CZ299825B6 - Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná - Google Patents

Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná Download PDF

Info

Publication number
CZ299825B6
CZ299825B6 CZ20001680A CZ20001680A CZ299825B6 CZ 299825 B6 CZ299825 B6 CZ 299825B6 CZ 20001680 A CZ20001680 A CZ 20001680A CZ 20001680 A CZ20001680 A CZ 20001680A CZ 299825 B6 CZ299825 B6 CZ 299825B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
plant
thr
acid molecule
leu
Prior art date
Application number
CZ20001680A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20001680A3 (cs
Inventor
G. Heyer@Arnd
W. Hellwege@Elke
Gritscher@Dominique
Original Assignee
Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. filed Critical Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Publication of CZ20001680A3 publication Critical patent/CZ20001680A3/cs
Publication of CZ299825B6 publication Critical patent/CZ299825B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymeru, jejichž molekuly obsahují v prumeru více než 20 fruktosylových zbytku, pricemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny definované v popisu. Dále se toto rešení týká vektoru obsahujících tyto molekuly nukleové kyseliny, hostitelských bunek transformovaných temito molekulami nukleové kyseliny, zejména transgenních rostlinných bunek, rostlinných pletiv a rostlin, dále množitelského materiálu a skliznových produktu, a zpusobu prípravy techto transformovaných hostitelských bunek. Krome toho se týká zpusobu prípravy FFT a FFT kódované molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, výroby transgenních rostlin, které syntetizují inulin s dlouhým retezcem díky zavedení molekul DNA kódujících FFT; zpusobu výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v prumeru více než 20 fruktosylových zbytku, v ruzných hostitelských organismech, zejména rostlinách, a také zpusobu in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v prumeru více než 20 fruktosylovýchzbytku, pomocí FFT, a použití tohoto inulinu.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou fruktosyl-transferázovou (FFT) aktivitu. Dále se tento vynález týká vektorů obsahujících tyto molekuly nukleové kyseliny, hostitelských buněk transformovaných těmito molekulami nukleové kyseliny, zejména Iransgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, dále množitelského materiálu a sklizňových produktů, a dále způsobu přípravy těchto transformovai> ných hostitelských buněk. Kromě toho se vynález týká způsobu přípravy FFT a FFT kódované molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu. Dále sc předmětný vynález týká produkce transgenních rostlin, kterc syntetizují inulin s dlouhým řetězcem díky zavedení molekul DNA kódujících FFT. Předkládaný vynález se také týká způsobu výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož zbytky obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, v různých hostitelských organis20 mech, zejména rostlinách, způsobu in vifro výroby tohoto vysokomolekulárního inulinu pomocí FFT podle vynálezu, a použití tohoto vysokomolekulárního inulinu.
Dosavadní stav techniky
Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají velmi široké spektrum aplikací, například jich lze užít ke zvýšeni viskozity vodných systémů, jako detergentů. jako suspendačních činidel nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro kom plexo vání. ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylovc póly sacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože to jsou biologicky odbouratelnc (biodegradovatclné).
Kromě jejich využití jako obnovitelné suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylovc polymery také zajímavé jako potravinová aditiva, například jako umělá sladidla. Pro různé aplikace jsou potřeba polymery s různou délkou řetězce. Zatímco polymery s krátkým nebo středně dlouhým řetězcem jsou výhodné v potravinářském průmyslu, polymery s vysokým stupněm polymerizace (DP) jsou užitečné pro technické účely, jakoje například výroba surfaklantů (povrchově aktivních látek).
Doposud by ly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách pomocí exprese enzymů fruktosyltransferáz bakteriálního původu. Většina bakteriálních fruktosyltransferáz syntetizuje levan, fruktosylový polymer vázaný β-2.6 vazbou, který má četná β-2,1 větvení. Toto větvení představuje z technického hlediska značnou nevýhodu a proto je levan jakožto technický materiál podstatně měně významný než inulin.
Dosud je znám pouze jeden bakteriální gen. jehož produkt se účastní syntézy inulinu, a sice gen ftf ze Strepfoeoccus mutans. V principu je možné exprimovat gen v rostlinách, pokud by byl získán a upraven metodami genového inženýrství. Avšak výtěžek inulinu z transgenních rostlin je tak nízký, že ekonomicky výhodné vy užití takových transgenních rostlin nepřipadá v úvahu.
Dále je také znám způsob přípravy transgenních rostlin exprimu j ících íruktosyltransferázy z řie litin (hus tuberosus. Exprese těchto genů v iransgenních rostlinách vede k tvorbě inulinu s průměrným stupněm polymerizace DP - 6 až DP = 10. Polymery s tímto stupněm polymerizace nelze považovat za inulin s dlouhým řetězcem. Inulin s průměrným stupněm polymerizace DP - ó až DP - 10 však není vhodný pro většinu technických aplikací.
- 1 CZ 299825 B6
Způsoby produkce inulinu s dlouhým řetězcem v rostlinách nebo způsoby přípravy vhodných enzymů pro syntézu inulinu nejsou dosud známy.
Patentová přihláška PCT/US89/02729 popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhovalo použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně ?. Aerobacíer levanicum, Streptococcus safivarius a Bacillus subtiiis, nebo dextransacharózy z Leuconostoc wesenleroides. Avšak nikde nebyla popsána ani produkce aktivních enzymů, ani levanu či dextranu a ani příprava transgenních rostlin. Patentová přihláška io PCT/EP93/02110 popisuje způsob produkce transgenních rostlin cxprimujících gen Ise levansacharázy z gram negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny. kterc obsahují gen sacB zBacittus snbíilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. Transgenní rostliny exprimující gen SacB tvoří rozvětvený levan. Transgenní rostliny exprimující gen ftf syntetizují vysokomolekulúrní inu lin, avšak výnos je tak nízký, že ekonomické využití nepřichází v úvahu.
Patentová přihláška PCT/NE96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomoct těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanovcho profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Když se v transgenní rostlině exprimuje gen SST a EET. může se tvořit inulin. Průměrný stupeň polymerizace inulinu je však v rozmezí PL) “ 6 až PD = 10. Produkce vysokomolekulárního inulinu není možná způsoby, které byly popsány v PCT/NE96/00012. Přihláška PCT/EP97/02195 popisuje způsob přípravy transgenních rostlin tvořících inulin pomocí genu ftf ze Streptococcus mutans. Výtěžek vysokomolekulárního inulinu je však nízký, jak tomu bylo i u rostlin popsaných v přihlášce PCT/N E93/00279. Přihláška DE 19708 744.4 popisuje produkci inulinu s krátkým řetězcem pomocí enzymu, který vykazuje fruktosylpolymerázovou aktivitu. Inulin s krátkým řetězcem lze připravit v transgenních rostlinách. Výtěžek inulinu s krátkým řetězcem je velký a u brambor odpovídá buněčnému obsahu
5(i sacharózy. Produkce inulinu s dlouhým řetězcem však nebyla popsána.
Podle dosavadního stavu techniky byla syntéza inulinu u rostlin důkladně zkoumána (Pollock a Chatteron. Fructans, The biochemistry of Planíš, Vol. 14, J 988, Academie Press, str. 109 140). Avšak přirozeně se v rostlinách vyskytující inulin je inulin s krátkým řetězcem s maximálním
5? stupněm polymerizace přibližně DP = 35 (viz výše publikace Pollock a Chatteron). Syntéza a metabolismus fruktanu v rostlinách vyžadují aktivitu alespoň třech enzymu: sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST). která tvoří trisacharidovou kestózu. fruklanfruktosyltransferázy závislé na fruktanu (EET). která přenáší fruktosylový zbytek z fruktanových molekul s nej menším stupněm polymerizace DP = 3 (kestóza) na sacharózu a vy šší fruktany, a fruktan40 exohydrolázy (FEH). která odstraňuje fruktózové zbytky z fruktanových molekul. Není známo, zda rozdíly v průměrné molekulově hmotnosti inulinu z různých rostlinných druhů, např. 2 x 10' v případě AUiumcepa a 5 x 10' v případě Helium t uber ošum. vycházejí z rozdílných vlastností jejich SST, EET a ΓΕΗ, /tohoto důvodu není možně vzhledem k současným znalostem týkajícím sc syntézy inulinu u rostlin identifikovat vhodné DNA sekvence, jejichž pomocí by mohl být syntetizován vysokomotekulární inulin v rostlinách v ekonomicky zajímavých množstvích.
Proto je cílem předkládaného vy nálezu poskytnout molekulu nukleové ky seliny a způsoby, které umožní připravit geneticky modifikované organismy, zejména rostliny, schopné tvořit inulin s dlouhým řetězcem.
Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů provedení a de linován patentovými nároky.
Pod stata vynálezu
Podstatu předmětného vynálezu tvoří molekuly nukleové kyseliny kódující protein senzymatic5 kou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolckulámích fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměrů více než 20 fruktosylových zbytků, přičemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
(a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedeni nou jako id. č. 2 a id. č. 4:
(b) molekuly nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci uvedenou jako id. č. 1 nebo id. č. 3, nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci;
i? (c) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci přinejmenším z 80 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. č. 1;
(d) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci přinejmenším z 85 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. č. 2; a (e) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence zčásti (a), (b), (c) nebo (d).
Výhodná je podle vynálezu molekula nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci zvíce než 90% identickou s kódující sekvencí uvedenou v id, é. I. Dále je výhodná molekula nukleové kyseliny, kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 90 % identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2, podle ještě výhodnějšího provedení zvíce než 95 % identická s aminokyselinovou sekvencí id ě. 2, podle ještě výhodnějšího provedení zvíce než 97% identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2, a podle nejvýhodnějšího provedení zvíce w než 99 % identická s aminokyselinovou sekvencí id č. 2. Výhodně jc molekulou nukleové kyseliny molekula DNA, nej výhodněji molekula cDNA, nebo molekula RNA. Molekula nukleové kyseliny nejlépe pochází z artyčoku.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující libovolnou výše specifikova?5 nou molekulu nukleové kyseliny. Výhodný je vektor, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, výhodně jsou tyto regulační prvky odvozeny / promotoru B33 genu pa tat inu nebo promotoru 35S CaMV.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hostitelská buňka transformovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo libovolným výše specifikovaným vektorem. nebo buňka, která je odvozena z takové buňky, kde tyto odvozené buňky obsahují uvedenou molekulu nukleové kyseliny nebo uvedený vektor. Výhodně tato hostitelská buňka navíc obsahuje gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacliaróze.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy FFT. jehož podstata spočívá v tom. že se výše specifikované hostitelské buňky kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT a pak sc FFT izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží FFT kódovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo připravená výše definovaným způsobem.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk, zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiva transgen5? nich rostlin, jehož podstata spočívá vtom. že obsahuje krok, kdy se vnese molekula libovolné výše specifikované nukíeové kyseliny nebo výše specifikovaný vektor do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují libovolnou výše specifikovanou molekulu nukíeové kyseliny nebo vektor nebo které jsou připravitelná výše uvedeným způsobem nebo které jsou odvozeny z takových buněk, pletiv nebo rostlin, kde uvedená odvozená buňka, pletivo nebo rostlina obsahuje uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo uvedený vektor.
κι Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které navíc obsahují gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SS Γ) závislou na sacharóze.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlina obsahující výše specifikované rostlinné buňky nebo rostlinné pletivo.
Výhodně je touto rostlinou užitková rostlina, nejvýhodnějí se jedná o rostlinu obsahující sacharózu.
2d Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží množíte Iský materiál libovolné z výše specifikovaných rostlin obsahující libovolné z výše specifikovaných rostlinných buněk.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží sklizňovč produkty libovolných zvýše specifikovaných rostlin obsahující libovolné z výše specifikovaných rostlinných buněk.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby vysokomolekulárního inu!inu, jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (a) kultivaci libovolné výše specifikované transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva nebo rostliny za podmínek, které umožňují tvorbu F F1 a přeměnu 1 -kestózy. případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na tento vysokomolekulární inulin. a (b) izolování takto vytvořeného inulinu zkultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby vysokomolekulárního inulinu jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá
4o v tom, že zahrnuje (a) přivedení l-kcstózy nebo ekvivalentního substrátu do kontaktu s FFT za podmínek, které umožňují přeměnu na tento vysokomolekulární inulin, a (b) izolování takto vytvořeného inulinu.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, jehož podstata spočívá v tom, že sc sacharóza jakožto substrát přemění na vysokomolekulární inulin působením kombinace enzymů obsahující SS 1 a FFT.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití vysokomolekulárního inulinu, jehož molekul> obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, připravitelného z libovolné výše specifikované hostitelské buňky, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva, rostliny, množí55 telského materiálu nebo ze sklizňového produktu, nebo za pomoci libovolného z výše speciílko• 4 CZ 299825 B6 váných způsobů, k výrobě surfaktantú kc zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentu. suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo vázání vody.
Ve smyslu předkládaného vynálezu znamená, že enzym mající fruktosy Itransferázovou aktiv i5 tu (FFT) je protein, který je schopný katalvzovat vznik β-2,1 glykosidické a/nebo Q-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami, Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může pocházet z l-kestózy nebo íruktanového polymeru.
Vysokomolekulámím fruktosylovým polymerem se ve smyslu předkládaného vynálezu rozumí ío molekula obsahující v průměru více než 20. výhodně více než 25 a ještě výhodněji nejméně fruktosy lový ch zbytků. Navíc se ve smyslu předkládaného vynálezu vysokomolekulámím fruktosy lovým polymerem rozumí molekula obsahující v průměru méně než 3000, výhodněji méně než 300 a zvláště výhodně méně než 100 fruktosy lových zbytků. Fruktosy lové zbytky jsou spojeny buď β 2.1 nebo β-2.6-glykosidiekou vazbou. V případě inulinu jsou zbytky obecně i? navázány β-2. l-glykosidickými vazbami. V malé míře se vyskytují také β—2,6—glykosidické vazby, v méně než 5 % případů, výhodně méně než ve 3 %. výhodněji méně než v 1.5 % a nej výhodněji méně než v 0,5 % případů. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu
C-2 fruktosylového zbytku. V takovém případě fruktosylový polymer obsahuje také molekulu
?.o sacharózy.
Podle vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že během exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu se v transgenních rostlinách tvořila velká množství inulinu. lnu lín tvořený v rostlinách měl průměrný stupen polymerizace zřetelně vyšší než DP = 20. 1 o bylo neočekávané, neboť podobný enzym / Helianthus tuberosus se podílí na syntéze inulinu s průměrným stupněm polymerizaee nižším než DP = 20 v transgenních rostlinách (viz PCT/N 1.96/00012).
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA. tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genoniové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyse5 o líny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyčoku. nebo mohou být syntetizovány pomoct známých metod.
Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (vč např. Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY} zavést do molekul nukleové kyseliny podle vynálezu odlišné mutace, což vede k tomu, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Na jedné straně je tu možnost vytvářet deleční mutanty. kdy se tvoří molekuly nukleové kyseliny postupujícími delecemi od 5’- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA. Tyto nukleové kyseliny pak poskytují syntézu proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konei nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaei enzymu v plaslidech (tranzitní peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již nadále lokalizovány ve vakuoláeh, ale v cytosolu, nebo které jsou díky připojení dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.
Na druhé straně další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje například enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu Ktn nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existují, jako jsou například
5o alosterické regulace nebo ková len tni modifikace.
Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou substrátovou speeifícitu nebo speeifícitu pro produkt. Mohou být také tvořeny mutanty. které vykazují změněný profil aktivita— teplota.
- 5 CZ 299825 B6
Pro manipulaci v prokaryotických buňkách metodami genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidu umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím standardních metod (Sambrook et al., / 9S9, Molecular Clon ing, A Laboratory Manual. 2. vydáni,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se mohou zaměňovat báze a mohou být přidávány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby sc fragmenty DNA navzájem spojily, mohou knim byt přidány speciální adaptační nebo spojovací sekvence, adaptéry nebo spojky (línkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA nebo nadbytečná štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, m delece nebo substituce, muže se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primerů. restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.
Termín „hy bridizace“ má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hybrid i15 začních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Clon ing, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem hybridizace ve stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných takto: 50% formám id. 5x SSC. 5x Denhardtňv roztok, 40 mM fosforečnan sodný pfl 6.8, 0,5% (hmot./objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS. 0,1 mg/ml
2o DNA ze spermatu sleďů, a to při 42 °C. Příkladem obvyklé hybridizace v non stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných stejně jako viz výše. s tím rozdílem, že místo 50% je užit 30% formani id. Promývací podmínky jsou v případě stringentních podmínek výhodně 0,5x SSC/0,5% SDS při 60 ŮC a v případě non-stringentních podmínek výhodné 2x SSC/0.5% SDS při 56 °C.
Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolovány například zgenomových nebo eDNA knihoven, které byly připraveny zodpovídajících organismu. například zartyčoku.
.κι K identifikování a izolování takovýchto molekul nukleové kyseliny mohou být použity molekuly podle vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, například získané hybridizací pomocí obvyklých metod (viz například Sambrook a kol., 1989, Molecular Clotting, A Laboratory Manual, 2 vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, AT).
Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence je zcela shodná nebo v podstatě podobná sekvenci uvedené zde jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3, nebo části těchto sekvencí, fragmenty použité jako hybridizační sondy mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých •io způsobu syntézy, a jejichž sekvence jsou v podstatě podobné sekvencím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Molekuly hybrid i zuj íeí s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty se míní části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden /.proteinu podle vynálezu. Termín „derivát v tomto smyslu znamená. že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše \ jedné nebo několika pozicích, avšak s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie znamená sekvenční identitu alespoň 40 %. zejména alespoň v 60 %, výhodně více než 80% a nejvýhodnéji více než 90%. Proteiny kódované takovými molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvenci id. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než 90 %, 95 %, 97 % a 99 %, Odchylky od výše popsaných molekul nukleové kyseliny mohou být tvořeny delecí. substitucí, inzercí nebo rekombinací.
s
-6CZ 299825 B6
Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami, a které představují deriváty těchto molekul, jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modifikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence z jiných organismu nebo mutace, které mohou vzniknout bud1 přirozeně nebo které byly ? vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně sc vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.
Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určilo té společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace, čí fyzikální vlastnosti, jako jc elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografií, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimum pH. teplotní optimum.
Jak již bylo uvedeno, ve výhodném provedení jsou nukleové kyseliny podle vynálezu získány z artyčoku (C vnara sco/ymus).
Pokud se týče vektoru obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, výhodně se jedná o plazili idy. kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané v oboru geno20 vého inženýrství.
Ve vektoru podle vynálezu je sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně operativně spojena s regulačními prvky, což zaručuje transkripci a sy ntézu RNA v prokaryotiekýeh a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.
Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména v prokaryotickýeh nebo eukaryotických buňkách jako jsou bakterie. houby, řasy, buňky živočichů a výhodně rostlinné buňky a rostliny. Výhodné hostitelské organismy jsou zvláště kvasinky jako například 5. cerevisiac, bakterie mléčného kvašení jako so Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris.,
Lactobacillus acidophilus a Leuconostoc eremoris.
Kódované enzymy mohou být použily pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Zvláště výhodné jsou rostlinné buňky.
Přehled týkající se různých expresních systémů lze najít např. v publikacích Methods in
Enzymol ogy 153, 1987, 385-516. Bitter a kol. Methods in Enzywology 153, 1987, 516-544,
Sawers a kol. Applied Microbiology and Biotechnology 465, 1996, 1-9, Bili man Jaeobe,
Current Opinion in Biotechnology 7, 1996, 500-504, llockeny, Trends in Biotechnology 12, 40 1994, 45 6 463, a Qrifflths a kol, Methods in Molecular Biology 75. /997, 427-440. Expresní systémy pro kvasinky by ly popsány v publikacích Hensinng a kol, Antonie van Leuwenhoek 67,
1995, 261-29, Bussineu a kol, Developments in Biological Standardlzation 83, 1994, 13-198, (re/lissen a kol, Antonie van Leuwenhoek 62, 1992, 79-93, Eleer, Current Opinion in
Biotechnology 3. 1992. 486-496, Vedvick, Current Opinion in Biotechnology 2, 1991, 742-745: 45 a Buekholz, Biotechnology 9, 1991, 1067 1072. V publikacích podle dosavadním stavu techniky byly expresní vektory' popsány ve značném rozsahu. Kromě genu selekčního markéru a replikačního počátku, který' zajišťuje replikací ve vybraném hostiteli, obvykle expresní vektory obsahují bakteriální nebo virový promotor, a ve většině případů také term i načni signál transkripce.
Obvykle je alespoň jedno restrikční místo nebo polylinker (vícečetné klonovat í místo) mezi pro50 motorem a terminačním signálem, což dovoluje vložit kódující sekvenci DNA. Jestliže je aktivní ve vybraném hostitelském organismu, může se jako promotorova sekvence užít DNA přirozené kontrolující transkripci odpovídajícího genu. Tuto sekvenci jc možné zaměnit jinou promotorovou sekvencí. Je také možné užít promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genu a nebo indukováte)ný promotor, který umožňuje cílenou regulaci exprese genu ležícího po směru trans55 kripce (..down stream“). Bakteriální a virové pro motorové sekvence těchto vlastností jsou z dosa-7CZ 299825 B6 vadního stavu techniky známy, přičemž byly popsány v různých publikacích. Regulační sekvence pro expresi v mikroorganismech (jako je E. coli nebo 5. cerev/.sme) byly dostatečně popsány v publikacích podle dosavadního stavu techniky. Promotory, které dovolují zvláště silnou expresi „downstream ležícího genu jsou např. T7 promotor (Studier a koí, Melhods in Enzymology 185.
? 1990, 60-89); laeuv5. trp, trp -lacUV5 (DeBoer a kol., in Rodriguez and Chemberlain,
Promotors. Struct utře and Punct ion, Praeger, New York, 1982, 462- 481; DeBoer a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1983, 21-25, λρ 1. rae (Boros et aí, gene 42, 1986, 97-100). Obvykle je množství proteinu nejvyšší v úseku od středu ke konci logaritmické fáze růstového cyklu mikroorganismu. Z tohoto důvodu se výhodně užívají indukovatelné promotory při synteze proteinů, ío To často umožňuje vyšší produkci než užití konstitutivního promotoru. Použití silného konstitutivního promotoru často vede. prostřednictvím permanentní transkripce a translace klonovaného genu, ke ztrátě energie na jiné nezbytné buněčné funkce, což pak zpomaluje růst buněk (Bernard R. (Jlick, JackJ. Pusternak, Molekulare Biotechnologie, 1995, Spektrum Akademischer Yerlag (imhll, Heidelberg, Berlin, Oxford, str. 342). Aby tedy bylo dosaženo optimálního množství proteinu, často se užívá dvoufázový proces. Nejdříve se hostitelské buňky kultivují v optimálních podmínkách, dokud sc nedosáhne relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhé fázi je indukována transkripce v závislosti na tom, jaký byl použit promotor. Zvláště vhodný je v takovém případě promotor tac indukovatelný laktózou nebo IPTG (=iz.opropyl-p-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer a kol.. Proč. Natí Acad. Sci. USA 80, 1983, 21-25). Terminační signály t ran skr i pce by Iy v dosa vad η í m sta vu tec h n i ky také doslat eč ně popsá ny.
Transformaci hostitelské buňky odpovídající DNA. která kóduje protein, lze provést standardním postupem, jaký je například popsán v publikaci Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratoře Manual, Cold Spring flarbor Laboratory, Cofd Spring Harhor, NY. 1989. Kultivace hostitelských buněk se provádí v živném médiu, které odpovídá nutričním požadavkům použitých hostitelských buněk, zejména pokud jde o pil, teplotu, koncentrace solí, provzdušňování média, přítomnost antibiotik, vitaminů, stopových prvků apod.
Purifíkacc enzymu produkovaného hostitelskými buňkami sc provádí obvyklými purifikačními technikami jako je precipitace, iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC s reverzní fází apod.
Modifikací DNA. která je exprimována v hostitelských buňkách, je možné v hostitelských buňkách expriinovat takový polypeptid, který se snáze izoluje z kultivačního média díky určitým vlastnostem, takže je například možné expriinovat protein jako luzní protein s další polypeptidovou sekvencí, jejíž, specifické vazebné vlastnosti dovolují izolovat fůzní protein pomocí afinitní chromatografie (víz např. Hopp a kol.. Biotechnology 6, 1988, l 204-1 210, Sassenfeld, Trend in Bioteehnol. 8, 1990, 88-93).
Pro expresi v rostlinných buňkách jsou výhodné regulační prvky promotoru 1333 patatinového genu. Dalším výhodným promotorem je promotor 35S CaMV a promotor genu pro alkoholdehydrogenázu ze Saccharomyces eerevisiae.
Vektory podle vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky, které stabilizují vektor v hostii? telskem organismu, například bakteriální replikační počátek nebo 2-mikron-DNA pro stabilizaci v V. eerevisiae. Kromě toho mohou obsahovat levou a pravou hraniční sekvenci T-DNA z Agrobacterium. což umožňuje stabilní integraci do genomu rostlin.
Vektory podle vynálezu mohou dále obsahovat funkční terminátory, jako je například terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium.
Podle dalšího provedení je nukleová kyselina podle vynálezu spojena s molekulou nukleové kyseliny vektoru podle vynálezu, kdy nukleová kyselina kóduje funkční signální sekvence, aby bylo možné směrovat produkt do různých buněčných kompartmentů. Taková modifikace může například spočívat v tom. že se přidá N- koncová sekvence pro sekreci do apoplastu vyšších rost-8CZ 299825 Bó lin, ale v rozsahu vynálezu je také jakákoliv další modifikace vedoucí k fúzi signálního peptidu se sekvencí kódující FFT. Molekula nukíeové kyseliny obsažená vc vektoru podle vynálezu může zejména obsahovat sekvence kódující aminokyselinové sekvence způsobující sekreci. V této souvislosti je výhodné užití signálního peptidu α-CGTázy zKlebsiela oxytoca M5A1 (Fiedler a kol., J. Mol. Biol. 256. 1996, 279-291) nebo signálního peptidu, který'je kódován nukleotidy 11 529 až 11 618 sekvence vedené v GeneBank pod číslem X860I4.
Zvláště výhodně provedení vynálezu se týká plazmidů p35-csFFT a p33-csFFT a jejich konstrukce, která je popsána v příkladech.
V dalším provedení sc vynález týká hostitelských buněk, které přechodně nebo stabilně obsahují molekuly nukíeové kyseliny nebo vektor}' podle vynálezu nebo pocházejí z takových buněk. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný vnesení in vitro rekombinantní DNA a pak je případně schopen syntetizovat proteiny kódované molekulami nukíeové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Výhodně jsou to mikroorganismy. Výhodně podle vynálezu jde o bakterie a protista (jako jsou houby, zejména kvasinky a řasy), jak jsou definovány například v Schlegelově „Allgemaine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2). V souvislostí s prokaryotickými hostitelskými organismy je třeba poznamenat, že byl ukázán pozitivní účinek inulinu na růst určitých mikroorganismů, jako jsou například bifidobakterie z lidského intest mál ního traktu, B i fído bakteriím se přisuzuje zdravotní účinek (viz. např, Gibson a kol, lni. SugarJ. 96, 1994, 381-386; Roberfroid a kol, J. of Nutrition 128. 1998, 11 19). Byl také diskutován inhibiční účinek na nádory (viz například publikace Reddy a kol, Carcinogenesis 18, 1982 1371 1374: Singh a kol, Carcinogenesis 18, 1997. 833-84T). Z tohoto důvodu hostitelské buňky podle vynálezu, jako jsou kvasinky (pekař25 ské) nebo bakterie mléčného kvašení (jogurt, podmáslí) jsou vhodné pro použití v potravinářském průmyslu.
Ve zvláště výhodném provedení podle vynálezu hostitelská buňka navíc obsahuje gen kódující sacharózafruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze, l akové sekvence byly například izo30 továny z a rty čo ku (německá patentová přihláška Df-AI 197 08 774), Cichorium inlibus (de Ilalleux a kol. Plant Physiol. 113, 1992 1003 1013). Helianthus tuberosus (WO 96/21023 a Allium cepa (Vijn a kol. Plant Phsiol 117. 1998, 1507-1513).
Vynález se zejména týká transgcnních rostlinných buněk transformovaných nukleovými kyseli35 námi podle vynálezu nebo jejich deriváty nebo částmi. Transgenní rostlinné buňky jsou výhodně schopné syntetizovat enzymy vhodné pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že do nich zavedená molekula nukíeové kyseliny podle vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj. v těchto buňkách se při40 rozené nevyskytuje, nebo je v genomu lokalizována na jiném místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence. Navíc transgenní buňky podle vynálezu výhodně obsahují sekvenci DNA kódující SSI.
Předkládaný vynález se rovněž týká proteinů kódovaných molekulami nukíeové kyseliny podle vynálezu, a také způsobů jejich produkce, kdy sc hostitelské buňky podle vynálezu kultivují za podmínek umožňujících syntézu proteinu. Protein se pak izoluje z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález lýka FFT. připravitelné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo způsobem podle vynálezu.
Předkládaný vynález se dále týká molekul nukleových kyselin, které specificky hybridizují s molekulou nukíeové kyseliny podle vynálezu, s molekulou k ní komplementární nebo s její částí. Výhodně se jedná o oligonukleotidy s délkou nejméně 10, zejména nejméně 15 a výhodně nejméně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou využít jako primer} v PCR reakci. Mohou sloužit také jako složky „antisense konstruktu nebo DNA molekul, které kódují vhodné ribozymy.
-9CZ 299825 Bó
Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, kterýžto způsob obsahuje vnesení molekuly nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
Tím, že předkládaný vynález poskytuje nukleové kyseliny podle vynálezu, dovoluje pomocí metod rekombinantní DNA produkovat inulin s dlouhým řetězcem v různých organismech, zejména v rostlinách, což dosud klasickými šlechtitelskými metodami nebylo možné. Zvýšením aktivity PP I , například nadměrnou expresí (..overexpresíf) vhodných molekul nukleové kyseliny io podle vynálezu nebo poskytnutím rnulantů. které již nadále nepodléhají buněčné specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.
Je tudíž také možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách ke i? zvýšení aktivity příslušné FFT nebo ke vnesení FFT do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkům z oboru známými, aby se získala FFT podle vynálezu, která již nadále nepodléhá buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo která má modifikovanou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.
Pro tento účel muže odborník v oboru použít řadu různých rostlinných transformačních systémů. Tak například použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo extenzivně zkoumáno aje popsáno například v patentu EP-A-120 516 a dále v publikaci lloeketmr. The Binary Plant Vector System, Offse/drukkerij Kantem Β. V., Alblasserdam (1985). Chapter V, Fraley, Crit. Rev.
Platit. Sci.. 4, 1-46 and An, EMBOJ. 4 (1985), 277-287.
Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné exp lan táty společně kultivují (koku lti vují) s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobaclerium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (například segmentů listů, stonku nebo kořenu, ale také z protoplastů nebo suspenzní bunčč30 né kultury) lze regenerovat celou rostlinu ve vhodném médiu, které obsahuje antibiotika nebo biocidní látky vhodné pro selekci transformovaných buněk. Rostliny připravené takovým způsobem se pak musí testovat, aby se zjistilo, zdaje přítomna vnesená DNA. Jinou možností je vnesení DNA do rostlinných buněk biol i Stic kou metodou nebo transformací protoplastů. což je z dosavadního stavu techniky známo (viz například Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotech35 nology, A Mul ti Volume Comprehensive Treatise (H. ,1. Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, editorsk Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York Basel Cambridge}.
Alternativním systémem pro transformaci jcdnodčložnýcli rostlin je transformace biolistiekou metodou, elektricky nebo chemicky indukovaným příjmem DNA do protoplastů, elektroporací
3o částečně permeabilizováných buněk, makroinjckcí DNA do květří, mikroinjekcí DNA do mikrospor nebo proembrya metodou bobtnání (viz např. kusardi, Plant J. 5. 1994, 571-582; Paszkowski. Biotechnology 24, 1992. 38^ -392). Zatímco transformace dvoudčložných rostlin vektorovým systémem založeným na Ti—plazmidu prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens je již dávno zavedenou technikou, novější studie ukazují, že transformace vektory založenými na Agrobacte45 rium tumefaciens může být úspěšně použita i v případě jednoděložných rostlin (Chán a kol., Plant Mol. Biol. 22 (1993). 491-506; Hici a kol.. Plam J. 6 (1994}, 2N -282; Bytebier a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345 5349; Raineri a kol.. Bio/Technolog}· 8 (1990). 3338; Gould a kol., Plant Phvsiok 95 (1991), 426 434; Moonev a kol., Plant, Cell Tiss. & Org. ('ult. 25 (1991), 209-218; Li a kok, Plam Mol. Biol. 20 (1992). 'li)37 1048).
Tři z výše jmenovaných systémů pro transformaci byly úspěšně zavedeny také pro různé druhy obilovin: elekroporace rostlinného pletiva, transformace protoplastů a přenos DNA ostřelováním regenerovatclné tkáně a buněk (přehled viz Jahne a kok, Euphyt/ca85 (1995). 3544). V odborné literatuře bylo popsáno několik způsobů transformace pšenice (přehledy viz. Maheshwari a kok,
Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).
- 10CZ 299825 B6
Jestliže jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizován v principu v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Aby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuo5 le. a je li nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou odborníkovi známy (viz např. Braun et al, EMBOJ., IL 1992. 3219-3227; Wolter a kol.. Proč. Nati. Acad Sci, USA, 85, 1988. 846 850: Sonnewalda kol. Planil. 1. 1991, 95-106, Rocha Sasa, EMBOJ. 8, 1989. 23-29).
to Předkládaný vynález se tudíž také týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenních rostlinných buněk pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodné spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. lakové rostlinné buňky sc odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, žc obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která se v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tím, že tato molekula je vložena do genomu buňky na místo, kde sc přirozeně nevyskytuje, tj. do jiné genomové oblasti. Jelikož 1-kestóxa je přirozeným substrátem FPT a sama je tvořena v reakci fruktosyltransferázy (SST) závislé na sacharóze sc sacharózou. je zvláště výhodné a pravděpodobné do konce nutné poskytnout, kromě molekul nukleové kyseliny, vektoru a FFT podle vynálezu, také SST, Takže výhodné provedení vynálezu se týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které navíc obsahují gen kódující fruktosyl transferázu (SST) závislou na sacharóze. To mohou být například rostliny nebo rostlinné buňky, které již přirozeně exprimují SST jako např. ěckanka, Helianthus tuberosus nebo jiřina, a nebo rostliny, do kterých byla sekvence DNA kódující SST vnesena metodami genového inženýrství. Tyto sekvence je možné vnést navzájem nezávisle nebo současně s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odboruísi) kum známých. Rostliny připrav itelné regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dalším předmětem vynálezu jsou rostliny obsahující transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu. tj. jak jednoděložné, lak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které obsahují sacharózu, jako jsou rýže. kukuřice, cukrová řepa, cukrová třtina.
brambory a zelenina (rajčata, karotka, pór, čekanka apod.). krmné nebo luční trávy, sladké brambory, pšenice, ječmen, řepka a sója.
Vynález se také týká množíteIského materiálu a produktů sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semen, hlíz, podnoží, sadby, řízků, kalusu, buněčných kultur apod.
41)
Dále se vynález týká inulinu s dlouhým řetězcem, který 1/c získat z hostitelských buněk podle vynálezu, zejména z transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv nebo rostlin, a takc z jejich množitelského materiálu nebo sklizňových produktů.
•ts V dalším provedení se vynález týká způsobů produkce inulinu, které byly definovány výše.
Izolace inulinu z různých zdrojů, zejména rostlinných pletiv, by la například popsána v publikacích Gibson a kol. Int. SugarJ. 96, 1994, 381 386, Baxa, Úzech J. Food Sci. 16, 1998, C-Nr a dále v FP-A-787 745, DeLeeoheer, Cyrbohydr. Org. Raw Matter IH Workshop, 1996, Meeting
5i) dáte 1994. 6~-92, Verlag VCLI Weinhehn, Gertnanv, a ruský patent RU 2001 1621 Cl.
Předkládaný vynález se dále týká způsobu in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem využitím sacharózy a kombinace enzymu SST a enzymu FFT podle vynálezu. Dále sc vynález týká způsobu in vitro produkce inulinu užitím směsi obsahující fruktosylové oligomery a FPT podle vynálezu. V této souvislosti je třeba uvést, že fruktosylový oligomer je oligomer složený z fruktó-11CZ 299825 B6 zových jednotek s DP přibližně 2 až 7, který' může mít na koncích glukózové zbytky . Když se provádí způsob podle vynálezu, užívají se výhodně rekombinantně produkované proteiny, které jsou tvořeny tak, že se vloží DNA kódující příslušný protein do hostitelské buňky a tam se exprimuje. Protein je pak izolován buďto z hostitelských buněk nebo z kultivačního média. Hostitelské buňky jsou výhodně hostitelské buňky podle vynálezu definované v předchozím textu. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užijí enzymy, které byly připraveny rekombinantní technologií a seeernovány z hostitelských buněk do kultivačního média, takže není nutné narušovat buňky nebo dále purifikovat protein, neboť secemovaný protein lze snadno získat ze supernatantu. Aby sc odstranila rezidua kultivačního média, užijí se obvyklé způsoby jako je dialýza, m reverzní osmóza, chromatografické metody apod. To samé platí pro koncentrování proteinu vylučovaného do média. Sekrece proteinů mikroorganismy je normálně zprostředkována N-konco* vým signálním peptídem (signální sekvence, vedoucí peptid). Proteiny se signální sekvencí mohou procházet membránou mikroorganismu. Sekrece proteinů lze dosáhnout spojením sekvence DNA kódující signální peptid s odpovídajícím úsekem kódujícím enzym. Zvláště výhodné je použití signálního peptidu α-CGTázy z Klebsiela oxyíoca M5A1 fbielder a kol., J. Mol. Biol. 256, 1996. 279-291) nebo signálního peptidu. který' jc kódován nukleotidy 1 1 529 až í t 618 sekvence uložené v GeneBank pod č. X86014.
Enzymy použité v postupu podle vynálezu mohou být alternativně připraveny nikoliv využitím
2o mikroorganismů, ale užitím in vitro transkripčních a translačních systémů, které umožňují exprimovat protein. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je ITT produkována v protoplastcch z listového pletiva rostlin.
Dále se vynález týká inulinu produkovaného hostitelskou buňkou, zejména rostlinnou buňkou,
2? pletivem nebo rostlinou podle vynálezu, nebo získaného z rozmnožovacího materiálu nebo produktů sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Takový inulin se může výhodně použít pro přípravu surfaktantů ke zvýšení viskozíty ve vodných systémech, jako detergent, jako suspendační činidlo nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování a pro vázání vody.
Jednotlivá provedení podle vynálezu a další provedení jsou odborníkům v oboru zřejmá. Tato provedení jsou obsažena v popisu příkladů podle vynálezu. Další odborná literatura týkající se výše popsaných postupů, prostředků nebo použití, který lze využít ve smyslu předkládaného vynálezu, je obsažena vc stavu techniky, např. ve veřejných knihovnách nebo v elektronické .3? podobě. Veřejnou databází je například databáze Mcdline, na kterou je přístup prostřednictvím i π ternetu na ad rese: http://v\w \v .nebi.nim. nih.gov/fub Med/medline.html.
Další obdobné databáze jsou odborníkům známy a jejich adresy lze získat pomocí internetu například na adrese: http://vvvv\v.lycos,com.
Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentu a patentových přihlášek lze nalézt v publikaci Berks, Tibtech 12, 1994, 352- 364.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek I (ukazuje analýzu celkového extraktu z protoplastu pomocí HPLC. Protoplasty byly transformovány různými vektory : A: Transformace byla provedena vektorem pA7, který' neobsahuje kódující úsek fúzovaný s promotorem cAMV .358. B: Trans formace byla provedena vekto5ti rem pA7-csFFT, který obsahuje kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy zartyčoku fúzovaný s promotorem cAMV 358. C: Transformace byla provedena vektorem pA7-htFPT, který obsahuji e kód uj ící úsek t r li k ta n; 1 r u k t osy 11 r a n s fe r ázy z Hel ianthus tube ros us fúzo v a 11 ý s p ro m ot o re m cAMV 35S. Před analýzou byly úplné extrakty z protoplastu inkubovány ve směsi fruktosylových oligomerú po dobu 12 hodin. Analýza byla provedena jak je popsáno v příkladu 1.
- 12CZ 299825 B6
Obrázek 2 ukazuje konstrukci plazmidu p35-esFFT.
Obrázek 3 ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p35-esFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekul) inulinu s dlouhým řetězcem v trans5 gen nich rostlinách, které exprimovaly SST a také FF1 z artyčoku (35S-SST/FFT 22/19).
Obrázek 4 ukazuje konstrukci plazmidu p33-csFFT.
Obrázek 5 ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, kterc byly připraveny transformací konslío ruktem p33 csFFT.Analýza ukázala, žc sc tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, kterc exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (35S-SST/FFT 47).
Předkládaný vynález je dále podrobněji ilustrován pomocí následujících příkladů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující fruktosyltransferázu z artyčoku (Cynare scolytnus)
Celková RNA by la izolována zčešule (receptaculum) artyčoku (Sambrook et al, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Poly(A) mRNA se izolovala za použitím RNA izolačního systému PolyATtraet (Protnega Corporation, Madison, WL USA), Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 pg této RNA pomocí soupravy pro syntézu „ZAp cDNA synthesis kit“ od firmy Stratagene podle instrukci výrobce. Získalo sc 2x10fl nezávislých rekombinantních fágů. Amplifikovaná cDNA kni3o hovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného P a odpovídajícího cDNA pro SST z artyčoku (Notl fragment z plazmidu pC'y21 podle DL 197 08 774.4). Sekvence SST z artyčoku bvla popsána v patentové přihlášce DE 197 08 774.4. Pozitivní klony byly sereenovány pomocí sondy SSL v silně stringentních podmínkách. Klony reagující pozitivně ve sereeningu byly vynechány, neboť se evidentně jednalo o SST cDNA. Ze zbývajících klonů byly izolovány inzerty cDNA tak, že se plazmidová DNA izolovaná standardním postupem vyštěpila restrikční ni enzymem Noll a pak byla klonována do vektoru pA7. Kohezní konce Noll fragmentu byly zaplněny užitím 14 polymerázy. Poté bvl fragment ligován do míst Smál v pA7. Vektor pA7 je derivátem pUC18 (Yanish-Perron, gene 33, 1985. 103-119), který obsahuje vložený promotor 35 S z viru mozaiky květáku. CaMV (nukleotidy 7146 až 7464, dle (lardner, Nucl. Acids
4o Res. 9. 1981.2871 2888) mezi místa EeoRl a Sael v polylinkeru. Kromě promotoru 35S obsahuje vektor pA7 polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTiACHS (Gielen, EMBO J. 3, 1984, 835-846). tj. nukleotidy 11 749 až 11 939). který byl izolován jako fragment PvullHindlll z plazmidu pAGV40 (llerrera-Strella, Nátuře 303, 1983, 209-213) a klonován mezi místa Sphl a HindllI polylinkeru po adici linkeru Sphl k místu Pvull.
Proloplasty tabáku byly transformovány užitím derivátů pA7 obsahujících cDNA z artyčoku. a sice metodou, kterou popsal Negrutiu, Plant Mol. Biol. 8, 1987, 363 373. Transformované protoplasty byly kultivovány v médiu K3 (Nagy a Maliga, Z. Pflanezenphysiologie 78. 1976. 453— 455) při 25 °C po dva dny ve tmě. Pak byly získány buněčné extrakty opakovaným zmrazením
5(i a roztátím. Extrakty byly inkubovány 12 hodin s oligofruktany (67,5 % l-ketóza, 28,4 % nystó7a, 3,6 % fruktosyInystóza, 0,5 % sacharóza) při 28 °C a pak analyzovány užitím HPLC. Analýzy HPLC byly provedeny na aniontové výměnné koloně CarboPAc PA 100, napojené na gradientový chromatograficky systém Dioncx DX-300 (Dionex. Sunnyvale, CA, USA). Monomery, oligomery a polymery' cukrů byly stanoveny pomocí pulzam péro metrické detekce. Nastavení detektoru pro tento účel bylo následující: 1j = 0,48 s, T- 0,12 s. Ί4 ~ 0.12 s. Ej=0,05V,
CZ 299825 Bó
E2 = 0,65 V, E; =-0,95 V, citlivost OJ gC, integrace = 0,28 až 0,48 s, průtokové médium A0.Í5M NaOH, průtokové médium B - IM NaAc v 0J5M NaOH. gradient: 10 minut 100% A, 2 minuty lineární zvýšení z 0% B na 100% B. 2 minuty 100% B. 2 minuty lineární zvýšení z 0% A na 100% A, 5 minut A. Vzorky byly před aplikací odsoleny a filtrovány (Microcon 10. Amicon, Beverly. USA). Průtoková rychlost byla 1 ml min V několika extraktech (viz obr. I) byl nalezen vy sokorno leku lární ínulin.
Příklad 2 io
Sekvenční analýza inzertu eDNA plazmidu pCy3
Inzert eDNA / derivátu pA7 (pCy3), který byl zodpovědný za syntézu vysokomolekulárního mulinu v testu s protoplasty, byl sekvencován obvyklou dideoxynukleotidovou metodou (Sangcr i? et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 74, 1977, 5463-5467).
Inzert klonu pCy21 jc DNA velikosti 2 073 bp. Nukleotidová sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. I. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 2. Sekvence id. č. 3 je varianta sekvence id. č. 1, která kóduje stejný protein jako sekvence id. č. 1.
Sekvenční analýza a srovnání sjiž publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená jako sekvence id. č. I je nová a obsahuje kódující úsek vykazující homologii s FFT jiných organismů.
Příklad 3
Syntéza plazmidu p35-csFFT a vložení plazmidu do genomu bramboru
3(i Plazmid p35-csFFT (obr. 2) obsahuje tři fragmenty A. B a C v binárním vektoru pBin 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res.. 12: 871 1. modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., (8: 203).
Fragment A obsahuje promotor 35S z viru mozaiky květáku (CaMV). Obsahuje úsek nukleotidů 7146 až 7464 (Gardner. Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888), který je vložen mezi štěpná místa EcoRl a Sad polylinkeru z pBin I9-Hyg.
Fragment B obsahuje nukleotidy 1 až 2073 sekvence id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Not! z vektoru pBK < MV. ve kterém byl vložen do štěpného místa EcoRl prostřednictvím linkerové sekvence EcoRI/Noti.
Fragment C obsahuje po lyadeny lační signál genu 3 z 1 -DNA Ti plazmidu pTi ACII 5 (Giclen et al., 1984; EMBO .1.. 3. 835-846), nukleotidy 11 749 až 11 939, který byl izolován jako fragment Pvull-llindlll z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrclla et al., 1983, Nátuře, 303, 209 213) a klonován mezí štěpná místa SphJ a HindlII polylinkeru z pBinl9-Hyg po přidání línkem Sphl ke štěpnému místu Pvull.
Plazmid p35 csSST byl vnesen do Agrobacterium (Hofgen a Willmitzcr. Nucleic Acids Res., 16. 1988, 9877) a pak byl zaveden do rostlin bramboru prostřednictvím genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium užitím výše popsaných v oboru známých metod. Tyto rostliny braní5o boru byly transformovány sekvencí DNA kódující SST zartyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z listu regenerovaných rostlin byly získány extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýzy se prováděly postupem popsaným v příkladu 1. Analýzy listů velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem
- 14CZ 299825 B6 nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního tnulinu, který je důsledkem exprese genu FFT artvěoku obsaženém v plazmidu p35-csFFT (srov. obr. 3).
Tabulka 1
Analýza obsahu i nul i nu v hlízách t ran sgen nich rostlin bramboru exprimujících geny SST a FFT z artyčoku
Rostlina obsah fruktanu pmol fruktózy/g čerstvé hmotnosti proměnný stupeň polymerizace (poměr fruktóza/glukóza)
35-SST/FFT 22/26 30/81 21 (20/1)
35-SS7/FFT 3G/17 9 *7 Ί 7. 20 (19/1)
Příklad 4
Příprava plazmidu p33-csFFT a vnesení plazmidu do genomu bramboru
Plazmid p33-csFFT (obr. 4) je shodný s plazmidem p35-csFFT, s výjimkou toho, že fragment A obsahuje promotor B33 patat i nového genu b33 z bramboru místo promotoru 35 S CaMV. Obsahuje fragment Dral (pozice -1 512 až pozice +14) patatinového genu B33 (Rocha-Sosa et aL
1989, FMBOJ., 8:23-29), který byl vložen mezi štěpná místa EcoRl a Sací polylinkeru z pBinl9 Hyg.
Plazmid p33-csFFT byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium, jak bylo již popsáno v příkladu 3. Tyto rostliny bramboru byly transfonno25 vány sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DBA! 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány 7 transformovaných buněk.
Analýzy hlíz velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly
3o výskyt vysokomolekulárního mulinu, kterýje výsledkem exprese genu FFT z artyčoku obsaženého v p33 csFFT (srov. obr. 5).
- IS CZ 299825 B6
SEZNAM SEKVENCÍ
Í2'i INFORMACE PRO SEKVENCI 5 IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
iii CtiARÁKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 3 páru bulí (B; TYP: nukleová kyselinu [O TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TY? MOLEKULY: cDNA (ni! HYPOTETICKÁ: ne (ix) ZNAKY:
(A) iW.N0/OZNAČENÍ : CDS (3) POZICE: 21. ..1872 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50
Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu
10
GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98
Glu His Ala Pro Asn 15 His Thr Pro Leu Leu 20 Asp His Pro Glu Pro 25 Pro
CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG C-TT TCG TCC AGT ATC 146
Pro Ala Ala Val 30 Arg Asn Arg Leu Leu 35 Ile Arg val Ser Ser 40 Ser Ile
ACA TTG GTC TCT CTG TTT TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTG 194
Thr Leu Val 45 Ser Leu Phe Phe Val 50 Ser Ala Phe Leu Leu 55 Ile Leu Leu
TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA 242
Tyr Gin His Asp Ser Thr Tyr Thr Asp ASp Asn Ser Ala Pro Ser Glu
65 70
AGT TCT Ser Ser 75 TCC Ser CAG Gin CAG CCC TCC GCT GCC GAT Asp CGC Arg 85 CTG Leu AGA Arg TGG Trp GAG Glu AGA Arg 90 290
Gin pro 80 Ser Ala Ala
ACA GCT TTT CAT TTC CAG CCC GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC 338
Thr Ala Phe His Phe Gin Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn
100 105
GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC 386
Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn
110 115 120
- 1 6 CZ 299825 B6
434
CCG TAC GCA CCG Pro Tyr Ala Pro 125 TTT Phe TGG GGC AAC ATG ACA TGG GGT CAC GCC Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala 130 135 GTG TCC
Val Ser
AAA . GAC ATG ATC AAC TGG TTC GAG CTT CCG i ATC GCC TTG GCC CCA . ACC
Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr
140 145 150
GAA TGG TAC GAT ATC GAG GGT GTT TTA TCA , GGC TCA ACC ACG ATC CTC
Glu Trp Tyr Asp ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu
155 160 165 170
CCT GAT GGT CGA ATC TTT GCT CTC TAT ACC GGA AAC ACA AAC GAT CTC
Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu
175 180 185
GAG CAA CTT CAA TGC AAA GCC GTG CCA GTT AAT GCA TCC GAC CCA CTT
Glu Gin Leu Gin Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu
190 195 200
CTT GTT GAA TGG GTC AGG TAC GAT GCT AAC CCG ATC CTG TAT GCT CCA
Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Prú Ile Leu Tyr Ala Pro
205 210 215
TCA GGG ATC GGG TTA ACA GAT TAC CGG GAC CCG TCA ACA GTT TGG ACG
Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr
220 225 230
GGT CCC GAT GGA AAA CAT CGG ATG ATC ATA GGG ACT AAA CGA AAT ACT
Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr
235 240 245 250
ACA GGA CTC GTA CTT GTA TAC CAT ACC ACC GAT TTC ACA AAC TAC GTA
Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val
255 260 265
ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA
Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu
270 275 280
TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT
Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp
285 290 295
GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG
Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp
300 305 310
GAG GGA CAC GCG ATG GAC TAC TCG ATC ggg ACA TAC GAT GCA TTT
Glu Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe
315 320 325 330
4Θ2
530
578
626
674
722
770
818
866
914
962
1010
-17CZ 299825 B6
AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu
335 340
CTA GAC GTC GGT ATC GGG Leu Asp Val Gly Ile Gly
345
1058
TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106
Leu Arg CyS Asp 350 Tyr Gly Arg Phe Phe 355 Ala Ser Lys Ser Leu 360 Tyr Asp
CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154
Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp
365 370 375
AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202
Ser Tyr Asp Gin Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val
380 385 390
GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250
Ala Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin
395 400 405 410
TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 129Θ
Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe
415 420 425
AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346
Lys Asn Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly
430 435 440
TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA TTT GAG GTG GAT CAA GAG 13 94
Ser Ala Thr Gin Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu
445 450 455
GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442
Ala Leu LyS Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cvs Thr Thr
460 465 470
AGT Ser 475 TCG Ser GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA Ala 490 1490
Gly Ala Ala LyS 480 Gly Glu Val Leu Asp 485 His Ser Gly Ile
GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538
Val Leu Ala His Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr
495 500 505
ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1556
Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp
510 515 520
- IX CZ 299825 B6
AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT Asp TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 1634
Lys Leu Arg Ser S25 Ser Tyr Tyt 530 Asp Gly Glu Lys Val 535 Val Tyr Gly
AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682
Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu
540 545 550
GTG Val 555 GAT Asp CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 1730
His Ser Val Val 560 Glu Gly Phe Ala Gin 565 Gly Gly Arg Thr val 570
ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1773
Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala ile Tyr Glu Ala Ala Lys
575 5Θ0 585
CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1825
Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Len
590 595 600
AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1372
Lys Val Trp Gin Met Ser Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe
605 610 615
AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT ijt1 1932
GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992
AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2073
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: SIC aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
- 19 CZ 299825 B6
(Xi) POPIS SEKVENCE : SEKVENCE S ID. Č. . 2:
Met 1 Arg Thr Thr Glu Pro Gin 5 Thr Asp Leu 10 Glu Hia Ala Pro Asn His 15
Thr Pro Leu Leu Asp His Pro 20 Glu Pro Pro 25 Pro Ala Ala Val Arg Asn 30
Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser 35 Ser Ser Ile 40 Thr Leu Val 45 Ser Leu Phe
Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu 50 55 Ile Leu Leu Tyr Gin 60 His Asp Ser Thr
Tyr 65 Thr Asp Asp Asn Ser Ala 70 Pro Ser Glu Ser Ser 75 Ser Gin Gin Pro 80
Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg 35 Trp Glu Arg 90 Thr Ala Phe His Phe Gin 95
Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr 100 Asp Pro Asn 105 Gly Pro Leu Phe His Mec 110
Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr 115 Gin Tyr Asn 120 Pro Tyr Ala 125 Pro Phe Trp
Gly Asn Met Thr Trp Gly His 130 135 Ala Val Ser Lys Asp 140 Met Ile Asn Trp
Phe 145 Glu Leu Pro Ile Ala Leu 150 Ala Pro Thr Glu Trp 155 Tyr Asp Ile Glu 160
Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr 165 Thr Ile Leu 170 Pro Asp Gly Arg Ile Phe 175
Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr 180 Asn A.sp Leu 135 Glu Gin Leu Gin Cys Lys 190
Ala Val Pro Val Asn Ala Ser 195 Asp Pro Leu 200 Leu Val Glu 205 Trp Val Arg
Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu 210 215 Tyr Ala Pro Ser Gly 220 Ile Gly Leu Thr
Asp 225 Tyr Arg Asp Pro Ser Thr 230 Val Trp Thr Gly Pro 235 Asp Gly Lys Eis 240
Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys 245 Arg Asn Thr 250 Thr Gly Leu Val Leu Val 255
Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr 260 Asn Tyr Val 265 Met Leu Asp Glu Pro Leu 270
His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro
275 280 285
Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro 250 295 300
Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp 320
305 310 315
Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe Asn Asp Lys Trp Thr Pro
325 330 335
Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly
340 345 350
Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg
355 360 365
Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gin Asp Val
370 375 380
Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu
385 390 395 400
Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin Trp Pro Val Glu Glu Ile
405 410 415
Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn Ile Thr Leu Glu
420 425 430
Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly Ser Ala Thr Gin Leu Asp
435 440 445
Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser
450 455 460
Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys
465 470 475 480
Gly Glu Val Leu Asp His Ser Giy Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr
485 490 495
Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys
500 505 510
Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr
515 520 525
Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu
535
540
530
-21 CZ 299825 B6
Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val
545 550 555 560
Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr
565 570 575
Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn 580 585 590
Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gin Met Ser 595 600 605
Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe 610 6*5
- 77 C7. 29982S Β6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
ÍA) DÉLKA: 2073párů baží fBj TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché ÍD) TOPOLOGIE: lineární (iii TYP MOLEKULY: cDNA ; i11) ΗΥΡΟΤΕΤΓΟΚΑ: ano (ix) DALŠÍ ZNAKY:
(Aí lTMÉNC/OZNA-CENI : CDS (Bj POZICE: 21 . . 1K?2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3
TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT Met Arg Thr Thr Glu Pro Gin Thr Asp Leu
620 625
GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA
Glu His Ala 630 Pro Asn His Thr Pro 635 Leu Leu ASp His Pro 640 Glu Pro Pro
CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG GTT TCG TCC AGT ATC
Pro Ala 645 Ala Val Arg Asn Arg 650 Leu Leu Ile Arg Val 6 5 5 Ser Ser Ser Ile
ACA TTG GTC TCT CTG TTT TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTC-
Thr 660 Leu Val Ser Leu Phe 665 phe Val Ser Ala Phe 670 Leu Leu Ile Leu Leu 675
TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA
Tyr Gin His Asp Ser 630 Thr Tyr Thr Asp Asp 6S5 Asn Ser Ala Pro Ser 690 Glu
AGT TCT TCC CAG CAG CCC TCC GCT GCC GAT CGC CTG AGA TGG GAG AGA
Ser Ser Ser Gin 695 Gin Pro Ser Ala Ala 700 Asp Arg Leu Arg Trp 705 Glu Arg
ACA GCT TTT CAT TTC CAG ccc GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC
Thr Ala Phe 710 His Phe Gin Pro Ala 715 Lys Asn Phe Ile Tyr 720 Asp Pro Asn
GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC
Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn
725 730 735
146
194
242
290
338
386
-23CL 299825 Bó
CCG TAC GCT CCC TTT TGG GGA AAC ATG ACT TGG GGA CAT GCC GTC AGT Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser 434
740 745 750 755
AAG GAT ATG ATA AAT TGG TTT GAA TTA CCG ATA GCC TTA GCG CCA ACT 482
Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr
760 765 770
GAG TGG TAC GAC ATA GAA GGT GTT CTG AGT GGC AGT ACT ACC ATT TTA 530
Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu
775 730 785
CCT GAC GGA AGA ATT TTC GCT CTC TAC ACC GGA AAT ACA AAC GAC CTC 578
Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu
790 795 800
GAG CAG CTC CAG TGT AAG GCC GTG CCA GTT AAT GCT AGT GAT CCA TTA 626
Glu Gin Leu Gin Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu
805 810 815
TTG GTA GAA TGG GTT CGC TAC GAT GCC AAT CCG ATA TTA TAT GCC CCT 674
Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro
820 825 630 835
AGT GGC ATC GGC CTC ACA GAT TAC AGA GAT CCT AGT ACT GTG TGG ACG 722
Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr
840 845 850
GGC CCT GAC GGT AAA CAC CGT ATG ATA ATC GGG ACG AAG AGG AAT ACG 770
Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr
855 860 865
ACT GGA CTC GTC TTA GTA TAT CAC ACT ACC GAC TTT ACA AAT TAT GTA 818
Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val
870 875 880
ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA 866
Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu
885 890 895
TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT 914
Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp
900 905 910 915
GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG 962
Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp
920 925 930
GAG GGA CAC GCG ATG GAC TTT TAC TCG ATC GGG ACA TAC GAT GCA TTT 1010
Glu Gly His Ala Met ASp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe
935 940 945
-24Cl 299825 Bó
AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058
Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly ile Gly
950 955 960
TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106
Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp
965 970 975
CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154
Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp
980 985 990 995
AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202
Ser Tyr Asp Gin Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val
1000 1005 1010
GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250
Ala Arg Thr Ile Val Leu 1015 Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin
1020 1025
TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 1298
Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe
1030 1035 1040
AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346
Lys Asn Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Giy
1045 1050 1055
TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA TTT GAG GTG GAT CAA GAG 1394
ser Ala Thr Gin Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu
1060 1065 1C70 1075
GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442
Ala Leu Lys Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr
1080 1085 1090
AGT TCG GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA 1490
Ser Ser Gly Ala Ala Lys Giy Glu Val Leu Asn His Ser Gly Ile Ala
1095 11Q0 1105
GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538
Val Leu Ala His Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr
1110 1115 1120
ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1586
Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp
1125 1130 1135
-25 CZ 299825 B6
AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 16 34
Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly
1140 1145 1150 1155
AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA. TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682
Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu
1160 1165 1170
GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 173 0
Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val
1175 1180 1185
ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1778
Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys
1190 1195 1200
CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826
Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu
1205 1210 1215
AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872
Lys Val Trp Gin Met Ser Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe
1220 1225 1230
AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932
GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992
AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2 0 73 !21 INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
ÍA) DÉLKA: 617 aminokyselin ÍB) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
-26CZ 299825 B6
( xi) popis SEKVENCE: SEKVENCE S ID . č. 4:
Met 1 Arg Thr Thr Glu Pro Gin 5 Thr Asp Leu 10 Glu His Ala Pro Asn His 15
Thr Pro Leu Leu 20 Asp His Pro Glu Pro Pro 25 Pro Ala Ala Val Arg Asn 30
Arg Leu Leu Ile 35 Arg Val Ser Ser Ser Ile 40 Thr Leu Val Ser Leu Phe 45
Phe Val 50 Ser Ala Phe Leu Leu 55 Ile Leu Leu Tyr Gin 60 His Asp Ser Thr
Tyr 65 Thr Asp Asp Asn Ser Ala 70 Pro Ser Glu Ser 75 Ser Ser Gin Gin Pro 80
Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg 85 Trp Glu Arg 90 Thr Ala Phe His Phe Gin 95
Pro Ala Lys Asn 100 Phe Ile Tyr Asp Pro Asn 105 Gly Pro Leu Phe His Met 110
Gly Trp Tyr His 115 Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn 120 Pro Tyr Ala Pro Phe Trp 125
Gly Asn 130 Met Thr Trp Gly His 135 Ala Val Ser Lys Asp 140 Met Ile Asn Trp
Phe 145 Glu Leu Pro Ile Ala Leu 150 Ala Pro Thr Glu 155 Trp Tyr Asp Ile Glu 160
Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr 165 Thr Ile Leu 170 Pro Asp Gly Arg Ile Phe 175
Ala Leu Tyr Thr 180 Gly Asn Thr Asn Asp Leu 185 Glu Gin Leu Gin Cys Lys 190
Ala Val Pro Val 195 Asn Ala Ser Asp Pro Leu 200 Leu Val Glu Trp Val Arg 205
Tyr Asp 210 Ala Asn Pro Ile Leu 215 Tyr Ala Pro Ser Gly 220 Ile Gly Leu Thr
Asp 225 Tyr Arg Asp Pro Ser Thr 230 Val Trp Thr Gly 235 Pro Asp Gly Lys His 240
Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys 245 Arg Asn Thr 250 Thr Gly Leu Val Leu Val 255
Tyr His Thr Thr 260 Asp Phe Thr Asn Tyr Val 265 Met Leu Asp Glu Pro Leu 270
-27 CZ 299825 B6
His Ser Val 275 Pro Asn Thr Asp Met 280 Trp Glu Cys Val Asp Leu 285 Tyr Pro
Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro
290 295 300
Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp
305 310 315 320
Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe Asn Asp Lys Trp Thr Pro
325 330 335
Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly
340 345 350
Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg
355 360 365
Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gin Asp Val
370 375 380
Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu
385 390 395 400
Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gin Trp Pro Val Glu Glu Ile
405 410 415
Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn Ile Thr Leu Glu
420 425 430
Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly Ser Ala Thr Gin Leu Asp
435 440 445
Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser
450 455 460
Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys
465 470 475 480
Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr
485 490 495
Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys
500 505 510
Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr
515 520 525
Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu
530 535 540
28CZ 299825 B6
Asp 545 Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val
550 555 560
Glu Gly Phe Ala Gin 565 Gly Gly Arg Thr Val 570 Ile Thr Ser Arg Val 575 Tyr
Pro Thr Lys Ala 530 Ile Tyr Glu Ala Ala 5Θ5 Lys Leu Phe Val Phe 590 Asn Asn
Ala Thr Thr 595 Thr Ser Val Lys Ala 600 Thr Leu Lys Val Trp 605 Gin Met Ser
Gin Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe
610 615

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Molekula nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (FFT) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměru více než 20 fruklosylových zbytků, přičemž molekula nukleové kyseliny je vybrána ze skupiny zahrnující:
    io (a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako id. č. 2 a id, ě. 4;
    (b) molekuly nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci uvedenou jako id. ě. 1 nebo id. ě. 3, nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci:
    (c) molekuly nukleové kyseliny obsahující nuklcotidovou sekvenci přinejmenším z 80 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. č. I;
    (d) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci přinej20 menším z 85 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. č. 2: a (e) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotídové sekvence zčásti (a), (b). (c) nebo (d).
  2. 2? 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která obsahuje nuklcotidovou sekvenci zvíce než 90 % identickou s kódující sekvencí uvedenou v id. ě. 1.
  3. 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1. kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 90 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
    3(i
  4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 95 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
  5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku I, kde aminokyselinová sekvence kódovaného
    55 proteinu je z více než 97 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. ě. 2.
  6. 6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1. kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než 99 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
    40
  7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároků 1 až 6, kterou je molekula DNA.
  8. 8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, kterou je molekula cDNA.
  9. 9. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 6, kterou je molekula RNA.
  10. 10. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 9. která pochází z artyeoku.
  11. 11. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků I až 10.
    so
  12. 12. Vektor podle nároku 11. kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotiekýeh a/nebo eukaryotických buňkách.
  13. 13. Vektor podle nároku 12. kde regulační prvky jsou odvozeny z promotoru B33 genu patatinu
    55 nebo promotoru 35S CaMV.
    -30CZ 299825 B6
  14. 14, Hostitelská buňka transformovaná molekulou nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10. nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, nebo buňka, která je odvozena z takové buňky, kde tyto odvozené buňky obsahují uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo
    5 uvedeny vektor.
  15. 15. Hostitelská buňka podle nároku 14, která navíe obsahuje gen kódující sacharózofruktosyb transferázu (SST) závislou na sacharóze.
    io
  16. 16. Způsob přípravy FFT, vyznačující se tím, že hostitelské buňky podle nároku 14 se kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT, a pak se FFT izoluje zkultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
  17. 17. FFI kódovaná molekulou nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, nebo při15 pravená způsobem podle nároku 16.
  18. 18. Způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk podle nároku 14 nebo 15. zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiv a transgenních rostlin, vyznačující se tím. žc obsahuje krok, kdy se vnese molekula nukíeové kyseliny podle
    2o kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
  19. 19. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují molekulu nukíeové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků I až 10, nebo vektor
    25 podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, nebo které jsou připravitelné způsobem podle nároku 18, nebo které jsou odvozeny z takových buněk, pletiv nebo rostlin, kde uvedená odvozená buňka, pletivo nebo rostlina obsahuje uvedenou molekulu nukíeové kyseliny nebo uvedený vektor.
  20. 20. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostli.w na podle nároku 19, které navíc obsahují gen kódující sacharózefruktosyl-transferázu (SST) závislou na sacharóze.
  21. 21. Rostlina obsahující rostlinné buňky nebo rostlinné pletivo podle nároku 19 nebo 20.
    35
  22. 22, Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 19 až 21. kterou je užitková rostlina.
  23. 23. Rostlina podle nároku 22. kde užitková rostlina je rostlina obsahující sacharózu.
  24. 24. Množitelský materiál rostlin podle kteréhokoliv z nároku 19 až 23, obsahující rostlinné buň4íi ky podle nároku 19 nebo 20.
  25. 25. Sklizňové produkty rostlin podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23, obsahující rostlinné buňky podle nároku 19 nebo 20.
    45
  26. 26. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu, jehož molekuly obsahují v průměru více než
    20 fruktosylových zbytků, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) kultivaci transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva podle nároku 19 nebo 20, nebo rostliny podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23 za podmínek,
    50 které umožňují tvorbu FF I a přeměnu I-kestózy. případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na tento vysokomolekulární inulin. a (b) izolováni takto vytvořeného inulinu zkultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.
  27. 27. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruktosylových zbytků, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) přivedení 1-kestózy nebo ekvivalentního substrátu do kontaktu s FFT podle nároku 17 za 5 podmínek, které umožňují přeměnu na tento vysokomolekulární inulin, a (b) izolování takto vytvořeného inulinu.
  28. 28. Způsob in vitro výroby vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru io více než 20 fruktosylových zbytků, vyznačující sc tím. žc se saeharóza, jakožto substrát, přemění na vysokomolekulární inulin působením kombinace enzymů obsahující SST a FFT podle nároku 17.
  29. 29. Použití vysokomolekulárního inulinu. jehož molekuly obsahují v průměru více než 20 fruk15 losy lovýeh zbytků, připravitelného z hostitelské buňky, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva podle nároku 19 nebo 20, z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 19 až 23, z množitelskcho materiálu podle nároku 24, nebo ze sklizňového produktu podle nároku 25, nebo za pomoci způsobu podle kteréhokoliv z nároku 26 až 28 k výrobě surfaktantů ke zvýšení viskozity vodných systému, jako detergentů. suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo
    20 vázání vody.
CZ20001680A 1997-11-06 1998-11-06 Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná CZ299825B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19749122A DE19749122A1 (de) 1997-11-06 1997-11-06 Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20001680A3 CZ20001680A3 (cs) 2000-10-11
CZ299825B6 true CZ299825B6 (cs) 2008-12-03

Family

ID=7847857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20001680A CZ299825B6 (cs) 1997-11-06 1998-11-06 Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6559356B1 (cs)
EP (1) EP1029067B1 (cs)
JP (1) JP4287046B2 (cs)
CN (1) CN1202255C (cs)
AR (1) AR017767A1 (cs)
AT (1) ATE427357T1 (cs)
AU (1) AU753390B2 (cs)
BR (2) BRPI9816319B1 (cs)
CA (1) CA2309133C (cs)
CZ (1) CZ299825B6 (cs)
DE (2) DE19749122A1 (cs)
DK (1) DK1029067T3 (cs)
ES (1) ES2324188T3 (cs)
HU (1) HU226813B1 (cs)
PL (1) PL194854B1 (cs)
WO (1) WO1999024593A1 (cs)
ZA (1) ZA9810110B (cs)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0952222A1 (en) 1998-04-17 1999-10-27 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile
DE19840028A1 (de) * 1998-09-02 2000-03-09 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung
DE19857654A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Max Planck Gesellschaft Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine
US6791015B2 (en) 2000-10-30 2004-09-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructan biosynthetic enzymes
MXPA03005645A (es) * 2000-12-21 2004-04-21 Suedzucker Ag Procedimiento para la preparacion de carbohidratos.
EP1597978A1 (en) 2004-05-17 2005-11-23 Nutricia N.V. Synergism of GOS and polyfructose
AR052059A1 (es) 2004-12-21 2007-02-28 Bayer Cropscience Gmbh Plantas de cana azucarera con contenido incrementado de carbohidratos de almacenamiento
FR2888971B1 (fr) * 2005-07-20 2007-11-02 Nicolas Bara Procede d'identification sequentielle d'echantillons
JP5415939B2 (ja) * 2006-04-28 2014-02-12 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 超長鎖のイヌリン
ES2356690T3 (es) * 2006-04-28 2011-04-12 Bayer Cropscience Ag Inulina de longitud de cadena muy larga.
DE602007014037D1 (de) * 2006-04-28 2011-06-01 Bayer Corpscience Ag Inulin mit sehr grosser kettenlänge
EP2016104B1 (en) * 2006-04-28 2010-12-22 Bayer CropScience AG Inulin of very high chain length
CL2007003744A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
CL2007003743A1 (es) * 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
JP2010520900A (ja) 2007-03-12 2010-06-17 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト フェノキシ置換されたフェニルアミジン誘導体及び殺真菌剤としてのその使用
US8080688B2 (en) * 2007-03-12 2011-12-20 Bayer Cropscience Ag 3, 4-disubstituted phenoxyphenylamidines and use thereof as fungicides
EP1969934A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969929A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010520899A (ja) 2007-03-12 2010-06-17 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト ジハロフェノキシフェニルアミジン及び殺真菌剤としてのその使用
EP1969931A1 (de) * 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010524869A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト チアジアゾリルオキシフェニルアミジンおよび殺菌剤としてのこれらの使用
DE102007045919B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045922A1 (de) 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045956A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045920B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistische Wirkstoffkombinationen
DE102007045953B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2090168A1 (de) 2008-02-12 2009-08-19 Bayer CropScience AG Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2072506A1 (de) 2007-12-21 2009-06-24 Bayer CropScience AG Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2168434A1 (de) 2008-08-02 2010-03-31 Bayer CropScience AG Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
EP2321262A1 (de) 2008-08-14 2011-05-18 Bayer CropScience AG Insektizide 4-phenyl-1h-pyrazole
DE102008041695A1 (de) 2008-08-29 2010-03-04 Bayer Cropscience Ag Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2201838A1 (de) 2008-12-05 2010-06-30 Bayer CropScience AG Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2198709A1 (de) 2008-12-19 2010-06-23 Bayer CropScience AG Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge
EP2223602A1 (de) 2009-02-23 2010-09-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen
EP2204094A1 (en) 2008-12-29 2010-07-07 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction
AU2009335333B2 (en) 2008-12-29 2015-04-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Method for improved use of the production potential of genetically modified plants
EP2039770A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039771A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039772A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
PL2391608T3 (pl) 2009-01-28 2013-08-30 Bayer Ip Gmbh Pochodne N-cykloalkilo-N-bicyklometyleno-karboksyamidów jako środki grzybobójcze
AR075126A1 (es) 2009-01-29 2011-03-09 Bayer Cropscience Ag Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas
US8372982B2 (en) 2009-02-17 2013-02-12 Bayer Cropscience Ag Fungicidal N-(Phenylcycloalkyl)carboxamide, N-(Benzylcycloalkyl)carboxamide and thiocarboxamide derivatives
EP2218717A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Bayer CropScience AG Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives
TW201031331A (en) 2009-02-19 2010-09-01 Bayer Cropscience Ag Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance
BRPI0924986A8 (pt) 2009-03-25 2016-06-21 Bayer Cropscience Ag "combinações de substâncias ativas com propriedades inseticidas e acaricidas, seus usos e método para o controle de pragas animais".
EP2410850A2 (de) 2009-03-25 2012-02-01 Bayer Cropscience AG Synergistische wirkstoffkombinationen
BRPI0924436B1 (pt) 2009-03-25 2017-06-06 Bayer Cropscience Ag combinações de substâncias ativas com propriedades inseticidas e acaricidas e seu uso, bem como método para o controle de pragas e animais
BRPI0924839B1 (pt) 2009-03-25 2018-03-20 Bayer Intellectual Property Gmbh Combinações de substâncias ativas com propriedades inseticidas e acaricidas, seus usos e método para o controle de praga animais
EP2232995A1 (de) 2009-03-25 2010-09-29 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
BRPI0924451B1 (pt) 2009-03-25 2017-12-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Combinations of active substances and their uses, as well as methods for the control of animal pests and method for the manufacture of insecticides and acaricides
EP2239331A1 (en) 2009-04-07 2010-10-13 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
JP5771189B2 (ja) 2009-05-06 2015-08-26 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ シクロペンタンジオン化合物、ならびにこの殺虫剤、殺ダニ剤および／または抗真菌剤としての使用
EP2251331A1 (en) 2009-05-15 2010-11-17 Bayer CropScience AG Fungicide pyrazole carboxamides derivatives
AR076839A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Bayer Cropscience Ag Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas
EP2255626A1 (de) 2009-05-27 2010-12-01 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
EP2437595B1 (de) 2009-06-02 2018-10-31 Bayer CropScience AG Verwendung von fluopyram zur kontrolle von sclerotinia ssp
CN102510721B (zh) 2009-07-16 2014-11-19 拜尔农作物科学股份公司 含苯基三唑的协同活性物质结合物
WO2011015524A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Bayer Cropscience Ag Fungicide heterocycles derivatives
EP2292094A1 (en) 2009-09-02 2011-03-09 Bayer CropScience AG Active compound combinations
EP2343280A1 (en) 2009-12-10 2011-07-13 Bayer CropScience AG Fungicide quinoline derivatives
EP2519502A2 (en) 2009-12-28 2012-11-07 Bayer CropScience AG Fungicidal hydroximoyl-heterocycles derivatives
JP5782657B2 (ja) 2009-12-28 2015-09-24 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 殺菌剤ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体
US8796463B2 (en) 2009-12-28 2014-08-05 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
BR112012018108A2 (pt) 2010-01-22 2015-10-20 Bayer Ip Gmbh combinações acaricidas e/ou inseticidas de ingredientes ativos
EP2542533B1 (de) 2010-03-04 2014-09-10 Bayer Intellectual Property GmbH Fluoralkyl-substituierte 2-amidobenzimidazole und deren verwendung zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
CN102933078A (zh) 2010-04-06 2013-02-13 拜耳知识产权有限责任公司 4-苯基丁酸和/或其盐用于提高植物应激耐受性的用途
MX342482B (es) 2010-04-09 2016-09-30 Bayer Ip Gmbh Uso de derivados de acido (1-cianociclopropil)-fenilfosfinico, sus esteres y/o sus sales para potenciar la tolerancia de plantas al estres abiotico.
WO2011134911A2 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
WO2011134912A1 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives
JP2013525401A (ja) 2010-04-28 2013-06-20 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺菌剤ヒドロキシモイル−複素環誘導体
BR112012030607B1 (pt) 2010-06-03 2018-06-26 Bayer Cropscience Ag Composto, composição fungicida e método para controlar fungos fitopatogênicos de culturas
UA110703C2 (uk) 2010-06-03 2016-02-10 Байєр Кропсайнс Аг Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду
ES2533026T3 (es) 2010-06-03 2015-04-07 Bayer Intellectual Property Gmbh N-[(het)arilalquil)]pirazol (tio)carboxamidas y sus análogos heterosustituidos
SG185668A1 (en) 2010-06-09 2012-12-28 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
CA2801834A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Kathleen D'halluin Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
EP2595961B1 (en) 2010-07-20 2017-07-19 Bayer Intellectual Property GmbH Benzocycloalkenes as antifungal agents
PL2611300T3 (pl) 2010-09-03 2016-10-31 Podstawione skondensowane pochodne dihydropirymidynonów
AU2011306889C1 (en) 2010-09-22 2015-11-19 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of active ingredients for controlling nematodes in nematode-resistant crops
EP2460406A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops
JP5977242B2 (ja) 2010-10-07 2016-08-24 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト テトラゾリルオキシム誘導体とチアゾリルピペリジン誘導体を含んでいる殺菌剤組成物
CN103313977B (zh) 2010-10-21 2015-06-03 拜耳知识产权有限责任公司 1-(杂环羰基)哌啶
RU2013123057A (ru) 2010-10-21 2014-11-27 Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх N-бензил гетероциклические карбоксамиды
UA109460C2 (uk) 2010-11-02 2015-08-25 Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх N-гетарилметилпіразолілкарбоксаміди
BR112013012081A2 (pt) 2010-11-15 2016-07-19 Bayer Ip Gmbh 5-halogenopirazol (tio) carboxamidas
EP2640706B1 (en) 2010-11-15 2017-03-01 Bayer Intellectual Property GmbH N-aryl pyrazole(thio)carboxamides
CN107266368A (zh) 2010-11-15 2017-10-20 拜耳知识产权有限责任公司 5‑卤代吡唑甲酰胺
EP3372081A3 (en) 2010-12-01 2018-10-24 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Use of fluopyram for controlling nematodes in crops
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
EP2474542A1 (en) 2010-12-29 2012-07-11 Bayer CropScience AG Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2658853A1 (en) 2010-12-29 2013-11-06 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2471363A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Bayer CropScience AG Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2494867A1 (de) 2011-03-01 2012-09-05 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden
US20130345058A1 (en) 2011-03-10 2013-12-26 Wolfram Andersch Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds
EP2686311A1 (en) 2011-03-14 2014-01-22 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
BR112013025871A2 (pt) 2011-04-08 2016-07-26 Bayer Ip Gmbh composto de fórmula (i) e sua utilização, composição para o controle dos fungos nocivos fitopatogênicos, método para o controle de fungos fitopatogênicos das culturas e processo para a produção das composições
EP2511255A1 (de) 2011-04-15 2012-10-17 Bayer CropScience AG Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate
AR085568A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas
AR085585A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
AR090010A1 (es) 2011-04-15 2014-10-15 Bayer Cropscience Ag 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento
HUE043158T2 (hu) 2011-04-22 2019-08-28 Bayer Cropscience Ag (Tio)karboxamid-származékot és fungicid vegyületet tartalmazó hatóanyag készítmények
EP2718443B1 (en) 2011-06-06 2017-11-29 Bayer CropScience NV Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
JP2014520776A (ja) 2011-07-04 2014-08-25 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 植物における非生物的ストレスに対する活性薬剤としての置換されているイソキノリノン類、イソキノリンジオン類、イソキノリントリオン類およびジヒドロイソキノリノン類または各場合でのそれらの塩の使用
EP2549788B1 (en) 2011-07-22 2016-10-12 Thales A method for managing single channel spatial reuse in the presence of potentially disruptive nodes in a mobile ad-hoc network
BR112014002855A2 (pt) 2011-08-10 2017-02-21 Bayer Ip Gmbh combinações do composto ativo que incluem derivados específicos do ácido tetrâmico
CN103890181A (zh) 2011-08-22 2014-06-25 拜尔作物科学公司 修饰植物基因组的方法和手段
JP2014524455A (ja) 2011-08-22 2014-09-22 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 殺真菌性ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
CN103781353B (zh) 2011-09-09 2016-10-19 拜耳知识产权有限责任公司 用于改良植物产量的酰基高丝氨酸内酯衍生物
JP6002225B2 (ja) 2011-09-12 2016-10-05 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ 殺菌性４−置換−３−｛フェニル［（ヘテロシクリルメトキシ）イミノ］メチル｝−１，２，４−オキサジアゾール−５（４ｈ）−オン誘導体
BR112014006208B1 (pt) 2011-09-16 2018-10-23 Bayer Intellectual Property Gmbh método de indução de respostas reguladoras do crescimento nas plantas aumentando o rendimento de plantas úteis ou plantas de cultura e composição de aumento do rendimento da planta compreendendo isoxadifen-etilo ou isoxadifeno e combinação de fungicidas
AU2012307321B2 (en) 2011-09-16 2016-07-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
BR112014005990B1 (pt) 2011-09-16 2019-12-31 Bayer Ip Gmbh método para induzir uma resposta específica de regulação do crescimento de plantas
EP2757886A1 (de) 2011-09-23 2014-07-30 Bayer Intellectual Property GmbH Verwendung 4-substituierter 1-phenyl-pyrazol-3-carbonsäurederivate als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
EA028662B1 (ru) 2011-10-04 2017-12-29 Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх Рнк-интерференция для борьбы с грибами и оомицетами путем ингибирования гена сахаропиндегидрогеназы
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
US9617286B2 (en) 2011-11-21 2017-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicide N-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives
CA2857438A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal n-bicycloalkyl and n-tricycloalkyl (thio)carboxamide derivatives
IN2014CN04325A (cs) 2011-12-19 2015-09-04 Bayer Cropscience Ag
IN2014DN06122A (cs) 2011-12-29 2015-08-14 Bayer Ip Gmbh
US9556158B2 (en) 2011-12-29 2017-01-31 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2H)-one derivatives
CN104244714B (zh) 2012-02-22 2018-02-06 拜耳农作物科学股份公司 琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhi)用于防治葡萄中的木材病害的用途
CA2865300C (en) 2012-02-27 2021-02-16 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations containing a thiazoylisoxazoline and a fungicide
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
JP2015517996A (ja) 2012-04-12 2015-06-25 バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ 殺真菌剤として有用なｎ−アシル−２−（シクロ）アルキルピロリジンおよびピペリジン
KR102062517B1 (ko) 2012-04-20 2020-01-06 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 Ｎ-시클로알킬-ｎ-［（헤테로시클릴페닐）메틸렌］-（티오）카르복사미드 유도체
JP2015516396A (ja) 2012-04-20 2015-06-11 バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（三置換シリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体
US11518997B2 (en) 2012-04-23 2022-12-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome engineering in plants
WO2013167544A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
BR112014027643B1 (pt) 2012-05-09 2019-04-24 Bayer Cropscience Ag Pirazole-indanil-carboxamidas.
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
EP2871958A1 (en) 2012-07-11 2015-05-20 Bayer CropScience AG Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress
BR112015004858A2 (pt) 2012-09-05 2017-07-04 Bayer Cropscience Ag uso de 2-amidobenzimidazóis, 2-amidobenzoxazóis e 2-amidobenzotiazóis substituídos ou sais dos mesmos como substâncias ativas contra estresse abiótico em plantas
CN105357967B (zh) 2012-10-19 2019-02-19 拜尔农科股份公司 使用羧酰胺衍生物促进植物生长的方法
CA2888559C (en) 2012-10-19 2021-03-02 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
DK2908641T3 (da) 2012-10-19 2018-04-23 Bayer Cropscience Ag Fremgangsmåde til behandling af planter mod svampe, der er resistente over for fungicider, ved anvendelse af carboxamid- eller thiocarboxamidderivater
CA2888600C (en) 2012-10-19 2021-08-10 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
WO2014079957A1 (de) 2012-11-23 2014-05-30 Bayer Cropscience Ag Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
CA2892701A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary pesticidal and fungicidal mixtures
WO2014083089A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Ternary fungicidal and pesticidal mixtures
US9775349B2 (en) 2012-11-30 2017-10-03 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal or pesticidal mixture
JP6359551B2 (ja) 2012-11-30 2018-07-18 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 三元殺菌剤混合物
EP2925136A2 (en) 2012-11-30 2015-10-07 Bayer CropScience AG Binary fungicidal mixtures
EP2740720A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
CN105072903A (zh) 2012-12-05 2015-11-18 拜耳作物科学股份公司 取代的1-(芳基乙炔基)-环己醇、1-(杂芳基乙炔基)-环己醇、1-(杂环基乙炔基)-环己醇和1-(环烯基乙炔基)-环己醇用作抵抗非生物植物胁迫的活性剂的用途
EP2740356A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
IN2015DN04206A (cs) 2012-12-19 2015-10-16 Bayer Cropscience Ag
US20160016944A1 (en) 2013-03-07 2016-01-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Fungicidal 3--heterocycle derivatives
EP2981614A1 (en) 2013-04-02 2016-02-10 Bayer CropScience NV Targeted genome engineering in eukaryotes
BR112015025331A2 (pt) 2013-04-12 2017-07-18 Bayer Cropscience Ag novos derivados de triazolintiona
CN105308032B (zh) 2013-04-12 2017-05-24 拜耳作物科学股份公司 新的三唑衍生物
CN105555135B (zh) 2013-04-19 2018-06-15 拜耳作物科学股份公司 涉及邻苯二甲酰胺衍生物应用的用于改善对转基因植物生产潜能的利用的方法
JP2016519687A (ja) 2013-04-19 2016-07-07 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト バイナリー殺虫または農薬混合物
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
EP3013802B1 (en) 2013-06-26 2019-08-14 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
US20160150782A1 (en) 2013-07-09 2016-06-02 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of selected pyridone carboxamides or salts thereof as active substances against abiotic plant stress
US10071967B2 (en) 2013-12-05 2018-09-11 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
US10070645B2 (en) 2013-12-05 2018-09-11 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
AR101214A1 (es) 2014-07-22 2016-11-30 Bayer Cropscience Ag Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas
CN104145825B (zh) * 2014-09-04 2016-04-13 东莞市睿绅生物技术有限公司 朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法
AR103024A1 (es) 2014-12-18 2017-04-12 Bayer Cropscience Ag Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas
EP3283476B1 (en) 2015-04-13 2019-08-14 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives
EP3436575A1 (en) 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11306337B2 (en) 2015-11-12 2022-04-19 Ctc—Centro De Tecnologia Canavieira S.A. Polypeptides having hydrolytic activity on 1-kestose in the presence of sucrose but lacking sucrase (invertase) activity, polynucleotides encoding same and methods of producting and using same in industrial sucrose production from 1-kestose
US20190159451A1 (en) 2016-07-29 2019-05-30 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
BR112019005668A2 (pt) 2016-09-22 2019-06-04 Bayer Ag novos derivados de triazol
WO2018054829A1 (en) 2016-09-22 2018-03-29 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives and their use as fungicides
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN106617081B (zh) * 2016-09-26 2020-08-04 江南大学 长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用
WO2018077711A2 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of pyraziflumid for controlling sclerotinia spp in seed treatment applications
CA3046145A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of insecticides for controlling wireworms
WO2018108627A1 (de) 2016-12-12 2018-06-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
EP3332645A1 (de) 2016-12-12 2018-06-13 Bayer Cropscience AG Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2018204777A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes
US12297436B2 (en) 2017-05-18 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2019025153A1 (de) 2017-07-31 2019-02-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
EP3684397A4 (en) 2017-09-21 2021-08-18 The Broad Institute, Inc. SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED EDITION OF NUCLEIC ACIDS
EP3728575A4 (en) 2017-12-22 2021-11-24 The Broad Institute, Inc. CAS12B SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SPECIFIC EDITING OF DNA BASES
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
US20210323950A1 (en) 2018-06-04 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Herbicidally active bicyclic benzoylpyrazoles
CA3124110A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
US20220372501A1 (en) * 2019-09-24 2022-11-24 Ginkgo Bioworks, Inc. Production of oligosaccharides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994014970A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-07 Stichting Scheikundig Onderzoek In Nederland Method for obtaining transgenic plants showing a modified fructan pattern
EP0627490A1 (de) * 1993-05-17 1994-12-07 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Verfahren zur Herstellung von langkettigem Inulin
WO1996021023A1 (en) * 1995-01-06 1996-07-11 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) Dna sequences encoding carbohydrate polymer synthesizing enzymes and method for producing transgenic plants
DE19617687A1 (de) * 1996-05-03 1997-11-06 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL100908A0 (en) * 1991-02-22 1992-11-15 Salk Inst Biotech Ind Invertase genes and their use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994014970A1 (en) * 1992-12-28 1994-07-07 Stichting Scheikundig Onderzoek In Nederland Method for obtaining transgenic plants showing a modified fructan pattern
EP0627490A1 (de) * 1993-05-17 1994-12-07 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Verfahren zur Herstellung von langkettigem Inulin
WO1996021023A1 (en) * 1995-01-06 1996-07-11 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) Dna sequences encoding carbohydrate polymer synthesizing enzymes and method for producing transgenic plants
DE19617687A1 (de) * 1996-05-03 1997-11-06 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lüscher M. et al.: "Inulin synthesis by a combination of purified fructosyltransferase from tubers of Helianthus tuberosus", FEBS lett 385, 39û42, 1996 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR9813968A (pt) 2000-09-26
AR017767A1 (es) 2001-10-24
JP2001521757A (ja) 2001-11-13
EP1029067B1 (en) 2009-04-01
PL340364A1 (en) 2001-01-29
DE19749122A1 (de) 1999-06-10
CN1280624A (zh) 2001-01-17
HUP0100111A3 (en) 2003-04-28
AU753390B2 (en) 2002-10-17
DE69840704D1 (de) 2009-05-14
HU226813B1 (en) 2009-11-30
US7083963B2 (en) 2006-08-01
JP4287046B2 (ja) 2009-07-01
CZ20001680A3 (cs) 2000-10-11
CN1202255C (zh) 2005-05-18
BRPI9816319B1 (pt) 2016-05-17
BR9813968B1 (pt) 2011-03-09
DK1029067T3 (da) 2009-06-22
US6559356B1 (en) 2003-05-06
EP1029067A1 (en) 2000-08-23
PL194854B1 (pl) 2007-07-31
HUP0100111A2 (hu) 2001-05-28
CA2309133C (en) 2011-09-06
ES2324188T3 (es) 2009-07-31
ZA9810110B (en) 1999-05-05
ATE427357T1 (de) 2009-04-15
WO1999024593A1 (en) 1999-05-20
US20040014092A1 (en) 2004-01-22
CA2309133A1 (en) 1999-05-20
AU1667499A (en) 1999-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ299825B6 (cs) Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná
JP4101304B2 (ja) フルクトシルポリメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子
AU699552B2 (en) DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alpha-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms
EP0816503B1 (en) Alpha-1-6 fucosyltransferases
HU226140B1 (en) Dna molecules that code for enzymes involved in strach synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules
JP4659983B2 (ja) フルクトース転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸分子、およびその使用
CN1809636B (zh) 耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
JPH11123080A (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物
AU777455B2 (en) Nucleic acid molecules from artichoke (cynara scolymus) encoding enzymes having fructosyl polymerase activity
HK1034286A (en) Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin
AU2002314061B2 (en) DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules
JPH1084973A (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20131106