¾rg換ぉよび欠損させることなどを行つ T¾ょレ、。

形質転換の文橡となる植物体には、遺ィ 5÷導入の可能なレ、ずれの植包含さ。

本発明の植物又は植物体には、被子植物の単子難物や双子難物、裸子植物等が包含さ οこのおな植物には、任意の有用植物、特に働植物、 ^¾物、花卉植物や木相物がまた、本発明の植物又は植物体には、シダ植物、コ^ t物なども含¾½»。本発明力 s使用さ i #¾fi物種の例としては、具体的には、ナス科、イネ科、ァブラ斗、バラ科、マメ科、ゥリ科、シソ科、ユリ科、ァカザ科、セリ科、フトモト科、 tレガォ科の植物などが挙げられる。ナス科の植物の例としては、 Nicotiana、 Solanum, Datura, Lycopersion,または Petuniaに属す物力 S挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどが含まイネ科の植物の例としては、 Qryza、 Hordenum, Secale、 Scccharum, Echinochloa,また f¾Z eaに属す ¾jf物が挙げられ、例えば、イネ、ォォムギ、ライムギ、ヒェ、モロコシ、トウモロコ、どが含 *H¾。

7" ラ^斗の植物の例としては、 Raphanus、 Brassica、 Arabidopsis, Wasabia,または Capsella に属す物が挙げられ、例えば、大根、 Wラナ、シロイヌナズナ、ヮサビ、ナズナなどが含轨る。

パラ科の植物の例としては、 Qrunus、 Malus、 P nus, Fragaria,また ^Rosaに属す物力 S挙げられ、例えば、ウメ、、リ ^、ヽナシ、ンダイチゴ、バラなどが含¾^>。

マメ禾斗の植物の例としては、 Glycine^ Vigna、 Phaseolus、 Rsum、 Vicia、 Arachis、 Trifolium、 Alphalfa,また i^Medicagoに属す 5¾物が挙げられ、例えば、ダイズ、ァズキ、インゲンマメ、ェンドウ、ソラマノ、ラッカセィ、クローバ、ゥマゴャ、よどが含 ¾ ^>。

ゥリ科の植物の例としては、 L ffa、 Cucurbita,または Cucumisに属す物力 S挙げられ、例えば、へチマ、カポチヤ、キユウリ、メロどが含 ¾Τ/δ₀

シ f斗の植物の例としては、 Lavanduk、 Mentha,また ^Perillaに属する植物力 S挙げられ、例えば、ラベンダー、ハツ力、シソなどが含 ¾Τ/δ。

ユリ科に属す 5¾物の例としては、 A]lium、 Lilium,また im¾ aに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどが含 *Tl^。

ァカザ科の植物の例としては、 Spinaciaに属す ¾t直物が挙げられ、例えば、ホウレンソゥなどが含 0¾。

セリ科の植物の例としては、 Angelica, Daucus、 Cryptotaenia,また〖ま Apitumに属すま物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどが含¾¾

t/レガォ科の植物の例としては、 Ipomoeaに属する植物が挙げられ、例えば、サッマイモなどが含 *½。

上記のよう云物と同じ !·生質を有する子孫、また、それらの器官及 υι¾織本発明の文橡である。

また、本発明には、ヒアルロ ^成酵素を魏する形離云赚物細胞が含¾^。また、ヒアルロ^ ^成酵素を生産する形質転赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの繊も含 *½。

ヒアルロ ^成赫を生産する形辦云灘物細胞は、 (i)ヒアルロン齡成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアル口/^成^ ¾のアミノ酸配列にぉレヽて、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNAを含む発糊繊えベクターを用い T¾t物細胞¾ ^質転換することにより ¾ことができる。

ヒアルロ成瞧を生産する形難灘物は、ヒアルロン齡成酵素をコードする DNA 又は (ii)ヒアルロン酉給成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ^^成活性を有するポリペプチドをコードする飄む発糊繊えベクターを用いて植物体 ¾r?鄉云換することにより ¾ことができる。

麵難灘物細胞又は植物内にぉレ、ては、ヒアルロ ^成酵素遺伝子がヒアルロ成活性を持つ赫として発現さ

上記のようなヒアルロ^生産能を有する形難灘物細胞又は形質転灘物、或レ、は、ヒアルロ^^成瞧を生産する形質転誰物細胞或レ、は形爾云灘物を用 V、ることにより、ヒアル口を植物により生産することが可能になる。

該开觸云賺物細胞又は形難鎌物により生産されたヒアルロを分離又は取得する方法としては、例えば、以下のような: が挙げら。

上記形云灘物又は形歸云赚物細胞お咅養し、植物内にヒアルロ mを生産させた後、該形難赚物細胞又は植物から適宜^！の方法によって、ヒアルロ ^を抽出する。

例えば、形，云鎌物であれば、草齢せた植物の葉¾ ^枠して、適当な新幾溶媒により抽出を行う。

ヒアルロ ^む抽出液を濾過後、植物細胞 ¾r ^まなレ、ヒアルロの濾過鎌を ¾。この鎌をタ VTフィルトレーシヨンによって精製し、低分子量の不純物を除去する。溶解したヒアルロむ濾過灘をでタ τフィルトレーシヨンし、赚 ¾i続して捨てることによりヒアルロ ^の分離が可能である。医療用の製品力 s必要である際には、裔夜から核酸をさせるという工程を更に行つ Τ¾よい。この工程は、例えば、塩化セチルピリジユウムの第 4級アンモニゥム化合物等の! ^オン界面活醜を添ロすることによって行うことができる。

本発明により取得さ； ½ヒアルロは、ィ tiffi品及ぴ医薬品の成分、又はノリ材などの用途に有用 ί 糊できる。具体的には、ィ匕粧品 (^呆湿成分、又は、関節炎ゃ隱ゥマチ、火傷^ 0り傷の治療薬や目薬の成分などとして、有用翻 L ¾。

本発明によれば、本来植物で生産さよ力たヒアルロが、植物により生産さ。本発明によれば、ヒアルロ ^成酵素遺カ难物内で発現され、更に、植物内でヒアルロが生産さ: ½。

遺鶴え技法により、タンパク質を继するための宿主系としては、現在、遺繊ぇ植物、植物培養細胞、大腸菌、酵母などの微生物、動物細胞培養、遺繊ぇ動物などが利用可能である。しかし、いずれの生産システムにも一長一短があり、目的とする糸雕ぇタンパク質の用途およひ舊、生産量などを考慮して: ものぶ必要がある。植物以外の生産システムをみると、大腸菌はタンパク質のプロセッシングが起こらなレヽ、インクノージョ wディ (封入体) - 成する可能性があり、プロテアーゼによるが生 c¾などの問題がある。酵母などで赚難飾は起こるが麵虫自の構造である。また、治療用物質を微生物で生産する齢はエンドトキシンのなどを防ぐこめストが非常に高くなる。動物細胞は、細胞の維持管理が困 ¾ 、高価な培地を必要とする上に増も遅いため、大規模生産が難しい。なおかつウィルスゃガン遺伝のの危険性がある。遣纖ぇ動物のは、維持管理の問題の他に倫理的な問題がある。

—方、植物生産システムにおけ物培養細胞や植物は、開発期間が長くなる問題やアル力ロイドの醒まあるが、従来の農業生産システムが利用でき、ス^/レアップが容易なうえに、安価に大量に目的物質を生産すること力 s可能である。また微生物、動物細胞を宿主とした^^に問題になるトキシン、感染性ウィルスの心配もなレ、有望な物質生産系である。このように、本発明におけ ¾it物によるヒアルロ ^生産システムは、従来の動物生物による生産システムと比べて、 ^性が高ぐコストや:^、ルキ Ί荷も小さぐ産業上^^な生産システムとなってレ、る。

まで植物生産システムにおいて、動物およ敷生物由来のタンパク質を発現させ Tfc、由胜物がる必要な高次 ί^Ι«構造が維持されず、生産されたタンパク質が本来の機能を持たないことも多力 t動物微生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンノク質自体を抽出し X ^用することは従射われていたが、本発明のように、植物に動物^ [生物由来のタンパク質 ^)を発現させ、なおかつ植物内で発現し T、る, ¾ 拥して植物内で物質生産を行った例はほとんどな力 Co植物力 s元来ている纖の†f tを、ヒト由来!^潘酵素を繊えた植物で Hil離を変換した例はあるが、植物が元々继し T、た物糖質の構造を変化させたものであり、本発明のヒアルロのように植物が全く生産し Tヽなレ、物質を生産させた実例は従来になぐしかも、ヒアルロ ^のように 2觀の糖が一定の順序で数十個 fe¾ 、は数百個も連なった高分子の物質を生産した例もなレ、。

また、ヒアルロ^ ^成酵は、一般的に複数の!類通領域および膨^ S域を ^ Tヽる。ヒアルロ^ ^成酵素のように^ 合型タンパク質を、遺イ^? "を発現させる宿主と^る由来の遺ィ 5÷を発現する齢は、顧通領域おょぴ艦域が正しレ、構造を膽できなレ、ことが多レ、。特に、活翻ヒアル口 ^成酵素は、 1つのヒアルロ成酵素と膜に被するリン脂ある力ノレ: ^リピン約 14〜： 18分子とカ嚷合体 ¾^成し、ヒアルロ ^成赚活性に影響することなど力 S示唆されてレ、る。よって、本発明のように、植物内で植物力 S本来有し T、なレ、ヒアルロ^ 合成酵素遺伝子カ現し、しかも、ヒアルロを生産でき 6†離を維持し TV、ることは、従来の予想を大きく超えるものである。

このように、本発明におけるヒアルロ生産植物は、従 ¾St もは予測 U#¾い »テで fe て、かつ、産業上極めて棚な効果綠するものである。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明は ^ ^らに限定さことはない。

麵列

1.クロウィルス由来ヒアルロ ^成酵の単離

クロ ^ウィルスヒアルロ ^成,遺^^ (cvHAS)を PCRにより単离 ϋ "るために PCRブライマ一をィ懷しプライマーは、既に明らかになっているクロウィルスゲノム配列情報 (Kutish et al, 1996, Virology, 223, 303-317) (Ii et al, 1995, Virology, 212, 134-150) (Ii et al, 1997, Virology, 237, 360-377) (Lu et a], 1995, Virology, 206, 339-352) (Lu et al, 1996, Virology, 216, 102-123)およ口ウィルス由来ヒアルロ ^成遣ィ 5^·の同定情報 (Gmves etal,1999, virology, 257, 15-23) (DeAngelisetal, 1997, Scienoe, 278, 1800-1803) ¾ 考とし T¾計し、かつ発現ベクターへの導入に必要な制限酵素部位を付加したものをし制限サイトは 5'側プライマーには Ndel咅啦、 3，側プライマーには Xbal咅啦を付加し

5，側プライマー (配列番号 3)

5， - GCC GCC GCATAT GGG TAAAAATATAAT CATAAT GGTTTC G - 3，

3，側プライマー (配列番号 4)

5' - CTTGCAGTCTAGATCACACAGAC GAGCATTGGTAG -3' PCRの麵には、クロ ^ウィルス CVHI1株および CVKA1株のゲノム D A (広島大学先端物^ 科生命分子情報^ W究室山田隆謝受より謹)を用い

PGRは、 DNAポリメラーゼに KOD -plus-凍洋紡)を用レヽ、 94°C 2分、 (94°C 15秒、 0°C 30秒、 68°C 1分) 2サイクル、 (94°C 15秒、 60°C 30秒、 68°C 1分) 25サイクルの^。ログラムで行つ得られた PGR断片を、 pBluescriptnKS (+) (以後 pBSと省略する)の β -ガラクトシダーゼ遺ィ 5^·の開始コドン ATG眘啦が Ndelサイトになるように改変した大腸菌宪現ベクター (改変 pBS)の Ndelと bal咅啦に揷入し挿入された断片を、シークェ ^一〖なり CVHI1株由来ヒアルロ^ ^成酵素遺 ί¾Τ· cvHAS-m (配列番号 1)および CVKA1株由来ヒアルロ ^成瞧遺ィ好 cvHAS-KA (配列番号 2)の DNA配列を決定し

2. cvHASの大腸菌での発現おょ出

cvHAS-HI貌は cvHAS-KA む大腸菌 JM109を 37°Cで ifet咅養した培觀繊菌とし、 500mL坂口フラスコに 50mLの LB培地 (0.2%グルコースおよひアンピシリン^^む)と 500 ^ L の種菌を測し、 20°Cで約 72時間培養し cvHASの発現誘導のためのィ "。口ピノォ- β - D-ガラタトビラノシド (IPTG) 咅養開始と同時に添卩し培養終了後、培衝夜 c¾ 心分離を衍ことにより菌体を回収し、 30mlのバッファー (20mMトリス緩衝液 (pH7.5)、 0.2M Nad、 lmM EDTAヽ lmMベンズァミジンおょぴ lmM 2-メルカプトエタノール (2-ME) む)で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕し破 ?夜¾1心分離 (l¾000rpm、 20分)し、さらにその上清 ¾¾¾心分離 (xl00,000g、 1時間)することにより cvHAS ½む月麵分を抽出し、 200 のバッファー (上記と同様)で再溶解し、 cvHAS抽出液とし

3. cvHAS活國定

大腸菌で麵された cvHAS抽出液を用！/ヽアルロ^を invitoで合成し、その ®¾液中のヒアルロ濃度を測定する方法でヒアルロ ^成薩活性を表すこととし^ ₀ Invitoヒアルロ ^成は、 lOOmMトリス緩衝液 (pH7.0)、 0mMMgO2、 0.2mMEGTA、 20mM2-ME、 0.1% BSA、 2mM UD GlcA, 2mM UDP-GlcNAc, 20% glycerolおよび 10 1の HAS抽出液^み全量 50μ 1に調整した Si¾夜を 37°Cで 2時間、 4時間および 20時間 (0 させ j¾S後、 90°Cにて 3分間加熱し、反応を終了させ Co 液 ¾i心後、上清をヒアル口 ^の測定に用!/、ヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酷結合タンパク質によるヒアルロ ^の測^^のヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビォ)を用い

ヒアルロプレート「中外」は、ヒアルロ結合タンパク質を用レ、たサンドイッチ結合型ヒアル口 ^定法である。マイクロタイタープレート上に固定化したヒアルロ> ^合タンパク質に検体中のヒアルロを結合させた後、 ^標識ヒアル口:/^ ^合タンパク質を結合させ、サンドイツチ¾ ^成させる。引き^^、テトラメチルベンチジン (TMB)および過酸ィ tok素を加えると、のペル:^シダーゼの作用で ΊΜΒ力 s酸化されて呈色する。反応停止液を添口後、プレートリーダ一で波長 450nm、対照波長 620nmで吸光度を測定 (A450)することにより、サ^ °ルのヒアルロ «度力 S麵できる。

本キットに付属してレヽる標アル口矣激夜を用レヽて標準曲線を條し、サ °ル中に含 ¾τ てレ、るはサ ^ルの吸光度からヒアルロまなレ、赚 (Mock)の吸光度を引いた値 (△

A450)を用レヽ Ttアルロ^卖濃度を決定し、表 1でヒアルロン酸濃度 (HA濃度 (ngM) )とし TIE載 o ヒアルロ成瞧活性の表示にぉレ、ては、合成されたヒアルロ量ルとして表示するために、以下のような計算を行い変換しヒアルロ^プレート「中外」に付随し T、た標 2ptアル口 (濃度 lOQng/nJ)の吸光度を Aとして、各サルの吸光度を Bとすると総膝夜量が 50 μ 1であることから、そ ¾fれのヒアノレ口 ^成酵素活个生は

5 B X ΐω ngml÷ AX 50 μ 1 ÷ 1000 = C ng®¾0#^

と昇出し, o

ヒアルロ^の構成単位である (GlcA-Glc Ac)の分子量は 398.35であるので、 (GlcA-GlcNAc) nの分子量は 398.5Xn-18X(rrl)でますことがでさるので、

η= 10の、 (GlcA-GlcNAc) ιοの分子量は

10 398.8X10-18X(10-1) =3821.5 Daと算出さ l/5。

従って、

C÷3821.5Xn(今回は n=10)X1000=D pmol

と山レフ

また、抽出液のタンパク質濃度は BSAを標 ¾？ンパク質として用レヽ、 Bio-Ead protein assay 15

_

またヒアルロ ^成酵素活性は、ヒアルロ抽出液に含 ¾ いる lmgあたりのタンパク質が 1時間あたりに合成したヒアルロに取り込 ¾ lた GlcAの分 1)を計算することにより表 1で HA活性として表示し

その結果 1 す。

20 表 1におレ、て、ヒアルロ ^成酵素 ¾r ^まなレ、ベクターにより形辦云換した大腸菌由来の抽出液を Mockと表しストレフ。トコッカスピオゲネス由来ヒアルロ ^成酵素遺ィ 5^を持つベクタ一により形云換した大腸菌由来のヒアルロ^^成赚抽出液を spHASと表しクロウィルス CVKA1株由来のヒアル口/^成^ *¾r^£^ クタ一により形辦云換した大腸菌由来のヒアルロ ^成隨抽出液を cvHAS-KAと表レ 2回の反復を行ったのでそ

25 cvHAS-KAlおよび cvHAS_KA2と表し tクロウィルス CVHI1株由来のヒアルロ ^成酵素むベクターにより形 Kf云換した大腸菌由来のヒアルロ ^成^ *抽出液を cvHAS-HIと表し、

および cvHAS-HI2と表し

HAS活性の表法は、特開 2000-4886、 Itano, N. andEimata, K (1996) J. BioL Chem., 271， 9875-9878、 Tlapak-Simmons,V. L et aL,(l999) J. BioL Chem., 274, 4246-4253等現され

30 た方法と同様である。

表 1 cvHASの大腸菌での発麵淅

表 1の結果〖さ; ように、単離し fdt伝子がヒアルロ ^成纏活性を持つこと力^、さ

4. cvHAS植物発柳ベクターの條

上記 3.で懺し HAS活 I"生をした cvHAS-HIと cvHAS-KA むプラスミド DNA ¾^ として、 PCRにより制限酵素サイトを付加した PCRプライマーを用レ、て cvHAS-HIと cvHAS-KA 断片お曽幅し Co PCRプライマーは、 5'側は改変 pBS上の配列に制限酵素謝立 Dralを付加させたプライマーを設計し、 3'側は改変 pBS上のマノ！^クローニンダサイト中の制限酵素サイト部位 Sad 域をプライマーとし計し

5'側プライマー (酉己歹 U番号 5) 5' - GTG TGGAAT TTAAAG CGGATAACAAT TCA CAC AGG- 3'

3'側プライマー (配列番号 6) 5' - GGG CGAATT GGA GCT CCA CCG CGG - 3'

続レ、て、植物形，云換用べクタ^ pBI121(Jeffersonet aL, 1987, EMBO J, 6, 3901-3907)へ cvHASの挿入は、 pBI121纏艮酵素 Smalと Sadで消化し、挿入する cvHASは制限酵素 Dralと Sadで消化し、ライゲーシヨンで行っ Smalと Dralは切断眘啦が平滑耑となるので接続が可能である。

以上より、 cvHAS-HI む pBI121プラスミド (_PBI121cvHI)と cvHAS-KA む pBI121ブラスミド (_PBI121cvKA)力 Sィ懐でき

5.エレクト口ポレーショ ^ンピテントセルの傾

エレクト口ポレーションピテントセルは、ァグロバクテリゥム LBA4404 (Agrobacterium tumefeciens strain LBA4 04)単一コロニーを 5 mLの LB培地に植菌し、 28°Cで 1晚 ¾t咅養 toこの培養液を、 500mLの LB培地に植菌し、 600 nmにおける濁度が 0.5になるまで 28 °C で膨咅養し, 培養液 ¾S心分離 (5000ipm， 10 m¾ 4 °C)により難して上清を除去し、菌体 ¾¾f争するため 500 mLの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離 (5000rpm， 10min,4°C)により集菌して上清を除去しこの操作を 2回繰り返した後、麵こ 20 mLのした滅菌 10%ダリセロール裔夜を加えて懸濁し、遠心分離 (5000 rpm, 10min, 4 °C)により集菌して上清を除去しに 3 mLのロした滅菌 10%ク Uセロール激夜を加えて懸濁し、 40 Lずつ 1.5mL遠心管に分注して、液健素で難させてから -80。Cで保存し, Co

6.ァグロパクテリゥム LBA4404株への pBI121 HIと pBI121cvKAの導入

pBI121cvHIと pBI121cvKAプラスミド DNAを調製し、ァグロパクテリゥム LBA4404

5 (Agrabacterium tume&ciens strain LBA4 04) ^^レクト口ポレーシヨンにより導入し Co

Atume&ciens LBA4404のエレクト口ポレーションピテント細胞 40 μ 1に発現プラスミド (200 μ g/ml) 1 μ 1を混合した懸濁液を、あらかじめ氷中で冷却した饊亟間 β赚 1醒のキュベットに ¾Λ し、パルス電場 (1.8kV、 25 F、 200Ω)を印加し直ちに SOC500 を加え、 28°Cにて 3時間培養した後、カ^イシン^む LBフート培地に塗布し、 25°Cで 3日間培養し、 _PBI121cvHIと 10 pBI121cvKA むァグロバクテリゥムを得, Co -

7. pBI121cvHIと pBI121cvKA ¾ ^むァグロバタテリゥム LBA4404株によるタバコ培養細胞 (BY-2)の感染

形云換タバコ培養細胞は、 Niootianatabacum L. Bright Yellow 2 (以下、 ΒΥ·2と表すことが fc¾。 NagataetaL, 1981, Mol Gen Genet, 184, 161-165)を使用し,タバコ培養細胞の培養は、

15 Nagataらの方法 (NagataetaL, 1981, Mol Gen Genet, 184,161-165)に従レヽ、 LS(Linsmaierand Skoog)培地 (Iinsmaier and Skoog, 1965， Physiol Plant, 18， 100-127)中の KHZP04を 370mg L、 thiamine HQを lmg(L i 曽量し、さらこ最終濃度 3%の sucroseおよび最終濃度 0.2 τη の 2， 4—ジクロロフエノキ、 f乍酸 (2,4-D)を添口した改変 LS培地で行つ Co

タバコ培養細胞の形 ¾1云換は、 ¾Φ的に Anの方法 1985, Plant Physiol, 79， 568-570)に

20 従つカナマイシン 5Qmg/L む 5mLの LB培地で 28°Cにて 1 Bfe培養した pBI121cvHIおょぴ _PBI121cvKA ¾ ^むそ; il m©ァグロパテリウ At咅鎌 100 Lと、培養 4日目のタバコ培養細胞懸濁液 mLをンヤーレに A bてよく混ぜ、 25。Cで 2晚、暗所下で,置して雜培養しァグロノくクテリゥムを除くため、シャーレの中の培養液を 50mLの遠心管【して、さらにカ^^ィシン lOQmg Lとカル^^シリン 250mg^L ¾ ^む改変 LS培地を 20mL加えて、遠心 (lOOQrpm^

25 分)し、上清を除去し直ちに、新し！/、改変 LS培地 25mLを入れて遠心（1000rpm，4分)し、細胞を赚しこの操作を 3回繰り返し、ァグロバクテリゥムを除いた培養細胞をカナマイシン 100m 、カルシリン 250mg Lの入った改変 LS寒天培地にまき、 25°Cで暗黒下に静置して培養し約 2-3週間後にカルス化した細胞 ¾rffしレ、プレー Hq¾し、増殖してレ、るクローンを選択し最後に、力イシン 100mg L,カル^^ンリン 250 mg Lを加えた改変 IS培地

30 30ni q し、腿咅養を行つ

8.培養細胞での cvHASの生産およ Ό¾出

改変 LS培地中で 7日間培養した ΒΥ-2細胞懸濁液 150mL ¾S心分離 (lOOQrpm, 20分)行い、細胞と培地に分離し細胞を 3Qmlパッファー (20mMTris-HapH7.5、 0.2MNad、 ImM ED A、 ImM benzamidineおよび lQmM 2ME ½む)に懸濁し、フレンチプレスなり破砕し 35 破石權 ¾t心分離 (l¾000rpm、 20分)し、さらにその上清 ¾¾ϋ心分離 (xl00,000g、 1時間)することにより cvHAS ¾ ^む S麵分を抽出し、 300 μ 1バッファー (20mM Tris-HQ pH7.5、 0.2M Nad、 ImM EDTA、 ImM benzamidineおよび lQmM 2ME ¾r^む)で碰解し、 cvHAS抽出液とし

9.培養細胞が生産したヒアルロ f変の定量

培養細胞が生産したヒアルロ^を定量するためのサ °ルは、上記の細胞培養後に細胞と分 40 離した培地、 cvHAS抽出液およひアル口ニダーゼで処理した cvHAS抽出液を用レ寸 cvHAS- HIと cvHAS-KA¾ ^む培養細胞それぞれ 2¾を測定し細胞と分離した培地は、結乾燥により 2倍に議しヒアルローゼ消化は、ゥシ精巣由来ヒアル口^ーゼ (SIGMA)を

150mM Nad ¾ ^む lOQmMリ> バッファー (pH5.3)に lOQmg/mLの濃度で溶解し、 cvHAS 抽出液にし、 37°Cで 4時間ィ ^ュペートし：^そ; W?L©サ °ルを 90。Cにて 3分間加熱後、遠心分離 (12，000rpm、 10分)し、ヒアルロの定量に上清を用レヽ卞ヒアルロの定量は、ヒアルロプレート「中外」（富士レビォ)を用いて行つその結果を表 2 ¾¾す。

表 2におレ、て、クロウィルス CVKA1株由来のヒアルロ ^成酵 *¾ィ¾？ " £^クターにより形雷云換した BY-2由来のサルを cvHAS-KAと表し、 2回の反復を行！/ヽ、そ ½ cvHAS-KAlおよび cvHAS-KA2と表しクロウィルス CVHI1株由来のヒアルロ ^成酵素遺むベクターにより形 Ml云換した BY-2由来のサ^レを cvHAS-HIと表し、 2回の反復を行レヽ、そ cvHAS-HIlおよび cvHAS-HI2と表しヒアルロ ¾ °レート「中外」（富士レビォ)に付属してレ、た標アル口の測果を「ヒアル口 (スタンダード)」とし TI己載 to ( )内の濃度〖票^アルロ^裔夜中のヒアル口 ^の濃度を表す。

表 2培養細胞生産ヒアルロの定量

表 2 さ; ½ように、それぞれのラインの培養細胞がヒアルロを生産してレ、ることカ¾ ^され

10.培養細胞生産 cvHASの活隨 IJ定植物培養細胞で^ ¾された cvHAS抽出液を用レヽ Ttアル口を invitoで合成し、その液中のヒアルロ^濃度を測定する方法でヒアルロ^^成酵素活性を言面し:^ Invitoヒアル口^^成は、 10QmMTris-Ha_PH7.0_s 40mMMgO2、 0.2mMEGTA, 2QmM2- mercaptoethanol, 0.1% BSA, 2mMUDP-GlcA, 2mMUDP-GlcNAc, 20% glyoerolおよび 10 1の HAS抽出液を含み全量 50 1に調整した反夜を 37°Cで 0、 2時間反応させた。反応後、 90°Cにて 3分間加熱し、 K ^を終了させ夜 ¾t心後、上清をヒアルロ ^の測定に用レ、ヒアル口合タンパク質によるヒアルロ ^の測定には、ヒアルロ ^フ°1/ート「中外」（富士レビォ)を用レ、 o HAS抽出液のタンパク質濃度は BSAを標ンパク質として用レヽ、 Bio-Ead

その結果を表す。表 3植物培養細胞生産 cvHASの活性測定

表さ l¾ように、植物培養細胞で生産された cvHASは、 cvHAS-HI, cvHAS-KAともにヒアルロ^^成酵素活性を持つことが明らかになつ^他の由来のヒアルロ > ^成酵素でも植物細胞でヒアル口^の合成が可能であることが示唆さ;！^。

11.形難換タバコ培養細胞が生産したヒアルロ^^有画分の調製

力^イシン (lOOmg L)およびカルシリン ( 50mgU¾ ^む改変 LS培地中で 10日間培養した形云換 BY-2の細胞懸濁液 150mL ¾t心分離 (1000rpni、 20分)し、上清の培地を回収しこの培地を濾過し (ami∞nYM-10)、約 4分の 1に謹した後、 2倍量のエタノールを添カロして、析出物 ¾1心で回収し析出物を水に溶解し、ヒアルロ 7V—トにより、溶解物中のヒアルロン酸を検出し、ヒアルロ ^有画分が得られていることをしさらに、このヒアル口 ^有画分に、 150mMNaCl½む lOOmMリン醱爱衝液 (pH5.3)に溶解したゥシ精巣由来ヒアルロ^^ーゼ (SIGMA)赚動口え、最終濃度 2kU/mlにて 37°Cでヒアル口^、、ーゼ反応を開始し一定時間の開始後に 95°Cにて 20分間加熱し、 ®¾¾ri亭止し ®S液を遠心して得られた上清を HPLCによる分析に供し HPLCは、 ¾φ:的に Tawadaらの她 (Tawad et aL， 2002， Glycobiology, 12, 421-426)に従レヽ、アミノカラム yMC-PackNH2(46rnmx 15cm)を用レヽ、サ。ル 50 μ 1を 50°Cにて、流速 lnJ/minで流し、 Na¾P04を移動相としたグラジェント溶出 (20→500mM、 30分)により、生成物を UV(21Qnm)で検出し図 1は、— の抽出物のヒアルロニダーゼ処理液の HPLCの測結果を示す。開始 1時間後にはヒアルロニダーゼの作用によりした低分子量ヒアルロ混合物と推定さ; ¾複数の糖のピークが検出されヒアルロ^^ーゼ処理の時間,観と共に、した低分子量ヒアルロ ¾鵰合物の分子量は低分藤; し、開始 24時間後には、初期の混合物のピークのほとんどは消失し、最^^物の 4糖および 6糖のみが検出され^ ヒアル口-ダーゼ処理の時間経過と共に見られるこのようなオリゴ糖の生ターンは、ヒアルロン酸のヒアル口:^ーゼ処理と同様の結果であり、 ΒΥ-2の培職も抽出された画分に高分子量のヒアルロが含有されてレ、ることが示され, 12. _PBI121cvHIと pBI121cvKA むァグロバタテリゥム LBA4404株によるタバコの感染タバコ ( iootianatabacumSR-1)の形換は、ァグロパクテリゥムを用レ、るリーフディスク法 (山田康之、岡田吉美編、「植物ノ^^クノロジ一！!」、東京化学同人、 1991年)に従つ力ィシン 50m≠, ^む 5mLの LB培地で 28°Cにて 1晚培養した pBI121cvHIおよび

pBI121cvKAをそ; Wれ含むァグロバテリゥムの培鎌に、滅菌処理したタバコのリーフディスクを 3分間浸した後、癬氏上で余分な菌体を除去し、 MS (Murashige and Skoog)解厳

(Murash¾e and Skoog, 1962, Physiol Plant, 15， 473)に 3%スクロース、 B5ビタミン、 lmg Lベンジルアミ / °リン、 lmg Lナフタレン酢酸および 0.3%ゲランガムを励ロレ pH5.7に調整した分化培地に静置し、 28°Cにて 2日間、暗所で,置し, 鎩させたリーフディスクを滅菌水で 3回赚し、滅上で余分な水分を除去した後、抗生物質としてカナマイシン (lOOmg^およラフオラン fe50mgU¾r む分化培地に静置し、 25°Cにて 16時間光条件下でカルスの形成を誘導し t誘導開始 3週間後に、形態的に正常なシュート ¾1び、茎葉 Sr^んだ状態で切り出し、カナマイシン (100mgDおよラフオラン (¾0mgL)¾r ^む発根培地 (MS ΜίΆ 3%スクロース、 Β5ビタミンおよび 0.3%ゲランガム、 _PH5.7)^ 25。Cにて 16時間光条件下で発根を誘導し:^ 2週間後に発根が認められたシュート発根培地え、茎葉の生育した複数個のラインが得られ

13.形，云換タバコの继したヒアルロの定量

のァグロバタテリゥムによる感染で得られた 6ラインの形云換タバコの集約 lOOmgを 2ml容チューブし、 200 ^ 1のバッファー (20mMTris-HapH7.5, 0.2MNaCl、 ImMEDTAおよび 10mM2ME ¾r ^む)を加えて懸濁し、 400mgのジルコ二アビーズ (直径 2mm)を加えビードスマュ (和研薬 BS-12)を用レヽて、チューブを振とう攪舰理することにより、タバコの葉を破碎処理した (¾500rpm， 5分)。破枠後の液 ¾i心し (15，000rpm， 10分)、上清を出液として回収し粗出液を水で 10倍に辦尺し、測定サ:^ °ルとして用いヒアルロの定量は、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビォ)を用いて行っ^その結果を表 2ί す。尚、タバコ野生株 (wild)および mock(pBI121で形，云換したタバコ)の葉を用レヽて同様の破碎処理を行レヽ、比較のサ °ルとして月 Co cvHAS形 SI云換タバコのうち、 cvHAS-KAの 1ライン (Νο.2έΗこはヒアルロ^が有意に検出されたの結；^ら、形難換で得られたタバコ植物体にぉレヽ τ¾ヒアル口^が生産されてレ、ること力宿ヽさ表 4形難換タバコの生産したヒアルロン酸の定量

14.形灘云換タバコにおける cvHASの転写の鵷

±¾ϋのァグロパクテリゥムによる感染で得られた 6ラインの形難換タバコの葉からトータル ΕΝΑを抽出しトータル ΕΝΑの抽出は、 R ea^PkntMiniEit(Q[AGE]^を用い、謝のプ口！^ールに従つ^液 f植素で十分に?^!]した鉢に約 lOQmgの葉嫌し、液 ί核素中で乳棒で粉末状に破碎し直ちに、 1% 2-mercaptoethanol ¾ ^む Buffer RF 450 μ 1に破翻胞を懸濁し、ボノッタスミキサーで勝し tこの棚夜を QIAshredfierスヒンカラムし、遠心により、細胞破片の除去とホモ、^ィズを行っ^得られた破石鞭の上清に半のエタノールを添卩し、 ENea¾ミニカラム〖し以後、プロトコールに従い、および溶出の操作を順次行い、トータル ENA.を抽出し尚、タバコ野生株 (wild)および mock(pBI121で形，云換したタノコ)の ¾rfflレヽて 1 の石を ί?レ \ J:匕のサ。ルとして fflレ寸

次に、得られたトータル RNA ¾f ^として、 RT-PCRを行つナ 1st strand cDNAは、 ReverTra Ace - a-凍洋紡)を用レヽ、寸のプロールに従！/ヽ、上述の 1 μ gのトータル匪および random primer力も合成し 1st strand cDNA ¾ ^とした PGRは、 DNAポリメラーゼに KOD Dash DNA polymerase凍洋紡)を用レヽ、 (95°C 30秒、 59°C 2秒、 74°C 30秒) 30サイクルの^ &プログラムで行っ^プライマーとして、 5'側プライマー (配列番号 3)および 3'側プライマー (配列番号 4)を用い図 2は、 RT-PCRの液のァガロース電気泳動の結果を示す。 cvHAS形質車云換タバコのうち、ヒアルロ生産能の認められた cvHAS-KAの 1ライン (No.2)にのみ、相当サイズの明瞭お曽幅バンドが検出され、 cvHAS遺伝子の転写カ嚇され

Claims

請求の範囲

1. (1) (i)ヒアルロ成酵素をコードする DNA又は (ϋ)ヒアルロン^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアル口/ ^ 合成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発雞繊えベクターを用レ、て植物細胞灘換する工程、（2)形露云換して得られた形質転換体を生育する工程、（3)該形露云換体により生産されたヒアルロを分离 t る工程を有する、ヒアルロの製^ ^法。

2. (1) (i)ヒアルロ > ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく ί彌入され且つヒアル口^ 合成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊繊えベクターを用レ、て植物体 ¾ F須転換する工程、（2)形云換して得られた形，云換体を生育する工程、（3)該形藤換体により生産されたヒアルロを分离 ft"る工程を有する、ヒアルロ^の製法。

3. (i)ヒアルロ ^成をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成,のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ ^ 成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発麵糸雕えベクターを用レ、て植物細胞難換する工程を有する、ヒアルロ生産能を有する形露云赚物細胞のィ去。

4. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく ί彌入され且つヒアルロ ^ 成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊繊えべクタ一を用レ、て植物体を形難換する工程を有する、ヒアルロ生産能を有する形難赚物の ^法。

5, 発糊糸藤えベクター力 (1) (i)ヒアルロ ^成赫をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付力暗しくは挿入され且つヒアルロ > ^成活性を有するポリペプチドをコードする DNA及ぴ (2)器官特異的又は繊特異的プロモーターむ発麵繊えベクターであって、得ら; ίτδ形飾嫌物力器官特異的又は組織特異的ヒアルロ^^ 0能を有する形云鎌物である、請求項 4に記載の方法。

6. ヒアルロ ^成酵素力 S ftl)物由来又ば微生物由来ヒアルロ成酵素である、請求項 1〜5のレヽずれかに記載の方法。

7. ヒアルロ ^成瞧がクロウィルス由来ヒアルロ ^成酵素である請求項:!〜 5 のいずれかに記載の去。

8. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ酸配列にぉレ、て、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロ^^ 成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発觀繊えべクタ一を用レ、て植物細胞難換することにより得ら; ½ヒアルロ生産能を有する形難難物細

9. (i)ヒアル口/^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロン^成酵素のアミノ酸配列にぉレ、て、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく ί«λされ且つヒアルロ ¾^ 成活性を有するポリペプチドをコ一ドする DNA む発麵糸纖ぇベクターを用レヽ T¾物体を形爾云換することにより得ら ^、ヒアルロ生産能を有する形質転嫌物又はそれと同じ 14質を有する ¾又はそれらの器官又はそれらの通

10. 植物体が、被子植物、裸子植物、シダ植物及物からなるら選ば; ί½レ、ずれかの植物 ί 'ある、請求項 9に記載の形爾云灘物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの織

11. 器官が、根、茎、塊茎、葉、雄、 ¾¾、種子及ひ頂からなる微も選ば ½>1禾 IX は 2¾以上の器官である、請求項 9に記載の形質転鎌物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの滅

12. 繊が、表皮、師部、織、木部及ひ雅管胁らなる微ら還ま 1觀纖以上の繊である、請求項 9に記載の形歸云赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの織

13. 発? Iffl糸應ぇベクターが、 (1) (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成藤のアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付カ睹しく赚入され且つヒアルロ >^成活性を有するポリペプチドをコードする DNA及び (2)器官特異的又は繊特異的プロモーターむ発糊繊えベクターであって、得ら b0形質転赚物、器官特異的又は紙織特異的ヒアルロ^^ ¾能を有する形云灘物である、請求項 9に記載の形 ®$云^ t物又はそれと同じ I"生質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの紙

14. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする DNA又は (ii)ヒアルロ ^成酵素のアミノ麵己列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく入され且つヒアルロ ^ 成活性を有するポリペプチドをコードする D A む発糊繊ぇベクターを用！/、て植物細胞爾云換することにより得ら l ^、ヒアルロ ^成酵素を生産する形露云赚物細

15. (i)ヒアルロ ^成酵素をコードする D A又は (ii)ヒアルロ ^成,のアミノ麵己列において、 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しく f¾ 入され且つヒアルロ^^ 成活性を有するポリペプチドをコードする DNA む発糊繊ぇベクターを用レ、て植物体を形云換することにより得ら; ½、ヒアル口 ^成酵素を生産する形 ¾云^ t物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの織

16. ヒアルロ ^成酵素カ^ 物由来又ば微生物由来ヒアルロ成,で &δ、請求項 8又は 14に記載の形難鎌物細胞。

17. ヒアルロ ^成酵素ヵ^ I動物由来又敷生物由来ヒアルロ ^成,で ¾¾、請求項 9〜； 13、 15の！/、ずれかに記載の形爾云誰物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの織

18. ヒアルロ^ ^成酵素がクロウィルス由来ヒアルロ ^成酵素である、請求項 8又は 14に記載の形難鎌物細胞。

19. ヒアルロン成酵素力クロウィルス由来ヒアルロ ^成酵素である、請求項 9〜

13、 15のレヽずれかに記載の形質転赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの糸 Ilio

20. 請求項 8又は 14に記載の形爾云赚物細胞或いは請求項 9〜13、 15のレヽずれかに記載の形爾云赚物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの紙織によて生産されたヒアルロ Ho