CN106617081B - 长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用，属于急性胰腺炎的预防和治疗技术领域。本发明证明了长链菊粉对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎发挥保护作用，可作为有效的成分添加到防治急性胰腺炎的药物当中，降低临床上急性胰腺炎的发生发展和炎症程度。本发明通过长链菊粉对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型进行预防性处理，对其胰腺组织进行病理组织形态观察，小鼠血清胰脂肪酶、血清淀粉酶、组织中炎症细胞释放酶MPO的水平、组织及血清中抑炎因子IL10和促炎性细胞因子TNF‑α，IL1β进行测定。比较长链菊粉处理组与炎症模型组小鼠的各个指标水平，长链菊粉处理组小鼠各项指标显著优于炎症模型组。

Description

长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用

技术领域

本发明涉及长链菊粉调节急性胰腺炎症及其引起的相关组织损伤的作用，属于急性胰腺炎的预防和治疗技术领域。

背景技术

菊粉是一类天然果聚糖的混合物。果聚糖是果糖单元通过(2-1)链联接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物，以胶体形态含于细胞的原生质中。主要见于菊科植物，例如，在菊芋的块茎、天竺牡丹(大理菊)的块根、蓟的根。研究表明，膳食中的长链菊粉可以缓解坏死性结肠炎患者症状，低发酵寡聚糖、二糖、多元醇饮食可有效减少肠易激综合征患者功能性胃肠症状，这说明长链菊粉在提供营养的同时对炎症也具有一定的调节作用。

急性胰腺炎作为重要的消化疾病之一，会引起全身炎症反应综合征以及多器官功能综合不全征，包括肠道屏障受损等，其具体的发病机制尚未完全明确。急性胰腺炎与结肠炎的起因及部位不同，其治疗干预策略也不相同，如丁酸及丁酸梭菌对结肠炎具有缓解作用，但却对急性胰腺炎无保护作用。如何更有效的预防急性胰腺炎的发生、在临床上如何更有效的阻断炎症扩散、治疗急性胰腺炎，使它避免发展成重症急性胰腺炎甚至胰腺癌，从而减少胰腺炎的病死率以及并发症发生率，探明急性胰腺炎的发病机制并开发相应的预防和治疗方法就尤为重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明证明了长链菊粉对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠发挥预防作用，并降低组织炎症程度。本发明涉及的长链菊粉，在安全剂量范围内对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠发挥保护作用，降低炎症程度，可作为有效成分添加到防治急性胰腺炎的膳食中。

本发明所使用的长链菊粉结构式如式(1)所示：

其中，n＝10～60

本发明的第一个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的药物或者药物组合物，其特征在于，所述药物或者药物组合物以长链菊粉作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，本发明的长链菊粉可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

在本发明的一种实施方式中，本发明的药物或者药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

在本发明的一种实施方式中，用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

在本发明的一种实施方式中，所述长链菊粉是式(1)中的任一单体或者两种以上单体按照任意比例混合得到的，都能降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量、降低血清淀粉酶水平、调节炎症水平。

在本发明的一种实施方式中，所述长链菊粉是一类天然果聚糖的混合物，可购自荷兰sensus公司、比利时beneo orafti公司或者上海开楷贸易有限公司等，也可购自生产或者销售式(1)长链菊粉的公司、生产或者销售以式(1)长链菊粉为主要成分的可用于药物或者食品的混合物的公司。

本发明的第二个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的食品，所述食品以长链菊粉作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述食品包括保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂等。

本发明本发明的第三个目的是提供一种降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量的制剂，所述制剂是以有效剂量的长链菊粉作为主要活性成份。

本发明的第四个目的是提供一种降低血清淀粉酶水平和/或提高胰腺组织中抑炎因子IL10表达水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的长链菊粉作为主要活性成份。

本发明的第五个目的是提供一种降低胰腺组织中促炎症因子TNF-α，IL1β表达水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的长链菊粉作为主要活性成份。

本发明的制剂是指药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂等。

本发明的第六个目的是提供长链菊粉的新应用；所述长链菊粉结构式如下：

其中，n＝10～60。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量，或者降低胰腺组织中促炎症因子TNF-α和/或IL1β表达水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低血清淀粉酶水平或者提高胰腺组织中抑炎因子IL10表达水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明证明了只需要进行短期长链菊粉喂食(3天)即可对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎发挥保护作用，可作为有效的成分添加到防治急性胰腺炎的药物当中，降低临床上急性胰腺炎的发生发展和炎症程度。此外，发明人也曾尝试以短链菊粉(n＜10)进行喂食，结果发现对于雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎无法发挥保护作用。

本发明通过长链菊粉对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型进行预防性处理，对其胰腺组织进行病理组织形态观察，小鼠血清胰脂肪酶、血清淀粉酶、组织中炎症细胞释放酶MPO的水平、组织及血清中抑炎因子IL10和促炎性细胞因子TNFα，IL1β进行测定。比较长链菊粉处理组与炎症模型组小鼠的各个指标水平，长链菊粉处理组小鼠各项指标显著优于炎症模型组。

附图说明

图1是用髓过物氧化酶试剂盒、血清淀粉酶试剂盒和血清胰脂肪酶酶联免疫吸附法试剂盒分别测定的小鼠胰腺组织中髓过物氧化酶(MPO)水平(图1A)、血清中的淀粉酶(AMY)水平(图1B)以及血清中的胰脂肪酶(lipase)(图1C)，比较长链菊粉处理组与炎症模型组的炎症程度；其中，control表示对照组，AP表示急性胰腺炎模型组，ITF IV表示长链菊粉预防处理组。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

图2是用HE染色的方法观察胰腺组织的病理变化；其中，control表示对照组，AP表示急性胰腺炎模型组，ITF IV表示长链菊粉预防处理组。

图3是用酶联免疫吸附法测定小鼠胰腺组织匀浆上清液中的炎症因子释放水平，比较长链菊粉处理组与炎症模型组的炎症程度；其中，肿瘤坏死因子用TNF-α表示(图3A)，白介素因子用IL10(图3B，图3C)、IL1β(图3D，图3E)表示，control表示对照组，AP表示急性胰腺炎模型组，ITF IV表示长链菊粉预防处理组。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

图4是用荧光定量PCR测定小鼠结肠组织中紧密连接蛋白的mRNA表达，比较长链菊粉处理组与炎症模型组的结肠紧密程度；其中，紧密连接蛋白用ZO1，occludin表示，control表示对照组，AP表示炎症模型组，ITF IV表示长链菊粉预防处理组。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

图5是用酶联免疫吸附法测定小鼠结肠组织匀浆上清液中的炎症因子释放水平，比较长链菊粉处理组与炎症模型组的炎症程度；其中，白介素因子用IL10、IL1β表示(图5B、C)，肿瘤坏死因子用TNF-α表示(图5A)，control表示对照组，AP表示炎症模型组，ITF IV表示长链菊粉预防处理组。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

具体实施方式

实施例1.急性胰腺炎模型建立

将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分成对照组(control)、急性胰腺炎组(AP)、长链菊粉预防组(ITF IV)，采用腹腔注射的方式分别给对照组、急性胰腺炎组及预防组小鼠注射生理盐水(0.90％)和雨蛙素(50ug/kg)；每小时注射一次，连续注射8次。实验期内，三组小鼠喂食饲料相同，除预防组于注射雨蛙素造模前连续摄入三天5％(长链菊粉质量g/普通小鼠饲料总重g)长链菊粉饲料。长链菊粉购自荷兰sensus公司。

实施例2.长链菊粉抵抗急性胰腺炎发生时胰腺组织MPO的表达

白细胞尤其中性粒细胞的活化作为急性胰腺炎发病机制中的重要一环，在其病理过程中发挥着极其重要的作用。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞的功能和活性状态。中性白细胞中存在有髓过氧化酶，每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5％，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，并测定中心白细胞的数目。其原理如下：

MPO+H₂O₂→复合物；复合物+AH₂(供氢体)→H₂O+MPO+A产物

通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定A产物的生成量，从而推算出MPO的活力及H₂O₂减少的量和白细胞的数目。如图1A，结果表明，急性胰腺炎组的胰腺MPO活力较正常组明显上升，长链菊粉处理组的MPO活力较疾病组明显下降。由此可得，经长链菊粉预防处理后急性胰腺炎小鼠的胰腺MPO活力显著下调，从而改善急性胰腺炎。

实施例3.长链菊粉降低急性胰腺炎发生时血清淀粉酶(AMY)的水平

已有数据显示，90％以上急性胰腺炎患者的血清中的AMY都会增高，因此本发明检测了AMY含量变化。

淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMY的活力。如图1B，结果显示，急性胰腺炎组的AMY活力较正常组明显上升，长链菊粉处理组的AMY活力较疾病组明显下降。由此可得，经长链菊粉预防处理后急性胰腺炎小鼠的AMY活力显著下调，从而改善急性胰腺炎。

实施例4.长链菊粉降低急性胰腺炎发生时血清胰脂肪酶(lipase)的水平

血清淀粉酶增高程度常与病情严重程度不成正比，且血清淀粉酶也可以在除急性胰腺炎以外的许多疾病中升高，如胃穿孔，胰腺肿瘤等。因此单独用血清淀粉酶诊断急性胰腺炎是有局限性的。血清脂肪酶在急性胰腺炎发病后活性升高，也可用于急性胰腺炎的测定。通常但其特异性更高，持续时间更长，因此，对血清脂肪酶进行测定以验证结论的准确性。

采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清lipase水平。分别向预先包被了小鼠lipase单克隆抗体的酶标孔中加入lipase温育；温育后，加入生物素标记的抗lipase抗体，再与联袂亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠lipase的浓度呈正相关。如图1C，结果显示，AP小鼠的血清胰脂肪酶较control组小鼠高，且ITF IV小鼠的血清胰脂肪酶较急性胰腺炎小鼠明显下调。由此可得，经长链菊粉预防处理后急性胰腺炎小鼠血清胰脂肪酶在血清中的表达水平显著降低，从而改善急性胰腺炎。

实施例5.长链菊粉缓解小鼠急性胰腺炎胰腺组织水肿及炎症浸润程度

用HE染色的方法，将对照组(control)、炎症模型组(AP)、表示长链菊粉预防处理组(ITF IV)的胰腺经固定、脱水、染色、脱蜡、透明和封片等主要过程，观察胰腺组织的组织完整性，胰腺水肿程度和炎症细胞浸润程度。如图2，结果显示，control组胰腺组织结构密实，无明显裂纹。AP小鼠胰腺组织结构疏松，有明显水肿及炎症浸润现象，而ITF IV组较AP组则有明显的改善作用。

实施例6.长链菊粉减少急性胰腺炎小鼠胰腺组织中炎症因子的释放

在急性胰腺炎中，TNFα与IL1β是促炎因子。急性胰腺炎发生后TNFα高表达，阻断其升高可减轻炎症病情。IL1β在急性胰腺炎早期即升高，并与TNFα协同作用，不但可以刺激自身的释放，还可以促进彼此的释放。IL10是一种有效的炎症抑制因子，能降低血清淀粉酶，抑制炎症炎症介导的巨噬细胞的多种功能，包括TNF和IL1的产生，减轻胰腺组织水肿、出血，减轻胰腺炎的严重程度。

采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠胰腺组织5％匀浆上清液IL10、IL1β和TNFα水平。分别向预先包被了小鼠IL10、IL1β和TNFα单克隆抗体的酶标孔中加入IL10、IL1β和TNFα，温育；温育后，加入生物素标记的抗IL10、IL1β和TNFα抗体，再与联袂亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠IL10、IL1β和TNFα的浓度呈正相关。如图3A，结果显示，AP组胰腺TNFα水平明显高于control组，而ITF IV组的TNFα水平相较于AP组则显著下调。如图3B和3C，AP组胰腺与血清中IL10水平明显低于control组，而ITF IV组的IL10水平相较于AP组则显著上升。如图3D和3E，AP组胰腺与血清中IL1β水平明显高于control组，而ITF IV组的IL1β水平相较于AP组则显著下调。综上可得，经长链菊粉预防处理后，能够急性胰腺炎小鼠IL1β和TNFα在其胰腺组织及血清中的表达水平显著降低，同时IL10在其胰腺组织及血清中的表达水平显著上调，从而改善急性胰腺炎的胰腺炎症程度。

实施例7.长链菊粉缓解小鼠急性胰腺炎引起的结肠组织通透程度。

急性胰腺炎的发生会导致肠道屏障受损，肠道通透性降低。紧密连接蛋白(ZO1、occludin)的含量是反映肠道组织紧密与通透程度的重要指标。

采用荧光定量PCR法(QPCR)测定小鼠结肠组织的紧密连接蛋白mRNA表达相对含量。组织样品通过使用高通量组织研磨机在trizol中进行破碎，之后使用氯仿等进行抽提，离心后吸取上清，加入等体积的异丙醇进行沉淀RNA，离心后弃上清，用75％乙醇DEPC进行洗涤所得RNA。对得到的RNA进行浓度和纯度的测量后，使用Takara反转录试剂盒将组织样品中的RNA反转到cDNA。根据mRNA设计的引物在正式实验前需进行QPCR测试其特异性和扩增效率，得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄，无明显引物二聚体熔解曲线峰。引物验证结果良好后进行正式实验.

使用SYBR Green mix进行相关基因的扩增检测。扩增程序为：55℃预热30秒；95℃5分钟；接下来循环39次：95℃30秒；58℃30秒；之后进行引物特异性检测，从65℃保持5秒之后每秒上升0.1℃至95℃，观察引物特异性。如图4，结果显示，AP组结肠ZO1和occludin的mRNA水平明显低于control组，而ITF IV组的ZO1和occludin的mRNA水平相较于AP组则显著上升。由此可得，经长链菊粉预防处理后，急性胰腺炎小鼠肠道紧密连接蛋白(ZO1，occludin)的mRNA表达显著上调，其从而改善由急性胰腺炎引起的肠道组织通透程度减弱。

实施例8.长链菊粉减少急性胰腺炎小鼠结肠组织中炎症因子的释放

急性胰腺炎会导致肠道屏障受损，其中包括肠道炎症的发生。TNFα与IL1β是促炎因子，IL10是一种有效的炎症抑制因子。本发明中研究了短期长链菊粉喂食对由急性胰腺炎引起的肠道组织损伤，包括炎症的改善。

采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠结肠组织5％匀浆上清液IL10、IL1β和TNF-α水平。分别向预先包被了小鼠IL10、IL1β和TNF-α单克隆抗体的酶标孔中加入IL10、IL1β和TNF-α，温育；温育后，加入生物素标记的抗IL10、IL1β和TNF-α抗体，再与联袂亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠IL10、IL1β和TNF-α的浓度呈正相关。如图5A和5C，结果显示，AP组结肠TNFα与IL1β水平明显高于control组，而ITF IV组的TNFα与IL1β水平相较于AP组则显著下调。如图5B，AP组结肠中IL10水平明显低于control组，而ITF IV组的IL10水平相较于AP组则显著上升。综上可得，经长链菊粉预防处理后，急性胰腺炎小鼠IL1β和TNF-α在结肠组织中的表达水平显著降低，同时IL10在结肠组织中的表达水平显著上调，从而改善由急性胰腺炎引起的肠道炎症程度。

综上，本发明采用短期长链菊粉喂食(3天)的方法，对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型进行预防性处理，发现短期长链菊粉喂食可对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎发挥保护作用，可作为有效的成分添加到防治急性胰腺炎的药物当中，降低临床上急性胰腺炎的发生发展和炎症程度。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.长链菊粉在制备预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的药物方面的应用；所述长链菊粉结构式如下：

其中，n＝10～60。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物配制成若干种剂型，包括口服制剂、能够注射的制剂、局部制剂，其中含有药学领域中的赋形剂。

4.长链菊粉在制备降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量，或者降低胰腺组织中促炎症因子TNF-α和/或IL1β表达水平的药物方面的应用；所述长链菊粉结构式如下：

其中，n＝10～60。

5.长链菊粉在制备降低血清淀粉酶水平或者提高胰腺组织中抑炎因子IL10表达水平的药物方面的应用；所述长链菊粉结构式如下：

其中，n＝10～60。

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