JPWO2005012529A1 - ヒアルロン酸生産植物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡで植物細胞又は植物体を形質転換する工程、（２）該形質転換した形質転換体を生育する工程、（３）生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の合成方法に関する。
Description
本発明は、植物によりヒアルロン酸を製造する方法、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物およびそれらの作製方法に主に関する。
植物は、光合成を利用して水と二酸化炭素から糖を合成する、エネルギー負荷の低い理想的な糖質生産系である。一部の生物を除いて、他の生物では糖を自身で合成することができずに、植物由来の糖を利用している。一方、植物由来の糖を原料として、糖を修飾したり、糖鎖を伸長し糖質を合成する能力は動物・微生物それぞれ独自に有しており、植物が生産することができない動物・微生物由来の糖誘導体や糖質もある。植物において生産不可能とされ、動物・微生物が生産している糖質としてヒアルロン酸が挙げられる。
ヒアルロン酸は、１９３４年にＭｅｙｅｒとＰａｌｍｅｒが、牛の眼球の硝子体から単離したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）である（Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９３４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０７，６２９−６３４）。彼らは、この物質がグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンがβ−１，３およびβ−１，４結合した二糖の繰り返し構造を有する直鎖状の多糖であることを示した（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．（１９５４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，１７５３−１７５７）。
その後、１９５０〜１９６０年代に、ヒアルロン酸生合成に関する研究がＡ群連鎖球菌を用いた無細胞系実験により行われ、ヒアルロン酸鎖の伸長にウリジン−５’−ジホスホ−グルクロン酸（以下、ＵＤＰ−グルクロン酸またはＵＤＰ−ＧｌｃＡとすることがある）およびウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとすることがある）の２種類の糖ヌクレオチドを用いることにより、連鎖球菌細胞膜に局在するヒアルロン酸合成酵素の活性が示された（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｍ．，Ｃｉｆｏｎｅｌｌｉ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｄｏｒｆｍａｎ，Ａ．（１９５９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，２３４３−２３５０）。ヒアルロン酸合成酵素を安定な活性型として、可溶化して高純度に精製することは長年の間、困難であったが、１９９３年に、連鎖球菌のヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｈａｓＡ）が単離され（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｐａｐａｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１４５６８−１４５７１）、それ以来、真核生物のヒアルロン酸合成酵素遺伝子のクローニングが報告され（Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９８７５−９８７８；Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２２２，８１６−８２０；Ｓｐｉｃｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｍ．Ｌ．ｄｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２３４００−２３４０６；Ｓｐｉｃｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，８９５７−８９６１；Ｓｈｙｊａｎ Ａ．Ｍ．，Ｈｅｌｄｉｎ，Ｐ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ Ｅ．Ｃ．，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｔ．ａｎｄ Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２３３９５−２３３９９；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２９４５−２２９４８）、さらに、クロレラウイルスＰＢＣＶ−１（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｊｉｎｇ，Ｗ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ ｖａｍ Ｅｔｔｅｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１８００−１８０４）やパスチュレラ ムルトシダ由来（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｊｉｎｇ，Ｗ．Ｄｒａｋｅ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ａｃｈｙｕｔｈａｎ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８４５４−８４５８）のヒアルロン酸合成酵素遺伝子が見出され、活性型の組換え酵素が得られるようになった。
これらの研究の進展と共に、ヒアルロン酸の広範囲の生理機能が解明され、ユニークな物理化学的特性と生物学的な機能が明らかにされてきた。高分子のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用手術補助剤、癒着防止や創傷治癒促進に使用されている。また、低分子のヒアルロン酸は生理活性効果があることが報告されている。そして、バイオマテリアル素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。
これまで、ヒアルロン酸は、動物組織からの抽出または微生物発酵により生産されてきた。しかしながら、動物組織からの抽出は、例えば狂牛病におけるプリオン、ウィルス等の混入の危険性が懸念されている。また、動物細胞は、細胞の維持管理が困難で高価な培地を必要とする上に増殖速度も遅い。一方、微生物発酵は、糖を含有する培地や設備投資のコストが問題である。また、大腸菌などでは、タンパク質のプロセッシングが起こらない、インクルージョンボディ（封入体）を形成する可能性があり、プロテアーゼによる分解が生じるなどの問題がある（Ｐｅｔｒｉｄｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４８，５２９）。また、治療用物質を微生物で生産する場合は、エンドトキシンの混入などを防ぐために精製コストが非常に高くなる。
このような理由から、光合成により原料である糖を植物内で合成し、それらの糖を用いて、ヒアルロン酸を植物に生産させることができれば、安全面、コスト面等の点から、産業上特に有利と考えられる。
しかし、植物で、動物および微生物由来のタンパク質を発現させた例はあるものの（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，１８，１１５１−１１５５；Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，６，２１９−２２６）、タンパク質が機能を持つために必要な高次構造や糖鎖構造が由来生物と異なるため、生産されるタンパク質が本来の機能を持たないことも多かった。例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２でエリスロポエチンを発現させたがｉｎ ｖｉｖｏで生理活性を持たなかった例などがある（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７，１１６３−１１７２）。
また、従来の技術は、動物や微生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンパク質自体を抽出して利用することが主に行われており、植物に動物や微生物由来のタンパク質を発現させ、なおかつ植物内で発現しているタンパク質を利用して植物内で物質生産を行った例はほとんどなかった。
植物内での物質生産として、ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素をタバコ培養細胞ＢＹ−２に導入した結果、従来から存在していた糖タンパク質の糖鎖に新たにβ１，４結合でガラクトースを結合させた報告がある（Ｐａｌａｃｐａｃ，Ｎ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４６９２−４６９７）。しかし、この反応は、糖転移酵素を用いて１種類の糖ヌクレオチドから１個の糖を転移させる反応であって、ヒアルロン酸のような２種類の糖ヌクレオチドを一定の順序で数十個あるいは数百個も転移させて高分子を生成する反応とは全く異なっている。
また、ヒアルロン酸合成酵素は、一般的に複数の膜貫通領域および膜結合領域を持っている。ヒアルロン酸合成酵素のような膜結合型タンパク質を、遺伝子を発現させる宿主と異なる由来の遺伝子を発現する場合は、膜貫通領域および膜結合領域が正しい構造を維持できないことが多い。例えば、活性型ヒアルロン酸合成酵素は、１つのヒアルロン酸合成酵素と膜に存在するリン脂質であるカルジオリピン約１４〜１８分子とが複合体を形成し、ヒアルロン酸合成酵素活性に影響することが示唆されている（Ｔｌａｐａｋ−Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｖ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４２３９−４２４５）。このように、植物内で植物が本来有していないヒアルロン酸合成酵素遺伝子を発現すること自体、想到困難であることが予測される。
このように、ヒアルロン酸を植物により生産する技術は有用性が高いと期待されるものの、ヒアルロン酸は植物が全く生産していない物質であり、このように植物がもともと生産しない物質を植物で生産すること、しかも、ヒアルロン酸のような高分子の物質を生産することは、従来の技術からは到底困難と考えられていた。
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素を植物内で発現し、植物では本来生産されないヒアルロン酸を、植物細胞又は植物を用いて生産させることを主な課題とする。
ヒアルロン酸は、１９３４年にＭｅｙｅｒとＰａｌｍｅｒが、牛の眼球の硝子体から単離したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）である（Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９３４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０７，６２９−６３４）。彼らは、この物質がグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンがβ−１，３およびβ−１，４結合した二糖の繰り返し構造を有する直鎖状の多糖であることを示した（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．（１９５４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，１７５３−１７５７）。
その後、１９５０〜１９６０年代に、ヒアルロン酸生合成に関する研究がＡ群連鎖球菌を用いた無細胞系実験により行われ、ヒアルロン酸鎖の伸長にウリジン−５’−ジホスホ−グルクロン酸（以下、ＵＤＰ−グルクロン酸またはＵＤＰ−ＧｌｃＡとすることがある）およびウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとすることがある）の２種類の糖ヌクレオチドを用いることにより、連鎖球菌細胞膜に局在するヒアルロン酸合成酵素の活性が示された（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｍ．，Ｃｉｆｏｎｅｌｌｉ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｄｏｒｆｍａｎ，Ａ．（１９５９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，２３４３−２３５０）。ヒアルロン酸合成酵素を安定な活性型として、可溶化して高純度に精製することは長年の間、困難であったが、１９９３年に、連鎖球菌のヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｈａｓＡ）が単離され（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｐａｐａｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１４５６８−１４５７１）、それ以来、真核生物のヒアルロン酸合成酵素遺伝子のクローニングが報告され（Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９８７５−９８７８；Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２２２，８１６−８２０；Ｓｐｉｃｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ，Ｍ．Ｌ．ｄｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２３４００−２３４０６；Ｓｐｉｃｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，８９５７−８９６１；Ｓｈｙｊａｎ Ａ．Ｍ．，Ｈｅｌｄｉｎ，Ｐ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ Ｅ．Ｃ．，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｔ．ａｎｄ Ｂｒｉｓｋｉｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２３３９５−２３３９９；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２９４５−２２９４８）、さらに、クロレラウイルスＰＢＣＶ−１（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｊｉｎｇ，Ｗ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ ｖａｍ Ｅｔｔｅｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１８００−１８０４）やパスチュレラ ムルトシダ由来（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｊｉｎｇ，Ｗ．Ｄｒａｋｅ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ａｃｈｙｕｔｈａｎ，Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８４５４−８４５８）のヒアルロン酸合成酵素遺伝子が見出され、活性型の組換え酵素が得られるようになった。
これらの研究の進展と共に、ヒアルロン酸の広範囲の生理機能が解明され、ユニークな物理化学的特性と生物学的な機能が明らかにされてきた。高分子のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用手術補助剤、癒着防止や創傷治癒促進に使用されている。また、低分子のヒアルロン酸は生理活性効果があることが報告されている。そして、バイオマテリアル素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。
これまで、ヒアルロン酸は、動物組織からの抽出または微生物発酵により生産されてきた。しかしながら、動物組織からの抽出は、例えば狂牛病におけるプリオン、ウィルス等の混入の危険性が懸念されている。また、動物細胞は、細胞の維持管理が困難で高価な培地を必要とする上に増殖速度も遅い。一方、微生物発酵は、糖を含有する培地や設備投資のコストが問題である。また、大腸菌などでは、タンパク質のプロセッシングが起こらない、インクルージョンボディ（封入体）を形成する可能性があり、プロテアーゼによる分解が生じるなどの問題がある（Ｐｅｔｒｉｄｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４８，５２９）。また、治療用物質を微生物で生産する場合は、エンドトキシンの混入などを防ぐために精製コストが非常に高くなる。
このような理由から、光合成により原料である糖を植物内で合成し、それらの糖を用いて、ヒアルロン酸を植物に生産させることができれば、安全面、コスト面等の点から、産業上特に有利と考えられる。
しかし、植物で、動物および微生物由来のタンパク質を発現させた例はあるものの（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，１８，１１５１−１１５５；Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，６，２１９−２２６）、タンパク質が機能を持つために必要な高次構造や糖鎖構造が由来生物と異なるため、生産されるタンパク質が本来の機能を持たないことも多かった。例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２でエリスロポエチンを発現させたがｉｎ ｖｉｖｏで生理活性を持たなかった例などがある（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７，１１６３−１１７２）。
また、従来の技術は、動物や微生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンパク質自体を抽出して利用することが主に行われており、植物に動物や微生物由来のタンパク質を発現させ、なおかつ植物内で発現しているタンパク質を利用して植物内で物質生産を行った例はほとんどなかった。
植物内での物質生産として、ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素をタバコ培養細胞ＢＹ−２に導入した結果、従来から存在していた糖タンパク質の糖鎖に新たにβ１，４結合でガラクトースを結合させた報告がある（Ｐａｌａｃｐａｃ，Ｎ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４６９２−４６９７）。しかし、この反応は、糖転移酵素を用いて１種類の糖ヌクレオチドから１個の糖を転移させる反応であって、ヒアルロン酸のような２種類の糖ヌクレオチドを一定の順序で数十個あるいは数百個も転移させて高分子を生成する反応とは全く異なっている。
また、ヒアルロン酸合成酵素は、一般的に複数の膜貫通領域および膜結合領域を持っている。ヒアルロン酸合成酵素のような膜結合型タンパク質を、遺伝子を発現させる宿主と異なる由来の遺伝子を発現する場合は、膜貫通領域および膜結合領域が正しい構造を維持できないことが多い。例えば、活性型ヒアルロン酸合成酵素は、１つのヒアルロン酸合成酵素と膜に存在するリン脂質であるカルジオリピン約１４〜１８分子とが複合体を形成し、ヒアルロン酸合成酵素活性に影響することが示唆されている（Ｔｌａｐａｋ−Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｖ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４２３９−４２４５）。このように、植物内で植物が本来有していないヒアルロン酸合成酵素遺伝子を発現すること自体、想到困難であることが予測される。
このように、ヒアルロン酸を植物により生産する技術は有用性が高いと期待されるものの、ヒアルロン酸は植物が全く生産していない物質であり、このように植物がもともと生産しない物質を植物で生産すること、しかも、ヒアルロン酸のような高分子の物質を生産することは、従来の技術からは到底困難と考えられていた。
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素を植物内で発現し、植物では本来生産されないヒアルロン酸を、植物細胞又は植物を用いて生産させることを主な課題とする。
図１は、ヒアルロニダーゼ処理液のＨＰＬＣの測定結果を示す。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲの反応液のアガロース電気泳動の結果を示す。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲの反応液のアガロース電気泳動の結果を示す。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又はヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡで、植物細胞又は植物を形質転換することにより、植物細胞又は植物においてヒアルロン酸合成活性酵素が発現し、更に、植物内でヒアルロン酸が生産されることを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次の事項に係るものである。
項１．（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
項２．（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
項３．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞の作製方法。
項４．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物の作製方法。
項５．発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物である、項４に記載の方法。
項６．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である項１〜５のいずれかに記載の方法。
項８．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られるヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞。
項９．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１０．植物体が、被子植物、裸子植物、シダ植物及びコケ植物からなる群から選ばれるいずれかの植物体である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１１．器官が、根、茎、塊茎、葉、花器、塊根、種子及び茎頂からなる群から選ばれる１種又は２種以上の器官である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１２．組織が、表皮、師部、柔組織、木部及び維管束からなる群から選ばれる１種又は２種以上の組織である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１３．発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１４．（ｉ）ヒアルン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞。
項１５．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１６．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
項１７．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１８．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
項１９．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項２０．項８又は１４に記載の形質転換植物細胞或いは項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織によって生産されたヒアルロン酸
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明においては、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、植物細胞又は植物体の形質転換を行う。
ヒアルロン酸合成酵素としては、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として、グルクロン酸とグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成するものであれば、その由来は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル等の脊椎動物由来のヒアルロン酸合成酵素、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属、クロレラウイルス等の微生物由来のヒアルロン酸合成酵素などを用いることができる。
これらのヒアルロン酸合成酵素のなかでも、クロレラウイルス由来のヒアルン酸合成酵素が特に好ましい。
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドは、ヒアルロン酸合成活性を失わない程度の変異がなされたポリペプチドであり、ヒアルロン酸合成酵素の一部且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドと、ヒアルロン酸合成酵素の欠失、付加、挿入又は置換体であって且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドの両方を含む。
ヒアルロン酸合成酵素の一部であって、且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドとは、上記のようなヒアルロン酸合成酵素においてヒアルロン酸合成活性を奏するために必須となるアミノ酸部位を含み、必須でない部分の一部は欠失し、かつヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドである。
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドの一例として、パスチュレラ ムルトシダ由来ヒアルロン酸合成酵素は、膜結合領域および膜貫通領域と思われる約２７０アミノ酸を欠失してもヒアルロン酸合成酵素活性をもつことが報告されている（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，８８３−８８９）。
このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロン酸合成活性を失わない限り、その個数は制限されない。
本発明におけるヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記ヒアルロン酸合成酵素又はポリペプチドをコードするものであれば特に限定されず、コドンの縮重により配列が異なるものも含まれる。
このようなＤＮＡとして、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を適宜用いることができる。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属、クロレラウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を用いることができる。
より具体的には、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素（ｈＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、マウス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｍＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ニワトリ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｇＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ラット由来のヒアルロン酸合成酵素（ｒＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ２、ウシ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｂＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ２、アフリカツメガエル由来のヒアルロン酸合成酵素（ｘＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｐｍＨＡＳ）遺伝子、ストレプトコッカス ピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｐＨＡＳ）遺伝子、ストレプトコッカス エクイリシミリス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｅＨＡＳ）遺伝子、クロレラウイルスＰＢＣＶ−１（ｃｖＨＡＳ）由来のＨＡＳ遺伝子などを用いることができる。
ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）遺伝子には、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３などの各種タイプを有するものがあるが、タイプの種類は特に限定されない。
このうち、クロレラウィルス由来のＨＡＳ遺伝子が特に好ましい。
上記（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組み換えベクターを用いて植物細胞又は植物体を形質転換することによって、本発明の形質転換体、換言すると、形質転換植物細胞又は形質転換植物が作製される。
本発明の形質転換植物細胞又は形質転換植物は、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入し、形質転換することにより得ることができる。
ここで、宿主とは、植物全体、種子、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
本明細書において、植物とは、種子植物、シダ植物、コケ植物、地衣植物等を含む、多細胞の植物を意味し、植物全体、種子、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも包含するものである。
また、該形質転換して得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離することにより、ヒアルロン酸が製造される。
発現用組換えベクターとしては、形質転換植物細胞又は形質転換植物作製のために通常用いられているベクターを用いることができる。
このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限はない。例えばプラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」、「ｐＩＧ１２１Ｈｍ」などを用いることができる。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、植物培養細胞に、エレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法もしくはパーティクルガン法で（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを導入することにより行うことができる。発現ベクターを導入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された植物細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養に用いることができ、また従来知られている植物組織培養法等を用いて、植物体を再生することもできる。
形質転換の対象となる植物細胞の例としては、例えば、タバコ由来ＢＹ−２細胞やＴ−１３細胞、ニンジン由来ｋｕｒｏｄａｇｏｓｕｎ細胞、ブドウ由来ＶＲ細胞やＶＷ細胞、ヨウシュヤマゴボウ由来ＰＡＲ細胞やＰＡＰ細胞やＰＡＷ細胞、シロイヌナズナ由来Ｔ８７細胞、アスパラガス由来Ａｓｐ−８６細胞やＡ．ｐｅｒ細胞やＡ．ｐａｓ細胞やＡ．ｐｌｏ細胞、スイカ由来Ｃｂａ−１細胞、トマト由来Ｓｌｙ−１細胞、ハッカ由来１−Ｍａｒ細胞、ニチニチソウ由来ＣＲＡ細胞やＶ２０８細胞や、ホウレンソウ由来Ｓｐｉ−ＷＴ細胞やＳｐｉ−Ｉ−１細胞やＳｐｉ−１２Ｆ細胞、ヘチマ由来Ｌｃｙ−１細胞やＬｃｙＤ６細胞やＬｃｙＤ７細胞や、イネ由来ＯＳ−１細胞、ツルニチニチソウ由来Ｖｍａ−１細胞、ゴマ由来ＰＳＢ細胞やＰＳＷ細胞やＰＳＧ細胞、ヒャクニチソウ由来ＺＥ３細胞などが挙げられる。
植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、形質転換は、採取した植物切片に、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法によって、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によって、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などを分離することにより行われる。
こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。
ヒアルロン合成酵素遺伝子が導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なるが、従来知られている植物組織培養法を適宜用いることができる。
例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ．２：ｐ７４）の方法を用いることができる。トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７：ｐ５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）の方法を用いることができる。ジャガイモでは、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、ｖｏｌ．７８：ｐ５８９）の方法を用いることができる。タバコでは、Ｎａｇａｔａら（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）の方法を用いることができる。シロイヌナズナではＡｋａｍａら（Ａｋａｍａら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７）の方法を用いることができる。
これらの方法により作製された植物体、または同じ性質を有するその子孫（繁殖媒体、例えば種子、塊茎、切穂などから得た植物体）も本発明の対象である。
植物内で、ヒアルロン酸合成活性を持つ酵素を発現させ、更に植物内でヒアルロン酸を生産、蓄積または分泌させる際には、植物の適切な組織および器官で特異的に発現するようにヒアルロン酸合成酵素遺伝子を制御することが好ましい。
そのような制御を行うためには組織特異的又は器官特異的プロモーターを更に発現用組み換えベクターに挿入して用いるとよい。
器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーターなどがある。
また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、緑色組織特異的プロモーターなどがある。
より具体的に、使用し得るプロモーターの例としては、例えば、構成的高発現プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡ遺伝子のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。緑色組織特異的プロモーターとしては、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットタンパク質をコードするｒｂｓ遺伝子のプロモーターやクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするＣＡＢ遺伝子のプロモーター、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットタンパク質をコードするＧａｐＡ遺伝子プロモーター等が挙げられる。また種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーゼ遺伝子のＬＯＸプロモーター、レクチン遺伝子のＰｓｌプロモーター、アミラーゼ遺伝子のＡｍｙｌＡプロモーター等が挙げられる。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン６ｂ−ヒドロキラーゼ遺伝子のＡ６Ｈ６Ｈプロモーター、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼのＰＭＴプロモーター等が挙げられる。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼのＳｕｓ４遺伝子プロモーター、グリコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
また、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を誘導性プロモーターで制御することも考えられる。誘導性プロモーターの例を以下に記載する。
傷害やサリチル酸の添加により発現が増加する耐病性関連遺伝子プロモーターであるＰＲ１ａプロモーターや、乾燥、低温、高塩濃度、アブシジン酸の転換より発現が増加するｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター等が挙げられる。農薬として用いられている化合物により発現が誘導されるプロモーターとしては、除草剤のセーフナーにより誘導されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ＫＤａサブユニットタンパク質をコードするＧＳＴ−２７遺伝子プロモーター、ベンゾ（１，２，３）−チアジアゾール−７−カルボシオイック酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨ）により誘導されるキチナーゼ遺伝子プロモーターやＰＲ遺伝子タンパク質プロモーター等がある。さらに、植物細胞内でヒアルロン酸合成遺伝子をより安定に発現させるためにインスレーターの利用や目的の細胞内小器官でヒアルロン酸合成酵素を局在させるためにシグナルペプチドを付加したり、ヒアルロン酸合成酵素の一部を置換および欠損させることなどを行ってもよい。
形質転換の対象となる植物体には、遺伝子導入の可能ないずれの植物も包含される。
本発明の植物又は植物体には、被子植物の単子葉植物や双子葉植物、裸子植物等が包含される。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、花卉植物や木本植物が含まれる。
また、本発明の植物又は植物体には、シダ植物、コケ植物なども含まれる。
本発明が使用され得る植物種の例としては、具体的には、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、フトモト科、ヒルガオ科の植物などが挙げられる。
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどが含まれる。
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属す植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどが含まれる。
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどが含まれる。
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどが含まれる。
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどが含まれる。
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどが含まれる。
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどが含まれる。
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどが含まれる。
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウなどが含まれる。
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどが含まれる。
ヒルガオ科の植物の例としては、Ｉｐｏｍｏｅａに属する植物が挙げられ、例えば、サツマイモなどが含まれる。
上記のような形質転換植物と同じ性質を有する子孫、また、それらの器官及び組織も本発明の対象である。
また、本発明には、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞が含まれる。また、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織も含まれる。
ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞は、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得ることができる。
ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物は、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得ることができる。
該形質転換植物細胞又は植物内においては、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子がヒアルロン酸合成活性を持つ酵素として発現される。
上記のようなヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物、或いは、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞或いは形質転換植物を用いることにより、ヒアルロン酸を植物により生産することが可能になる。
該形質転換植物細胞又は形質転換植物により生産されたヒアルロン酸を分離又は取得する方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を培養し、植物内にヒアルロン酸を生産させた後、該形質転換植物細胞又は植物から適宜公知の方法によって、ヒアルロン酸を抽出する。
例えば、形質転換植物であれば、乾燥させた植物の葉を粉砕して、適当な有機溶媒により抽出を行う。
ヒアルロン酸を含む抽出液を濾過後、植物細胞を含まないヒアルロン酸の濾過溶液を得る。この溶液をダイアフィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を除去する。溶解したヒアルロン酸を含む濾過溶液を純水でダイアフィルトレーションし、濾液を連続して捨てることによりヒアルロン酸の分離が可能である。医療用の製品が必要である際には、溶液から核酸を沈殿させるという工程を更に行ってもよい。この工程は、例えば、塩化セチルピリジニウムの第４級アンモニウム化合物等の陽イオン界面活性剤を添加することによって行うことができる。
本発明により取得されるヒアルロン酸は、化粧品及び医薬品の成分、又はバイオマテリアル素材などの用途に有用に利用できる。具体的には、化粧品の保湿成分、又は、関節炎や慢性リウマチ、火傷や切り傷の治療薬や目薬の成分などとして、有用に利用し得る。
本発明によれば、本来植物で生産されなかったヒアルロン酸が、植物により生産される。本発明によれば、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子が植物内で発現され、更に、植物内でヒアルロン酸が生産される。
遺伝子組換え技法により、タンパク質を生産するための宿主系としては、現在、遺伝子組換え植物、植物培養細胞、大腸菌、酵母などの微生物、動物細胞培養、遺伝子組換え動物などが利用可能である。しかし、いずれの生産システムにも一長一短があり、目的とする組換えタンパク質の用途および特性、生産量などを考慮して最適なものを選ぶ必要がある。植物以外の生産システムをみると、大腸菌はタンパク質のプロセッシングが起こらない、インクルージョンボディ（封入体）を形成する可能性があり、プロテアーゼによる分解が生じるなどの問題がある。酵母などでは糖鎖修飾は起こるが酵母独自の構造である。また治療用物質を微生物で生産する場合はエンドトキシンの混入などを防ぐために精製コストが非常に高くなる。動物細胞は、細胞の維持管理が困難で、高価な培地を必要とする上に増殖速度も遅いため、大規模生産が難しい。なおかつウイルスやガン遺伝の混入の危険性がある。遺伝子組換え動物の場合は、維持管理の問題の他に倫理的な問題がある。
一方、植物生産システムにおける植物培養細胞や植物は、開発期間が長くなる問題やアルカロイドの課題はあるが、従来の農業生産システムが利用でき、スケールアップが容易なうえに、安価に大量に目的物質を生産することが可能である。また微生物、動物細胞を宿主とした場合に問題になるトキシン、感染性ウイルスの心配もない有望な物質生産系である。
このように、本発明における植物によるヒアルロン酸生産システムは、従来の動物や微生物による生産システムと比べて、安全性が高く、コストやエネルギー負荷も小さく、産業上有利な生産システムとなっている。
これまで植物生産システムにおいて、動物および微生物由来のタンパク質を発現させても、由来生物が異なる場合、必要な高次構造や糖鎖構造が維持されず、生産されたタンパク質が本来の機能を持たないことも多かった。動物や微生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンパク質自体を抽出して利用することは従来行われていたが、本発明のように、植物に動物や微生物由来のタンパク質（酵素）を発現させ、なおかつ植物内で発現している酵素を利用して植物内で物質生産を行った例はほとんどなかった。植物が元来持っている糖鎖の構造を、ヒト由来糖転移酵素を組換えた植物で糖鎖構造を変換した例はあるが、植物が元々生産していた物質である糖質の構造を変化させたものであり、本発明のヒアルロン酸のように植物が全く生産していない物質を生産させた実例は従来になく、しかも、ヒアルロン酸のように２種類の糖が一定の順序で数十個あるいは数百個も連なった高分子の物質を生産した例もない。
また、ヒアルロン酸合成酵素は、一般的に複数の膜貫通領域および膜結合領域を持っている。ヒアルロン酸合成酵素のように膜結合型タンパク質を、遺伝子を発現させる宿主と異なる由来の遺伝子を発現する場合は、膜貫通領域および膜結合領域が正しい構造を維持できないことが多い。特に、活性型ヒアルロン酸合成酵素は、１つのヒアルロン酸合成酵素と膜に存在するリン脂質であるカルジオリピン約１４〜１８分子とが複合体を形成し、ヒアルロン酸合成酵素活性に影響することなどが示唆されている。よって、本発明のように、植物内で植物が本来有していないヒアルロン酸合成酵素遺伝子が発現し、しかも、ヒアルロン酸を生産できる構造を維持していることは、従来の予想を大きく超えるものである。
このように、本発明におけるヒアルロン酸生産植物は、従来技術からは予測し得ない技術であって、かつ、産業上極めて有利な効果を奏するものである。
すなわち、本発明は、次の事項に係るものである。
項１．（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
項２．（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
項３．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞の作製方法。
項４．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物の作製方法。
項５．発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物である、項４に記載の方法。
項６．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である項１〜５のいずれかに記載の方法。
項８．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られるヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞。
項９．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１０．植物体が、被子植物、裸子植物、シダ植物及びコケ植物からなる群から選ばれるいずれかの植物体である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１１．器官が、根、茎、塊茎、葉、花器、塊根、種子及び茎頂からなる群から選ばれる１種又は２種以上の器官である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１２．組織が、表皮、師部、柔組織、木部及び維管束からなる群から選ばれる１種又は２種以上の組織である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１３．発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物である、項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１４．（ｉ）ヒアルン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞。
項１５．（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１６．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
項１７．ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項１８．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
項１９．ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
項２０．項８又は１４に記載の形質転換植物細胞或いは項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織によって生産されたヒアルロン酸
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明においては、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、植物細胞又は植物体の形質転換を行う。
ヒアルロン酸合成酵素としては、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として、グルクロン酸とグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成するものであれば、その由来は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル等の脊椎動物由来のヒアルロン酸合成酵素、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属、クロレラウイルス等の微生物由来のヒアルロン酸合成酵素などを用いることができる。
これらのヒアルロン酸合成酵素のなかでも、クロレラウイルス由来のヒアルン酸合成酵素が特に好ましい。
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドは、ヒアルロン酸合成活性を失わない程度の変異がなされたポリペプチドであり、ヒアルロン酸合成酵素の一部且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドと、ヒアルロン酸合成酵素の欠失、付加、挿入又は置換体であって且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドの両方を含む。
ヒアルロン酸合成酵素の一部であって、且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドとは、上記のようなヒアルロン酸合成酵素においてヒアルロン酸合成活性を奏するために必須となるアミノ酸部位を含み、必須でない部分の一部は欠失し、かつヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドである。
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドの一例として、パスチュレラ ムルトシダ由来ヒアルロン酸合成酵素は、膜結合領域および膜貫通領域と思われる約２７０アミノ酸を欠失してもヒアルロン酸合成酵素活性をもつことが報告されている（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，８８３−８８９）。
このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロン酸合成活性を失わない限り、その個数は制限されない。
本発明におけるヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記ヒアルロン酸合成酵素又はポリペプチドをコードするものであれば特に限定されず、コドンの縮重により配列が異なるものも含まれる。
このようなＤＮＡとして、公知のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を適宜用いることができる。例えば、ヒト、マウス、ラビット、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属、クロレラウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を用いることができる。
より具体的には、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素（ｈＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、マウス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｍＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ニワトリ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｇＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ラット由来のヒアルロン酸合成酵素（ｒＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ２、ウシ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｂＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ２、アフリカツメガエル由来のヒアルロン酸合成酵素（ｘＨＡＳ）遺伝子のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｐｍＨＡＳ）遺伝子、ストレプトコッカス ピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｐＨＡＳ）遺伝子、ストレプトコッカス エクイリシミリス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｅＨＡＳ）遺伝子、クロレラウイルスＰＢＣＶ−１（ｃｖＨＡＳ）由来のＨＡＳ遺伝子などを用いることができる。
ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）遺伝子には、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３などの各種タイプを有するものがあるが、タイプの種類は特に限定されない。
このうち、クロレラウィルス由来のＨＡＳ遺伝子が特に好ましい。
上記（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組み換えベクターを用いて植物細胞又は植物体を形質転換することによって、本発明の形質転換体、換言すると、形質転換植物細胞又は形質転換植物が作製される。
本発明の形質転換植物細胞又は形質転換植物は、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入し、形質転換することにより得ることができる。
ここで、宿主とは、植物全体、種子、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
本明細書において、植物とは、種子植物、シダ植物、コケ植物、地衣植物等を含む、多細胞の植物を意味し、植物全体、種子、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも包含するものである。
また、該形質転換して得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離することにより、ヒアルロン酸が製造される。
発現用組換えベクターとしては、形質転換植物細胞又は形質転換植物作製のために通常用いられているベクターを用いることができる。
このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限はない。例えばプラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」、「ｐＩＧ１２１Ｈｍ」などを用いることができる。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、植物培養細胞に、エレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法もしくはパーティクルガン法で（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを導入することにより行うことができる。発現ベクターを導入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された植物細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養に用いることができ、また従来知られている植物組織培養法等を用いて、植物体を再生することもできる。
形質転換の対象となる植物細胞の例としては、例えば、タバコ由来ＢＹ−２細胞やＴ−１３細胞、ニンジン由来ｋｕｒｏｄａｇｏｓｕｎ細胞、ブドウ由来ＶＲ細胞やＶＷ細胞、ヨウシュヤマゴボウ由来ＰＡＲ細胞やＰＡＰ細胞やＰＡＷ細胞、シロイヌナズナ由来Ｔ８７細胞、アスパラガス由来Ａｓｐ−８６細胞やＡ．ｐｅｒ細胞やＡ．ｐａｓ細胞やＡ．ｐｌｏ細胞、スイカ由来Ｃｂａ−１細胞、トマト由来Ｓｌｙ−１細胞、ハッカ由来１−Ｍａｒ細胞、ニチニチソウ由来ＣＲＡ細胞やＶ２０８細胞や、ホウレンソウ由来Ｓｐｉ−ＷＴ細胞やＳｐｉ−Ｉ−１細胞やＳｐｉ−１２Ｆ細胞、ヘチマ由来Ｌｃｙ−１細胞やＬｃｙＤ６細胞やＬｃｙＤ７細胞や、イネ由来ＯＳ−１細胞、ツルニチニチソウ由来Ｖｍａ−１細胞、ゴマ由来ＰＳＢ細胞やＰＳＷ細胞やＰＳＧ細胞、ヒャクニチソウ由来ＺＥ３細胞などが挙げられる。
植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、形質転換は、採取した植物切片に、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法によって、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によって、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現用組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などを分離することにより行われる。
こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。
ヒアルロン合成酵素遺伝子が導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なるが、従来知られている植物組織培養法を適宜用いることができる。
例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ．２：ｐ７４）の方法を用いることができる。トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７：ｐ５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）の方法を用いることができる。ジャガイモでは、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、ｖｏｌ．７８：ｐ５８９）の方法を用いることができる。タバコでは、Ｎａｇａｔａら（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）の方法を用いることができる。シロイヌナズナではＡｋａｍａら（Ａｋａｍａら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７）の方法を用いることができる。
これらの方法により作製された植物体、または同じ性質を有するその子孫（繁殖媒体、例えば種子、塊茎、切穂などから得た植物体）も本発明の対象である。
植物内で、ヒアルロン酸合成活性を持つ酵素を発現させ、更に植物内でヒアルロン酸を生産、蓄積または分泌させる際には、植物の適切な組織および器官で特異的に発現するようにヒアルロン酸合成酵素遺伝子を制御することが好ましい。
そのような制御を行うためには組織特異的又は器官特異的プロモーターを更に発現用組み換えベクターに挿入して用いるとよい。
器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーターなどがある。
また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、緑色組織特異的プロモーターなどがある。
より具体的に、使用し得るプロモーターの例としては、例えば、構成的高発現プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡ遺伝子のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。緑色組織特異的プロモーターとしては、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットタンパク質をコードするｒｂｓ遺伝子のプロモーターやクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするＣＡＢ遺伝子のプロモーター、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットタンパク質をコードするＧａｐＡ遺伝子プロモーター等が挙げられる。また種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーゼ遺伝子のＬＯＸプロモーター、レクチン遺伝子のＰｓｌプロモーター、アミラーゼ遺伝子のＡｍｙｌＡプロモーター等が挙げられる。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン６ｂ−ヒドロキラーゼ遺伝子のＡ６Ｈ６Ｈプロモーター、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼのＰＭＴプロモーター等が挙げられる。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼのＳｕｓ４遺伝子プロモーター、グリコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
また、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を誘導性プロモーターで制御することも考えられる。誘導性プロモーターの例を以下に記載する。
傷害やサリチル酸の添加により発現が増加する耐病性関連遺伝子プロモーターであるＰＲ１ａプロモーターや、乾燥、低温、高塩濃度、アブシジン酸の転換より発現が増加するｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター等が挙げられる。農薬として用いられている化合物により発現が誘導されるプロモーターとしては、除草剤のセーフナーにより誘導されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの２７ＫＤａサブユニットタンパク質をコードするＧＳＴ−２７遺伝子プロモーター、ベンゾ（１，２，３）−チアジアゾール−７−カルボシオイック酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨ）により誘導されるキチナーゼ遺伝子プロモーターやＰＲ遺伝子タンパク質プロモーター等がある。さらに、植物細胞内でヒアルロン酸合成遺伝子をより安定に発現させるためにインスレーターの利用や目的の細胞内小器官でヒアルロン酸合成酵素を局在させるためにシグナルペプチドを付加したり、ヒアルロン酸合成酵素の一部を置換および欠損させることなどを行ってもよい。
形質転換の対象となる植物体には、遺伝子導入の可能ないずれの植物も包含される。
本発明の植物又は植物体には、被子植物の単子葉植物や双子葉植物、裸子植物等が包含される。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、花卉植物や木本植物が含まれる。
また、本発明の植物又は植物体には、シダ植物、コケ植物なども含まれる。
本発明が使用され得る植物種の例としては、具体的には、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、フトモト科、ヒルガオ科の植物などが挙げられる。
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどが含まれる。
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属す植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどが含まれる。
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどが含まれる。
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどが含まれる。
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどが含まれる。
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどが含まれる。
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどが含まれる。
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどが含まれる。
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウなどが含まれる。
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどが含まれる。
ヒルガオ科の植物の例としては、Ｉｐｏｍｏｅａに属する植物が挙げられ、例えば、サツマイモなどが含まれる。
上記のような形質転換植物と同じ性質を有する子孫、また、それらの器官及び組織も本発明の対象である。
また、本発明には、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞が含まれる。また、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織も含まれる。
ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞は、（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得ることができる。
ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物は、ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得ることができる。
該形質転換植物細胞又は植物内においては、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子がヒアルロン酸合成活性を持つ酵素として発現される。
上記のようなヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物、或いは、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞或いは形質転換植物を用いることにより、ヒアルロン酸を植物により生産することが可能になる。
該形質転換植物細胞又は形質転換植物により生産されたヒアルロン酸を分離又は取得する方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を培養し、植物内にヒアルロン酸を生産させた後、該形質転換植物細胞又は植物から適宜公知の方法によって、ヒアルロン酸を抽出する。
例えば、形質転換植物であれば、乾燥させた植物の葉を粉砕して、適当な有機溶媒により抽出を行う。
ヒアルロン酸を含む抽出液を濾過後、植物細胞を含まないヒアルロン酸の濾過溶液を得る。この溶液をダイアフィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を除去する。溶解したヒアルロン酸を含む濾過溶液を純水でダイアフィルトレーションし、濾液を連続して捨てることによりヒアルロン酸の分離が可能である。医療用の製品が必要である際には、溶液から核酸を沈殿させるという工程を更に行ってもよい。この工程は、例えば、塩化セチルピリジニウムの第４級アンモニウム化合物等の陽イオン界面活性剤を添加することによって行うことができる。
本発明により取得されるヒアルロン酸は、化粧品及び医薬品の成分、又はバイオマテリアル素材などの用途に有用に利用できる。具体的には、化粧品の保湿成分、又は、関節炎や慢性リウマチ、火傷や切り傷の治療薬や目薬の成分などとして、有用に利用し得る。
本発明によれば、本来植物で生産されなかったヒアルロン酸が、植物により生産される。本発明によれば、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子が植物内で発現され、更に、植物内でヒアルロン酸が生産される。
遺伝子組換え技法により、タンパク質を生産するための宿主系としては、現在、遺伝子組換え植物、植物培養細胞、大腸菌、酵母などの微生物、動物細胞培養、遺伝子組換え動物などが利用可能である。しかし、いずれの生産システムにも一長一短があり、目的とする組換えタンパク質の用途および特性、生産量などを考慮して最適なものを選ぶ必要がある。植物以外の生産システムをみると、大腸菌はタンパク質のプロセッシングが起こらない、インクルージョンボディ（封入体）を形成する可能性があり、プロテアーゼによる分解が生じるなどの問題がある。酵母などでは糖鎖修飾は起こるが酵母独自の構造である。また治療用物質を微生物で生産する場合はエンドトキシンの混入などを防ぐために精製コストが非常に高くなる。動物細胞は、細胞の維持管理が困難で、高価な培地を必要とする上に増殖速度も遅いため、大規模生産が難しい。なおかつウイルスやガン遺伝の混入の危険性がある。遺伝子組換え動物の場合は、維持管理の問題の他に倫理的な問題がある。
一方、植物生産システムにおける植物培養細胞や植物は、開発期間が長くなる問題やアルカロイドの課題はあるが、従来の農業生産システムが利用でき、スケールアップが容易なうえに、安価に大量に目的物質を生産することが可能である。また微生物、動物細胞を宿主とした場合に問題になるトキシン、感染性ウイルスの心配もない有望な物質生産系である。
このように、本発明における植物によるヒアルロン酸生産システムは、従来の動物や微生物による生産システムと比べて、安全性が高く、コストやエネルギー負荷も小さく、産業上有利な生産システムとなっている。
これまで植物生産システムにおいて、動物および微生物由来のタンパク質を発現させても、由来生物が異なる場合、必要な高次構造や糖鎖構造が維持されず、生産されたタンパク質が本来の機能を持たないことも多かった。動物や微生物由来のタンパク質を植物で発現させて、そのタンパク質自体を抽出して利用することは従来行われていたが、本発明のように、植物に動物や微生物由来のタンパク質（酵素）を発現させ、なおかつ植物内で発現している酵素を利用して植物内で物質生産を行った例はほとんどなかった。植物が元来持っている糖鎖の構造を、ヒト由来糖転移酵素を組換えた植物で糖鎖構造を変換した例はあるが、植物が元々生産していた物質である糖質の構造を変化させたものであり、本発明のヒアルロン酸のように植物が全く生産していない物質を生産させた実例は従来になく、しかも、ヒアルロン酸のように２種類の糖が一定の順序で数十個あるいは数百個も連なった高分子の物質を生産した例もない。
また、ヒアルロン酸合成酵素は、一般的に複数の膜貫通領域および膜結合領域を持っている。ヒアルロン酸合成酵素のように膜結合型タンパク質を、遺伝子を発現させる宿主と異なる由来の遺伝子を発現する場合は、膜貫通領域および膜結合領域が正しい構造を維持できないことが多い。特に、活性型ヒアルロン酸合成酵素は、１つのヒアルロン酸合成酵素と膜に存在するリン脂質であるカルジオリピン約１４〜１８分子とが複合体を形成し、ヒアルロン酸合成酵素活性に影響することなどが示唆されている。よって、本発明のように、植物内で植物が本来有していないヒアルロン酸合成酵素遺伝子が発現し、しかも、ヒアルロン酸を生産できる構造を維持していることは、従来の予想を大きく超えるものである。
このように、本発明におけるヒアルロン酸生産植物は、従来技術からは予測し得ない技術であって、かつ、産業上極めて有利な効果を奏するものである。
以下、実施例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
１．クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の単離
クロレラウイルスヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｃｖＨＡＳ）をＰＣＲにより単離するためにＰＣＲプライマーを作製した。プライマーは、既に明らかになっているクロレラウイルスゲノム配列情報（Ｋｕｔｉｓｈ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２３，３０３−３１７）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１２，１３４−１５０）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３７，３６０−３７７）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０６，３３９−３５２）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１６，１０２−１２３）およびクロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成遺伝子の同定情報（Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７，１５−２３）（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１８００−１８０３）を参考として設計し、かつ発現ベクターへの導入に必要な制限酵素部位を付加したものを作製した。制限酵素サイトは５’側プライマーにはＮｄｅＩ部位、３’側プライマーにはＸｂａＩ部位を付加した。
ＰＣＲの鋳型には、クロレラウイルスＣＶＨＩ１株およびＣＶＫＡ１株のゲノムＤＮＡ（広島大学 先端物質科学研究科生命分子情報学研究室 山田 隆 教授より譲渡）を用いた。
ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用い、９４℃ ２分、（９４℃ １５秒、４０℃ ３０秒、６８℃ １分）２サイクル、（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分）２５サイクルの反応プログラムで行った。得られたＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（以後ｐＢＳと省略する）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンＡＴＧ部位がＮｄｅＩサイトになるように改変した大腸菌発現ベクター（改変ｐＢＳ）のＮｄｅＩとＸｂａＩ部位に挿入した。挿入された断片を、シークエンサーによりＣＶＨＩ１株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｃｖＨＡＳ−ＨＩ（配列番号１）およびＣＶＫＡ１株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｃｖＨＡＳ−ＫＡ（配列番号２）のＤＮＡ配列を決定した。
２．ｃｖＨＡＳの大腸菌での発現および抽出
ｃｖＨＡＳ−ＨＩまたはｃｖＨＡＳ−ＫＡを含む大腸菌ＪＭ１０９を３７℃で一晩培養した培養液を種菌とし、５００ｍＬ坂口フラスコに５０ｍＬのＬＢ培地（０．２％グルコースおよびアンピシリンを含む）と５００μＬの種菌を添加し、２０℃で約７２時間培養した。ｃｖＨＡＳの発現誘導のためのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は培養開始と同時に添加した。培養終了後、培養液の遠心分離を行うことにより菌体を回収し、３０ｍｌのバッファー（２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジンおよび１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む）で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、さらにその上清を超遠心分離（ｘ１００，０００ｇ、１時間）することによりｃｖＨＡＳを含む膜画分を抽出し、２００μｌのバッファー（上記と同様）で再溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液とした。
３．ｃｖＨＡＳ活性測定
大腸菌で生産されたｃｖＨＡＳ抽出液を用いてヒアルロン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定する方法でヒアルロン酸合成酵素活性を表すこととした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏヒアルロン酸合成は、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ２−ＭＥ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌおよび１０μｌのＨＡＳ抽出液を含み全量５０μｌに調整した反応液を３７℃で２時間、４時間および２０時間（Ｏ／Ｎ）反応させた。反応後、９０℃にて３分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。
ヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定試薬のヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。
ヒアルロン酸プレート「中外」は、ヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチ結合型ヒアルロン酸定量方法である。マイクロタイタープレート上に固定化したヒアルロン酸結合タンパク質に検体中のヒアルロン酸を結合させた後、酵素標識ヒアルロン酸結合タンパク質を結合させ、サンドイッチを形成させる。引き続き、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を加えると、標識酵素のペルオキシダーゼの作用でＴＭＢが酸化されて呈色する。反応停止液を添加後、プレートリーダーで波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍで吸光度を測定（Ａ４５０）することにより、サンプルのヒアルロン酸濃度が評価できる。
本キットに付属している標準ヒアルロン酸溶液を用いて標準曲線を作製し、サンプル中に含まれているはサンプルの吸光度からヒアルロン酸を含まない溶液（Ｍｏｃｋ）の吸光度を引いた値（△Ａ４５０）を用いてヒアルロン酸濃度を決定し、表１でヒアルロン酸濃度（ＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ））として記載した。
ヒアルロン酸合成酵素活性の表示においては、合成されたヒアルロン酸量をモルとして表示するために、以下のような計算を行い変換した。ヒアルロン酸プレート「中外」に付随していた標準ヒアルロン酸（濃度１００ｎｇ／ｍｌ）の吸光度をＡとして、各サンプルの吸光度をＢとすると総反応液量が５０μｌであることから、それぞれのヒアルロン酸合成酵素活性は
ＢＸ１００ｎｇ／ｍｌ÷ＡＸ５０μｌ÷１０００＝Ｃｎｇ／反応時間
と算出した。
ヒアルロン酸の構成単位である（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）の分子量は３９８．３５であるので、（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎの分子量は３９８．５Ｘｎ−１８Ｘ（ｎ−１）で表すことができるので、
ｎ＝１０の場合、（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）１０の分子量は
３９８．８Ｘ１０−１８Ｘ（１０−１）＝３８２１．５Ｄａと算出される。
従って、それぞれの反応時間でヒアルロン酸に取り込まれたＧｌｃＡの分子数は
Ｃ÷３８２１．５Ｘｎ（今回はｎ＝１０）Ｘ１０００＝Ｄｐｍｏｌ
と算出した。
また、抽出液のタンパク質濃度はＢＳＡを標準タンパク質として用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド）により測定した結果を表１でタンパク量として記載した。
またヒアルロン酸合成酵素活性は、ヒアルロン酸抽出液に含まれている１ｍｇあたりのタンパク質が１時間あたりに合成したヒアルロン酸に取り込まれたＧｌｃＡの分子数（ｐｍｏｌ）を計算することにより表１でＨＡ活性として表示した。
その結果を表１に示す。
表１において、ヒアルロン酸合成酵素を含まないベクターにより形質転換した大腸菌由来の抽出液をＭｏｃｋと表した。ストレプトコッカス ピオゲネス由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を持つベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸合成酵素抽出液をｓｐＨＡＳと表した。クロレラウイルスＣＶＫＡ１株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸合成酵素抽出液をｃｖＨＡＳ−ＫＡと表し、２回の反復を行ったのでそれぞれをｃｖＨＡＳ−ＫＡ１およびｃｖＨＡＳ−ＫＡ２と表した。クロレラウイルスＣＶＨＩ１株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸酵素抽出液をｃｖＨＡＳ−ＨＩと表し、２回の反復を行ったのでそれぞれをｃｖＨＡＳ−ＨＩ１およびｃｖＨＡＳ−ＨＩ２と表した。
ＨＡＳ活性の表現方法は、特開２０００−４８８６、Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９８７５−９８７８、Ｔｌａｐａｋ−Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｖ．Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４２４６−４２５３等に表現された方法と同様である。
表１の結果に表されるように、単離した遺伝子がヒアルロン酸合成酵素活性を持つことが確認された。
４．ｃｖＨＡＳ植物発現用ベクターの作製
上記３．で作製しＨＡＳ活性を確認したｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより制限酵素サイトを付加したＰＣＲプライマーを用いてｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’側は改変ｐＢＳ上の配列に制限酵素部位ＤｒａＩを付加させたプライマーを設計し、３’側は改変ｐＢＳ上のマルチクローニングサイト中の制限酵素サイト部位ＳａｃＩを含む領域をプライマーとして設計した。
続いて、植物形質転換用ベクターｐＢＩ１２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ，６，３９０１−３９０７）へｃｖＨＡＳの挿入は、ｐＢＩ１２１を制限酵素ＳｍａＩとＳａｃＩで消化し、挿入するｃｖＨＡＳは制限酵素ＤｒａＩとＳａｃＩで消化し、ライゲーション反応で行った。ＳｍａＩとＤｒａＩは切断部位が平滑末端となるので接続が可能である。
以上より、ｃｖＨＡＳ−ＨＩを含むｐＢＩ１２１プラスミド（ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩ）とｃｖＨＡＳ−ＫＡを含むｐＢＩ１２１プラスミド（ｐＢＩ１２１ｃｖＫＡ）が作製できた。
５．エレクトロポレーションコンピテントセルの作製
エレクトロポレーションコンピテントセルは、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＢＡ４４０４）単一コロニーを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、２８℃で１晩振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、６００ｎｍにおける濁度が０．５になるまで２８℃で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去し、菌体を洗浄するため５００ｍＬの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去した。この操作を２回繰り返した後、沈殿に２０ｍＬの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去した。沈殿に３ｍＬの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、４０μＬずつ１．５ｍＬ遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから−８０℃で保存した。
６．アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株へのｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡの導入
ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡプラスミドＤＮＡを調製し、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＢＡ４４０４）へエレクトロポレーションにより導入した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４のエレクトロポレーションコンピテント細胞４０μｌに発現プラスミド（２００μｇ／ｍｌ）１μｌを混合した懸濁液を、あらかじめ氷中で冷却した電極間距離１ｍｍのキュベットに注入し、パルス電場（１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）を印加した。直ちにＳＯＣ５００μｌを加え、２８℃にて３時間培養した後、カナマイシンを含むＬＢプレート培地に塗布し、２５℃で３日間培養し、ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムを得た。
７．ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株によるタバコ培養細胞（ＢＹ−２）の感染
形質転換タバコ培養細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ２（以下、ＢＹ−２と表すことがある。Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１８４，１６１−１６５）を使用し，タバコ培養細胞の培養は、Ｎａｇａｔａらの方法（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１８４，１６１−１６５）に従い、ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１８，１００−１２７）中のＫＨ２ＰＯ４を３７０ｍｇ／Ｌ、ｔｈｉａｍｉｎｅ ＨＣｌを１ｍｇ／Ｌに増量し、さらに最終濃度３％のｓｕｃｒｏｓｅおよび最終濃度０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加した改変ＬＳ培地て行った。
タバコ培養細胞の形質転換は、基本的にＡｎの方法い（Ａｎ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７９，５６８−５７０）に従った。カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬのＬＢ培地で２８℃にて１晩培養したｐＢＩ１２１ｃｖＨＩおよびｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むそれぞれのアグロバテリウム培養液１００μＬと、培養４日目のタバコ培養細胞懸濁液４ｍＬをシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃で２晩、暗所下で静置して共存培養した。
アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を５０ｍＬの遠心管に移して、さらにカナマイシン１００ｍｇ／Ｌとカルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを含む改変ＬＳ培地を２０ｍＬ加えて、遠心（１０００ｒｐｍ，４分）し、上清を除去した。直ちに、新しい改変ＬＳ培地２５ｍＬを入れて遠心（１０００ｒｐｍ，４分）し、細胞を洗浄した。この操作を３回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞をカナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌの入った改変ＬＳ寒天培地にまき、２５℃で暗黒下に静置して培養した。約２−３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。最後に、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを加えた改変ＬＳ培地３０ｍＬに移し、継代培養を行った。
８．培養細胞でのｃｖＨＡＳの生産および抽出
改変ＬＳ培地中で７日間培養したＢＹ−２細胞懸濁液１５０ｍＬを遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０分）行い、細胞と培地に分離した。細胞を３０ｍｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）に懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、さらにその上清を超遠心分離（ｘ１００，０００ｇ、１時間）することによりｃｖＨＡＳを含む膜画分を抽出し、３００μｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）再溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液とした。
９．培養細胞が生産したヒアルロン酸の定量
培養細胞が生産したヒアルロン酸を定量するためのサンプルは、上記の細胞培養後に細胞と分離した培地、ｃｖＨＡＳ抽出液およびヒアルロニダーゼで処理したｃｖＨＡＳ抽出液を用いた。ｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡを含む培養細胞それぞれ２株を測定した。細胞と分離した培地は、凍結乾燥により２倍に濃縮した。ヒアルロニダーゼ消化は、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．３）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。それぞれのサンプルを９０℃にて３分間加熱後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、ヒアルロン酸の定量に上清を用いた。ヒアルロン酸の定量は、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いて行った。その結果を表２に示す。
表２において、クロレラウイルスＣＶＫＡ１株由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を含むベクターにより形質転換したＢＹ−２由来のサンプルをｃｖＨＡＳ−ＫＡと表し、２回の反復を行い、それぞれをｃｖＨＡＳ−ＫＡ１およびｃｖＨＡＳ−ＫＡ２と表した。クロレラウイルスＣＶＨＩ１株由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を含むベクターにより形質転換したＢＹ−２由来のサンプルをｃｖＨＡＳ−ＨＩと表し、２回の反復を行い、それぞれをｃｖＨＡＳ−ＨＩ１およびｃｖＨＡＳ−ＨＩ２と表した。ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）に付属していた標準ヒアルロン酸の測定結果を「ヒアルロン酸（スタンダード）」として記載した。（）内の濃度は標準ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度を表す。
表２に示されるように、それぞれのラインの培養細胞がヒアルロン酸を生産していることが確認された。
１０．培養細胞生産ｃｖＨＡＳの活性測定
植物培養細胞で生産されたｃｖＨＡＳ抽出液を用いてヒアルロン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定する方法でヒアルロン酸合成酵素活性を評価した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏヒアルロン酸合成は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌおよび１０μｌのＨＡＳ抽出液を含み全量５０μｌに調整した反応液を３７℃で０、２時間反応させた。反応後、９０℃にて３分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定には、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。ＨＡＳ抽出液のタンパク質濃度はＢＳＡを標準タンパク質として用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド）により測定した。その結果を表３に示す。
表３に示されるように、植物培養細胞で生産されたｃｖＨＡＳは、ｃｖＨＡＳ−ＨＩ、ｃｖＨＡＳ−ＫＡともにヒアルロン酸合成酵素活性を持つことが明らかになった。他の由来のヒアルロン酸合成酵素でも植物細胞でヒアルロン酸の合成が可能であることが示唆される。
１１．形質転換タバコ培養細胞が生産したヒアルロン酸含有画分の調製
カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカルベニシリン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＬＳ培地中で１０日間培養した形質転換ＢＹ−２の細胞懸濁液１５０ｍＬを遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０分）し、上清の培地を回収した。この培地を限外濾過し（ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０）、約４分の１に濃縮した後、２倍量のエタノールを添加して、析出物を遠心で回収した。析出物を水に溶解し、ヒアルロン酸プレートにより、溶解物中のヒアルロン酸を検出し、ヒアルロン酸含有画分が得られていることを確認した。さらに、このヒアルロン酸含有画分に、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に溶解したウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）溶液を等量加え、最終濃度２ｋＵ／ｍｌにて３７℃でヒアルロニダーゼ反応を開始した。一定時間の反応開始後に９５℃にて２０分間加熱し、反応を停止した。反応液を遠心して得られた上清をＨＰＬＣによる分析に供した。ＨＰＬＣは、基本的にＴａｗａｄａらの方法（Ｔａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２，４２１−４２６）に従い、アミノカラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＮＨ２（４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）を用い、サンプル５０μｌを５０℃にて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＮａＨ２ＰＯ４を移動相としたグラジェント溶出（２０→５００ｍＭ、３０分）により、生成物をＵＶ（２１０ｎｍ）で検出した。図１は、上述の抽出物のヒアルロニダーゼ処理液のＨＰＬＣの測定結果を示す。反応開始１時間後にはヒアルロニダーゼの作用により生成した低分子量ヒアルロン酸混合物と推定される複数の糖のピークが検出された。ヒアルロニダーゼ処理の時間経過と共に、生成した低分子量ヒアルロン酸混合物の分子量は低分子側に移行し、反応開始２４時間後には、初期の混合物のピークのほとんどは消失し、最終生成物の４糖および６糖のみが検出された。ヒアルロニダーゼ処理の時間経過と共に見られるこのようなオリゴ塘の生成パターンは、ヒアルロン酸のヒアルロニダーゼ処理と同様の結果であり、ＢＹ−２の培地から抽出された画分に高分子量のヒアルロン酸が含有されていることが示された。
１２．ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株によるタバコの感染
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）の形質転換は、アグロバクテリウムを用いるリーフディスク法（山田康之、岡田吉美編、「植物バイオテクノロジーＩＩ」、東京化学同人、１９９１年）に従った。カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬのＬＢ培地で２８℃にて１晩培養したｐＢＩ１２１ｃｖＨＩおよびｐＢＩ１２１ｃｖＫＡをそれぞれ含むアグロバテリウムの培養液に、滅菌処理したタバコのリーフディスクを３分間浸した後、濾紙上で余分な菌体を除去し、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）無機塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１５，４７３）に３％スクロース、Ｂ５ビタミン、１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸および０．３％ゲランガムを添加し、ｐＨ５．７に調整した分化培地に静置し、２８℃にて２日間、暗所で静置した。感染させたリーフディスクを滅菌水で３回洗浄し、濾紙上で余分な水分を除去した後、抗生物質としてカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクラフォラン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む分化培地に静置し、２５℃にて１６時間光条件下でカルスの形成を誘導した。誘導開始３週間後に、形態的に正常なシュートを選び、茎葉を含んだ状態で切り出し、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクラフォラン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む発根培地（ＭＳ無機塩、３％スクロース、Ｂ５ビタミンおよび０．３％ゲランガム、ｐＨ５．７）に移し、２５℃にて１６時間光条件下で発根を誘導した。２週間後に発根が認められたシュートを新鮮な発根培地に移し替え、茎葉の生育した複数個のラインが得られた。
１３．形質転換タバコの生産したヒアルロン酸の定量
上述のアグロバクテリウムによる感染で得られた６ラインの形質転換タバコの葉約１００ｍｇを２ｍｌ容チューブに移し、２００μｌのバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）を加えて懸濁し、４００ｍｇのジルコニアビーズ（直径２ｍｍ）を加えた。ビードスマッュ（和研薬ＢＳ−１２）を用いて、チューブを振とう攪拌処理することにより、タバコの葉を破砕処理した（２，５００ｒｐｍ，５分）。破砕処理後の液を遠心し（１５，０００ｒｐｍ，１０分）、上清を粗抽出液として回収した。粗出液を水で１０倍に希釈し、測定サンプルとして用いた。ヒアルロン酸の定量は、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いて行った。その結果を表２に示す。尚、タバコ野生株（ｗｉｌｄ）およびｍｏｃｋ（ｐＢＩ１２１で形質転換したタバコ）の葉を用いて同様の破砕処理を行い、比較のサンプルとして用た。ｃｖＨＡＳ形質転換タバコのうち、ｃｖＨＡＳ−ＫＡの１ライン（Ｎｏ．２）にはヒアルロン酸が有意に検出されたの結果から、形質転換で得られたタバコ植物体においてもヒアルロン酸が生産されていることが確認さた。
１４．形質転換タバコにおけるｃｖＨＡＳの転写の確認
上述のアグロバクテリウムによる感染で得られた６ラインの形質転換タバコの葉からトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付のプロトコールに従った。液体窒素で十分に冷却した乳鉢に約１００ｍｇの葉を移し、液体窒素中で乳棒で粉末状に破砕した。直ちに、１％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＢｕｆｆｅｒ ＲＦＴ４５０μｌに破砕細胞を懸濁し、ボルテックスミキサーで撹拌した。この破砕液をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに移し、遠心により、細胞破片の除去とホモジナイズを行った。得られた破砕液の上清に半分量のエタノールを添加し、ＲＮｅａｓｙミニカラムに移した。以後、プロトコールに従い、洗浄および溶出の操作を順次行い、トータルＲＮＡを抽出した。尚、タバコ野生株（ｗｉｌｄ）およびｍｏｃｋ（ｐＢＩ１２１で形質転換したタバコ）の葉を用いて同様の破砕処理を行い、比較のサンプルとして用いた。
次に、得られたトータルＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（東洋紡）を用い、添付のプロトコールに従い、上述の１μｇのトータルルＲＮＡおよびｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒから合成した。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を用い、（９５℃ ３０秒、５９℃ ２秒、７４℃ ３０秒）３０サイクルの反応プログラムで行った。プライマーとして、５’側プライマー（配列番号３）および３’側プライマー（配列番号４）を用いた。図２は、ＲＴ−ＰＣＲの反応液のアガロース電気泳動の結果を示す。ｃｖＨＡＳ形質転換タバコのうち、ヒアルロン酸生産能の認められたｃｖＨＡＳ−ＫＡの１ライン（Ｎｏ．２）にのみ、相当サイズの明瞭な増幅バンドが検出され、ｃｖＨＡＳ遺伝子の転写が確認された。
クロレラウイルスヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｃｖＨＡＳ）をＰＣＲにより単離するためにＰＣＲプライマーを作製した。プライマーは、既に明らかになっているクロレラウイルスゲノム配列情報（Ｋｕｔｉｓｈ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２３，３０３−３１７）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１２，１３４−１５０）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３７，３６０−３７７）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０６，３３９−３５２）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１６，１０２−１２３）およびクロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成遺伝子の同定情報（Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７，１５−２３）（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１８００−１８０３）を参考として設計し、かつ発現ベクターへの導入に必要な制限酵素部位を付加したものを作製した。制限酵素サイトは５’側プライマーにはＮｄｅＩ部位、３’側プライマーにはＸｂａＩ部位を付加した。
ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用い、９４℃ ２分、（９４℃ １５秒、４０℃ ３０秒、６８℃ １分）２サイクル、（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分）２５サイクルの反応プログラムで行った。得られたＰＣＲ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（以後ｐＢＳと省略する）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンＡＴＧ部位がＮｄｅＩサイトになるように改変した大腸菌発現ベクター（改変ｐＢＳ）のＮｄｅＩとＸｂａＩ部位に挿入した。挿入された断片を、シークエンサーによりＣＶＨＩ１株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｃｖＨＡＳ−ＨＩ（配列番号１）およびＣＶＫＡ１株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｃｖＨＡＳ−ＫＡ（配列番号２）のＤＮＡ配列を決定した。
２．ｃｖＨＡＳの大腸菌での発現および抽出
ｃｖＨＡＳ−ＨＩまたはｃｖＨＡＳ−ＫＡを含む大腸菌ＪＭ１０９を３７℃で一晩培養した培養液を種菌とし、５００ｍＬ坂口フラスコに５０ｍＬのＬＢ培地（０．２％グルコースおよびアンピシリンを含む）と５００μＬの種菌を添加し、２０℃で約７２時間培養した。ｃｖＨＡＳの発現誘導のためのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は培養開始と同時に添加した。培養終了後、培養液の遠心分離を行うことにより菌体を回収し、３０ｍｌのバッファー（２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジンおよび１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む）で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、さらにその上清を超遠心分離（ｘ１００，０００ｇ、１時間）することによりｃｖＨＡＳを含む膜画分を抽出し、２００μｌのバッファー（上記と同様）で再溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液とした。
３．ｃｖＨＡＳ活性測定
大腸菌で生産されたｃｖＨＡＳ抽出液を用いてヒアルロン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定する方法でヒアルロン酸合成酵素活性を表すこととした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏヒアルロン酸合成は、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ２−ＭＥ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌおよび１０μｌのＨＡＳ抽出液を含み全量５０μｌに調整した反応液を３７℃で２時間、４時間および２０時間（Ｏ／Ｎ）反応させた。反応後、９０℃にて３分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。
ヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定試薬のヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。
ヒアルロン酸プレート「中外」は、ヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチ結合型ヒアルロン酸定量方法である。マイクロタイタープレート上に固定化したヒアルロン酸結合タンパク質に検体中のヒアルロン酸を結合させた後、酵素標識ヒアルロン酸結合タンパク質を結合させ、サンドイッチを形成させる。引き続き、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を加えると、標識酵素のペルオキシダーゼの作用でＴＭＢが酸化されて呈色する。反応停止液を添加後、プレートリーダーで波長４５０ｎｍ、対照波長６２０ｎｍで吸光度を測定（Ａ４５０）することにより、サンプルのヒアルロン酸濃度が評価できる。
本キットに付属している標準ヒアルロン酸溶液を用いて標準曲線を作製し、サンプル中に含まれているはサンプルの吸光度からヒアルロン酸を含まない溶液（Ｍｏｃｋ）の吸光度を引いた値（△Ａ４５０）を用いてヒアルロン酸濃度を決定し、表１でヒアルロン酸濃度（ＨＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ））として記載した。
ヒアルロン酸合成酵素活性の表示においては、合成されたヒアルロン酸量をモルとして表示するために、以下のような計算を行い変換した。ヒアルロン酸プレート「中外」に付随していた標準ヒアルロン酸（濃度１００ｎｇ／ｍｌ）の吸光度をＡとして、各サンプルの吸光度をＢとすると総反応液量が５０μｌであることから、それぞれのヒアルロン酸合成酵素活性は
ＢＸ１００ｎｇ／ｍｌ÷ＡＸ５０μｌ÷１０００＝Ｃｎｇ／反応時間
と算出した。
ヒアルロン酸の構成単位である（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）の分子量は３９８．３５であるので、（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）ｎの分子量は３９８．５Ｘｎ−１８Ｘ（ｎ−１）で表すことができるので、
ｎ＝１０の場合、（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ）１０の分子量は
３９８．８Ｘ１０−１８Ｘ（１０−１）＝３８２１．５Ｄａと算出される。
従って、それぞれの反応時間でヒアルロン酸に取り込まれたＧｌｃＡの分子数は
Ｃ÷３８２１．５Ｘｎ（今回はｎ＝１０）Ｘ１０００＝Ｄｐｍｏｌ
と算出した。
また、抽出液のタンパク質濃度はＢＳＡを標準タンパク質として用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド）により測定した結果を表１でタンパク量として記載した。
またヒアルロン酸合成酵素活性は、ヒアルロン酸抽出液に含まれている１ｍｇあたりのタンパク質が１時間あたりに合成したヒアルロン酸に取り込まれたＧｌｃＡの分子数（ｐｍｏｌ）を計算することにより表１でＨＡ活性として表示した。
その結果を表１に示す。
表１において、ヒアルロン酸合成酵素を含まないベクターにより形質転換した大腸菌由来の抽出液をＭｏｃｋと表した。ストレプトコッカス ピオゲネス由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を持つベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸合成酵素抽出液をｓｐＨＡＳと表した。クロレラウイルスＣＶＫＡ１株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸合成酵素抽出液をｃｖＨＡＳ−ＫＡと表し、２回の反復を行ったのでそれぞれをｃｖＨＡＳ−ＫＡ１およびｃｖＨＡＳ−ＫＡ２と表した。クロレラウイルスＣＶＨＩ１株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した大腸菌由来のヒアルロン酸酵素抽出液をｃｖＨＡＳ−ＨＩと表し、２回の反復を行ったのでそれぞれをｃｖＨＡＳ−ＨＩ１およびｃｖＨＡＳ−ＨＩ２と表した。
ＨＡＳ活性の表現方法は、特開２０００−４８８６、Ｉｔａｎｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９８７５−９８７８、Ｔｌａｐａｋ−Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｖ．Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４２４６−４２５３等に表現された方法と同様である。
４．ｃｖＨＡＳ植物発現用ベクターの作製
上記３．で作製しＨＡＳ活性を確認したｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより制限酵素サイトを付加したＰＣＲプライマーを用いてｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’側は改変ｐＢＳ上の配列に制限酵素部位ＤｒａＩを付加させたプライマーを設計し、３’側は改変ｐＢＳ上のマルチクローニングサイト中の制限酵素サイト部位ＳａｃＩを含む領域をプライマーとして設計した。
以上より、ｃｖＨＡＳ−ＨＩを含むｐＢＩ１２１プラスミド（ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩ）とｃｖＨＡＳ−ＫＡを含むｐＢＩ１２１プラスミド（ｐＢＩ１２１ｃｖＫＡ）が作製できた。
５．エレクトロポレーションコンピテントセルの作製
エレクトロポレーションコンピテントセルは、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＢＡ４４０４）単一コロニーを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、２８℃で１晩振盪培養した。この培養液を、５００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、６００ｎｍにおける濁度が０．５になるまで２８℃で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去し、菌体を洗浄するため５００ｍＬの滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去した。この操作を２回繰り返した後、沈殿に２０ｍＬの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）により集菌して上清を除去した。沈殿に３ｍＬの冷却した滅菌１０％グリセロール溶液を加えて懸濁し、４０μＬずつ１．５ｍＬ遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから−８０℃で保存した。
６．アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株へのｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡの導入
ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡプラスミドＤＮＡを調製し、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＢＡ４４０４）へエレクトロポレーションにより導入した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４のエレクトロポレーションコンピテント細胞４０μｌに発現プラスミド（２００μｇ／ｍｌ）１μｌを混合した懸濁液を、あらかじめ氷中で冷却した電極間距離１ｍｍのキュベットに注入し、パルス電場（１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）を印加した。直ちにＳＯＣ５００μｌを加え、２８℃にて３時間培養した後、カナマイシンを含むＬＢプレート培地に塗布し、２５℃で３日間培養し、ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムを得た。
７．ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株によるタバコ培養細胞（ＢＹ−２）の感染
形質転換タバコ培養細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ２（以下、ＢＹ−２と表すことがある。Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１８４，１６１−１６５）を使用し，タバコ培養細胞の培養は、Ｎａｇａｔａらの方法（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１８４，１６１−１６５）に従い、ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１８，１００−１２７）中のＫＨ２ＰＯ４を３７０ｍｇ／Ｌ、ｔｈｉａｍｉｎｅ ＨＣｌを１ｍｇ／Ｌに増量し、さらに最終濃度３％のｓｕｃｒｏｓｅおよび最終濃度０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加した改変ＬＳ培地て行った。
タバコ培養細胞の形質転換は、基本的にＡｎの方法い（Ａｎ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，７９，５６８−５７０）に従った。カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬのＬＢ培地で２８℃にて１晩培養したｐＢＩ１２１ｃｖＨＩおよびｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むそれぞれのアグロバテリウム培養液１００μＬと、培養４日目のタバコ培養細胞懸濁液４ｍＬをシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃で２晩、暗所下で静置して共存培養した。
アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を５０ｍＬの遠心管に移して、さらにカナマイシン１００ｍｇ／Ｌとカルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを含む改変ＬＳ培地を２０ｍＬ加えて、遠心（１０００ｒｐｍ，４分）し、上清を除去した。直ちに、新しい改変ＬＳ培地２５ｍＬを入れて遠心（１０００ｒｐｍ，４分）し、細胞を洗浄した。この操作を３回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた培養細胞をカナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌの入った改変ＬＳ寒天培地にまき、２５℃で暗黒下に静置して培養した。約２−３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。最後に、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを加えた改変ＬＳ培地３０ｍＬに移し、継代培養を行った。
８．培養細胞でのｃｖＨＡＳの生産および抽出
改変ＬＳ培地中で７日間培養したＢＹ−２細胞懸濁液１５０ｍＬを遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０分）行い、細胞と培地に分離した。細胞を３０ｍｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）に懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、さらにその上清を超遠心分離（ｘ１００，０００ｇ、１時間）することによりｃｖＨＡＳを含む膜画分を抽出し、３００μｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）再溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液とした。
９．培養細胞が生産したヒアルロン酸の定量
培養細胞が生産したヒアルロン酸を定量するためのサンプルは、上記の細胞培養後に細胞と分離した培地、ｃｖＨＡＳ抽出液およびヒアルロニダーゼで処理したｃｖＨＡＳ抽出液を用いた。ｃｖＨＡＳ−ＨＩとｃｖＨＡＳ−ＫＡを含む培養細胞それぞれ２株を測定した。細胞と分離した培地は、凍結乾燥により２倍に濃縮した。ヒアルロニダーゼ消化は、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．３）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ｃｖＨＡＳ抽出液に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。それぞれのサンプルを９０℃にて３分間加熱後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、ヒアルロン酸の定量に上清を用いた。ヒアルロン酸の定量は、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いて行った。その結果を表２に示す。
表２において、クロレラウイルスＣＶＫＡ１株由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を含むベクターにより形質転換したＢＹ−２由来のサンプルをｃｖＨＡＳ−ＫＡと表し、２回の反復を行い、それぞれをｃｖＨＡＳ−ＫＡ１およびｃｖＨＡＳ−ＫＡ２と表した。クロレラウイルスＣＶＨＩ１株由来のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を含むベクターにより形質転換したＢＹ−２由来のサンプルをｃｖＨＡＳ−ＨＩと表し、２回の反復を行い、それぞれをｃｖＨＡＳ−ＨＩ１およびｃｖＨＡＳ−ＨＩ２と表した。ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）に付属していた標準ヒアルロン酸の測定結果を「ヒアルロン酸（スタンダード）」として記載した。（）内の濃度は標準ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度を表す。
１０．培養細胞生産ｃｖＨＡＳの活性測定
植物培養細胞で生産されたｃｖＨＡＳ抽出液を用いてヒアルロン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定する方法でヒアルロン酸合成酵素活性を評価した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏヒアルロン酸合成は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、２ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌおよび１０μｌのＨＡＳ抽出液を含み全量５０μｌに調整した反応液を３７℃で０、２時間反応させた。反応後、９０℃にて３分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定には、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。ＨＡＳ抽出液のタンパク質濃度はＢＳＡを標準タンパク質として用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド）により測定した。その結果を表３に示す。
１１．形質転換タバコ培養細胞が生産したヒアルロン酸含有画分の調製
カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカルベニシリン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＬＳ培地中で１０日間培養した形質転換ＢＹ−２の細胞懸濁液１５０ｍＬを遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０分）し、上清の培地を回収した。この培地を限外濾過し（ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０）、約４分の１に濃縮した後、２倍量のエタノールを添加して、析出物を遠心で回収した。析出物を水に溶解し、ヒアルロン酸プレートにより、溶解物中のヒアルロン酸を検出し、ヒアルロン酸含有画分が得られていることを確認した。さらに、このヒアルロン酸含有画分に、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に溶解したウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ）溶液を等量加え、最終濃度２ｋＵ／ｍｌにて３７℃でヒアルロニダーゼ反応を開始した。一定時間の反応開始後に９５℃にて２０分間加熱し、反応を停止した。反応液を遠心して得られた上清をＨＰＬＣによる分析に供した。ＨＰＬＣは、基本的にＴａｗａｄａらの方法（Ｔａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２，４２１−４２６）に従い、アミノカラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＮＨ２（４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）を用い、サンプル５０μｌを５０℃にて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＮａＨ２ＰＯ４を移動相としたグラジェント溶出（２０→５００ｍＭ、３０分）により、生成物をＵＶ（２１０ｎｍ）で検出した。図１は、上述の抽出物のヒアルロニダーゼ処理液のＨＰＬＣの測定結果を示す。反応開始１時間後にはヒアルロニダーゼの作用により生成した低分子量ヒアルロン酸混合物と推定される複数の糖のピークが検出された。ヒアルロニダーゼ処理の時間経過と共に、生成した低分子量ヒアルロン酸混合物の分子量は低分子側に移行し、反応開始２４時間後には、初期の混合物のピークのほとんどは消失し、最終生成物の４糖および６糖のみが検出された。ヒアルロニダーゼ処理の時間経過と共に見られるこのようなオリゴ塘の生成パターンは、ヒアルロン酸のヒアルロニダーゼ処理と同様の結果であり、ＢＹ−２の培地から抽出された画分に高分子量のヒアルロン酸が含有されていることが示された。
１２．ｐＢＩ１２１ｃｖＨＩとｐＢＩ１２１ｃｖＫＡを含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株によるタバコの感染
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＳＲ−１）の形質転換は、アグロバクテリウムを用いるリーフディスク法（山田康之、岡田吉美編、「植物バイオテクノロジーＩＩ」、東京化学同人、１９９１年）に従った。カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬのＬＢ培地で２８℃にて１晩培養したｐＢＩ１２１ｃｖＨＩおよびｐＢＩ１２１ｃｖＫＡをそれぞれ含むアグロバテリウムの培養液に、滅菌処理したタバコのリーフディスクを３分間浸した後、濾紙上で余分な菌体を除去し、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）無機塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１５，４７３）に３％スクロース、Ｂ５ビタミン、１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸および０．３％ゲランガムを添加し、ｐＨ５．７に調整した分化培地に静置し、２８℃にて２日間、暗所で静置した。感染させたリーフディスクを滅菌水で３回洗浄し、濾紙上で余分な水分を除去した後、抗生物質としてカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクラフォラン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む分化培地に静置し、２５℃にて１６時間光条件下でカルスの形成を誘導した。誘導開始３週間後に、形態的に正常なシュートを選び、茎葉を含んだ状態で切り出し、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクラフォラン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む発根培地（ＭＳ無機塩、３％スクロース、Ｂ５ビタミンおよび０．３％ゲランガム、ｐＨ５．７）に移し、２５℃にて１６時間光条件下で発根を誘導した。２週間後に発根が認められたシュートを新鮮な発根培地に移し替え、茎葉の生育した複数個のラインが得られた。
１３．形質転換タバコの生産したヒアルロン酸の定量
上述のアグロバクテリウムによる感染で得られた６ラインの形質転換タバコの葉約１００ｍｇを２ｍｌ容チューブに移し、２００μｌのバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ２ＭＥを含む）を加えて懸濁し、４００ｍｇのジルコニアビーズ（直径２ｍｍ）を加えた。ビードスマッュ（和研薬ＢＳ−１２）を用いて、チューブを振とう攪拌処理することにより、タバコの葉を破砕処理した（２，５００ｒｐｍ，５分）。破砕処理後の液を遠心し（１５，０００ｒｐｍ，１０分）、上清を粗抽出液として回収した。粗出液を水で１０倍に希釈し、測定サンプルとして用いた。ヒアルロン酸の定量は、ヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いて行った。その結果を表２に示す。尚、タバコ野生株（ｗｉｌｄ）およびｍｏｃｋ（ｐＢＩ１２１で形質転換したタバコ）の葉を用いて同様の破砕処理を行い、比較のサンプルとして用た。ｃｖＨＡＳ形質転換タバコのうち、ｃｖＨＡＳ−ＫＡの１ライン（Ｎｏ．２）にはヒアルロン酸が有意に検出されたの結果から、形質転換で得られたタバコ植物体においてもヒアルロン酸が生産されていることが確認さた。
上述のアグロバクテリウムによる感染で得られた６ラインの形質転換タバコの葉からトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付のプロトコールに従った。液体窒素で十分に冷却した乳鉢に約１００ｍｇの葉を移し、液体窒素中で乳棒で粉末状に破砕した。直ちに、１％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＢｕｆｆｅｒ ＲＦＴ４５０μｌに破砕細胞を懸濁し、ボルテックスミキサーで撹拌した。この破砕液をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに移し、遠心により、細胞破片の除去とホモジナイズを行った。得られた破砕液の上清に半分量のエタノールを添加し、ＲＮｅａｓｙミニカラムに移した。以後、プロトコールに従い、洗浄および溶出の操作を順次行い、トータルＲＮＡを抽出した。尚、タバコ野生株（ｗｉｌｄ）およびｍｏｃｋ（ｐＢＩ１２１で形質転換したタバコ）の葉を用いて同様の破砕処理を行い、比較のサンプルとして用いた。
次に、得られたトータルＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行った。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（東洋紡）を用い、添付のプロトコールに従い、上述の１μｇのトータルルＲＮＡおよびｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒから合成した。１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を用い、（９５℃ ３０秒、５９℃ ２秒、７４℃ ３０秒）３０サイクルの反応プログラムで行った。プライマーとして、５’側プライマー（配列番号３）および３’側プライマー（配列番号４）を用いた。図２は、ＲＴ−ＰＣＲの反応液のアガロース電気泳動の結果を示す。ｃｖＨＡＳ形質転換タバコのうち、ヒアルロン酸生産能の認められたｃｖＨＡＳ−ＫＡの１ライン（Ｎｏ．２）にのみ、相当サイズの明瞭な増幅バンドが検出され、ｃｖＨＡＳ遺伝子の転写が確認された。
【配列表】
Claims (20)
- （１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
- （１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程、（２）形質転換して得られた形質転換体を生育する工程、（３）該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を有する、ヒアルロン酸の製造方法。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞の作製方法。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換する工程を有する、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物の作製方法。
- 発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物である、請求項４に記載の方法。
- ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られるヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- 植物体が、被子植物、裸子植物、シダ植物及びコケ植物からなる群から選ばれるいずれかの植物体である、請求項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- 器官が、根、茎、塊茎、葉、花器、塊根、種子及び茎頂からなる群から選ばれる１種又は２種以上の器官である、請求項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- 組織が、表皮、師部、柔組織、木部及び維管束からなる群から選ばれる１種又は２種以上の組織である、請求項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- 発現用組換えベクターが、（１）（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び（２）器官特異的又は組織特異的プロモーターを含む発現用組換えベクターであって、得られる形質転換植物が、器官特異的又は組織特異的ヒアルロン酸生産能を有する形質転換値物である、請求項９に記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物細胞。
- （ｉ）ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡ又は（ｉｉ）ヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて植物体を形質転換することにより得られる、ヒアルロン酸合成酵素を生産する形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、請求項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
- ヒアルロン酸合成酵素が脊椎動物由来又は微生物由来ヒアルロン酸合成酵素である、請求項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、請求項８又は１４に記載の形質転換植物細胞。
- ヒアルロン酸合成酵素がクロレラウィルス由来ヒアルロン酸合成酵素である、請求項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織。
- 請求項８又は１４に記載の形質転換植物細胞或いは請求項９〜１３、１５のいずれかに記載の形質転換植物又はそれと同じ性質を有する子孫又はそれらの器官又はそれらの組織によって生産されたヒアルロン酸。
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