DE19617687A1 - Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter, hochmole­ kulares Inulin erzeugender Pflanzen, Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens und die mit Hilfe dieser Mittel und des Verfahrens erhältlichen Pflanzen sowie das darin enthaltene hochmolekulare Inulin.

Hochmolekulare, wasserlösliche, lineare Polymere, beispielsweise Polyacrylate und Polymethylacrylate sind bekannt. Diese werden beispielsweise zur Vis­ kositätserhöhung von wäßrigen Systemen, als suspen­ dierendes Agens, zur Sedimentationsbeschleunigung und Komplexierung sowie in Superabsorbern zur Was­ serbindung und in Wasser verdünnbaren Lacken einge­ setzt. Als nachteilig erweist sich, daß diese Pro­ dukte biologisch nicht abbaubar sind. Ersatzweise kommen derivatisierte hochpolymere Polysaccharide in Betracht. Solche Polysaccharide lassen sich bis­ her biotechnologisch durch Fermentation und Trans­ glycosylierung gewinnen. Fermentativ erzeugte Poly­ mere sind jedoch aufgrund wirtschaftlicher Ge­ sichtspunkte für Anwendungen im größeren Maßstab nicht geeignet. Seit einiger Zeit wird daher ver­ sucht, lineare, wasserlösliche Polymere, wie zum Beispiel Inulin, in Pflanzen zu produzieren.

Inulin, ein β-2-1 verknüpftes Polyfructan, ist als Speicherkohlenhydrat in einigen zweikeimblättrigen, höheren Pflanzen nachweisbar, und liegt mit einem Molekulargewicht von 5-50 kD vor. Unter den Bakte­ rien sind außerdem einige gram-positive und gram­ negative Bakterienarten bekannt, die ein verwandtes Fructanpolymer, das β-2-6 verknüpfte Levan, mittels sogenannter Levansucrasen synthetisieren. Bakteri­ ell gebildete Polyfructane weisen erheblich höhere Molekulargewichte von bis zu 2000 kD auf. Derzeit ist lediglich ein gram-positives Bakterium be­ schrieben, Streptococcus mutans, das mit Hilfe ei­ nes ftf (Fructosyltransferease) Gens Inulin auf der Basis von Saccharose bildet (Shiroza und Kuramitsu, J. Bacteriology (1988) 170, 810 bis 816).

Verfahren zur Veränderung der Kohlenhydratkonzen­ tration und/oder der Zusammensetzung der Kohlenhy­ drate in transgenen Pflanzen mittels biotechnologi­ scher Methoden sind bekannt. Die PCT/US89/02729 be­ schreibt eine Möglichkeit zur Erzeugung von Kohlen­ hydratpolymeren, insbesondere Dextran oder Poly­ fructose, in transgenen Pflanzen, insbesondere de­ ren Früchten. Zur Erzeugung dieser Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrase oder Dextransucrase aus verschiedenen Mikroorganismen vorgeschlagen. Weder die Bildung der aktiven Enzyme, noch die von Levan oder Dextran sowie die Herstellung transgener Pflanzen wird nachgewiesen.

Die PCT/EP93/02110 offenbart ein Verfahren zur Her­ stellung Polyfructose erzeugender transgener Pflan­ zen, die das lsc Gen für eine Levansucrase aus ei­ nem gram-negativen Bakterium enthalten.

Die PCT/NL93/00279 offenbart die Transformation von Pflanzen mit chimären Genen, die das sacB Gen aus Bacillus subtilis oder das ftf Gen aus Streptococ­ cus mutans enthalten. Im Falle des sacB Gens wird zur Erhöhung des Expressionsniveaus in transfor­ mierten Pflanzen außerdem eine Modifikation des 5′- untranslatierten Bereichs des bakteriellen Gens empfohlen. Für das Fructosyltransferasegen aus Steptococcus mutans werden keine Sequenzmodifika­ tionen zur Verbesserung der Expression beschrieben. Das Expressionsniveau der Fructosyltransferase ist daher vergleichsweise gering.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das techni­ sche Problem zugrunde, ein Verfahren und Mittel zur Herstellung von hochmolekularem Inulin in Pflanzen bereitzustellen, die die einfache und kostengün­ stige Erzeugung des Inulins in großer Menge in Pflanzen ermöglichen.

Die Lösung dieses technischen Problems liegt in der Bereitstellung eines modifizierten Fructosyltrans­ ferasegens, insbesondere eines Gens, in dem der aminoterminale Bereich eines bekannten Fructosyl­ transferasegens durch den aminoterminalen Bereich eines anderen Gens ersetzt ist. Die bevorzugte er­ findungsgemäß vorgesehene Modifikation der Sequenz des bekannten Fructosyltransferasegens besteht also in einem Austausch der codierenden Region des ami­ noterminalen Bereiches eines Fructosyltransferase­ gens gegen den aminoterminalen Bereich eines ande­ ren Gens. Überraschenderweise kann ein derart modi­ fiziertes Fructosyltransferasegen effizient in hö­ heren Pflanzen exprimiert werden, wobei hochmoleku­ lares Inulin in großer Menge erhalten wird. In be­ sonders vorteilhafter Weise ist keine umfassende Sequenzmodifikation oder Neusynthese des ursprüng­ lichen Fructosyltransferasegens notwendig.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird un­ ter einem Fructosyltransferasegen die codierende DNA-Sequenz eines Gens verstanden, dessen Genpro­ dukt eine Saccharose: β-D-Fructosyltransferaseakti­ vität aufweist. Ein derartiges Gen kann pflanzli­ cher, tierischer, mikrobieller oder synthetischer Herkunft sein. Erfindungsgemäß werden unter modifi­ zierten Fructosyltransferasegenen die codierenden DNA-Sequenzen von modifizierten Genen verstanden, deren Genprodukte eine Saccharose: β-D-Fructosyl­ transferaseaktivität aufweisen und in der Lage sind, β-2-1 verknüpfte Polyfructane, also insbeson­ dere Inuline, zu bilden. Die Genprodukte der modi­ fizierten Gene weisen also die vorstehend defi­ nierte biologische Aktivität einer Inulinsucrase auf. Unter dem Begriff Modifikation werden sämtli­ che Manipulationen an einer DNA-Sequenz verstanden, beispielsweise Nucleotidsubstitutionen, -deletio­ nen, -inversionen oder -additionen. Unter dem ami­ noterminalen Bereich eines Gens wird der Bereich der codierenden DNA-Sequenz verstanden, der den aminoterminalen Bereich des Genproduktes codiert.

Schließlich wird erfindungsgemäß unter hochmoleku­ larem Inulin ein Inulin mit einem Molekulargewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton verstanden.

Die Lösung des vorgenannten technischen Problemes wird insbesondere durch das im Hauptanspruch cha­ rakterisierte Gen, dieses Gen aufweisende Vektoren, diese Vektoren verwendende Transformationsverfahren und die mit diesem Verfahren erhaltenden Pflanzen und Inuline bereitgestellt. Die Unteransprüche be­ treffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Die Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungs­ form ein modifiertes Fructosyltransferasegen, in dem der aminotermale Bereich eines Fructosyltrans­ ferasegens durch den aminoterminalen Bereich eines anderen Gens ersetzt ist. Außer dem Austausch des ursprünglichen aminoterminalen Bereichs des Fructo­ syltransferasegens gegen den aminoterminalen Bereich eines anderen Gens kann das Fructosyltransferasegen selbstverständlich auch weitere Modifikationen auf­ weisen oder vollsynthetisch hergestellt sein.

Die Erfindung betrifft aber auch alle anderen Modi­ fikationen eines Fructosyltransferasegens, sofern das gebildete Genprodukt in Pflanzen hochmolekula­ res Inulin erzeugen kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß der aminoterminale Bereich des anderen Gens aus einem anderen pflanz­ lichen oder bakteriellen Gen, insbesondere dem lacZ-Gen von Escherichia coli stammt. Insbesondere ist bevorzugt, daß der genannte aminoterminale Be­ reich des lacZ-Gens die aminoterminalen Aminosäuren 21 bis 30 der β-Galactosidase codiert.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß die Fructosyltransferase aus Strep­ tococcus mutans stammt. Selbstverständlich betrifft die Erfindung jedoch auch die Verwendung von ande­ ren Fructosyltransferasen, solange sie in erfin­ dungsgemäß vorgegebener modifizierter Form Inuline erzeugen können.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt der zu ersetzende aminoterminale Bereich des Fructosyltransferasegens einen dessen Signalpeptid codierenden Bereich dar. Im Zusammen­ hang der vorliegenden Erfindung wird unter einem Signalpeptid codierenden Bereich der Bereich zwi­ schen Translationsstart und Beginn der das reife, prozessierte Protein codierenden DNA-Sequenz ver­ standen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Er­ findung ein modifiziertes Fructosyltransferasegen, das an eine Signalsequenz fusioniert ist, welche eine Signalpeptid zur Aufnahme des modifizierten Gens in das endoplasmatische Retikulum einer euka­ ryontischen Zelle codiert. Die Erfindung sieht also vor, daß ein modifiziertes Gen der Erfindung mit Signalsequenzen versehen werden kann, die eine Lo­ kalisation des Genproduktes in bestimmten Komparti­ menten der Zelle erlauben. Erfindungsgemäß beson­ ders bevorzugt ist die Signalsequenz eines Patatin­ gens, insbesondere des Patatingens B33, aus Kartof­ fel. Bei der Verwendung der das Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplasmatische Retikulum codierenden Signalsequenz aus dem aminoterminalen Bereich des Patatin-B33-Gens wird eine Translokation des Gen­ produktes in den apoplastischen Raum erreicht. Folglich wird dort die Synthese des hochmolekularen Inulins durchgeführt, so daß spezifische Verände­ rungen in der Kohlenhydrat-Zusammensetzung der transgenen Pflanze erreicht werden können. Selbst­ verständlich können erfindungsgemäß auch andere Si­ gnalsequenzen verwendet werden. So kommen insbeson­ dere Signalsequenzen in Betracht, die Signalpeptide codieren, welche zur Aufnahme eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum führen und die dadurch nachgewiesen werden können, daß sie zwar in den Vorläuferproteinen, nicht aber in prozessierten, reifen Proteinen detektiert werden können. Bekann­ termaßen werden nämlich die Signalpeptide während der Aufnahme ins endoplasmatische Retikulum proted­ lytisch entfernt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, daß das modifizierte Fructosyl­ transferasegen an eine Signalsequenz fusioniert ist, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endo­ plasmatische Retikulum einer eukaryontischen Zelle und zur Weiterleitung in die Vacuole codiert. Die Verwendung eines Signalpeptids zur vacuolären Loka­ lisation des Genproduktes ist vorteilhaft insofern, als das dadurch ebenfalls spezifische Veränderungen der Kohlenhydrat-Zusammensetzung der erhaltenen transgenen Pflanzen bewirkt werden können. Erfin­ dungsgemäß können beispielsweise Signalpeptide zur vacuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste ver­ wendet werden (Raikhel und Lerner, Dev.Genet (1991) 12, 255-260), 43 Aminosäuren im aminoterminalen Be­ reich des reifen Phytohämaglutinins der Bohne co­ dierende Signalsequenzen (Tague et al., Plant cell (1990) 2, 533-546) und Signalsequenzen aus einem Pa­ tatingen aus Kartoffel.

Erfindungsgemäß ist besonders bevorzugt, zur Loka­ lisation des Genproduktes in der Vacuole eine Si­ gnalsequenz des Patatin-B33-Gens zu verwenden, ins­ besondere eine, die die 60 aminoterminalen Amino­ säuren des Propeptids codiert (Rosahl et al., Mol Gen Genet (1986) 203, 214-220), also die nt 736 bis 855. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird diese Sequenz als erweiterte B33-Signalsequenz bezeichnet. Diese Sequenz kann sowohl als Fragment genomischer DNA der Kartoffel als auch aus cDNA zum Transcript des B33-Gens gewonnen werden. Die Fusion der erweiterten B33-Signalsequenz zum modifizierten Gen der Erfindung führt zur Aufnahme von dessen Genprodukt in die Vacuole und damit zu einer spezi­ fischen Änderung in der Kohlenhydrat-Zusammenset­ zung der erhaltenen transgenen Pflanze.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser erweiterten B33-Signalsequenz beziehungsweise des davon codierten Peptids zum Transport beliebiger anderer Genprodukte in pflanzliche Vacuolen.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, insbeson­ dere ein Plasmid, enthaltend ein modifiziertes Fructosyltransferasegen, welches gegebenenfalls zu den genannten Signalsequenzen fusioniert ist. Ins­ besondere betrifft die Erfindung einen Vektor oder ein Plasmid, enthaltend ein modifiziertes Fructo­ syltransferasegen, gegebenenfalls fusioniert an eine Signalsequenz, das unter der Kontrolle eines in Pflanzen aktiven Promotors, insbesondere eines organspezifischen Promotors, steht. Bekanntermaßen ist Saccharose das Substrat für die Fructosyltrans­ ferase, so daß die Produktion von hochmolekularem Inulin insbesondere in solchen Pflanzengeweben oder Pflanzenorganen von Vorteil ist, die große Mengen an Saccharose speichern. Dazu zählen beispielsweise die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm vom Zucker­ rohr. Erfindungsgemäß kann die Expression des modi­ fizierten Fructosyltransferasegens in solchen Orga­ nen erreicht werden, indem gewebespezifische Promo­ toren verwendet werden. Eine organspezifische Ex­ pression in Kartoffelknollen oder Rüben von Zucker­ rüben ist beispielsweise mit dem B33-Promotor des B33-Gens aus Kartoffel möglich.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor oder ein Plasmid, in dem der 3′-Terminus des modifizierten Fructosyltransferasegens an eine Transcriptionster­ minationssequenz, beispielsweise die Polyadenylie­ rungsstelle des nos-Gens aus Agrobacterium tumefa­ ciens, fusioniert ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform be­ trifft die Erfindung die Plasmide pB33cftf, pB33aftf, pB33v1ftf und pB33v2ftf (siehe Fig. 1 bis 4).

Die Erfindung betrifft auch prokaryontische und eu­ karyontische Zellen, die einen Vektor, ein Plasmid oder eine DNA-Sequenz der Erfindung enthalten. Ins­ besondere betrifft die Erfindung die erfindungsge­ mäßen Vektoren, Plasmide oder DNA-Sequenzen aufwei­ senden Zellen, beispielsweise Bakterienzellen oder, bevorzugt, Pflanzenzellen. Diese können das modifi­ zierte Fructosyltransferasegen der Erfindung entwe­ der transient oder, besonders bevorzugt, stabil in­ tegriert in ihr Genom enthalten. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden unter den erfin­ dungsgemäßen Pflanzenzellen solche verstanden, die entweder direkt unmittelbar aus dem Transformati­ onsereignis hervorgegangen sind und demgemäß, je nach gewählter Transformationsmethode, undifferen­ ziert oder differenziert vorliegen können oder sich differenzierende beziehungsweise ausdifferenzierte Pflanzenzellen.

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die minde­ stens eine, bevorzugt jedoch eine Vielzahl von Zel­ len enthalten, die das erfindungsgemäße Fructosyl­ transferasegen oder dieses enthaltende Vektoren oder Plasmide aufweisen und infolge dessen hochmo­ lekulares Inulin erzeugen. Die Erfindung ermöglicht also die Bereitstellung von Pflanzen der verschie­ densten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund des eingeführten modifizier­ ten Fructosyltransferasegens in der Lage sind, hochmolekulares Inulin zu erzeugen. Da die bekann­ ten Pflanzen nicht in der Lage sind, hochmolekula­ res Inulin zu produzieren, ist die erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens leicht, beispielsweise durch Antikörpertests, mög­ lich. Gegenüber den wenigen bekannten Inulin erzeu­ genden Pflanzen ergibt sich der Vorteil, daß eine gezielte Lokalisierung des gebildeten Inulins mög­ lich ist und das zudem eine Erhöhung der Expressi­ onsrate und damit der Menge an gebildeten Inulin erreicht wird. Zudem weist das durch das erfin­ dungsgemäße Gen bakteriellen Ursprungs erzeugte er­ findungsgemäße Inulin ein höheres Molekulargewicht als pflanzliches Inulin auf. Auch hier läßt sich der Nachweis erfolgreicher Transformation mit den erfindungsgemäßen Sequenzen beispielsweise durch Kompartiment-spezifische Antikörpertests, gegebe­ nenfalls unter Quantifizierung, nachweisen.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, daß die zu transformierende Pflanze eine Nutzpflanze, insbe­ sondere eine Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Zuc­ kerrüben-, Zuckerrohr- oder Kartoffelpflanze ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her­ stellung der vorgenannten Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor oder einem Plasmid der Erfindung, die Integration des in diesem Vektor oder Plasmid enthaltenden modifizierten Fructosyl­ transferasegens, gegebenenfalls unter Einschluß von dessen Signalsequenzen, in das Genom der Pflanzen­ zelle(n) und die Regeneration der Pflanzenzelle(n) zu intakten, transformierten, hochmolekulares Inu­ lin erzeugenden Pflanzen.

Schließlich betrifft die Erfindung das von den er­ findungsgemäßen Pflanzen hergestellte hochmoleku­ lare Inulin. Dieses zeichnet sich gegenüber natür­ licherweise in einigen Pflanzen vorkommendem Inulin insbesondere auch durch sein hohes Molekulargewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton aus.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 stellt die Konstruktion des Plasmids pB33cftf dar.

Fig. 2 stellt die Konstruktion des Plasmids pB33aftf dar.

Fig. 3 stellt die Konstruktion des Plasmids pB33v1ftf dar.

Fig. 4 stellt die Konstruktion des Plasmids pB33v2ftf dar.

Fig. 5 stellt eine Northern-Blot Analyse der Genexpression, das heißt der ftf-mRNA Ge­ halte, in Knollen ausgewählter Transfor­ manten mit den erfindungsgemäßen Kon­ strukten dar.

Fig. 6 stellt eine Dünnschichtchromatographie- Analyse der Inulingehalte von Knollen ei­ ner Reihe von mit dem Plasmid pB33v1ftf transformierter Pflanzen dar.

Die Ausführungsbeispiele beschreiben die Erfindung in Einzelheiten.

Ausführungsbeispiel 1

Herstellung des Plasmids pB33cftf und Einbringen des entsprechenden Konstrukts in das Genom von Kar­ toffel.

Das Plasmid pB33cftf enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vetor pBin19-Hyg (Bevan, Nucl Acids Res (1984) 12, 8711, modifiziert nach Becker, Nucl Acids Res (1990) 18, 203) (vgl. Fig. 1).

Das Fragment A beinhaltet den B33 Promotor des Pa­ tatin Gens b33 der Kartoffel. Es enthält ein DraI Fragment (Position: -1512 bis Position +14) des Pa­ tatin Gens b33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J (1989) 8, 23-29), das zwischen der EcoRI- und der SacI- Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg inse­ riert ist.

Das Fragment B ist eine Fusion der nt 780-3191 des ftf Gens aus Streptococcus mutans (Genbank ENBL Ac­ cession M18954) an eine Kombination der nt 724-716 und nt 759-727 des Plasmids pBluescript KS, die die aminoterminalen Aminosäuren 21-30 der β-Galactosi­ dase repräsentieren. Clonierungsbedingt entsteht vor dieser Sequenz ein ATG-Startcodon, das für die Translation des Fusionsproduktes in Pflanzen ge­ nutzt wird. Die Sequenz bis zur Fusion an nt 780 des ftf Gens ist im folgenden dargestellt:

Die nt 780-3191 des ftf Gens wurden als EarI- (auf­ gefüllt mit DNA Polymerase)/BglII-Fragment aus dem Plasmid pTS102 (Shiroza and Kuramitsu, J Bacteriol (1988) 170, 810-816) isoliert. Durch die Fusion dieses Fragments des ftf Gens an die genannte DNA- Sequenz erfolgt der Austausch des ursprünglichen N- Terminus gegen den aminoterminalen Bereich der β- Galactosidase.

Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopin-Synthase-Gen aus Agrobacterium tumefaciens) der T-DNA des Ti-Plasmids pTiAch 5 (Gielen et al., EMBO J. (1984) 3, 835-846), also die Nucleotide 11749-11939, welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al., Nature (1983) 303, 209-213) iso­ liert worden ist und nach Addition von Sph I Lin­ kern an die Pvu II-Schnittstelle zwischen die SphI- und die Hind III-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg cloniert worden ist.

Das Plasmid pB33cftf hat eine Größe von ca. 14 kb.

Das Konstrukt pB33cftf wurde in Kartoffelpflanzen eingebracht. Aus transformierten Zellen wurden in­ takte Pflanzen regeneriert. Die Analyse der Knollen einer Reihe von mit diesem Gen transformierten Pflanzen zeigte eindeutig das Vorkommen von Inulin, was auf die Expression des erfindungsgemäßen Gens zurückzuführen ist.

Ausführungsbeispiel 2

Herstellung des Plasmids pB33aftf und Einbringen des entsprechenden Konstrukts in das Genom von Kar­ toffel.

Das Plasmid pB33aftf enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19-Hyg (Bevan, Nucl Acids Res (1984) 12, 8711, modifiziert nach Becker, Nucl Acids Res (1990) 18, 203) (vgl. Fig. 2).

Das Fragment A beinhaltet den B33 Promotor des Pa­ tatin Gens b33 der Kartoffel. Es enthält ein DraI Fragment (Position:-1512 bis Position +14) des Pa­ tatin Gens b33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J (1989) 8, 23-29), das zwischen der EcoRI- und der SacI- Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg inse­ riert ist.

Das Fragment B ist eine Fusion des modifizierten ftf Gens von Streptococcus mutans (nt 780-3191, vgl. Beispiel 1) an die nt 724 bis 833 des Patatin­ gens b33 über eine Sequenz der Nukleotide GTCGACGG- TATCG. Diese Sequenz (in Fig. 2 als "a" bezeich­ net) beinhaltet die Codierregion für das Signalpep­ tid zur Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum (ER) (Rosahl et al., Mol Gen Genet (1986) 203, 214- 220; Sequenz stammt aus pcT58). Proteine, die eine derartige Signalsequenz besitzen, werden zunächst in das ER aufgenommen und dann in den apoplasti­ schen Raum exportiert.

Das Fragment c enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopin-Synthase Gen aus Agrobacterium tumefaciens) der T-DNA des Ti-Plasmids pTiAch 5 (Gielen et al., EMBO J (1984) 3, 835-846), also die Nucleotide 11749-11939, welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., Nature (1983) 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II-Schnittstelle zwischen die SphI- und die Hind III-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg cloniert worden ist.

Das Plasmid pB33aftf hat eine Größe von ca. 14 kb.

Das Konstrukt B33aftf wurde in Kartoffelpflanzen eingebracht. Aus transformierten Zellen wurden in­ takte Pflanzen regeneriert. Die Analyse der Knollen einer Reihe von mit diesem Gen transformierten Pflanzen zeigte eindeutig das Vorkommen von Inulin, was auf die Expression des erfindungsgemäßen Gens zurückzuführen ist.

Ausführungsbeispiel 3

Herstellung des Plasmids pB33v1ftf und Einbringen des entsprechenden Konstrukts in das Genom von Kar­ toffel.

Das Plasmid pB33v1ftf enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19-Hyg (Bevan, Nucl Acids Res (1984) 12, 8711, modifiziert nach Becker, Nucl Acids Res (1990) 18, 203) (vgl. Fig. 3).

Das Fragment A beinhaltet den B33 Promotor des Pa­ tatin Gens b33 der Kartoffel. Es enthält ein DraI Fragment (Position:-1512 bis Position +14) des Pa­ tatin Gens b33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J (1989) 8, 23-29), das zwischen der EcoRI- und der SacI- Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg inse­ riert ist.

Das Fragment B ist eine Fusion des modifizierten ftf Gens von Streptococcus mutans (nt 780-3191, vgl. Beispiel 1) an die nt 724 bis 1399 des Pata­ tingens b33 über eine Sequenz der Nukleotide GTCGACGGTATCG. Diese Sequenz (in Fig. 3 als "VI" bezeichnet) beinhaltet die Codierregion für das Si­ gnalpeptid zur Aufnahme in das ER, sowie die daran anschließende Information für ein Signal zur Wei­ terleitung in die Vacuole (Rosahl et al., Mol Gen Genet (1986) 203, 214-220, Sequenz stammt aus pgT5). In die Codierregion dieser erweiterten Si­ gnalsequenz ist ein Intron inseriert. Aus dem Tran­ script des chimären Gens wird die Nucleotidsequenz des Introns durch "splicing" entfernt. Proteine, die ein derartiges Signalpeptid besitzen, werden zunächst in das ER aufgenommen und dann in die Va­ cuole transportiert.

Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopin-Synthase Gen aus Agrobacterium tumefaciens) der T-DNA des TI-Plasmids pTiAch 5 (Gielen et al., EMBO J (1984) 3, 835-846), also die Nucleotide 11749-11939, welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., Nature (1983) 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph 1 Linkern an die Pvu II-Schnittstelle zwischen die SphI- und die Hind III-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg cloniert worden ist.

Das Plasmid pB33v1ftf hat eine Größe von ca. 14 kb.

Das Konstrukt B33v1ftf wurde in Kartoffelpflanzen eingebracht. Aus transformierten Zellen wurden in­ takte Pflanzen regeneriert. Die Analyse der Knollen einer Reihe von mit diesem Gen transformierten Pflanzen zeigte eindeutig das Vorkommen von Inulin, was auf die Expression des erfindungsgemäßen Gens zurückzuführen ist (vgl. Abb. 6).

Ausführungsbeispiel 4

Herstellung des Plasmids pB33v2ftf und Einbringen des entsprechenden Konstrukts in das Genom von Kar­ toffel.

Das Plasmid pB33v2ftf enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19-Hyg (Bevan, Nucl Acids Res (1984) 12, 8711, modifiziert nach Becker, Nucl Acids Res (1990) 18, 203) (vgl. Fig. 4).

Das Fragment A beinhaltet den B33 Promotor des Pa­ tatin Gens b33 der Kartoffel. Es enthält ein DraI Fragment (Position: -1512 bis Position +14) des Pa­ tatin Gens b33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J (1989) 8, 23-29), das zwischen der EcoRI- und der SacI- Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg inse­ riert ist.

Das Fragment B ist eine Fusion des modifizierten ftf Gens von Streptococcus mutans (nt 780-3191, vgl. Beispiel 1) an ein Fragment (in Fig. 4 als "V2" bezeichnet) der cDNA des Patatingens b33. Die cDNA enthält die in Ausführungsbeispiel 3 erwähnte Signalsequenz zur Aufnahme in das ER und zur Wei­ terleitung in die Vacuole; die Codierregion ist je­ doch nicht durch ein Intron unterbrochen (Rosahl et al., Mol Gen Genet (1986) 203, 214-220; nt 724- 903/1293-1399, Sequenz stammt aus pcT58, (Zählung nach pgT5)). Proteine, die ein derartiges Signal­ peptid besitzen, werden zunächst in das ER aufge­ nommen und dann in die Vacuole transportiert.

Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 (Octopin-Synthase Gen aus Agrobacterium tumefaciens) der T-DNA des Ti-Plasmids pTiAch 5 (Gielen et al., EMBO J (1984) 3, 835-846), also die Nucleotide 11749-11939, welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al., Nature (1983) 303, 209-213) iso­ liert worden ist und nach Addition von Sph I Lin­ kern an die Pvu II-Schnittstelle zwischen die SphI- und die Hind III-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg cloniert worden ist.

Das Plasmid pB33v2ftf hat eine Größe von ca. 14 kb.

Das Konstrukt B33v2ftf wurde in Kartoffelpflanzen eingebracht. Aus transformierten Zellen wurden in­ takte Pflanzen regeneriert. Die Analyse der Knollen einer Reihe von mit diesem Gen transformierten Pflanzen zeigte eindeutig das Vorkommen von Inulin, was auf die Expression des erfindungsgemäßen Gens zurückzuführen ist.

Ausführungsbeispiel 5 Nachweis des gebildeten Inulins

Knollenmaterial wurde in 100 mM Natriumacetat, pH 5,6 in Gegenwart von unlöslichem Polyvinylpyrro­ lidon (1 ml/100 mg Material) homogenisiert, 30 min bei 65°C inkubiert und anschließend bei 65°C fil­ triert. 15 ml Homogenat wurden mit 15 µl RNAse A (1 mg/ml) und 15 µl DNAse (10 mg/ml) 30 min bei 37°C, anschließend mit 20 µl ProteinaseK (20 mg/ml) 30 min bei 60°C inkubiert. Inulin wurde aus dem Ho­ mogenat durch Einstellen auf 80% Ethanol gefällt und abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 50 µl Wasser bei 75°C gelöst und nochmals mit 80% Ethanol gefällt. Das Sediment wurde dann in 30 µl Wasser bei 75°C gelöst, 4 µl der Lösung wurden dünn­ schichtchromatographisch analysiert beziehungsweise für 15 min mit einem Überschuß an Endoinulinase bei 56°C behandelt.

Transformations- und Regenerationsprotokoll für Kartoffel

Die Kartoffeln wurden gemäß (Potrykus I., Spangen­ berg G. (Hrsg.), 1995, "Genetransfer to plants", Dietze J., Blau A., Willmitzer L., "A Bacteria Me­ diated Transformation of Potato", Springer Lab Ma­ nual, Seite 24-39) transformiert und regeneriert.

Aufarbeitung und Gewinnung des gebildeten Inulins

Kartoffelknollen werden gewaschen und dann mit ei­ ner Reibe (zum Beispiel von der Firma Nivoba) zu Reibsel zerkleinert. Die Reibsel werden dann mit einem Wasserstrom über Hydrozyklone geleitet und dabei in Pülpe-, Feststoff- und Fruchtwasser-Frak­ tionen aufgeteilt. Die im wesentlichen aus Inulin bestehende Feststoff-Fraktion wird durch Waschen mit Wasser gereinigt und getrocknet.

Claims (21)

1. Modifiziertes Fructosyltransferasegen, in dem der aminoterminale Bereich eines Fructosyltrans­ ferasegens durch den aminoterminalen Bereich eines anderen Gens ersetzt ist und das ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Inulinsucrase co­ diert.

2. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach An­ spruch 1, wobei das andere Gen das lacZ-Gen aus Escherichia coli ist.

3. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach An­ spruch 2, wobei der aminoterminale Bereich des LacZ Gens die aminoterminalen Aminosäuren 21 bis 30 der β-Galactosidase codiert.

4. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Fructosyl­ transferasegen aus Streptococcus mutans stammt.

5. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der zu ersetzende aminoterminale Bereich des Fructosyltransferasegens dessen Signalpeptid codierende Sequenz ist.

6. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das modifizierte Fructosyltransferasegen im Leseraster an eine Si­ gnalsequenz fusioniert ist, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme des Gens in das endoplasmatische Reti­ kulum einer eukaryontischen Zelle codiert.

7. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Signalsequenz aus einem Patatingen, insbesondere dem aminotermi­ nalen Bereich des Patatin-B33-Gens stammt.

8. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das modifizierte Fructosyltransferasegen im Leseraster an eine Si­ gnalsequenz fusioniert ist, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme des Gens in das endoplasmatische Reti­ kulum einer eukaryontischen Zelle und zur Weiter­ leitung an die Vacuole codiert.

9. Modifiziertes Fructosyltransferasegen nach ei­ nem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Signalsequenz die erweiterte Signalsequenz eines Patatingens aus Kartoffel, insbesondere die 60 aminoterminalen Ami­ nosäuren des vom Patatin-B33-Gen codierten Propep­ tids, umfaßt.

10. Vektor, enthaltend ein modifiziertes Fructo­ syltransferasegen, gegebenenfalls unter Einschluß von Signalsequenzen, nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Vektor nach Anspruch 10, enthaltend ein modi­ fiziertes Fructosyltransferasegen, gegebenenfalls unter Einschluß von Signalsequenzen, nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das unter der Kontrolle eines in Pflanzen aktiven Promotors, insbesondere eine or­ ganspezifischen Promotors, steht.

12. Vektor nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei der Promotor der B33-Promotor des Patatin- B33-Gens aus Kartoffel ist.

13. Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wo­ bei der 3′-Terminus des modifizierten Fructosyl­ transferasegens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 an ein Transcriptionsterminationssignal, insbesondere eine Polyadenylierungsstelle des nos-Gens, fusio­ niert ist.

14. Plasmide pB33cftf, pB33aftf, pB33v1ftf und pB33v2ftf.

15. Zelle, enthaltend einen Vektor, ein Plasmid oder ein modifiziertes Fructosyltransferasegen nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Zelle nach Anspruch 15, die eine Bakterien- oder Pflanzenzelle, insbesondere eine Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Zuckerrüben-, Zuckerrohr- oder Kartoffelpflanzenzelle ist.

17. Pflanze, enthaltend mindestens eine Zelle nach Anspruch 16, insbesondere eine Mais-, Reis-, Wei­ zen-, Gersten-, Zuckerrüben-, Zuckerrohr- oder Kar­ toffelpflanze.

18. Samen und Früchte einer Pflanze nach Anspruch 17.

19. Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Inulin erzeugenden Pflanze, umfassend

• a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor oder Plasmid nach einem der Ansprüche 10 bis 14,
• b) die Integration des in den Vektoren oder Plasmiden enthaltenen modifizierten Fructosyl­ transferasegens, gegebenenfalls unter Einschluß von dessen Signalsequenzen, in das Genom der transformierten Zelle(n), und
• c) die Regeneration von intakten, hochmolekula­ res Inulin erzeugenden Pflanzen.

20. Hochmolekulares Inulin mit einem Molekularge­ wicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton, erhältlich aus einer Pflanze nach Anspruch 17.

21. Verwendung des die 60 aminoterminalen Amino­ säuren das Patatin-B33-Propeptids aufweisenden Pep­ tids oder der dieses Peptid codierenden DNA-Sequen­ zen zum Transport eines Genproduktes in eine pflanzliche Vacuole.