JPH1084973A - ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 - Google Patents

ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物

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JPH1084973A
JPH1084973A JP9111124A JP11112497A JPH1084973A JP H1084973 A JPH1084973 A JP H1084973A JP 9111124 A JP9111124 A JP 9111124A JP 11112497 A JP11112497 A JP 11112497A JP H1084973 A JPH1084973 A JP H1084973A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ラフィノース合成酵素を同定し、効率のよい
ラフィノースの製造法を提供する。 【解決手段】 下記性質を有するラフィノース合成酵素
をスクロースとガラクチノールに作用させ、ラフィノー
スを生成させる。(1)作用及び基質特異性:スクロー
スとガラクチノールからラフィノースを生成する。
(2)至適pH:約6〜8 (3)至適温度:約35〜40℃ (4)分子量: ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子
量:約75kDa〜95kDa ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Native P
AGE)により測定される分子量:約90kDa〜10
0kDa 還元条件下におけるSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(SDS−PAGE)により測定される分子
量:約90kDa〜100kDa (5)阻害:ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミ
ド、ミオイノシトールにより阻害される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラフィノース合成
酵素、ラフィノース合成酵素もしくはラフィノース合成
酵素を含む細胞抽出物を用いたラフィノースを合成する
方法、ラフィノース合成酵素をコードするDNA、及び
このDNAの植物における利用に関する。ラフィノース
は、ビフィズス菌増殖活性を有し食品原料として、ある
いは臓器保存液などの医薬品として様々な分野で利用さ
れている.
【0002】
【従来の技術】ラフィノースは、スクロースのグルコシ
ル基にガラクトースがα−1,6結合したラフィノース
族オリゴ糖の一つである。ラフィノース属オリゴ糖に
は、ラフィノースの他に、ガラクトースが2つ結合した
スタキオース、3つ結合したベルバスコースなどがあ
る。これらの糖は、豆類、ナタネ、綿実など様々な植物
の種子中の貯蔵糖と、キュウリやメロンなどウリ科植物
にみられる転流糖として、また耐冷性を獲得したロゼッ
ト葉、甜菜(サトウダイコン)など植物に広く存在す
る。
【0003】ラフィノース族オリゴ糖の生合成は、次の
ようであり、 UDP-カ゛ラクトース + ミオイノシトール → カ゛ラクチノール + UDP ・・・(a) カ゛ラクチノール + スクロース → ラフィノース + ミオイノシトール ・・・(b) カ゛ラクチノール + ラフィノース → スタキオース + ミオイノシトール ・・・(c) 各々の反応は(a)ガラクチノール合成酵素(GS:EC
2.4.1.123)、(b)ラフィノース合成酵素(RS:EC
2.4.1.82)(c)スタキオース合成酵素(STS:EC2.
4.1.67)により触媒される。
【0004】現在、ラフィノースは、甜菜から抽出さ
れ、スクロース精製過程において分離精製されている。
しかし、ラフィノースはスクロースの結晶性を低下させ
るので、甜菜は低ラフィノースを目標に育種、改良さ
れ、甜菜中のラフィノース含量は0.03%から0.1
6%(Enzyme Microb. Technol., Vol.4 May, 130-135
(1982))と低い。従って、このような低含量の甜菜より
効率的にラフィノースを得るのは容易ではない。
【0005】先に述べたように、ラフィノースは、ダイ
ズをはじめとするマメ科の成熟種子に含まれているほ
か、甜菜、あるいはキュウリなどのウリ科植物に含まれ
ている。ダイズの成熟種子中には、ダイズオリゴ糖とし
て、スクロース(含有量約5%)、スタキオース(同約
4%)、ラフィノース(同約1%)が含まれている。こ
れらのダイズオリゴ糖は、脱脂ダイズから除蛋白した画
分に回収され、濃縮後、機能性食品などに利用されてい
る。しかし、オリゴ糖全体の中でもラフィノースは10
%であり、量的にも少ない。
【0006】一方、ラフィノースの酵素的合成法も報告
されている(Trends in Glycoscience and Glycotechno
logy 7.34, 149-158(1995))。これは、α-ガラクトシ
ダーゼの縮合反応によりガラクトビオースを合成し、さ
らにこのガラクトビオースをガラクトシル基の供与体と
してスクロースにガラクトシル転移反応により転移させ
て、ラフィノースを合成する方法である。しかし、この
反応は、乳糖加水分解物1.9kgよりガラクトビオー
スが350g合成され、ガラクトビオース190gとス
クロース760gよりラフィノース100gが得られる
反応であり、生成するラフィノースの収率が低く、効率
的な合成法には至っていない。
【0007】以上のような方法の他に、生合成系酵素遺
伝子の形質転換により、ラフィノース含量の高い植物を
育種する方法も考えられる。例えば、Kerrらはガラ
クチノール合成酵素遺伝子をクローニングし、ナタネを
形質転換した(WO93/02196)。しかし、その結果、GS
活性は増加したが、ラフィノース族オリゴ糖は逆に低下
し、ガラクチノール合成酵素を導入することによるラフ
ィノース族オリゴ糖の生合成を増加させるという目的は
達成されなかった。したがって、植物のラフィノース族
オリゴ糖の含量を増加させるする方法は提供されていな
い。
【0008】一方、ラフィノ―ス族オリゴ糖を低減化す
ることも求められている。先に述ベたように、ラフィノ
ース族オリゴ糖は、主に、ダイズなど豆類、ナタネ、綿
実など様々な植物の種子中の貯蔵糖と、キュウリやメロ
ンなどウリ科植物にみられる転流糖として、また、耐冷
性を獲得したロゼット葉、甜菜、など植物に広く存在す
るが、ダイズ、ナタネ、綿菜などの搾油されたミールに
は、これらのラフィノース族オリゴ糖が含まれている。
これらミールのほとんどは、飼料として利用されている
が、α−ガラクトシダーゼを持たないヒトや動物は、直
接ラフィノース族オリゴ糖を消化することはできない。
さらに、ラフィノース族オリゴ糖は、腸内細菌が資化し
ガスを発生させるなどにより、飼料の代謝エネルギー効
率を低下させることが知られており、飼料中のラフィノ
ース族オリゴ糖を除くことで、トリの飼料効率が上昇し
たと報告されている(Coon, Proceeding Soybean Utili
zation Alternatives. Univrsity of Minnesota, 203-2
11 (1989))。このようなことから、ラフィノース族オ
リゴ糖の減少したダイズ、ナタネ、綿実などの飼料作物
が望まれている。
【0009】また、これらの植物の中では、油の含量を
多くする育種がなされてきた。光合成産物は、油脂、蛋
白質、ラフィノース族オリゴ糖を含む糖質に分配されて
いる。ダイズでは、油脂量と糖質量に逆の相関があるこ
とが報告されている。ラフィノース族オリゴ糖の生成を
抑制することにより、同じ光合成の能カのダイズにおい
て油脂含量を増加させることが期待できる。
【0010】以上の観点から、Kerrらは、交配選抜
育種により、ラフィノース族オリゴ糖が80%から90
%低下した低ラフィノース族オリゴ糖ダイズ品種を作出
したと報告している(WO93/00742)。しかしこれは、品
種の作出であり、栽培適性や、耐病性などに対応した様
々な品種に応用できるものではない。また、広く様々な
植物に適用できるものではない。
【0011】甜菜、サトウキビなどにも含まれるラフィ
ノースは、砂糖の結晶性を低下させることが知られてい
る。従って、ラフィノースの生成がなければ、これら植
物での砂糖の生成効率が上がることが期待できるが、ラ
フィノースを含まないテンサイは作出されていない。
【0012】上述したように、従来精製されたラフィノ
ース合成酵素は、酵素活性として確認されているのみで
あり、酵素の同定はなされていなかった。また、その活
性も低いものであり、活性の高いラフィノース合成酵素
が望まれていた。また、従来のラフィノースの製造法は
収率が低く、効率のよいラフィノースの製造法が望まれ
ていた。その一方で、ラフィノ―ス族オリゴ糖が低減化
された植物を育種することも望まれている。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、活性の高いラフィノース合成酵
素及びこれをコードするDNAの取得、効率的なラフィ
ノースの酵素的合成法、及びラフィノース合成酵素をコ
ードするDNAの植物における利用法を提供することを
課題とする。
【0014】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、キュウリからラ
フィノース合成酵素を精製することに成功した。また、
このラフィノース合成酵素をコードする遺伝子をクロー
ニングするために、本発明者らは鋭意検討を行った。そ
の結果、キュウリのラフィノース合成酵素ペプチド断片
のアミノ酸配列より推定した塩基配列をもとに一本鎖D
NAを化学合成し、この一本鎖合成DNAをプライマー
として、キュウリから抽出したpoly(A)+RNA
より作製したcDNAを鋳型としてPCRを行い、ラフ
ィノース合成酵素遺伝子に特異的なDNA断片を得た。
さらに、このDNA断片をプローブとしてキュウリ由来
cDNAライブラリーに対しハイブリダイゼーションを
行い、ラフィノース合成酵素遺伝子を単離する方法を採
用し、ラフィノース合成酵素遺伝子を単離した。この単
離したラフィノース合成酵素遺伝子断片を用い、植物で
発現可能な制御領域を有するキメラ遺伝子を作成し、植
物を形質転換した。さらに、導入したラフィノース合成
酵素遺伝子により、内在性ラフィノース合成酵素の機能
を制御し、ラフィノース族オリゴ糖の低減化した植物を
作出するに至った。すなわち本発明は、下記性質を有す
るラフィノース合成酵素を提供する。
【0015】(1)作用及び基質特異性:スクロースと
ガラクチノールからラフィノースを生成する。
【0016】(2)至適pH:約6〜8 (3)至適温度:約35〜40℃ (4)分子量: ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子
量:約75kDa〜95kDa ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Native P
AGE)により測定される分子量:約90kDa〜10
0kDa 還元条件下におけるSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(SDS−PAGE)により測定される分子
量:約90kDa〜100kDa (5)阻害:ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミ
ド、ミオイノシトールにより阻害される。
【0017】本発明は、上記ラフィノース合成酵素の具
体的な態様として、アミノ酸配列中に、配列表配列番号
1〜3に示す各アミノ酸配列を含むラフィノース合成酵
素を提供する。
【0018】また、本発明は、下記(A)又は(B)に
示すタンパク質であるラフィノース合成酵素を提供す
る。 (A)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 (B)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スク
ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
性を有するタンパク質。
【0019】本発明はまた、スクロース及びガラクチノ
ールに上記ラフィノース合成酵素を作用させてラフィノ
ースを生成させることを特徴とするラフィノースの製造
方法を提供する。
【0020】本発明はさらに、上記ラフィノース合成酵
素をコードするDNA、及び、下記(A)又は(B)に
示すタンパク質をコードするDNAを提供する。 (A)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 (B)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スク
ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
性を有するタンパク質。
【0021】本発明は、上記DNAの具体的態様とし
て、下記(a)又は(b)に示すDNAを提供する。
【0022】(a)配列表の配列番号4に記載の塩基配
列のうち、少なくとも塩基番号57〜2408からなる
塩基配列を含むDNA。 (b)配列表の配列番号4に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号57〜2408からなる塩基配列とス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスク
ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
性を有するタンパク質をコードするDNA。
【0023】さらに本発明は、ラフィノース合成酵素遺
伝子又はその一部と、植物細胞で発現可能な転写制御領
域とを含むキメラ遺伝子、及び、このキメラ遺伝子で形
質転換された植物を提供する。
【0024】また本発明は、前記キメラ遺伝子で植物を
形質転換し、この遺伝子を植物細胞内で発現させること
により、前記植物のラフィノース族オリゴ糖含量を変化
させる方法を提供する。
【0025】以下、上記(1)〜(5)に記載の性質を
有するラフィノース合成酵素、又は、上記(A)及び
(B)のタンパク質であるラフィノース合成酵素を、単
に「ラフィノース合成酵素」ということがある。また、
ラフィノース合成酵素をコードするDNA、又はラフィ
ノース合成酵素をコードし、さらに非翻訳領域を含むD
NAを、「ラフィノース合成酵素遺伝子」ということが
ある。
【0026】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【0027】<1>本発明のラフィノース合成酵素 本発明のラフィノース合成酵素は、下記性質を有する。
【0028】(1)作用及び基質特異性:スクロースと
ガラクチノールからラフィノースを生成する。
【0029】(2)至適pH:約6〜8 (3)至適温度:約35〜40℃ (4)分子量: ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子
量:約75kDa〜95kDa ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Native P
AGE)により測定される分子量:約90kDa〜10
0kDa 還元条件下におけるSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(SDS−PAGE)により測定される分子
量:約90kDa〜100kDa (5)阻害:ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミ
ド、ミオイノシトールにより阻害される。
【0030】上記の性質を有するラフィノース合成酵素
は、キュウリ本葉より単離、精製されたものであり、発
明者により初めて同定された。このキュウリ由来のラフ
ィノース合成酵素は、後記実施例に示すように、その酵
素タンパク質のアミノ酸配列中に、配列表配列番号1〜
3に示す各アミノ酸配列を含んでいる。また、その全ア
ミノ酸配列を、配列表配列番号5に示す。
【0031】ラフィノース合成酵素は、ウリ科植物、例
えばメロン(Cucumis melo)、キュウリ(Cucumis sati
vas)などの植物から得られる。特に、これらの植物の
葉、特に葉脈系、及び種子等の組織がラフィノース合成
酵素の含有量が多い。
【0032】次に、本発明のラフィノース合成酵素の製
造法の例として、キュウリからラフィノース合成酵素を
単離・精製する方法を説明する。播種後6〜10週間の
キュウリ本葉より、葉脈系を集め、液体窒素下で乳鉢等
を用いて磨砕し、緩衝液を加えて蛋白質を抽出する。そ
の際、ラフィノース合成酵素の分解、失活等を防ぐため
の物質、例えばPMSF(フェニルメタンスルフォニル
フルオリド)等のプロテアーゼ阻害剤や、ポリクラール
AT(セルバ(Serva)社製)等を加えてもよい。こ
の抽出液から濾過及び遠心分離により不溶物を除去し、
粗抽出液を得る。
【0033】上記のようにして得られる粗抽出液を、通
常のタンパク質の精製法、例えば、陰イオン交換クロマ
トグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、塩析等を組み合わせて分画することに
よって、ラフィノース合成酵素を精製することができ
る。
【0034】陰イオン交換クロマトグラフィーは、例え
ば、HiTrapQ(ファルマシア社製)等の強塩基性
陰イオン交換体や、DEAE−TOYOPEARL(東
ソー社製)等の弱塩基性陰イオン交換体を充填したカラ
ムを用いることによって行うことができる。ラフィノー
ス合成酵素を含む抽出液をこれらのカラムに通液させて
酵素をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩
濃度の緩衝液を用いて酵素を溶出させる。その際、段階
的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。
例えば、HiTrapQカラムを用いた場合には、カラ
ムに吸着したラフィノース合成酵素活性は、0.3M程
度のNaClで溶出される。また、DEAE−TOYO
PEARLでは溶出液として0.05M〜0.35Mの
NaCl濃度勾配が、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフィーでは溶出液として0.01M〜0.3Mのリ
ン酸濃度勾配が好ましい。
【0035】上記の操作の順は特に問わず、また、各操
作は2回又はそれ以上繰り返してもよい。また、それぞ
れのカラムに試料液を通液する前に、透析等によって試
料液を適当な緩衝液に交換しておくことが望ましい。さ
らに、それぞれの段階で試料液を濃縮してもよい。
【0036】精製の各段階においては、分画されたフラ
クション中に含まれるラフィノース合成酵素活性を測定
し、活性の高いフラクションを集めて次の段階に供試す
ることが好ましい。ラフィノース合成酵素活性を測定す
る方法としては、例えば、Lehle,H らにより報告されて
いる放射性同位体を用いる方法(Eur.J.Biochem.,38,10
3-110(1973))が挙げられる。また、この変法として、
反応温度と基質濃度を変更してもよい。例えば、最終濃
度として、10mM 14C-スクロース、20mM ガラ
クチノール、25mM HEPES(2-(4-(2-ヒト゛ロキシエチ
ル)-1-ヒ゜ヘ゜ラシ゛ニル)エタンスルホン酸)-NaOH,pH7.0、
5mM DTT(ジチオスレイトール)を含む反応液
に、10μlの酵素液を加えて50μlとする。これ
を、32℃、1時間インキュベートして反応を行い、2
00μlのエタノールを加え、95℃で30秒間加熱し
て、反応を停止する。この反応液の遠心上清をワットマ
ン3MM濾紙にスポットし、n−プロパノール:酢酸エ
チル:水=4:1:2にて展開した。14Cのラフィノー
スへの取り込みを調べ、これをラフィノース合成酵素活
性(nmol/時間)とする。
【0037】本発明者は、上記の方法に代わる方法とし
て、ラフィノース合成反応により生成するラフィノース
をHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により定量
することによって、ラフィノース合成酵素活性を測定す
る方法を開発した。この方法によれば、Lehle,Hらの方
法に比べて簡便かつ迅速に測定することができ、特に精
製操作における活性フラクションの検出には好適であ
る。以下に本方法を説明する。
【0038】ラフィノース合成反応は、最終濃度が下記
の組成になるように調製した反応液に10〜50μlの
ラフィノース合成酵素液を添加して100μlとし、3
2℃で60分間、反応を行う。
【0039】〔反応液組成(最終濃度)〕 2.5 mM スクロース 5 mM ガラクチノール 5 mM DTT 20 mM トリス塩酸緩衝液(pH7.0)
【0040】上記のようにして反応を行った後、反応液
の4倍容のエタノールを加え、95℃で30秒間加熱し
て反応を停止する。これを遠心し、遠心上清を減圧乾固
した後、蒸留水に溶解し、HPLCにて反応生成物中の
ラフィノースを定量し、ラフィノース酵素活性とする。
HPLCは、例えば、糖分析システムDX500(Carb
oPac PA1カラム、パルスドアンペロメトリー検出器(ダ
イオネクス社製))を用いて行うことができる。
【0041】反応時間を変化させたときの生成ラフィノ
ース量を上記の方法により測定した結果を図1に示す。
図から明らかなように、本方法により、ラフィノース合
成酵素活性を直線性よく、かつ簡便に測定することがで
きる。
【0042】精製されたラフィノース合成酵素の精製度
の確認や分子量の測定は、ゲル電気泳動、ゲルろ過クロ
マトグラフィー等によって行うことができる。また、酵
素学的性質は、反応温度あるいは反応pHを変化させて
酵素活性を測定し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イ
オン等を反応液に添加し、残存酵素活性を測定すること
によって、検討すればよい。さらに、ラフィノース合成
酵素を種々のpH条件下又は温度条件下に一定時間さら
した後に酵素活性を測定することにより、安定pH範囲
及び安定温度範囲を調べることができる。
【0043】前記したラフィノース合成酵素の性質は、
このようにして決定されたものであるが、測定条件によ
って異なる結果が得られる場合があることに留意すべき
である。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分
子量の測定は、用いるゲルろ過剤や緩衝液の種類、ある
いは分子量マーカーによって、影響される。また、酵素
活性は、同じpHであっても緩衝液の種類又は塩濃度に
よって異なることが多い。したがって、ラフィノース合
成酵素の同定に際しては、個々の性質のみではなく、総
合的な検討を行うことが好ましい。
【0044】本発明のラフィノース合成酵素は、上記の
ようにキュウリから単離・精製することによって得られ
るが、異種タンパク質の醗酵生産に通常用いられている
方法によって、後述するラフィノース合成酵素をコード
するDNAを適当な宿主に導入し、発現させることによ
っても製造することができる。
【0045】ラフィノース合成酵素遺伝子を発現させる
ための宿主としては、エシェリヒア・コリ(Esche
richia coli)をはじめとする種々の原核細
胞、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharo
myces cerevisiae)をはじめとする種
々の真核細胞が考えられるが、植物細胞、特にタバコ、
キュウリ、シロイヌナズナ(アラビドプシス)等の植物
由来の細胞が望ましい。
【0046】形質転換に用いる組み換えプラスミドは、
発現させようとする細胞の種類に応じた発現ベクター
に、ラフィノース合成酵素をコードするDNAを挿入す
ることで調製可能である。植物の発現ベクターは、植物
で働くプロモーターDNA配列、またはそれらを複数個
組み合わせたものと、植物で働くターミネーターDNA
配列を持ち、その両側に外来遺伝子を挿入できる配列を
有するものであればよい。
【0047】このようなプロモーターには、植物体全体
で発現するCaMV 35SRNAプロモーター、Ca
MV 19SRNAプロモーター、ノパリン合成酵素プ
ロモーター等、緑色組織で発現するRubisCO小サ
ブユニットプロモーター等、種子などの部位特異的に発
現するナピン(napin)、ファセオリン(phas
eolin)等の遺伝子のプロモーター等が挙げられ
る。さらに、上記のようなターミネーターとしてはノパ
リン合成酵素ターミネーター、RubisCO小サブユ
ニット3’側部位等が挙げられる。
【0048】植物用の発現ベクターとしてpBI12
1、p35S−GFP(CLONTECH社製)等が市
販されているのでこれを用いてもよい。ウイルスRNA
を発現するベクターを用い、そのコードしている外皮蛋
白質などの遺伝子をラフィノース合成酵素遺伝子に置換
してもよい。
【0049】形質転換には通常用いられている方法、ア
グロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロ
ポレーション法、PEG法等を、供試する宿主細胞に応
じて用いればよい。ラフィノース合成酵素活性の検出に
は、ラフィノース合成酵素精製を行った方法を用いるこ
とができる。その際、試料を陰イオン交換カラムに通す
などして、あらかじめα‐ガラクトシダーゼを除いてお
くことが望ましい。
【0050】キュウリ由来のラフィノース合成酵素をコ
ードする遺伝子とは、発現した時にラフィノース合成酵
素活性を有するものであればすべて含まれるが、好まし
くは、配列表の配列番号5記載のアミノ酸配列をコード
するDNAを有する遺伝子、又は配列表の配列番号4記
載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。尚、配列表
の配列番号5記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子と
は、コドンの縮重を考慮すると種々の塩基配列が包含さ
れる。即ち、このような種々の塩基配列の中から、遺伝
子発現系の諸要素、たとえば宿主細胞の種類等による優
先コドン、転写されたRNAにより形成される高次構造
の回避などを考慮して選択すればよい。選択された塩基
配列は、自然界からクローニングされたDNAであって
も、人為的に化学合成されたDNAであってもよい。
【0051】<2>本発明のラフィノース合成酵素をコ
ードするDNA ラフィノース合成酵素をコードするDNAは、キュウリ
などの植物体から単離したpoly(A)+RNAから
cDNAライブラリーを調製し、このcDNAライブラ
リーをハイブリダイゼーションによってスクリーニング
することによって、取得することができる。ハイブリダ
イゼーションに用いるプローブは、ラフィノース合成酵
素タンパク質の部分アミノ酸配列に基づいて合成された
オリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR(polyme
rase chain reaction)によって増幅することによっ
て、取得することができる。
【0052】以下に、キュウリ由来のpoly(A)+
RNAから本発明のDNAを取得する方法を具体的に説
明する。poly(A)+RNAの抽出部位としては、
ラフィノース合成酵素遺伝子が発現していればキュウリ
植物体のどこを用いても良く、様々な生長段階の葉、
茎、蕾、果実、種子等より得ることができるが、望まし
くは果実をつけた後の展開葉、特に葉脈部分を材料とす
るのがよい。
【0053】キュウリ組織から全RNAを抽出するに
は、効率よく損傷の少ないRNAが得られるならば方法
は制限されず、例えば、フェノール/SDS法、グアニ
ジンイソチオシアネート/塩化セシウム法等、公知のい
ずれの方法によっても可能である。こうして得た全RN
Aからオリゴ(dT)担体を用いてpoly(A)+
NAを分離できる。また、全RNAを抽出せずにpol
y(A)+RNAを得ることのできるキット(MPG
Direct mRNA Purification
Kit、CPG,INC.社等)を使用しても良い。
【0054】cDNAライブラリーのスクリーニングに
使用するプローブのDNA断片は、PCRを行うことで
得ることができる。既にわかっているペプチド断片のア
ミノ酸配列、例えば配列表配列番号1〜3に示すアミノ
酸配列より推定される塩基配列を有する一本鎖DNAを
化学合成し、これをプライマーに用いてPCRを行う。
プライマーには、得られているペプチド断片のアミノ酸
配列のどの部分を用いてもよいが、コドンの縮重が少な
く、複雑な高次構造を形成しないと思われる配列を選ぶ
のが望ましい。また、RACE(Rapid Ampl
ification of cDNA End:PCR
PROTOCOLS A Guideto Meth
ods and Applications、ACAD
EMIC press INC.p28〜38)を行っ
ても良い。
【0055】このようなPCRの鋳型には、cDNAラ
イブラリー、一本鎖cDNAを用いることが望ましい。
PCR反応に逆転写酵素活性を有する耐熱性DNAポリ
メラーゼを用いる場合には、poly(A)+RNA、
場合によっては全RNAを用いても良い。
【0056】cDNAライブラリーを作製するために
は、まずpoly(A)+RNAを鋳型にし、オリゴ
(dT)プライマー、ランダムプライマー等を用い、逆
転写酵素によって一本鎖cDNAを合成し、次にグブラ
−ホフマン(Gubler and Hoffman)
法、オカヤマ−バーグ(0kayama−Berg)法
(Molecular Cloning 2nd ed
ition、Cold Spring Harbor
press、1989)等により二本鎖cDNAを合成
する。ラフィノース合成酵素遺伝子の発現量が少ない場
合には、PCRを利用したcDNAライブラリー作製キ
ット(Capfinder PCR cDNA Lib
rary Construction Kit(CLO
NTECH社)等)を用いて、PCRによってcDNA
を増幅してもよい。このようにして合成したcDNA
は、平滑末端化、リンカーの付加、PCRによる制限酵
素サイトの付加等を行うことにより、ファージベクタ
ー、プラスミド等のクローニングベクターにクローニン
グできる。
【0057】ハイブリダイゼンション用のプローブに
は、上記のPCRで得られたDNA断片のうち、ラフィ
ノース合成酵素cDNAに特徴的な部分を選ぶ。また、
5’末端側に近いDNA断片を選ぶのが望ましい。この
ように選んだ増幅DNA断片を、PCR反応液から精製
する。この際、増幅したDNA断片をプラスミドを用い
てサブクローニングし、プラスミドを大量調製してから
制限酵素で切断し、電気泳動後にゲルを切り出して精製
しても、また、プラスミドを鋳型にPCRを行って、目
的部分だけを増幅して用いてもよい。さらには、最初に
増幅したDNA断片の量が十分に多い場合には、増幅し
たDNA断片をサブクローニングせずに電気泳動し、目
的DNA断片のバンドを含むゲル断片を切り出し、その
ゲル断片から精製してもよい。
【0058】cDNAライブラリーから目的クローンを
得るためのスクリーニングにはハイブリダイゼーション
を行う。上記の方法で得られたDNA断片はラベルして
ハイブリダイゼーションのプローブとすることができ
る。ラベルにはラジオアイソトープ、ビオチン等、種々
のものを用いることができるが、ランダムプライミング
法でラベルすることが望ましい。また、スクリーニング
にはハイブリダイゼーションではなくPCRを用いても
よい。さらに、ハイブリダイゼーションとPCRを組み
合わせてもよい。
【0059】上記のようにして得られたキュウリ由来の
ラフィノース合成酵素をコードするDNAの塩基配列、
及びこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表
配列番号4に例示する。また、このアミノ酸配列のみを
配列番号5に示す。後記実施例3で得られたラフィノー
ス合成酵素をコードするDNAを含むDNA断片を含む
プラスミドpMossloxCRSを保持するエシェリ
ヒア・コリJM109の形質転換体AJ13263は、
平成8年11月19日より、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所(郵便番号305 日本国茨城県つ
くば市東一丁目1番3号)にブダペスト条約に基づき国
際寄託されており、受託番号FERMBP−5748が
付与されている。
【0060】本発明のDNAは、コードされるラフィノ
ース合成酵素の活性、すなわちスクロースとガラクチノ
ールからラフィノースを生成する活性が損なわれない限
り、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ
酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むラフィノ
ース合成酵素タンパク質をコードするものであってもよ
い。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質
の立体構造における位置や種類によっても異なる。それ
は、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によって
は、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ
酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えない
ことに由来する。従って、キュウリ由来ラフイノース合
成酵素を構成する784アミノ酸残基全体に対し、35
から40%以上の相同性を有し、ラフイノース合成酵素
活性を有するものであってもよい。さらに、好ましく
は、510番日のアミノ酸から610番日のアミノ酸の
間において、65%の相同性を有することである。さら
に好ましくは、「数個」が、2から40個、好ましく
は、2から20個、さらに、2から10個である。
【0061】遺伝子全長において、約50%以上の相同
性があり、かつ、その中で約300塩基にわたる65%
以上の相同性がある遺伝子を含む。そのような遺伝子
は、GenBankなどのデータベースを用いて、キュ
ウリ由来ラフイノース合成酵素遺伝子に対し相同性を有
する遺伝子を検索することによって、塩基配列情報を得
ることができる。ホモロジー解析プログラムはLipm
an−Person法を採用したGENETIX−MA
C(遺伝子情報処理ソフトウエア、ソフトウエア開発
社)などを用いてもよく、また、インターネット上に公
開されているものを使用してもよい。このような方法に
より得られた塩基配列は遺伝子全長を含む場合と、遺伝
子全長を含まない場合がある。遺伝子全長を含まない場
合は、目的植物組織より抽出したRNAを鋳型に、キュ
ウリ由来ラフイノース合成酵素遺伝子と相同性の高い部
位に対応するプライマーを用い、5’RACE法、3’
RACE法にて、容易に全長遺伝子を取得することがで
きる。得られた全長遺伝子は、Soluble Protein Expres
sion System(lNVITROGEN社)や、Tight Control Express
ion System (INVITROGEN社)や、QIAexpress System(QI
AGEN社)などのキットが提供する適当な発現ベクターに
組み込み、遺伝子を発現させ、記載の方法でラフィノー
ス合成酵素活性を測定し、活性を有するクローンを選抜
すればよい。
【0062】このようなラフィノース合成酵素と実質的
に同一のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位
特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、
欠失、挿入、付加されるように塩基配列を改変すること
によって得られる。また、上記のような改変されたDN
Aは、従来知られている突然変異処理によっても取得さ
れ得る。突然変異処理としては、ラフィノース合成酵素
をコードするDNAをヒドロキシルアミン等でインビト
ロ処理する方法、及びラフィノース合成酵素をコードす
るDNAを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射
またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
(NTG)もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いら
れている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【0063】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、キュウリの個体差、品種間
差、遺伝子の多コピー化、各器官、組織の違いに基づく
場合などの天然に生じる変異も含まれる。
【0064】上記のような変異を有するDNAを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のラフィノース合成酵素活
性を調べることにより、ラフィノース合成酵素と実質的
に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。ま
た、変異を有するラフィノース合成酵素をコードするD
NAまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配
列番号4に記載の塩基配列のうち、塩基番号56〜24
07からなる塩基配列を有するDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ、ラフィノース合
成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを単
離することによっても、ラフィノース合成酵素タンパク
質と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得
られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相
同性が高いDNA同士、例えば50%以上の相同性を有
するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が
低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは
通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件であ
る60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、
0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハ
イブリダイズする条件が挙げられる。このような条件で
ハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコド
ンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失っ
たものも含まれるが、それらについては、市販の活性発
現ペクターにつなぎラフィノ―ス合成酵素活性を記述の
方法で測定することによって容易に取り除くことができ
る。
【0065】尚、本発明のDNAを、ラフィノース合成
酵素のアンチセンスRNAを発現させるために用いる場
合には、このDNAは活性のあるラフィノース合成酵素
をコードしている必要はない。また、センスRNAによ
っても、相同性のある内在性遺伝子の機能を抑制するこ
とができる。このような場合も、DNAが活性あるラフ
イノース合成酵素遺伝子をコードしている必要はなく、
また、全長を含まなくてもよく、好ましくは、60%の
相同性を有するN末端側翻訳領域が500塩基対程度あ
れぱよい。
【0066】本発明者らが目的とする、キュウリ由来の
ラフィノース合成酵素のcDNAのクローニングに成功
した方法は上述の通りであるが、それ以外に下記の方法
が挙げられる。
【0067】(1)キュウリ由来のラフィノース合成酵
素を単離精製し、決定されるアミノ酸配列、または配列
番号5に示すアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合成
する。
【0068】(2)キュウリ植物体から染色体DNAを
調製し、プラスミドベクター等を用いて染色体DNAラ
イブラリーを作製し、このライブラリーからラフィノー
ス合成酵素遺伝子を、ハイブリダイゼーンション又はP
CRによって取得する。尚、染色体由来のラフィノース
合成酵素遺伝子は、コード領域にイントロンが含まれる
ことが予想されるが、このようなイントロンによって分
断されたDNAであっても、ラフィノース合成酵素をコ
ードする限り本発明のDNAに含まれる。
【0069】(3)poly(A)+RNAを分子量等
によって分画し、ホイートジャーム又はウサギ網状赤血
球を用いたインビトロ翻訳系に供し、ラフィノース合成
酵素活性を有するポリペプチドをコードするmRNAが
存在する画分を決定し、それより目的のcDNA断片を
作製、取得する。
【0070】(4)抗キュウリラフィノース合成酵素抗
体を作製し、蛋白質発現ベクターにcDNAライブラリ
ーを乗せ、適当な宿主に感染させてcDNAがコードす
る蛋白質を発現させ、先程の抗体を用いて目的のcDN
Aをスクリーニングしても良い。
【0071】(5)ペプチド断片のアミノ酸配列から適
当なプライマーを合成し、RACE法によって、末端を
含む配列を増幅し、これをクローニングしてもよい。
【0072】<3>本発明のラフィノースの製造法 本発明のラフィノースの製造法においては、スクロース
及びガラクチノールに上記ラフィノース合成酵素を作用
させてラフィノースを生成させる。ラフィノース合成酵
素は、スクロースとガラクチノールに作用させると、ガ
ラクチノールを構成するガラクトース残基がスクロース
に転移し、ラフィノースが生成する。その際、ガラクチ
ノールを構成するミオイノシトールが生成する。
【0073】ラフィノースの製造に使用するラフィノー
ス合成酵素は、植物体から抽出した酵素であっても、本
発明のDNAを用いた遺伝子組換え法によって製造した
酵素であってもよい。
【0074】スクロース及びガラクチノールにラフィノ
ース合成酵素を作用させるには、ラフィノース合成酵素
又はラフィノース合成酵素生産能を有する細胞をアルギ
ン酸ゲルやポリアクリルアミドゲル等の担体に固定化し
た固定化酵素又は固定化細胞をカラムに充填し、このカ
ラムにスクロース及びガラクチノールを含む溶液を通液
してもよい。担体及びラフィノース合成酵素又は細胞を
担体に固定化する方法は、通常のバイオリアクターに用
いられる材料及び方法を採用することができる。
【0075】ラフィノース合成反応は、例えば、スクロ
ース及びガラクチノールを含む水溶液又は緩衝液等の溶
液に、ラフィノース合成酵素を添加することによって行
われる。前記溶液のpHは、約6〜8の範囲内、特にp
H7前後に調整されることが好ましい。また、反応温度
は約28〜42℃、好ましくは35〜40゜Cの範囲
内、特に38℃前後であることが好ましい。尚、本発明
のラフィノース合成酵素は、約pH5〜8の範囲、特に
pH6付近で安定である。また、本酵素は少なくとも約
40℃以下の温度範囲で安定である。
【0076】本発明のラフィノース合成酵素は、ヨード
アセトアミド、N−エチルマレイミド、MnCl2、Z
nCl2、NiCl2によって酵素活性が阻害されるの
で、これらの物質が反応液に含まれないことが望まし
い。
【0077】反応液に加えるガラクチノール及びスクロ
ースの濃度は、ガラクチノール 5mM以上、スクロー
ス 1.5mM以上が好適である。また、反応液に加え
るラフィノース合成酵素の添加量は、基質量に応じて添
加すればよい。
【0078】反応液に含まれる未反応のスクロース、ガ
ラクチノール及び酵素反応により生じるミオイノシトー
ルからラフィノースを分離する方法としては、例えばゲ
ル濾過クロマトグラフィーが挙げられる。
【0079】<4>本発明のキメラ遺伝子及び形質転換
植物 本発明のキメラ遺伝子は、ラフィノース合成酵素遺伝子
又はその一部と、植物細胞で発現可能な転写制御領域と
を含む。ラフィノース合成酵素遺伝子としては、前記<
2>に記載した本発明のラフィノース合成酵素をコード
するDNAが挙げられる。さらに、本発明のキメラ遺伝
子をアンチセンス遺伝子として利用する場合には、ラフ
ィノース合成酵素をコードするDNAの他に、ラフィノ
ース合成酵素遺伝子の非翻訳領域又はその一部であって
も、使用できる場合がある。非翻訳領域としては、例え
ば配列表配列番号4において塩基番号1〜55(5’非
翻訳領域)、あるいは2407〜2517に示す配列
(3’非翻訳領域)が挙げられる。
【0080】本発明のキメラ遺伝子において、転写制御
領域が、ラフィノース合成酵素をコードするDNAに、
このDNAコード鎖に相同なmRNA(センスRNA)
を発現するように連結されている場合は、このキメラ遺
伝子が導入された植物細胞はラフィノース合成酵素を発
現し、ラフィノース族オリゴ糖含量が増加する。一方、
前記転写制御領域が、前記DNAのコード鎖に相補的な
配列を有するRNA(アンチセンスRNA)を発現する
ように前記DNAに連結されている場合、および、ラフ
ィノース合成酵素遺伝子の一部の断片、好ましくは、上
流コード領域の約200塩基対以上に対するセンスRN
Aを発現するように連結されている場合、これらのキメ
ラ遺伝子が導入された植物細胞は、内在性ラフィノース
合成酵素の発現が抑制され、ラフィノース族オリゴ糖が
低減化する。
【0081】上記のように、本発明のキメラ遺伝子で植
物を形質転換し、この遺伝子を植物細胞内で発現させる
ことにより、前記植物のラフィノース族オリゴ糖含量を
変化させることができる。
【0082】本発明を適用する植物としては、油糧植物
であるダイズ、ナタネ、ワタ、砂糖を生産するテンサ
イ、サトウキビ、モデル植物としてシロイヌナズナ等が
挙げられる。
【0083】また、植物細胞で発現可能な転写制御領域
としては、前述したような、植物全体で発現するCaM
V 35SRNAプロモーター、CaMV 19SRN
Aプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等、緑
色組織で発現するRubisCO小サブユニットプロモ
ーター等、種子などの部位特異的に発現するナピン(n
apin)、ファセオリン(phaseolin)等の
遺伝子のプロモーター領域等が挙げられる。また、キメ
ラ遺伝子の3’末端には、ノパリン合成酵素ターミネー
ター、RubisCO小サブユニット3’側部位等のタ
ーミネーターが連結されてもよい。
【0084】キメラ遺伝子で植物を形質転換には通常用
いられている方法、アグロバクテリウム法、パーティク
ルガン法、エレクトロポレーション法、PEG法等を、
供試する宿主細胞に応じて用いればよい。
【0085】植物にキメラ遺伝子を導入する形質転換法
としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン
法、エレクトロポレーション法、PEG法等が挙げられ
る。アグロバクテリウム法として具体的には、バイナリ
ーベクターを用いる方法がある。すなわち、Tiプラス
ミド由来のT−DNA、大腸菌などの微生物で機能可能
な複製起点、及びベクターを保持する植物細胞または微
生物細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含むベクタ
ーを植物に感染させ、この植物から採取した種子を生育
させ、マーカー遺伝子の発現を指標としてベクターが導
入された植物を選択する。得られた植物について、ラフ
ィノース合成酵素活性を測定するか、あるいはラフィノ
ース族オリゴ糖の含量が変化したものを選択することに
よって、目的とする形質転換植物を取得することができ
る。
【0086】以下に、ダイズにキメラ遺伝子を導入する
方法について説明する。ダイズ形質転換には、パーティ
クルガン法(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 145 (19
89)、TIBTECH, 8, 145 (1990)、Bio/Technology, 6, 92
3 (1988)、Plant Physiol.,87, 671 (1988)、Develop.
Genetics, 11, 289 (1990)、Plant cell Tissue &Organ
Culture, 33, 227 (1993))、アグロバクテリウム法
(Plant Physiol., 91, 1212 (1989)、 WO94/02620、 P
lant Mol. Biol., 9, 135 (1987)、Bio/Technology, 6,
915 (1988))、エレクトロポレーション法(Plant Phy
siol., 99, 81(1992)、Plant Physiol., 84, 856 (198
9)、Plant Cell Reports, 10, 97 (1991))のいずれの
方法も用いることができる。
【0087】パーティクルガン法においては、エンビオ
ジェニック(embyogenc)組織、あるいは、開やく後3
0日から40日の未熟種子の胚軸を用いればよい。約1
gのエンビオジェニック組織をペトリ皿に広げ、日的の
キメラ遺伝子をコーテイングした金粒子、タングステン
粒子などを打ち込めばよい。組織は、1時間から2時問
後液体培地に移し、培養する。2週間後、形質転換体選
抜のための抗生物質入りの培地に移し、培養する。6週
間後に、緑色の耐性不定胚が得られるので、これをさら
に新しい培地に移して培養し、植物体を再生させる。あ
るいは、胚軸を用いた場合には、胚軸を無菌的に摘出
し、パーティクルガンで処理した後、高濃度のサイトカ
イニンを含むMS培地(Murashige and Skoog, Physiol
ogia Plantrum, 15, 473-497 (1962))にて培養をす
る。暗黒下で、2週間培養した後、サイトカイニンの含
量を低下させたMS培地にて12時間から16時間、光
照射下で室温で培養する。このとき、選抜マーカーとし
て用いた抗生物質を培地に添加しておくことが望まし
い。移植組織より多芽体が形成したら、ホルモン無添加
の培地に移すことで、発根させる。この幼植物体を温室
に移し、栽培する。
【0088】アグロバクテリウムを用いる方法では、植
物組織としてコチルドナリーノッド(Cotyldonary no
d)を用いることが望ましい。アグロパクテリウムは、
市販のLBA4404、C58、Z707などを用いる
ことができるが、望ましくは、Z707がよい。ベクタ
ーは、pMON530(Monsanto Co.)に目的遺伝子を
挿入したプラスミドなどを用いることができる。ダイレ
クト・フリーズ・ソー(Direct freeze thaw)方法(An
et al., Plant Mol. Biol. Mannual A3:1-19, 1988)
などによって、アグロバクテリウム ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)Z707(Hepburn et
al., J, Gen. Microbiol, 131, 2961 (1985))にプラス
ミドを導入する。このキメラ遺伝子で形質転換したアグ
ロバクテリウムは、一晩培養し、5000rpm、5分
間遠心し、B5懸濁培地に懸濁する。ダイズ種子は滅菌
し1/10濃度のB5培地にて3日間培養し、発芽させ
る。子葉を切り出し、アグロバクテリウムの懸濁液で、
2時間供培養する。この子葉をB5培地(ガンボルグ(G
amborg)B5塩(Exp. Cell. Res., 50, 151 (1968)、ガ
ンボルグB5ビタミン、3%スクロース。5μMベンジ
ルアミノプリン、10μM IBA、100μM アセ
トシリンゴン含有)に移し、25℃、23時間光照射
(60μEm-2S-1)の条件下で3日問培養する。次に、
アグロバクテリウムを除去するためにB5培地(5μM
ベンジルアミノプリン、100mg/Lカルベニシリ
ン、100mg/L バンコマイシン、500mg/L
セファタキシム(cefotaxime))にて4日間25℃で毎
日培地を交換しながら培養する。その後、B5培地(2
00mg/Lカナマイシン)にて培養する。1から2カ
月でマルチシュートが形成される。これを、B5培地
(0.58mg/L ジベレリン、50mg/L カナマ
イシン)で培養し、シュートを伸長させる。次に、B5
培地(10μM IBA)に移し、発根させる。発根し
た幼植物体は、馴化し、温室にて栽培することによって
形質転換体を得ることができる。
【0089】ラフィノース合成酵素遺伝子を導入した形
質転換体植物の確認は、形質転換体より、DNAを抽出
し、ラフィノース合成酵素遺伝子をプローブに用いてサ
ザンハイプリダイゼーションを行えば容易に確認でき
る。
【0090】
【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。はじめに、以下の実施例において、各精製
工程における活性画分の確認及び酵素の特性検討に用い
たラフィノース合成酵素活性の測定法を説明する。
【0091】<ラフィノース合成酵素活性測定法>ラフ
ィノース合成酵素の活性は、ラフィノース合成反応によ
り生成したラフィノースをHPLC(高速液体クロマト
グラフィー)により定量することによって行った。HP
LCは、糖分析システムDX500(CarboPac PA1カラ
ム、パルスドアンペロメトリー検出器(ダイオネクス社
製))を用いて行った。
【0092】ラフィノース合成反応は、最終濃度が下記
の組成になるように調製した反応液に10〜50μlの
ラフィノース合成酵素液を添加して100μlとし、3
2℃で60分間、反応を行った。
【0093】〔反応液組成(最終濃度)〕 2.5 mM スクロース 5 mM ガラクチノール 5 mM DTT 20 mM トリス塩酸緩衝液(pH7.0)
【0094】上記のようにして反応を行った後、反応液
の4倍容のエタノールを加え、95℃で30秒間加熱し
て反応を停止した。これを遠心し、遠心上清を減圧乾固
した後、蒸留水に溶解し、糖分析システムにて反応生成
物中のラフィノースを定量し、ラフィノース酵素活性と
した。
【0095】
【実施例1】 キュウリからのラフィノース合成酵素の
精製 <1>キュウリからのラフィノース合成酵素の抽出 播種後6〜10週間のキュウリ(品種「SUYOU」)
本葉より、葉脈系を集め、液体窒素にて凍結し、−80
℃にて保存した。凍結した葉脈系約200gを液体窒素
下で乳鉢にて磨砕し、緩衝液1(40mM トリス塩酸
緩衝液(pH7.0)、5mM DTT、1mM PMSF
(フェニルメタンスルフォニルフルオリド)、1%ポリ
クラールAT;セルバ社製)を加え、蛋白質を抽出し
た。抽出液は、ガーゼやミラクロス(カルバイオケム−
ノボバイオケム(Calbiochem-Novobiochem)社)などのフ
ィルターにて濾過し、濾液を4℃、約30,000×g
で60分間遠心した。得られた遠心上清を粗抽出液とし
た。
【0096】<2>陰イオン交換クロマトグラフィー
(1) 上記で得られた粗抽出液約560mlを、緩衝液2(2
0mM トリス塩酸緩衝液(pH7.0)、5mM DT
T)にて平衡化した強塩基性陰イオン交換クロマトグラ
フィーカラム(HiTrapQ;ファルマシア社製、
1.6cm×2.5cm)を5本連結したカラムに供
し、ラフィノース合成酵素活性をカラムに吸着させた。
続いてカラムの5倍容の緩衝液3(20mM トリス塩
酸緩衝液(pH7.0)、0.2M NaCl、5mM D
TT)にてカラムを洗浄して非吸着蛋白質を洗い流した
後、50mlの緩衝液4(20mM トリス塩酸緩衝液
(pH7.0)、0.3M NaCl、5mM DTT)に
てラフィノース合成酵素活性をカラムから容出させた。
【0097】<3>陰イオン交換クロマトグラフィー
(2) 上記の溶出液約75mlを透析チューブ(Pormem
branes MWCO:10,000;スペクトラ(S
pectra)社製)に入れ、10Lの緩衝液5(20
mM トリス塩酸緩衝液(pH7.0)、0.05M Na
Cl、5mMDTT)に対して、4℃で一晩透析した。
透析した試料を緩衝液5で平衡化した弱塩基性陰イオン
交換クロマトグラフィーカラム(DEAE−TOYOP
EARL;東ソー社製、2.2×20cm)に供し、ラ
フィノース合成酵素活性をカラムに吸着させた。続いて
カラムの5倍容の緩衝液5にてカラムを洗浄して非吸着
蛋白質を洗い流した後、20カラム容に対し0.05M
〜0.35MのNaCl濃度勾配を直線的にかけて酵素
活性を溶出し分画した。
【0098】<4>ゲル濾過クロマトグラフィー 上記で得られた溶出液約160mlを、濃縮器(セント
リプレップ10;Amicon社製)を用いて6.5m
lに濃縮した。この濃縮液3mlずつをゲルろ過クロマ
トグラフィーカラム(Superdex 200pg;
ファルマシア社製、2.6cm×60cm)に供した。
カラムの平衡化と溶出は、緩衝液6(20mM トリス
塩酸緩衝液(pH7.0)、0.1M NaCl、5mM
DTT、0.02% Tween 20)を用いて行っ
た。分画した各画分のうち、ラフィノース合成酵素活性
を有する画分を集めた。
【0099】<5>ハイドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィー ゲル濾過で分画したラフィノース合成酵素活性画分約2
5mlを、セントリプレップ10にて濃縮し、さらに、
緩衝液7(0.01M リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.0)、5mM DTT、0.02% Tween 2
0)を用いて緩衝液交換を行った。得られた濃縮液約
1.2mlを、あらかじめ同緩衝液にて平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラム(Bio−Scale CH
T−1;バイオラッド社製、0.7×5.2)に供し、
ラフィノース合成酵素活性を吸着させた。カラムを、カ
ラム体積の5倍量(10ml)の同緩衝液にて洗浄した
後、20カラム容に対し、0.01M〜0.3Mのリン
酸濃度勾配を直線的にかけて酵素活性を溶出し分画し
た。
【0100】<6>ハイドロキシアパタイトリクロマト
グラフィー 上記のようにして得られたハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーによる活性画分を同様にしてリクロマト
し、精製ラフィノース合成酵素画分(約2ml)とし
た。
【0101】本活性画分の蛋白質量は約200μgであ
った。また、全活性は5700nmol/時間であり、
蛋白質当たりの比活性は約28μmol/時間/mgで
あった。この活性画分は、後述するように電気泳動上で
分子量約90kDa〜100kDaの単一バンドを示す
タンパク質のみを含んでいた。得られた精製酵素標品の
比活性は、粗抽出液の約2000倍であり、HiTra
pQによる強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー後
の酵素量に対する回収率は12%であった。精製の結果
を表1にまとめた。
【0102】
【表1】 表1 ─────────────────────────────────── 全蛋白質 全活性 比活性 収率 mg nmol/h nmol/h/mg % ─────────────────────────────────── 粗抽出液 1915 20700 11 − HiTrapQ 1092 48800 45 100 DEAE-TOYOPERL 540 33000 61 68 Superdex 200pg 1.79 26500 14800 54 ハイト゛ロキシアハ゜タイトクロマトク゛ラフィー(1) 0.51 12600 24700 26 ハイト゛ロキシアハ゜タイトクロマトク゛ラフィー(2) 0.20 5700 28500 12 ───────────────────────────────────
【0103】
【実施例2】 ラフィノース合成酵素の特性の検討 実施例1で得られた精製ラフィノース合成酵素の特性を
検討した。
【0104】<1>分子量測定 (1)ゲルろ過クロマトグラフィー 精製ラフィノース合成酵素を10μlとり、この試料お
よび分子量マーカー(ゲル濾過用分子量マーカーキッ
ト:ファルマシア社製)をゲルろ過クロマトグラフィー
カラム(Superdex 200pg;ファルマシア
社製)に供した。カラムの平衡化と溶出は、緩衝液6
(20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.0)、0.1M
NaCl、5mM DTT、0.02% Tween 2
0)を用いて行った。その結果、ラフィノース合成酵素
の分子量は、約75kDa〜95kDaと推定された。
【0105】(2)ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(Native PAGE) 精製ラフィノース合成酵素を10μlとり、同量のサン
プル緩衝液(0.0625M トリス−塩酸(pH6.
8)、15%グリセロール、0.001%BPB)を加
え、電気泳動サンプルとした。このサンプル10μlを
10%ポリアクリルアミドゲル(第一化学薬品製、マル
チゲル10)に供し、0.025M トリス−0.19
2M グリシン緩衝液(pH8.4)で40mA、約60
分泳動した。泳動後、シルベストステイン銀染色キット
(ナカライテスク社製)にて染色した。その結果、分子
量は約90kDa〜100kDaと推定された。
【0106】(3)SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(SDS−PAGE) 精製ラフィノース合成酵素を10μlとり、同量のサン
プル緩衝液(0.0625M トリス−塩酸(pH6.
8)、2% SDS、10%グリセロール、5%メルカプ
トエタノール、0.001%BPB)を加え沸騰浴中で
1分間加熱し、電気泳動サンプルとした。このサンプル
10μlを10〜20%グラジエントポリアクリルアミ
ドゲル(第一化学薬品製)に供し、0.1%SDSを含
む0.025M トリス−0.192M グリシン緩衝液
(pH8.4)で40mA、約70分泳動した。泳動
後、シルベストステイン銀染色キット(ナカライテスク
社製)にて染色した。結果を図2に示す。その結果、分
子量は約90kDa〜100kDaと推定された。
【0107】<2>反応至適温度 前記のラフィノース合成酵素活性測定法にしたがって、
種々の温度条件下(28℃、32℃、36℃、40℃、
44℃、48℃、52℃)でラフィノース合成酵素活性
を測定した。各反応液に加えた酵素液は、2μlとし
た。32℃での酵素活性を100としたときの各温度で
の相対活性を図3に示す。その結果、ラフィノース合成
酵素は、約25〜42゜Cにわたる範囲で活性を示し、
反応至適温度は、35〜40℃付近であった。
【0108】<3>至適反応pH 前記のラフィノース合成酵素活性測定法にしたがって、
種々のpH条件下(pH4〜11)でラフィノース合成
酵素活性を測定した。各反応には、50mMクエン酸緩
衝液(pH4〜6)、50mM リン酸カリウム緩衝液
(pH5.5〜7.5)、50mM ビス−トリス緩衝
液(pH6〜7)、20mM トリス−塩酸緩衝液(p
H7〜8.5)、50mM グリシン−NaOH緩衝液
(pH9〜11)を用いた。また、各反応液に加えた酵
素液は、2μlとした。結果を図4に示す。
【0109】その結果、ラフィノース合成酵素はpH5
〜10の範囲で活性を示し、反応至適pHは、用いた緩
衝液の種類によっても異なるが、6〜8付近であった。
【0110】<4>阻害剤及び金属イオンの検討 精製ラフィノース合成酵素の反応液に、各種の酵素阻害
剤又は金属イオンを終濃度で1mMとなるように添加
し、ラフィノース合成酵素活性を前記と同様にして測定
した。阻害剤又は金属イオンを添加しない場合の酵素活
性に対する残存活性を表2に示す。ヨードアセトアミド
は酵素活性を顕著に阻害し、N−エチルマレイミドも阻
害効果を示した。また、CaCl2、CuCl2、MgC
2は阻害効果がほとんど認められなかったが、MnC
2、ZnCl2、NiCl2は阻害効果を示した。
【0111】
【表2】表2 ──────────────────── 阻害剤又は金属イオン 残存活性(%) ──────────────────── 無添加 100 ヨードアセトアミド 0 N−エチルマレイミド 40 CaCl2 115 CuCl2 101 MgCl2 96 MnCl2 32 ZnCl2 42 NiCl2 68 ────────────────────
【0112】<5>ミオイノシトールによる阻害 ラフィノース合成反応の反応生成物であるミオイノシト
ールによる阻害を調べた。各種濃度のミオイノシトール
を反応液に添加し、ラフィノース合成酵素活性を測定し
た。結果を図5に示す。添加したミオイノシトールの濃
度とともに酵素活性は阻害された。
【0113】<6>安定pH 50mM ビストリス塩酸緩衝液(pH5〜8、0.5
mM DTTを含む)、又は20mM トリス−塩酸緩衝
液(pH7〜8、0.5mM DTTを含む)中で、前
記陰イオン交換クロマトグラフィー(2)で得られたラ
フィノース合成酵素画分を4時間、4℃にてインキュベ
ートした後、ラフィノース合成酵素活性を測定した。イ
ンキュベートに用いた緩衝液のpHに対する酵素活性を
図6に示す。いずれのインキュベート条件においてもラ
フィノース合成活性が認められ、特にpH5〜7.5の
範囲で安定であった。
【0114】<7>安定温度 20mM トリス−塩酸緩衝液(pH7、5mM DTT
を含む)にて、前記陰イオン交換クロマトグラフィー
(2)で得られたラフィノース合成酵素画分を28℃、
32℃、37℃又は40℃で60分インキュベートした
後、ラフィノース合成酵素活性を測定した。その結果、
本酵素は、28℃〜40℃の範囲で前記インキュベート
処理を行わなかった対照区と比較して80%〜100%
の活性を有し、安定であった。
【0115】<8>アミノ酸配列の解析 精製ラフィノース合成酵素のシステイン残基を還元ピリ
ジルエチル化し、脱塩した。これをリジルエンドペプチ
ダーゼ(Achromobacter protease 1、和光純薬工業社
製)にて37℃、12時間消化し、ペプチド断片化し
た。得られたペプチド混合液を逆相HPLC(カラム:
ウォーターズ μBondasphere(φ2.1×150 mm、C18、300
Å)、ウォーターズ社製(ミリポア社))に供し、各ペプ
チド断片を分離取得した。溶媒には0.1%TFA(ト
リフルオロ酢酸)を用い、アセトニトリルの濃度勾配に
より溶出を行った。取得したペプチド断片のうち、3つ
の断片について、アミノ酸配列をプロテインシークエン
ーサーにより決定した。決定された各ペプチドのアミノ
酸配列を配列表配列番号1〜3に示す。以下、これらの
ペプチドを、それぞれ順にペプチド1、2、及び3とい
う。
【0116】
【実施例3】 ラフィノース合成酵素をコードするDN
Aの取得 <1>PCR法によるラフィノース合成酵素cDNAの
部分断片の単離 キュウリの主葉脈22gを液体窒素中で乳鉢を用いて磨
砕した。この磨砕物を、80℃に余熱した抽出バッファ
ー(100mM塩化リチウム、100mMトリス−塩酸
(pH8.0)、10mM EDTA、1%SDS)と等
量のフェノールを混合したものに加え、撹拌後、フェノ
ールと等量のクロロホルム:イソアミルアルコール(2
4:1)を加え、再び撹拌を行い、この混合液を4℃で
9250×g、15分間遠心処理し、上清を採取した。
この上清に対して繰り返しフェノール処理、クロロホル
ム:イソアミルアルコール処理を行い、遠心上清を得
た。この上清に等量の4M塩化リチウムを加え、−70
℃で1時間静置した。
【0117】室温にて解凍後、4℃で9250×g、3
0分間遠心処理し沈殿を得た。この沈殿を2M塩化リチ
ウム、80%エタノールにより1回ずつ洗浄し、乾燥後
2mlのジエチルピロカーボネート処理水に溶解し、精
製全RNAとした。得られた全RNAは2.38mgで
あった。
【0118】この全RNA全量を、オリゴ(dT)セル
ロースカラムを用いたpoly(A)+RNA精製キッ
ト(STRATAGENE CLONING SYST
EMS社製)に供し、poly(A)+RNA分子を精
製し、42.5μgのpoly(A)+RNAを得た。
【0119】上記のようにして得られたpoly(A)
+RNAから逆転写酵素SuperScriptII
(GIBCO BRL社製)を用いて一本鎖cDNAを
合成した。このcDNA混合物からラフィノース合成酵
素cDNAを単離するために、PCR法による増幅を行
った。PCRに用いるプライマーは、実施例2で決定し
たキュウリ由来のラフィノース合成酵素のペプチド断片
のアミノ酸配列から、図7に示す一本鎖オリゴヌクレオ
チド(配列番号6〜22)を合成した。各プライマーの
配列において、RはA又はGを、YはC又はTを、Mは
A又はCを、KはG又はTを、DはG、A又はTを、H
はA、T又はCを、BはG、T又はCを、NはG、A、
T若しくはC、又はイノシン(塩基はヒポキサンチン)
を、それぞれ表す。
【0120】プライマーとして、5’側プライマーにA
(A1(配列番号6)、A2(配列番号7)、A3(配
列番号8)、A4(配列番号9))、3’側プライマー
にD’(D’1(配列番号21)、D’2(配列番号2
2))の組み合わせと、5’側プライマーにC2(配列
番号14))、及び3’プライマーにB’1(配列番号
18)、あるいはB’2(配列番号19)を用いたとき
に、約540塩基対のDNAが増幅された。この断片を
TAクローニングキット(INVITROGENBV社
製)を用いてプラスミドpCRIIにクローニングし、
塩基配列を解析したところ、両末端のプライマー配列の
内側にペプチド1、2のアミノ酸配列をコードしている
塩基配列が存在し、前記増幅断片はラフィノース合成酵
素遺伝子に由来するDNA断片であることがわかった。
【0121】さらに、クローニングした上記PCR増幅
DNA断片のラフィノース合成酵素遺伝子上での位置を
特定するために、RACEキット(3’Ampifin
der RACE Kit(CLONTECH社製))
を用いて、3’RACEを行った。
【0122】前記cDNA混合物を鋳型に、5’側プラ
イマーにC(C1(配列番号13)、C2(配列番号1
4))、3’側プライマーにはオリゴ(dT)とアンカ
ー配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、さら
にこうして得られた増幅断片を鋳型に、Cより内側に位
置するD(D1(配列番号15)、D2(配列番号16))
を5’側プライマーに、3’側プライマーにはオリゴ
(dT)−アンカープライマーを用いてPCRを行っ
た。その結果、C1(配列番号13)、C2(配列番号
14)とオリゴ(dT)−アンカープライマーで増幅し
たDNAを鋳型に、D2(配列番号16)とオリゴ(d
T)−アンカープライマーでPCRを行ったときのみ、
約2400塩基対のDNA断片が増幅した。また、5’
側プライマーにC(C1(配列番号13)、C2(配列番
号14))、3’側プライマーにはオリゴ(dT)−ア
ンカープライマーを用いてPCRを行い、さらにこうし
て得られた増幅断片を鋳型に、5’側プライマーにE
(配列番号17)、3’側プライマーにはオリゴ(d
T)−アンカープライマーを用いてPCRを行った。そ
の結果、いずれの場合も、約300塩基対のDNA断片
を増幅した。
【0123】同様に、前記cDNA混合物を鋳型に、
5’側プライマーにA(A1(配列番号6)、A2(配列
番号7)、A3(配列番号8)あるいはA4(配列番号
9))、3’側プライマーにはオリゴ(dT)とアンカ
ー配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、さら
にこうして得られた増幅断片を鋳型に、Aより内側に位
置するB(B1(配列番号10)、B2(配列番号11)あ
るいはB3(配列番号12))、3’側に同じオリゴ(d
T)−アンカープライマーを用いてPCRを行った。そ
の結果、Aのいずれのプライマーを用いたときも、B2
プライマーを用いたときに約2000塩基対のDNA断
片を得た。そこで、A2、B2プライマーを用いて増幅
したDNA断片をクローニングした。塩基配列を解析し
たところ、5’側にプライマー作成に用いたペプチド断
片1のアミノ酸配列をコードする塩基配列が存在した。
また、3’側にはpoly(A)配列と、その上流にペ
プチド断片3に対応する塩基配列が存在した。
【0124】先のPCRの結果と合わせると、ラフィノ
ース合成酵素ペプチド断片は、そのN末端側から2、
1、3の順に並んでおり、先にPCRによって得られた
約540塩基対のDNA断片は、ラフィノース合成酵素
遺伝子上の5’末端に近い部分であることがわかった。
ラフィノース合成遺伝子全長を含むcDNAクローンを
スクリーニングするためには、プローブとするDNAが
5’末端側に近い部分を検出できることが望ましいた
め、このDNA断片をプローブとしてcDNAライブラ
リーのスクリーニングに使用した。
【0125】<2>ラフィノース合成酵素cDNAのコ
ード領域全長のクローニング まず、以下のようにしてcDNAライブラリーを作製し
た。<1>で得られたpoly(A)+RNA 3.8
μgからTime Saver cDNA合成キット
(Pharmacia Biotech社製)を用い
て、2本鎖cDNAを合成した。得られたcDNAを、
λファージベクターλMOSSlox(Amersha
m社製)のEcoRI制限酵素切断部位に組み込んだ
後、GigapackII Goldパッケージングキッ
ト(STRATAGENE CLONING SYST
EMS社製)を用いて、ファージ蛋白質中に取り込ま
せ、キュウリのcDNAライブラリーを調製した。な
お、本ライブラリーのタイターは1.46×107pf
u/μgベクターであった。
【0126】上記のキュウリのcDNAライブラリーか
ら1.4×105pfuに相当するファージを宿主細胞
エシェリヒア・コリ ER1647に感染させた後、直
径90mmの寒天プレート14枚に、プレートあたり
1.0×104pfuとなるように蒔いた。これを37
℃で約6.5時間培養した後、プレート上に形成された
ファージプラークをナイロンメンブレン(Amersh
am社製Hybond−N+)に転写した。
【0127】次に、上記ナイロンメンブレンを、アルカ
リで処理して転写されたDNAを変性させ、中和した後
に洗浄した。その後、このナイロンメンブレンを80℃
で2時間処理することでDNAをメンブレン上に固定し
た。
【0128】得られたナイロンメンブレンに対し、<1
>で得た約540塩基対のDNA断片をプローブに用
い、陽性クローンのスクリーニングを行った。上記の約
540塩基対のDNA断片を、制限酵素EcoRIで消
化後に電気泳動し、約540塩基対のインサートのみを
切り出して精製したものを、DNAラベル・検出システ
ム(Gene Images ラベリング・検出システ
ム(Amersham社製))を用いてフルオレセイン
ラベルし、プローブとした。前記のナイロンメンブレン
を60℃で30分間、プレハイブリダイゼーションを行
い、次いでラベルしたプローブを加えて60℃で16時
間のハイブリダイゼーションを行った。ラベルされたD
NAを検出するための抗体(アルカリフォスファターゼ
標識抗フルオレセイン抗体)は、50000倍に希釈し
て用いた。このスクリーニングにおいて陽性クローンの
候補株を得た。得られた候補株について上記と同様にし
てスクリーニングをさらに2回繰返し、純化した陽性ク
ローンを取得した。
【0129】上記の陽性クローンをエシェリヒア・コリ
BM25.8に感染させ、カルベニシリンを含む選択培
地上で培養することで、cDNAを含むプラスミドベク
ターλMOSSlox−CRSを切り出した。このプラ
スミドの挿入cDNAの長さは約2.5kbであった。
さらにこのプラスミドで腸菌JM109を形質転換し、
形質転換体からプラスミドDNAを調製し、これを塩基
配列を解析するための試料とした。
【0130】挿入cDNAの塩基配列の解析にはTaq
DyeDeoxy Terminator Cycl
e Sequencing Kit(Perkin−E
lmer社製)を用いる従来公知の方法で行った。
【0131】その結果、配列表の配列番号4に示す23
52塩基対よりなる塩基配列が明らかとなった。この配
列中には、本発明者らが用いたDNAプローブの塩基配
列と一致する部分が存在した。また、塩基配列から翻訳
されるアミノ酸配列を配列番号4及び配列番号5に示し
た。このアミノ酸配列中には、本発明者らが得たキュウ
リ由来のラフィノースシンターゼのペプチド1(配列番
号5中、アミノ酸番号215〜244)、2(配列番号
5中、アミノ酸番号61〜79)及び3(配列番号5
中、アミノ酸番号756〜769)と一致する部分が存
在し、ラフィノース合成酵素をコードすることが確認さ
れた。
【0132】上記のようにして得られたラフィノース合
成酵素をコードするDNAを含むプラスミドpMoss
loxCRSを保持するエシェリヒア・コリJM109
の形質転換体AJ13263は、平成8年11月19日
より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
(郵便番号305 日本国茨城県つくば市東一丁目1番
3号)にブダペスト条約に基づき国際寄託されており、
受託番号FERM BP−5748が付与されている。
【0133】
【実施例4】 ラフィノース合成酵素をコードするDN
Aを含むキメラ遺伝子及び形質転換植物 <1>キメラ遺伝子を含むプラスミドの構築 アグロバクテリウムとしてLBA4404、バイナリー
ベクターとしてpBI121(CLONTECH社)を
用いて、シロイヌナズナにラフィノース合成酵素のDN
A断片を導入した。pBI121は、pBIN19由来
のプラスミドであり、ノパリン合成酵素遺伝子プロモー
ター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ構造遺伝
子(NPTII)、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネータ
ー(Nos−ter)、CaMV 35Sプロモータ
ー、GUS(β−グルクロニダーゼ)遺伝子、及びNo
s−terが接続し、これらの両側に植物への移行が可
能な配列を有する。CaMV 35Sプロモーターの下
流にはSmaI部位があり、この部位に挿入されたイン
サートは該プロモーターの制御下で発現する。
【0134】バイナリーベクターpBI121に、実施
例3で得られたラフィノース合成酵素遺伝子断片を挿入
した。ラフィノース合成酵素遺伝子をDraI消化し、
配列表配列番号4において30番目から1342番目ま
での塩基を含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動に
より調製した。この断片をpBI121のSmaIサイ
トにライゲーションした。このライゲーション反応液を
用いてエシェリヒア・コリHB101を形質転換し、形
質転換株から組換えプラスミドを調製した。得られた組
換えプラスミドのうち、CaMV 35Sプロモーター
にラフィノース合成酵素DNA断片が逆向きに接続した
もの(アンチセンス)、正の向きに接続したもの(セン
ス)ものを2種選択し、それぞれ、pBIRS1及びp
BIRS9と命名した。
【0135】上記のようにして得られたプラスミドを、
トリペアレンタルメイティングによりアグロバクテリウ
ムLBA4404に導入した。シロイヌナズナの形質転
換は以下のように行った。シロイヌナズナ(Arabi
dopsis thaliana)の種子は、吸水処理
後、1%Tween20を含む80%エタノールにて5
分間、同じく1%Tween20を含む10%次亜塩素
酸ナトリウムで10分間処理し、滅菌水で5回洗浄して
殺菌した。これを、1%低融点アガロースに懸濁し、M
S培地(MS基本培地(Murashige and Skoog, Physiolo
gia Plantrum, 15, 473-497 (1962))、B5ビタミン、
10g/L スクロース 0.5g/L MES、pH
5.8)にまいた。これを、22℃、16時間光照射、
8時間暗期の培養室にて1週間培養し、双葉が展開した
ものをロックウールに定植した。同条件で培養を続け、
約3週間後、植物が抽台し、茎の高さが数cmになった
ところで摘心をした。摘心後1週間し、伸長した側枝の
最初の花が開花した状態まで生育させた。
【0136】ラフィノース合成酵素遺伝子を含む組換え
プラスミドを導入したアグロバクテリウムの前培養を2
mlのLB培地で行った。これを、50mg/Lカナマ
イシン、25mg/Lストレプトマイシン含有のLB培
地に接種し28℃で、約1日培養した。室温で集菌し、
浸潤用懸濁培地(1/2MS塩、1/2ガンボルグ(Gam
borg)B5ビタミン、5%スクロース、0.5g/L M
ES、pH5.7(KOH)、使用直前にベンジルアミ
ノプリンを最終濃度0.044μM、またシルウェット
(SilwetL77)を1L当たり200μl(最終濃
度0.02%)加える)に菌液のOD600が0.8にな
るように懸濁した。
【0137】浸潤を行う植物より開花結実している花を
取り除いた。ロックウールを逆さにして、前記アグロバ
クテリウム懸濁液に結実していない花を漬け、デシケー
タに入れて、40mmHGで15分間減圧した。2から
4週間で、種子を集めた。収穫した種子は、デシケータ
で保存した。
【0138】つぎに、選抜培地にて、形質転換体を選抜
した。先に述ベたように種子を殺菌し、選抜培地(MS
塩、ガンボルグB5ビタミン、1%スクロース、0.5
g/L MES、pH5.8、0.8%寒天;オートク
レーブ後、選択用抗生物質、カルベニシリン(最終濃度
100mg/L、カナマイシン(最終濃度50mg/
L)を加える)にて22℃で培養し、耐性植物を選抜し
た。耐性植物は新しい培地に移し、本葉が展開するまで
育てた。ここの植物から種子を収穫した。同様の選抜を
繰り返し、T3種子を獲得した。T3種子について、先
に述ベた方法によりラフィノース含量を定量した。結果
を3に示す。
【0139】
【表3】 表3 ─────────────────────────────── 植 物 ラフィノース含量(mg/g) ─────────────────────────────── 野生株 0.2 形質転換体(pBIRS1) 0.0 形質転換体(pBIRS9) 0.0 ───────────────────────────────
【0140】
【発明の効果】本発明により、精製されたラフィノース
合成酵素、ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノース
合成酵素遺伝子と植物で発現可能な制御領域を有するキ
メラ遺伝子、及びこのキメラ遺伝子が導入された植物が
提供される。
【0141】本発明のラフィノース合成酵素を用いるこ
とにより、スクロース及びガラクチノールから効率よく
ラフィノースを合成することができる。また、本発明の
ラフィノース合成酵素遺伝子又はキメラ遺伝子を利用す
ることにより、植物のラフィノース族オリゴ糖含量を変
化させることができる。
【0142】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:30 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部ペプチド 配列 Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu Thr Val His Pro Gln 1 5 10 15 Gly Val Ile Glu Gly Val Arg His Leu Val Asp Gly Gly Cys 20 25 30
【0143】配列番号:2 配列の長さ:19 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部ペプチド 配列 Pro Val Ser Val Gly Cys Phe Val Gly Phe Asp Ala Ser Glu Pro Asp 1 5 10 15 Ser Arg His
【0144】配列番号:3 配列の長さ:14 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部ペプチド 配列 Tyr Asp Gln Asp Gln Met Val Val Val Gln Val Pro Trp Pro 1 5 10
【0145】配列番号:4 配列の長さ:2517 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:キュウリ(Cucumis sativas) 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:56..2407 特徴を決定した方法: 配列 AAAAAACAAC CCTTCTTTTA GTTTTTTGGG TTTGTTTCTT CTTTTCTTCT CACAA ATG 58 Met 1 GCT CCT AGT TTT AAA AAT GGT GGC TCC AAC GTA GTT TCA TTT GAT GGC 106 Ala Pro Ser Phe Lys Asn Gly Gly Ser Asn Val Val Ser Phe Asp Gly 5 10 15 TTA AAT GAC ATG TCG TCA CCG TTT GCA ATC GAC GGA TCG GAT TTC ACT 154 Leu Asn Asp Met Ser Ser Pro Phe Ala Ile Asp Gly Ser Asp Phe Thr 20 25 30 GTG AAC GGT CAT TCG TTT CTG TCC GAT GTT CCT GAG AAC ATT GTT GCT 202 Val Asn Gly His Ser Phe Leu Ser Asp Val Pro Glu Asn Ile Val Ala 35 40 45 TCT CCT TCT CCG TAC ACT TCG ATA GAC AAG TCC CCG GTT TCG GTT GGT 250 Ser Pro Ser Pro Tyr Thr Ser Ile Asp Lys Ser Pro Val Ser Val Gly 50 55 60 65 TGC TTT GTT GGA TTC GAC GCG TCG GAA CCT GAT AGC CGA CAT GTT GTT 298 Cys Phe Val Gly Phe Asp Ala Ser Glu Pro Asp Ser Arg His Val Val 70 75 80 TCG ATT GGG AAG CTG AAG GAT ATT CGG TTT ATG AGT ATT TTC AGG TTT 346 Ser Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Arg Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe 85 90 95 AAG GTT TGG TGG ACT ACA CAC TGG GTT GGT CGA AAT GGT GGG GAT CTT 394 Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Arg Asn Gly Gly Asp Leu 100 105 110 GAA TCG GAG ACT CAG ATT GTG ATC CTT GAG AAG TCA GAT TCT GGT CGA 442 Glu Ser Glu Thr Gln Ile Val Ile Leu Glu Lys Ser Asp Ser Gly Arg 115 120 125 CCG TAT GTT TTC CTT CTT CCG ATC GTT GAG GGA CCG TTC CGA ACC TCG 490 Pro Tyr Val Phe Leu Leu Pro Ile Val Glu Gly Pro Phe Arg Thr Ser 130 135 140 145 ATT CAG CCT GGG GAT GAT GAC TTT GTC GAT GTT TGT GTC GAG AGT GGT 538 Ile Gln Pro Gly Asp Asp Asp Phe Val Asp Val Cys Val Glu Ser Gly 150 155 160 TCG TCG AAA GTT GTT GAT GCA TCG TTC CGA AGT ATG TTG TAT CTT CAT 586 Ser Ser Lys Val Val Asp Ala Ser Phe Arg Ser Met Leu Tyr Leu His 165 170 175 GCT GGT GAT GAT CCG TTT GCA CTT GTT AAA GAG GCG ATG AAG ATC GTG 634 Ala Gly Asp Asp Pro Phe Ala Leu Val Lys Glu Ala Met Lys Ile Val 180 185 190 AGG ACC CAT CTT GGA ACT TTT CGC TTG TTG GAG GAG AAG ACT CCA CCA 682 Arg Thr His Leu Gly Thr Phe Arg Leu Leu Glu Glu Lys Thr Pro Pro 195 200 205 GGT ATC GTG GAC AAA TTC GGT TGG TGC ACG TGG GAC GCG TTT TAC CTA 730 Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr Leu 210 215 220 225 ACG GTT CAT CCA CAG GGC GTA ATA GAA GGC GTG AGG CAT CTC GTC GAC 778 Thr Val His Pro Gln Gly Val Ile Glu Gly Val Arg His Leu Val Asp 230 235 240 GGC GGT TGT CCT CCC GGT TTA GTC CTA ATC GAC GAT GGT TGG CAA TCC 826 Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln Ser 245 250 255 ATC GGA CAC GAT TCG GAT CCC ATC ACC AAA GAA GGA ATG AAC CAA ACC 874 Ile Gly His Asp Ser Asp Pro Ile Thr Lys Glu Gly Met Asn Gln Thr 260 265 270 GTC GCC GGC GAG CAA ATG CCC TGC CGT CTT TTG AAA TTC CAA GAG AAT 922 Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Leu Lys Phe Gln Glu Asn 275 280 285 TAC AAA TTC CGT GAC TAC GTC AAT CCC AAG GCC ACC GGC CCC CGA GCC 970 Tyr Lys Phe Arg Asp Tyr Val Asn Pro Lys Ala Thr Gly Pro Arg Ala 290 295 300 305 GGC CAG AAG GGG ATG AAG GCG TTT ATA GAT GAA CTC AAA GGA GAG TTT 1018 Gly Gln Lys Gly Met Lys Ala Phe Ile Asp Glu Leu Lys Gly Glu Phe 310 315 320 AAG ACT GTG GAG CAT GTT TAT GTT TGG CAT GCT TTG TGT GGA TAT TGG 1066 Lys Thr Val Glu His Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp 325 330 335 GGT GGC CTT CGC CCG CAG GTG CCT GGC TTG CCT GAG GCA CGT GTG ATT 1114 Gly Gly Leu Arg Pro Gln Val Pro Gly Leu Pro Glu Ala Arg Val Ile 340 345 350 CAG CCA GTG CTT TCA CCA GGG CTG CAG ATG ACG ATG GAG GAT TTG GCG 1162 Gln Pro Val Leu Ser Pro Gly Leu Gln Met Thr Met Glu Asp Leu Ala 355 360 365 GTG GAT AAG ATT GTT CTT CAT AAG GTC GGG CTG GTC CCG CCG GAG AAG 1210 Val Asp Lys Ile Val Leu His Lys Val Gly Leu Val Pro Pro Glu Lys 370 375 380 385 GCT GAG GAG ATG TAC GAA GGA CTT CAT GCT CAT TTG GAA AAA GTT GGG 1258 Ala Glu Glu Met Tyr Glu Gly Leu His Ala His Leu Glu Lys Val Gly 390 395 400 ATC GAC GGT GTT AAG ATT GAC GTT ATC CAC CTA TTG GAG ATG TTG TGT 1306 Ile Asp Gly Val Lys Ile Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Leu Cys 405 410 415 GAA GAC TAT GGA GGG AGA GTG GAT TTG GCA AAG GCA TAT TAC AAA GCA 1354 Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr Tyr Lys Ala 420 425 430 ATG ACC AAA TCA ATA AAT AAA CAT TTT AAA GGA AAT GGA GTC ATT GCA 1402 Met Thr Lys Ser Ile Asn Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile Ala 435 440 445 AGT ATG GAA CAT TGT AAC GAC TTC ATG TTC CTT GGC ACG GAA GCT ATC 1450 Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr Glu Ala Ile 450 455 460 465 TCT CTT GGT CGT GTT GGT GAT GAC TTT TGG TGC ACG GAC CCC TCT GGT 1498 Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp Pro Ser Gly 470 475 480 GAT CCA AAC GGT ACG TTT TGG CTC CAA GGA TGT CAC ATG GTT CAT TGT 1546 Asp Pro Asn Gly Thr Phe Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His Cys 485 490 495 GCC AAC GAC AGC TTG TGG ATG GGG AAC TTC ATC CAC CCT GAC TGG GAT 1594 Ala Asn Asp Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile His Pro Asp Trp Asp 500 505 510 ATG TTC CAA TCC ACC CAC CCT TGT GCC GCC TTC CAT GCT GCC TCT CGA 1642 Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Ala Phe His Ala Ala Ser Arg 515 520 525 GCC ATC TCT GGT GGC CCG ATC TAT GTT AGT GAT TCT GTG GGA AAG CAT 1690 Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys His 530 535 540 545 AAC TTT GAT CTT CTG AAA AAA CTA GTG CTT CCT GAT GGA TCG ATC CTT 1738 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu 550 555 560 CGA AGT GAG TAC TAT GCA CTC CCG ACT CGC GAT TGT TTG TTT GAA GAC 1786 Arg Ser Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Glu Asp 565 570 575 CCT TTG CAT AAT GGA GAA ACT ATG CTT AAG ATT TGG AAT CTC AAC AAG 1834 Pro Leu His Asn Gly Glu Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn Lys 580 585 590 TTC ACT GGA GTG ATT GGT GCA TTC AAC TGC CAA GGA GGA GGA TGG TGT 1882 Phe Thr Gly Val Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp Cys 595 600 605 CGT GAG ACA CGC CGC AAC CAA TGC TTT TCA CAA TAC TCA AAA CGA GTG 1930 Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Tyr Ser Lys Arg Val 610 615 620 625 ACA TCC AAA ACT AAC CCA AAA GAC ATA GAA TGG CAC AGT GGA GAA AAC 1978 Thr Ser Lys Thr Asn Pro Lys Asp Ile Glu Trp His Ser Gly Glu Asn 630 635 640 CCT ATC TCT ATT GAA GGC GTT AAA ACC TTT GCG CTT TAC CTC TAT CAA 2026 Pro Ile Ser Ile Glu Gly Val Lys Thr Phe Ala Leu Tyr Leu Tyr Gln 645 650 655 GCC AAA AAA CTT ATC CTC TCC AAG CCC TCT CAA GAT CTT GAC ATA GCT 2074 Ala Lys Lys Leu Ile Leu Ser Lys Pro Ser Gln Asp Leu Asp Ile Ala 660 665 670 CTT GAC CCA TTC GAA TTC GAG CTC ATC ACT GTT TCA CCA GTG ACC AAA 2122 Leu Asp Pro Phe Glu Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro Val Thr Lys 675 680 685 CTC ATC CAA ACT TCT CTA CAC TTT GCC CCA ATT GGG CTG GTG AAC ATG 2170 Leu Ile Gln Thr Ser Leu His Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met 690 695 700 705 CTT AAC ACT AGT GGA GCC ATC CAA TCT GTG GAC TAT GAC GAT GAC CTA 2218 Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Gln Ser Val Asp Tyr Asp Asp Asp Leu 710 715 720 AGC TCA GTC GAG ATT GGT GTC AAA GGG TGT GGT GAG ATG CGA GTA TTT 2266 Ser Ser Val Glu Ile Gly Val Lys Gly Cys Gly Glu Met Arg Val Phe 725 730 735 GCA TCG AAA AAA CCA AGG GCT TGT CGT ATT GAT GGG GAG GAT GTT GGG 2314 Ala Ser Lys Lys Pro Arg Ala Cys Arg Ile Asp Gly Glu Asp Val Gly 740 745 750 TTC AAG TAT GAT CAG GAC CAA ATG GTG GTG GTT CAA GTG CCA TGG CCA 2362 Phe Lys Tyr Asp Gln Asp Gln Met Val Val Val Gln Val Pro Trp Pro 755 760 765 ATT GAT TCT TCA TCG GGT GGC ATT TCG GTT ATC GAG TAC TTG TTT 2407 Ile Asp Ser Ser Ser Gly Gly Ile Ser Val Ile Glu Tyr Leu Phe 770 775 780 TAATTTTTAT TTATGTAAGC TCAATGATTG TTGTTGTTGT CGCTGTTGTT GCTATCAATG 2467 TATTTCTCTC CAAAAGAAAA TTATGTGTAA TTTGGAGAGT AATTAAGTGA 2517
【0146】配列番号:5 配列の長さ:784 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列 Met Ala Pro Ser Phe Lys Asn Gly Gly Ser Asn Val Val Ser Phe Asp 1 5 10 15 Gly Leu Asn Asp Met Ser Ser Pro Phe Ala Ile Asp Gly Ser Asp Phe 20 25 30 Thr Val Asn Gly His Ser Phe Leu Ser Asp Val Pro Glu Asn Ile Val 35 40 45 Ala Ser Pro Ser Pro Tyr Thr Ser Ile Asp Lys Ser Pro Val Ser Val 50 55 60 Gly Cys Phe Val Gly Phe Asp Ala Ser Glu Pro Asp Ser Arg His Val 65 70 75 80 Val Ser Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Arg Phe Met Ser Ile Phe Arg 85 90 95 Phe Lys Val Trp Trp Thr Thr His Trp Val Gly Arg Asn Gly Gly Asp 100 105 110 Leu Glu Ser Glu Thr Gln Ile Val Ile Leu Glu Lys Ser Asp Ser Gly 115 120 125 Arg Pro Tyr Val Phe Leu Leu Pro Ile Val Glu Gly Pro Phe Arg Thr 130 135 140 Ser Ile Gln Pro Gly Asp Asp Asp Phe Val Asp Val Cys Val Glu Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ser Lys Val Val Asp Ala Ser Phe Arg Ser Met Leu Tyr Leu 165 170 175 His Ala Gly Asp Asp Pro Phe Ala Leu Val Lys Glu Ala Met Lys Ile 180 185 190 Val Arg Thr His Leu Gly Thr Phe Arg Leu Leu Glu Glu Lys Thr Pro 195 200 205 Pro Gly Ile Val Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala Phe Tyr 210 215 220 Leu Thr Val His Pro Gln Gly Val Ile Glu Gly Val Arg His Leu Val 225 230 235 240 Asp Gly Gly Cys Pro Pro Gly Leu Val Leu Ile Asp Asp Gly Trp Gln 245 250 255 Ser Ile Gly His Asp Ser Asp Pro Ile Thr Lys Glu Gly Met Asn Gln 260 265 270 Thr Val Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu Leu Lys Phe Gln Glu 275 280 285 Asn Tyr Lys Phe Arg Asp Tyr Val Asn Pro Lys Ala Thr Gly Pro Arg 290 295 300 Ala Gly Gln Lys Gly Met Lys Ala Phe Ile Asp Glu Leu Lys Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Thr Val Glu His Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr 325 330 335 Trp Gly Gly Leu Arg Pro Gln Val Pro Gly Leu Pro Glu Ala Arg Val 340 345 350 Ile Gln Pro Val Leu Ser Pro Gly Leu Gln Met Thr Met Glu Asp Leu 355 360 365 Ala Val Asp Lys Ile Val Leu His Lys Val Gly Leu Val Pro Pro Glu 370 375 380 Lys Ala Glu Glu Met Tyr Glu Gly Leu His Ala His Leu Glu Lys Val 385 390 395 400 Gly Ile Asp Gly Val Lys Ile Asp Val Ile His Leu Leu Glu Met Leu 405 410 415 Cys Glu Asp Tyr Gly Gly Arg Val Asp Leu Ala Lys Ala Tyr Tyr Lys 420 425 430 Ala Met Thr Lys Ser Ile Asn Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile 435 440 445 Ala Ser Met Glu His Cys Asn Asp Phe Met Phe Leu Gly Thr Glu Ala 450 455 460 Ile Ser Leu Gly Arg Val Gly Asp Asp Phe Trp Cys Thr Asp Pro Ser 465 470 475 480 Gly Asp Pro Asn Gly Thr Phe Trp Leu Gln Gly Cys His Met Val His 485 490 495 Cys Ala Asn Asp Ser Leu Trp Met Gly Asn Phe Ile His Pro Asp Trp 500 505 510 Asp Met Phe Gln Ser Thr His Pro Cys Ala Ala Phe His Ala Ala Ser 515 520 525 Arg Ala Ile Ser Gly Gly Pro Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Gly Lys 530 535 540 His Asn Phe Asp Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Pro Asp Gly Ser Ile 545 550 555 560 Leu Arg Ser Glu Tyr Tyr Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Glu 565 570 575 Asp Pro Leu His Asn Gly Glu Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn Leu Asn 580 585 590 Lys Phe Thr Gly Val Ile Gly Ala Phe Asn Cys Gln Gly Gly Gly Trp 595 600 605 Cys Arg Glu Thr Arg Arg Asn Gln Cys Phe Ser Gln Tyr Ser Lys Arg 610 615 620 Val Thr Ser Lys Thr Asn Pro Lys Asp Ile Glu Trp His Ser Gly Glu 625 630 635 640 Asn Pro Ile Ser Ile Glu Gly Val Lys Thr Phe Ala Leu Tyr Leu Tyr 645 650 655 Gln Ala Lys Lys Leu Ile Leu Ser Lys Pro Ser Gln Asp Leu Asp Ile 660 665 670 Ala Leu Asp Pro Phe Glu Phe Glu Leu Ile Thr Val Ser Pro Val Thr 675 680 685 Lys Leu Ile Gln Thr Ser Leu His Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn 690 695 700 Met Leu Asn Thr Ser Gly Ala Ile Gln Ser Val Asp Tyr Asp Asp Asp 705 710 715 720 Leu Ser Ser Val Glu Ile Gly Val Lys Gly Cys Gly Glu Met Arg Val 725 730 735 Phe Ala Ser Lys Lys Pro Arg Ala Cys Arg Ile Asp Gly Glu Asp Val 740 745 750 Gly Phe Lys Tyr Asp Gln Asp Gln Met Val Val Val Gln Val Pro Trp 755 760 765 Pro Ile Asp Ser Ser Ser Gly Gly Ile Ser Val Ile Glu Tyr Leu Phe 770 775 780
【0147】配列番号:6 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TTYTAYCTBA CHGTNCAYCC TCA 23
【0148】配列番号:7 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TTYTAYCTBA CHGTNCAYCC CCA 23
【0149】配列番号:8 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TTYTAYCTBA CHGTNCAYCC ACA 23
【0150】配列番号:9 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TTYTAYCTBA CHGTNCAYCC GCA 23
【0151】配列番号:10 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び11番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 GARGGNGTNM GNCAYCTRGT NGAYGG 26
【0152】配列番号:11 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び11番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 GARGGNGTNM GNCAYCTYGT NGAYGG 26
【0153】配列番号:12 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び11番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 GARGGNGTNM GNCAYTTRGT NGAYGG 26
【0154】配列番号:13 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:3番目のヌクレオチドNはイノシンを、
他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 GTNGGNTGYT TYGTNGGYTT YGAYGC 26
【0155】配列番号:14 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:3番目のヌクレオチドNはイノシンを、
他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 GTNGGNTGYT TYGTNGGRTT YGAYGC 26
【0156】配列番号:15 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:9番目及び11番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 TTYGAYGCNT CNGARCCHGA YTCDCGNCA 29
【0157】配列番号:16 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:9番目及び11番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 TTYGAYGCNT CNGARCCHGA YTCDAGYCAY 30
【0158】配列番号:17 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GAYCARGAYC TRATGGTNGT 20
【0159】配列番号:18 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び15番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 CCRTCNACYA GRTGNCKNAC NCCYTC 26
【0160】配列番号:19 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び15番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 CCRTCNACRA GRTGNCKNAC NCCYTC 26
【0161】配列番号:20 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:6番目及び15番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 CCRTCNACYA TRTGNCKNAC NCCYTC 26
【0162】配列番号:21 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:3番目及び18番目のヌクレオチドNはイ
ノシンを、他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 TGNCGHGART CDGGYTCNGA NGCRTCRAA 29
【0163】配列番号:22 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: 存在位置: 特徴を決定した方法: その他の情報:Nはイノシンを表す。 その他の情報:19番目のヌクレオチドNはイノシンを、
他のNは、A、G、C又はTを表す。 配列 RTGRCTHGAR TCDGGYTCNG ANGCRTCRAA 30
【図面の簡単な説明】
【図1】 ラフィノース合成反応によって生じるラフィ
ノース生成量と反応時間との関係を示す図。
【図2】 ラフィノース合成酵素のSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真。Mは分子量マ
ーカーを、Sはラフィノース合成酵素を含む試料を示
す。数字は分子量(kDa)を表す。
【図3】 ラフィノース合成酵素活性に対する反応温度
の影響を示す図。
【図4】 ラフィノース合成酵素活性に対する反応pH
の影響を示す図。
【図5】 ラフィノース合成酵素活性に対するミオイノ
シトールの影響を示す図。
【図6】 ラフィノース合成酵素の安定pH範囲を示す
図。
【図7】 合成プライマーとペプチドのアミノ酸配列と
の関係を示す図。RはA又はGを、YはC又はTを、M
はA又はCを、KはG又はTを、DはG、A又はTを、
HはA、T又はCを、BはG、T又はCを、NはG、
A、T若しくはCを、Iはイノシンを表す。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記性質を有するラフィノース合成酵
    素。 (1)作用及び基質特異性:スクロースとガラクチノー
    ルからラフィノースを生成する。 (2)至適pH:約6〜8 (3)至適温度:約35〜40℃ (4)分子量: ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される分子
    量:約75kDa〜95kDa ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分
    子量:約90kDa〜100kDa 還元条件下におけるSDS−ポリアクリルアミドゲル
    電気泳動により測定される分子量:約90kDa〜10
    0kDa (5)阻害:ヨードアセトアミド、N−エチルマレイミ
    ド、ミオイノシトールにより阻害される。
  2. 【請求項2】 アミノ酸配列中に、配列表の配列番号1
    〜3に示す各アミノ酸配列を含む請求項1記載のラフィ
    ノース合成酵素。
  3. 【請求項3】 下記(A)又は(B)に示すタンパク質
    であるラフィノース合成酵素。 (A)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列を有す
    るタンパク質。 (B)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列におい
    て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
    加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スク
    ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
    性を有するタンパク質。
  4. 【請求項4】 スクロース及びガラクチノールに請求項
    1〜3のいずれか一項に記載のラフィノース合成酵素を
    作用させてラフィノースを生成させることを特徴とする
    ラフィノースの製造方法。
  5. 【請求項5】 請求項1〜3のいずれか一項に記載のラ
    フィノース合成酵素をコードするDNA。
  6. 【請求項6】 下記(A)又は(B)に示すタンパク質
    をコードするDNA。 (A)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列を有す
    るタンパク質。 (B)配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列におい
    て、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
    加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、スク
    ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
    性を有するタンパク質。
  7. 【請求項7】 下記(a)又は(b)に示すDNAであ
    る請求項5記載のDNA。 (a)配列表の配列番号4に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号57〜2408からなる塩基配列を含
    むDNA。 (b)配列表の配列番号4に記載の塩基配列のうち、少
    なくとも塩基番号57〜2408からなる塩基配列とス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスク
    ロースとガラクチノールからラフィノースを生成する活
    性を有するタンパク質をコードするDNA。
  8. 【請求項8】 ラフィノース合成酵素遺伝子又はその一
    部と、植物細胞で発現可能な転写制御領域とを含むキメ
    ラ遺伝子。
  9. 【請求項9】 前記ラフィノース合成酵素遺伝子が、請
    求項5〜7のいずれか一項に記載のDNAである請求項
    8記載のキメラ遺伝子。
  10. 【請求項10】 前記転写制御領域が、前記DNAのコ
    ード鎖に相補的な配列を有するアンチセンスRNAを発
    現するように前記DNAに連結されている請求項8又は
    9記載のキメラ遺伝子。
  11. 【請求項11】 請求項8〜10のいずれか一項に記載
    のキメラ遺伝子で形質転換された植物。
  12. 【請求項12】 請求項8〜10のいずれか一項に記載
    のキメラ遺伝子で植物を形質転換し、この遺伝子を植物
    細胞内で発現させることにより、前記植物のラフィノー
    ス族オリゴ糖含量を変化させる方法。
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