CZ300084B6 - Molekuly nukleové kyseliny kódující fruktosyltransferázu, vektor, hostitelská bunka, zpusob její prípravy a použití, rostlinná bunka, rostlina, zpusob prípravy rostliny, rozmnožovací materiál, skliditelné cásti rostliny, fruktosyltransferáza, zpusob - Google Patents

Abstract

Molekula nukleové kyseliny kódující fruktosyltransferázu, která je vybrána ze skupiny zahrnující: (a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. c. 2; (b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku uvedenou zde jako sekvence id. c. 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci; (c) molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s retezcem komplementárním k molekulám nukleové kyseliny podle (a) nebo (b) za stringentníchpodmínek, (d) molekuly nukleové kyseliny jejichž nukleotidová sekvence se liší od sekvence molekulynukleové kyseliny podle (c) v dusledku degeneracegenetického kódu; (e) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci prinejmenším ze 70 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. c. 2; a k nim komplementární molekuly nukleové kyseliny.

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká molekuly nukleové kyseliny kódující fruktosy ltransferázu. vektorů obsahujících molekulu této nukleové kyseliny, hostitelské buňky transformované molekulou této nukleové kyseliny, způsobu přípravy teto hostitelské buňky a použití těchto hostitelských buněk jako potrav inového/krmivového doplňku, dále se předmětný vynález týká rostlinné buňky transformované molekulou uvedené nukleové kyseliny, způsobu přípravy rostliny za použití této nukleové kyseliny a rostliny získané tímto způsobem, rozmnožovacího materiálu obsahujícího tyto rostlinné buňky, skiiditelných částí rostlin obsahujících tyto rostlinné buňky a krmivá pro zvířata nebo potraviny pro člověka, které obsahují tyto skliditelné části. Dále se předmětný vynález týká fruktosy 1 transferázy kódované molekulou uvedené nukleové kyseliny, způsobu výroby této fruktosy Itransferázy a použití fruktosy ltransfcrázy pro výrobu polyfruktózy a k dalším účelům. Dále se předmětný vynález týká způsobu výroby polyfruktózy. zvláště inulinového typu. v hostitelských organizmech nebo in vitro. Kromě toho se předmětný vynález týká způsobů výroby surfaktantú s využitím postupu výroby polyfruktózy.

Dos a vadní stav techn iky

Vc vodě rozpustné lineární polymery nalézají mnoho způsobů využití, například jc lze užít ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, suspendaění činidla nebo pro urychlení sedimentace a vytváření komplexů, ale také pro vázání vody. Polymer) založené na sacharidech, například fruktosy lové polysacharidy. jsou zvláště zajímavým výchozím materiálem, neboť jsou

2(i biologicky degradovatelné.

Kromě jejich použití jako obnovitelných surovin pro průmyslovou výrobu, jsou fruktosy lové polymery zajímavé jako aditiva do potravin, např. jako sladidla, Pro různé aplikace jsou potřebné polymery s různou délkou řetězce. Zatímco výhodné polymery pro potravinářský průmysl jsou krátké nebo středně dlouhé, pro technické použití, například jako surlaklanty, jsou potřebné polymery s vysokým stupněm polymerizace (DP).

Byly popsány různé způsoby přípravy fruklanových polysacharidů v rostlinách tím, že se exprimovaly' fhiktosyltransferázy bakteriálního původu nebo polyfruktózy sc střední délkou řetězců •to tím. že sc exprimovaly fruktosy Itransferázy rostlinného původu. Například v PCT/US 89/02 729 se popisuje možnost vytvářet sacharidové polymery, zejména dextran nebo polyťruktózu. v transgenních rostlinách, zejména v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takto modifikovaných rostlin bylo navrženo použití levansaeharázy z mikroorganismů, zejména Aerobacter levanieutn. Streptococcus salivarius a Bacillus subdlis. nebo dextransacbarázy z Leuconostoc tnesenieroides. is Avšak nebyla popsána ani příprava aktivních enzymů, ani produkce levanu nebo dextranu v transgenních rostlinách.

V PCT/EP93/0211 se popisuje způsob přípravy transgenních rostlin, které exprimují gen lsc pro levansacharázu z gram-negativní bakterie Erwinia amylovora. Tyto rostliny vytvářejí vysoko50 molekulární silně rozvětvený levan.

V PCT/N 1.93/00279 se popisuje transformace rostlin chimérickými geny, které obsahují gen sacB z Bacillus subdlis. Tyto rostliny tvoří rozvětvený levan,

Bakteriální fruktosyltransferáza použitá v PCT/US89/02729, PCT/EP93/02110 a PCT/NL93/00279 syntetizuje levan, což je β-2,6 vázaný fruktosylový polymer, který má četná větvení typu β 2,1. Avšak vzhledem k četnému větvení má levan rozhodné nevýhody pro technické využití, a je tudíž mnohem méně žádán jakožto výchozí materiál na rozdíl od mulinu, který má β-2,1 ? vazby, V současnosti je znám jen jeden bakteriální gen, jehož produkt se podílí na syntéze inulinu, a sice jde o gen ftf ze Streptococcus mutans.

V PCT/NL93/00279 se popisuje transformace rostlin tímto genem, které syntetizovaly vysokomolekulární inulin. ale v tak malém množství, že není vhodné k průmyslovému využití.

ίο V PCT/EP97/02I95 se popisuje také způsob přípravy transgenních rostlin s genem ftf ze Streptococcus mutans produkujících inulin. Stejné jako u rostlin popsaných v PCT/NI.93/00279 byl však vyiěžek inu linu nízký. Je sice možné exprimovat gen, který byl předem upraven, v transgenních rostlinách, ale výtěžek inulinu z transgenních rostlin je tak nízký, že rostliny nejsou vhodné pro průmyslové využití.

Kromě toho se v PCT/NL96/00012 popisují DNA sekvence, které kódují enzymy syntetizující sacharidy a také přípravu transgenních rostlin pomocí těchto sekvencí. Sekvence popsané ve vynálezu pocházejí z Heliunthus tuberosus. Podle PCT/NL96/00012 se sekvence mohou užít k modifikaci profilu truktanu u petúnie, bramboru i samotné llelianthus tuberosus. Exprese sekvence popsané ve vynálezu, která kóduje sacharózofruktosyltranferá/u (SST) závislou na sacharóze nebo frukolsyltransferázu, v transgenních rostlinách umožňuje produkcí inulinu. Průměrný stupeň polymerizace inulinu je DP-6 až DP~IO. S takovým stupněm polymerizace nemůže být inulin považován za polymer s dlouhým řetězcem, /působ popsaný v PCT/NL96/00012 nedovoluje produkoval vy so konto leku lámí inulin,

V poslední době byla v publikaci Rchm a kol. (.7 Bacteriology 180 (199X), 1305-1310) popsána produkce oligosacharidů v kvasinkách po vnesení SST z Aspergillus foetidus. Avšak polymerizacní stupeň produktu byl pouze DP = 3.

3o V DE 197 08 774.4 se popisuje produkce 1-kestózy a nystózy užitím enzymů s fruktosylpolymerázovou aktivitou. V transgenních rostlinách se tak mohou tvořit tri-a tetrasacharidy. Výtěžek byl vysoký a u bramboru odpovídal buněčnému obsahu sacharózy. Avšak nebyla popsána produkce inulinu s delším řetězcem.

Syntéza polyfruktóz v houbách byla také diskutována v mnoha publikacích. Například v publikaci Barthomeuf a Pourraf (Biotechnology' Letters 17 (1995). 911 916) se popisuje příprava enzymu s fruktosyltransferázovou aktivitou z PenicMium rugulosum. Preparát však vykazoval různé enzymatické aktivity a nejednalo se tudíž o čistou fruktosyltransferázu. DNA sekvence genu pro fruktosyltransferázu není známa. Cairns a kol. (New Phytoiogist 129 (1995), 299-308) tu popsali přechodnou syntézu tri- tetra- a pentasacharidů ze sacharózy v kultivačním médiu Monographella nivalis. Odpovídající enzymatická aktivita se zdá být zejména hydrolytické povahy, nebof polyfruktózy jsou opět degradovány s rostoucím vyčerpáním substrátu. Jelikož není známa žádna DNA sekvence, není možné zhodnotit, spoléhajíc na homologii s fruktofuranosidázami (invertázami). zda jde skutečně o fruktosyltransferázu v pravém smyslu nebo o invertá45 zu.

U houby Aspergillus sydowi 1AM 2544 bylo ukázáno, že je schopná vytvářet polyfruktózy inulinového typu. Harada a kol. (in: Nishinari and Doi (Eds.), Food Hydrocolloids: Structures, Properties and Functions, Plenům, New York (1994), 77-82) popsali syntézu inulinu pomocí sn konidií Aspergillus sydowi. 125 g konidií bylo inkubováno ve 25 1 20% roztoku sacharózy a vytvořený produkt byl purifíkován pomocí HPLC. Avšak tento proces není vhodný pro průmyslovou výrobu inulinu vc velkém měřítku, Maramatsu a kol. (Agric. Biol. Chem. 52 (1988),

1303 1304) popsali produkci fruktooligosacharidů pomocí mycelií téže houby (Λ. sydowi JAM2544). Stupeň polymerizace byl v takovém případě 3 až 13. Enzymy zúčastněné v této syntéze byly jen částečně purifikovány nebo nebyly purifikovány vůbec. Aminokyselinové sek

C7. 300084 B6 vence nebo DNA sekvence příslušných enzymů nejsou známy. Návod pro purifikaci proteinů buďto nebyl popsán nebo byl popsán neúplně.

Cílem předmětného vynálezu je proto poskytnout molekuly nukleové kyseliny a způsoby, které 5 umožňují vytvářet geneticky modifikované organismy schopné produkovat polyfruktózu i nu li nového typu.

Podstata vynálezu io

Předmětný vynález se týká molekuly nukleové kyseliny kódující fruktosyltransťerázu. která je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. ě. 2; 15 (b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci;

(c) molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s řetězcem komplementárním k molekulám 20 nukleové kyseliny podle (a) nebo (b). kde použité podmínky zahrnují: 50% formani id, 5 x SSC, \ Denhardtův roztok, 40 mM hydrogensfosforečnan sodný, pil 6,8; 0,5% (hmot./objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS. 0,1 mg/ml DNA ze spermatu sleďů, při hybrídizačni teplotě 42 °C a následné promývání filtrů v 0,5 x SSC/0,5% SDS při 60 °C; a dále které jsou přinejmenším ze 60 % identické s molekulou nukleové kyseliny uvedenou ad (a) nebo ad (b);

(d) molekuly nukleové kyseliny jejichž nukleotidová sekvence se liší od sekvence molekuly nukleové kyseliny podle (c) v důsledku degenerace genetického kódu;

(e) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující v aminokyselinovou sekvenci při30 nejmcnším ze 70 % identickou s aminokyselinovou sekvenci uvedenou v id. č. 2:

a k nim komplementární molekuly nukleové kyseliny.

Ve výhodném provedení této molekuly nukleové kyselinyje aminokyselinová sekvence kódova35 ného proteinu zvíce než 80% identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2. podle ještě výhodnějšího provedení je zvíce než 90% identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2. a podle nejvýhodnějšího provedení je z. více než 95 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2. V případě léto molekuly nukleové kyseliny se výhodně podle předmětného vynálezu jedná o

DNA nebo RNA.

Podle předmětného vynálezu je výhodná molekula nukleové kyseliny, která kóduje poly peptid z houby, kde houba je výhodně z rodu Aspergíllus.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující libovolnou zvýše specifíko45 váných molekul nukleové kyseliny.

Výhodný je podle předmětného vynálezu vektor, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena $ regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelnc RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách. Kromě toho je výhodný vektor, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje úsek. který kóduje signální sekvenci, která ovlivňuje intracelulámí nebo extracelulární lokalizaci íruktosyltransferázy.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hostitelské buňky transformované libovolnou molekulou nukleové kyseliny. definovanou výše, nebo libovolným vektorem, definovaným výše, nebo které pocházejí z takových buněk.

Λ

A C7. 300084 B6

Ve výhodném provedení je tato hostitelská buňka bakteriální buňka nebo buňka houby.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy uvedených hostitelských buněk, při kterém se vhodné buňky transformují libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo libovolným výše specifikovaným vektorem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití těchto výše specifikovaných hostitelských buněk nebo výše specifikovaných rostlinných buněk jako potrávínového/krmivovcho ni doplňku.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlinná buňka, která je transformovaná výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo výše specifikovaným vektorem, nebo která pochází z takové buňky.

i?

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy rostliny jehož podstata spočívá v tom, že se:

(a) rostlina geneticky modifikuje vnesením libovolné výše specifikované molekuly nukleové zo kyseliny a/nebo libovolného výše specifikovaného vektoru, a (b) z buňky se regenerují rostliny, a případně (c) se generují další rostliny z rostliny podle (b)

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlina připrav itelná tímto způsobem.

Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu je touto rostlinou podle vynálezu užitková rostlina.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rozmnožovací materiál výše specifikované rostliny obsahující výše specifikované rostlinné buňky.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží skliditelné části výše specifikované rostliny obsahující výše specifikované rostlinné buňky.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží krmivo pro zvířata nebo potraviny pro člověka, které obsahuje výše specifikované skliditelné části rostlin.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby fruktosyltransferázy. jehož podstata spočívá v tom, že se výše specifikovaná hostitelská buňka nebo výše specifikovaná rostlinná buňka kultivuje v podmínkách, které dovolují syntézu fruktosyltransferázy a izolování fruktosyltransferázy z kultivovaných buněk a/nebo z kultivačního média.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží fruktosyltransferáza kódovaná výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo připravitelné výše specifikovaným způsobem,

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití výše specifikované fruktosyltransferázy pro výrobu polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulinového typu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby polyfruktózy. zvláště inu liliového typu, jehož podstata spočívá v tom, že:

-4C7. 300084 Bó (a) se kultivují výše specifikované hostitelské buňky nebo hostitel obsahující takové buňky v podmínkách, které dovolují produkci íruktosyltransferázy a přeměnu sacharózy případně přidané nebo substrátového ekvivalentu na polyfruktózu, (b) takto produkovaná polyfruktóza se získá z kultivovaných buněk, hostitele nebo kultivačního média.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob vvrobv polyfruktózy, zvláště i nu li nového typu, jehož podstata spočívá v tom, že se:

(a) sacharóza nebo ekvivalentní substrát přivede do kontaktu s výše specifikovanou fruktosyltransferázou v podmínkách, které dovolují přeměnu na polyfruktózu, a (b) získá se takto produkovaná polyfruktóza.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby polyfruktózy, zvláště inu liliového typu. jehož podstata spočívá v tom, žc obsahuje krok, kdy se polyfruktóza extrahuje z výše specifikované rostlinné buňky, z výše specifikované rostliny nebo z části takové rostliny.

2d Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití polyfruktózy připravené libovolným výše specifikovaným pro výrobu surfaktantů, ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentu. jako suspendačního činidla, k urychlení sedimentace a komple.xaci nebo vázání vody.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby surfaktantů, jehož podstata

2? spočívá v tom, že obsahuje výše specifikované kroky (a) a (b) nebo výše specifikovaný extrakční krok.

Sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 1 kóduje fruktanfruktosyltransferázu závislou na sacharóze z Aspergillus sydowh která v rostlinné buňce syntetizuje polyfruktany inulinového typu s dlouhým řetězcem. Překvapivě bylo zjištěno, ze je možné produkovat polyfruktany inulinového typu s dlouhým řetězcem s dobrým výtěžkem v hostitelském organismu, zejména když se sekvence podle vynálezu použije v transgenních rostlinách, bakteriích nebo houbách.

V rámci předkládaného vynálezu byl vypracován postup purifikace enzymu z Aspergillus sydowi.

Enzym byl purifikován do homogenity takovým způsobem, aby bylo možné stanovit sekvenci aminokyselin. Na základě aminokyselinových sekvencí byly připraveny oligonukleotidové primer}' pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pomocí těchto primerů byly amplifikovány genové fragmenty, které pak byly použity pro sereening cDNA knihoven. Bylo připraveno několik molekul cDNA se sekvenční homologií s PCR produkty. Většina takto získaných moleio kul obsahovala inzerty stejné velikosti. Úplnost cDNA molekuly byla potvrzena funkční expresí sekvence DNA v Saccharomyces nebo bramboru.

Purifikace enzymů, návrh oligonukleotidových primerů pro PCR. identifikace molekul cDNA aheterologní exprese jsou popsány v příkladech. Izolovaná sekvence DNA a zní odvozená proteinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. ě. I a 2. Sekvence DNA podle vynálezu je první popsaná sekvence kódující fruktanfruktosyltransferázu závislou na sacharóze z hub. Sekvence DNA a jí kódovaná proteinová sekvence se významně liší od sekvencí již známých fruktosyltranferáz. Tak např. je zde pouze 22,6% a 39% identita s Iruktosyltransferázou 7. Aspergillus naeslundii lev j z hlediska proteinové a DNA sekvence, v uvedeném pořadí. Přestože je zde sa 64% a 60,6% identita / hlediska proteinové a DNA sekvence z invertázou z Aspergillus niger. protein kódovaný tímto genem má zcela jinou aktivitu. J akže bylo ukázáno, že molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a fruktosyltransferázy, které kódují, jsou molekuly, které nebyly dosud popsány.

- Ί CZ 300084 B6

V kontextu předkládaného vynálezu se fruktosy ltransferázou rozumí protein, který je schopen kata lyžovat spojení β-2,1- glykosidické a/nebo β-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami. Přenášené fruktosylové zbytky pocházejí ze sacharózy.

Reakci katalyzovanou fruktanfruktosyltransferázou závislou na sacharóze podle vynálezu lze znázornit následujícím schématem:

n(G-F) -> G - F„ i (n-l)G io kde G ~ glukóza, F ^_ fruktóza a G - F = sacharóza. tzn. enzym přenáší fruktózový zbytek ze sacharózy na polyfruktan, který je vytvářen z molekuly sacharózy pomocí β-2.1-glykosidické vazby, přičemž se mohou vyskytnout i vazby β-2,6 glykosidické.

Polypeptid kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu s fruktosyltransferázovou is aktivitou vede k synteze polyfruktózy a v rostlinné buňce zejména k polyfruktóze inu!lnového typu (v popisu nazývané též jen inulin).

Termín póly fruktóza podle vynálezu označuje polyfruktan se stupněm polymerizace DP > 4, výhodně DP > 6 a zejména DP > 8. Póly fruktóza inulinového typu nebo zkráceně inulin označují

2d podle vynálezu fruktanový polymer s dlouhým řetězcem, tj. molekulu, kde jsou jednotky vázány hlavně β-2.1 glykosidickou vazbou, ale případně se vyskytuje i větvení β-2,6. Termín „dlouhý řetězec“ v léto souvislosti znamená, že stupeň polymerizace (DP) je větší než 20, výhodně větší než 50, výhodněji větší než 100 a nej výhodněji větší než 200. Fruklosylový polymer může nést terminální glu kozový zbytek, který je navázán prostřednictvím C-l OH skupiny glukózy a C 2 OH skupiny fruktosy lového zby tku. V tomto případě jeden fruklosy lový polymer obsahuje jednu molekulu sacharózy.

Pokud je enzym podle vynálezu užit pro syntézu polyfruktanu in vitro, získá se oligomerní produkt (DP 4 až 10).

Enzym kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu lze odlišit od známých fruktosyltransferáz prostřednictvím katalyzované reakce. Tak například známé rostlinné SST katalyzují reakci:

G-F ( G-E->G F-F + G.

Avšak fruktosyltransferázy závislé na ťruktanu z rostlin katalyzují následující reakci:

G - Fj, + G - F_m -» G - E„, i + G - F_m ,, přičemž tato reakce je plně reverzibilní.

Bakteriální fruktosy ltransferázy, například kódované genem sacB gene z ftocittus subtilis také katalyzují reakci typu nG - F-> G - F„ + (n-l) G,

Avšak tyto enzymy produkují levan, polyfruktan vázaný β-2,6-glykos^dickými vazbami s β-2,1-větvením.

Protein (FTF) kódovaný genem ftf ze Streptococcus mutans indukuje syntézu inulinu s molekulovou hmotností několik milionů Daltonů. Avšak gen ftf'nebo kódovaný protein nevykazují významnou homologii se sekvencí nukleové kyseliny uvedenou jako sekvence id. ě. I (pouze

37.3 %) nebo aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 (jen 22,6 %),

-6CZ 300084 B6

Podle předkládaného vynálezu termín ..hybridizaee“ znamená hybridizaei za obvyklých podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak jsou například podmínky popsané v publikaci

Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^(/ edition (1989/ Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem stringentních podmínek je: 50% formamid. 5 x SSC. 5 x Denhardtův roztok. 40 mM hydrogensfosforcčnan sodný, pH 6,8; 0.5% (hmot../objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS, 0,1 mg/ml DNA ze spermatu sleďů, při hybridizační teplotě 42 °C a následném promývání filtrů v 0,5 x SSC/0,5% SDS při 60 °C.

io Příkladem obvy klé hybridizace v nestringentních podmínkách je hybridizacc stejná jak je popsána výše. s výjimkou toho. že místo 50% formamidu se užije 30% formamid a následně jsou filtry promy vány v 2 x SSC/0,5% SDS při 56 °C.

Molekuly nukíeové kyseliny hvbridizující s molekulami podle vynálezu mohou být izolovány zgenomiekých nebo cDNA knihoven připravených především zhub. Takové molekuly nukleových kyselin mohou být identifikovány a izolovány pomocí molekul podle vynálezu nebo jejich fragmentu nebo reverzních komplementárních molekul, například hybridizaei ve standardních podmínkách (viz např. Sambrook a kol,, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^,hi edition (1989/ Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY). Molekuly nukíeové ?n kyseliny se mohou užít jako hybridizační sonda, která má přesně a nebo v podstatě sekvenci jako je sekvence id. č. I nebo její fragmenty, fragmenty použité pro hybridizaei mohou být také syntetické fragmenty, které byly připraveny obvyklou metodou, a jejichž sekvence je v podstatě identická se sekvencí molekuly nukíeové kyseliny podle vynálezu.

K molekulám hybrid izujícím s molekulami nukíeové kyseliny podle vynálezu patří také fragmenty. deriváty a alelické varianty molekul nukíeové kyseliny popsaných výše, které kódují protein podle vynálezu, fermín „fragmenty podle vynálezu znamená části molekul nukíeové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé na to, aby kódovaly proteiny s fruktosyltransferázovou aktivitou, fermín „derivát podle vynálezu znamená, že sekvence této molekuly se liší od výše popsaných molekul v jedné nebo více pozicích, avšak vy kazuje vysoký stupeň homologic s těmito sekvencemi. Homologic znamená alespoň 40% sekvenční identitu, zejména alespoň 60% identitu, výhodně alespoň 80% identitu a ještě výhodně nejméně 90% identitu. Proteiny kódované těmito nukleovými kyselinami výhodně mají alespoň 60% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvenci id. ě. 2. výhodně alespoň 70%, zvláště 80% a nej výhodněji 95% identitu. Odchylky od sekvence molekul nukíeové kyseliny podle vynálezu mohou být způsobeny například de lečem i, substitucemi, inzercemi a/nebo rekombinací. Molekuly nukíeové kyseliny podle vynálezu mohou být i jiné deriváty sekvencí pocházejících zhub. Derivát izaee takových sekvencí může být potřebná k tomu. aby se optimalizovala exprese v určitých hostitelských buňkách.

Molekuly nukleových kyselin, které jsou homologické s molekulami pospanými výše a představují deriváty těchto molekul, jsou obvykle variace těchto molekul, které vykazují stejnou biologickou funkci. Tyto variace jsou buďto přirozeně se vyskytující variace nebo jsou vneseny specifickou mutagenezí. Variace mohou být také synteticky připravené sekvence. Alelické varianty jsou bud‘to přirozeně se vyskytující varianty, nebo varianty připravené synteticky nebo technika4? mi rekombinantní DNA.

Proteiny kódované různými variantami molekul nukíeové kyseliny podle vynálezu mají výhodně určité společné vlastnosti, jako je například enzymatická aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, kon formace nebo fyzikální vlastnosti jako je elektroforetická mobilita při gelové elektroforéze, chromatografické vlastnosti, sedimentační koeficient, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, pil optimum nebo teplotní optimum.

Ve výhodném provedení molekuly nukíeové kyseliny podle vynálezu kódují polypeptid mající vlastnosti fruktosyltransferázy zhub, zejména výhodně zAspergillus, a nejvýhodněji fruktosyl55 transferázy z Aspergillus sydowi.

- 7 C7. 300084 Bó

Molekuly nukleové kyseliny podle vynalezu jsou molekuly DNA nebo RNA. Příklady odpovídajících molekul DNA jsou molekuly genomické DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, například z hub. zejména z Aspergdhíw a nej vý b od n čj i z A spergillus sydowi. nebo se syn tet izuj í známý m i metodám i. J e také možné v n ést různé mutace do molekul nukleové kyseliny podle vynálezu metodami známi v molekulární biologii {viz např. Sambrook a kol., Molecular don ing, A Laboratory Manual, 2^>>d edition (1989) Cold Spring llarbor Laboratory Press, Cold Spring llarbor, M\ Vnesení mutací indukuje syntézu proteinů s potenciálně změněnými biologickými vlastnostmi. Jedním z možných přístupů io je vytvoření dclečních mutantu, kde molekuly nukleové kyseliny mají progresivní delece na 5' nebo 3-konci kódujícího úseku DNA, což vede k syntéze proteinu odpovídajícím způsobem zkrácených. Dalším přístupem je specificky vytvářet enzymy lokalizované v různých kompartmentecb díky připojení různých signálních sekvencí. Aby bylo dosaženo lokalizace proteinu podle vynálezu v cytosolu, není třeba k sekvenci id. č. 2 přidávat žádnou signální sekvenci.

Na druhé straně mohou být vneseny bodové mutace do takových pozic, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivní například enzymatickou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem lze připravit například mutanty s modifikovanou Km hodnotou, nebo mutanty, které již nepodléhají allosterieké regulaci nebo kovalenlní modifikaci, které se obvykle v buňce vyskytují.

Kromě toho se mohou vytvořit mutanty s modifikovanou substrátovou nebo produkte vou speeificitou. Navíe se mohou vytvořit i mutanty s modifikovaným profilem akt i vita—teplota.

Pro genetické manipulace v prokaryotických buňkách se molekuly nukleových kyselin podle vynálezu nebo jejich fragmenty integrují do plazmidů, které umožňují mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinaci DNA sekvencí. Pomocí v oboru známých metod (viz například Sambrook a kol.. Molecular Clon ing, A Laboratory Manual, 2^>>d edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring llarbor, NY} lze provést záměnu bází nebo lze přidat přírodní nebo syntetickou sekvenci. Aby bylo možné připojit DNA fragmenty, mohou se k fragmentům připojit adaptéry' nebo linkery. Navíc lze využít manipulací, které nabízejí různá restrikční místa nebo kterými lze odstranit nadbytečnou DNA nebo restrikční místa. Kdekoliv mohou být užitečné inzerce, delece nebo substituce, je možné užít metody mutageneze in vitro. „opravy primerů, restrikce nebo ligace. Pro analýzu se obvykle užívá sekvencování. analýza restrikěnicb fragmentů a další biochemické a molekulárně biologické metody ,

Rozsah vynálezu zahrnuje vektory, které obsahují molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Výhodně jsou lyto vektory plazmidy. kozmidy, viry', bakteriofágy a další vektory, které jsou v oboru známy.

4<) Výhodně jsou molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu operativně spojeny ve vektoru podle vynálezu s regulačními elementy, které dovolují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotickýeh a/nebo eukaryotických buňkách, l ak například vektory podle vynálezu obsahuj í nás leduj í c í e I emen ty:

Promotor, který' zaručuje transkripci „downstream ležícího kódujícího úseku v buňce hostitelského organismu, a případně také zesilovací elementy.

Kódující úsek fúzovaný s promotorem, který obsahuje alespoň jeden otevřený čtecí rámec pro translaci polypeptidu. V předkládaném vynálezu je kódujícím úsekem molekula nukleové kyše50 líny podle vynálezu.

Případně další sekvence fúzované s kódujícím úsekem, například signál pro terminaci transkripce, pokud jsou vyžadovány pro úspěšnou genovou expresi v určitém hostitelském organismu, nebo signální sekvence ovlivňující subcelulární lokalizaci genového produktu nebo indukující sekreci proteinu.

- 8 CZ 300084 B6

Takové vektore mohou obsahovat ještě další geny jako jsou například markerové geny umožňující selekci vektoru ve vhodné hostitelské buňce ve vhodných podmínkách. Exprese molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu zahrnuje transkripci nukleové kyseliny do translatovatelné

RNA. Regulační prvky umožňující expresi v prokaryotické buňce a v eukaryotické buňce jsou odborníkům v oboru známy. K možným regulačním elementům vhodným pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v prokaryotické hostitelské buňce patří např. promotory' P_L, lae, trp nebo tac v E. coli. Zvláště výhodné je užití promotoru laeZ, který' je v E. coli indukovatelný 1PTG. Příklady regulačních elementů vhodných pro expresi v eukaryotické buňce io jsou promotory ΛΟΧ1 a GAE1 v kvasinkách a promotory CMV. SV40 a RSV, a zesilovače (cnhancery) CMV, SV40 nebo globinového íntronu v savčích nebo jiných živočišných buňkách. Pro expresi v kvasinkách je zvláště výhodné užití promotoru genu alkoholdehydrogenázy ze Saeeharomyces cerevisiae, který je v kvasinkách vysoce aktivní. Další vhodně systémy lze najít popsané ve stavu techniky, např. V Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989/,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.. a v Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.

Regulační elementy pro expresi molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinné buňce jsou v principu jakýkoliv promotor, enhaneer, terminátor apod.. které jsou aktivní v rostlinné buňce. Promotor může být vybrán například tak. že dochází ke konstitutivní expresi nebo k expresi jen v některých pletivech, nebo jen v určitém momentě vý voje rostlině nebo jen v určitém okamžiku determinovaném vnějšími faktory. Vzhledem k dané rostlině může být promotor buďto homologní nebo heterologní.

K vhodným promotorům patří např, 35S RNA promotor z viru mozaiky květáku. CMV (viz například patent Spojených států amerických US 5 352 605) a ubiquitinový promotor (viz patent Spojených států amerických US 5 614 399) pro konstitutivní expresi, promotor patatinového genu B33 (Rocha-Sosa. EMBOJ. 8 (1989), 23-29) pro expresi specifickou pro hlízy bramboru, nebo promotor, který zajišťuje expresi jen ve fotosynteticky aktivním pletivu, např. promotor

ST-LS1 (Stockhaus, Proč. Nati. Acad Sci. USA 84 (198⁷), ⁷ 943-7 94^: Stockhaus, EMBO J. 8 0989), 2 445-2 451). promotor Ca/b (viz např. patenty Spojených států amerických US 5 656 496, US 5 639 952, Bansal, Proč. Nad. Acad. Sci. USA 89 0992), 3 654-3 658) a promotor genu malé podjednotky Rubiseo SSU (viz například patenty Spojených států amerických US 5 034 322 a US 4 962 028). Avšak mohou se užít i promotory, které jsou aktivovány jen v určitém čase v závislosti na vnějších podmínkách (viz např. WO 93/07279). V tomto směru jsou zejména zajímavé promotory proteinů tepelného šoku. I aké se mohou užít promotory specifické pro semena, jako například promotor USP z Vicia faba. kleré umožňují specifickou expresi v semenech Vicia faba i jiných rostlin (Fiedler, Pian! Mol. Biol. 22 0 993), 669 6⁷9; Bautnlein, Mol. (Len. Genet. 225 0991), 459 467). Kromě toho mohou být užity promotory specifické pro

4o plody, jak byly například popsány v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/01373. Pro expresi v dozrávajících plodech rajčete jsou například vhodné cis-regulační elementy polygalakturonázového promotoru, které jsou aktivní ve vnějším nebo vnitřním perikarpu (Nicholass a ko/.. Pian! Mol. Biol. 28 0 995), ^423 435: Monlgomerya kol., Planí Cell 5 0993), 1049-1062). Další promotor specifický pro plody u rajčete popsali Van Haaren okol. (Planí Mol. Biol. 21 (1993),

625 640).

Kromě toho se mohou užít promotory pro expresi specifickou v endospermu. jako je například promotor glutelinového genu (Leisy, Planí Mol. Biol. 14 (1990), 41 50; Zheng, Planí J. 4 (1993), 357-366). promotor El MG pšenice, promotor USP, promotor fazeolinového genu nebo promoto5(i ry zeinových genů z kukuřice (Pedersen, Cell 29 0982), 1015-1026; Qualtrocchio, Planí Mol. Biol. 15 0990), 81 93) nebo promotor genu „shrunken l‘^L (sh—1) kukuřice (Werr. EMBOJ. 4 0985), 1373-1380).

Exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu je zvláště výhodná v takových částech rostli55 ny. které mají zvýšený obsah sacharózy. Jakovými orgány jsou například kořen cukrové řepy

-9 CZ 300084 B6 nebo stéblo cukrové třtiny nebo čiroku cukrového. Zvláště výhodné jsou proto promotory řídící expresi právě v těchto orgánech, jako je například patatinový promotor B33 v Solunům íuberosutn. Pro specifickou expresi ve stonku cukrové třtiny muže být použit ubiquítinový promotor v kombinaci s prvním intronem.

Vektory podle vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky, které ovlivňují stabilitu vektoru v hostitelském organismu, jako je například bakteriální replikační počátek nebo tzv. 2mikron-DNA pro stabilizaci a autonomní replikaci v kvasinkách. Také mohou být přítomny sekvence ..pravé hranice a „levé hranice z T-DNA z Agrohacferiutn, které dovolují stabilní io integraci do genomu rostlin. Také mohou být přítomny terminační sekvence, které slouží ke správné terminuj transkripce nebo připojení poly-A konce k transkriptu, která má stabilizující funkci pro transkript. l akové elementy jsou dostatečně popsány v odborné literatuře (např.

Gielen, EMBOJ 8 (1989), 23-29) a jsou volně vyměnitelné.

Ve výhodném provedení molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek. který obsahuje funkční signální sekvenci pro sekreci kódovaného enzymu, l akové sekvence jsou známy. Příkladem signálního peptidu, který dovoluje lokalizaci proteinu ve vakuole. je signální peptid karbo.xypeptidázy Y z kvasinky (CPY). Odpovídající gen byl popsán např. v Valíš a kol. (Cell 48, 887-899). Rostlinné signální sekvence jsou např. signální sekvence z genu Jektinu ječmene (Raikhe! and Lerner, Dev. Genet. 12(1991), 255- 269) nebo sekvence 43 aminokyselin z N koncového useku fytohemaglutininu z fazolu (Tague a kal., Plant Cell 2 (1990), 533 546). Příkladem C-koneového signálního peptidu je signální peptid ehitinázy (ΛΥuhaus a kol.. Planí J. 5 (1994), 45 54).

Výhodná signální sekvence je například signální sekvence genu proteinázového inhibitoru II z bramboru. Avšak je možné vybrat jakoukoliv signální sekvenci, která vede k sekreci daného polypeptidu ve vybraném hostiteli. Seeernovaná fruktosyltransferáza se pak získává z kultivačního média a užívá se pro syntéz}' in vitro.

so Ve zvláště výhodném provedení molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek. který obsahuje funkční signální sekvenci pro lokalizaci ve vakuole rostlinné buňky, výhodně jde o signální sekvenci patat i nového genu z bramboru (Sonnewald, Plant../. / (1998). 95 106). To umožňuje subcelulámí lokalizaci fruktosyltransferázy ve vakuole geneticky modifikovaných rostlinných buněk a rostlin, např. cukrové řepy a bramboru, a tudíž akumulací vysokomolekulámí polyfruktózy i nu li nového typu ve vakuole. Další signální sekvence pro lokalizaci ve vakuole byly popsány například v publikacích Matusoaka (Journal ofExperimental Rotany 50 (1999), 165-174), Chrispeels (Cell 68 (1992), 613 616), Matsuoka (Proč. Nad. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834-838), Bednarek (Plant Cell 3 (1991), 1195 1206) a Nakamura (Plant Phys. 101 (1993), 1 5).

V jiném provedení předkládaného vynálezu molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek, který kóduje signální sekvenci pro lokalizaci v plastidu rostlinné buňky. Jako taková signální sekvence muže být užita sekvence ferrodoxin: NADP(+fo.xidoreduktázy (FNR) ze špenátu, lato sekvence obsahuje 5' netranslatované úseky a také sousední sekvenci tranzitního peptidu sekvence cDNA plastidovchoproteinu NADP(+>-oxidoreduktázy (FNR) ze špenátu (nukleotidy -171 to +165; Jansen, Current Genedcs 13 (1988), 5H-522). Jako signální sekvence se také může užít tranzitní peptid voskovílého proteinu z kukuřice plus prvních 34 aminokyselin zc zralého voskového proteinu (K/osgen, Mol. Gen. Genet. 21⁷ (1989), 155-161). Ve výhodném provedení vynálezu je užit transitní peptid voskového proteinu z kukuři50 ce bez prvních 34 aminokyselin zralého proteinu.

Ve zvláště výhodném provedení se vynález týká plazmidů pSK-asl. pl 12-asi, pA7-asl, p35-asi, p35s3 asi. jejichž konstrukce je popsána v příkladech (viz obr. 1 až 5).

- 10CZ 300084 Bó

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a expresní vektory' podle vynálezu dovolují produkci polyfruktóz inulinového typu v různých hostitelských organismech, zejména v rostlinách, bakteriích a houbách. Kódované enzymy se mohou užít i mimo hostitelský organismus k produkci polyfruktóz inulinového typu. To znamená, že je zejména možné použít molekuly nukleových kyselin podle vynálezu k přípravě proteinů jimi kódovaných v jakémkoliv hostiteli, aby se z hostitelských buněk získal protein a/nebo kultivační médium, které se pak užijí pro in vitro syntézu inulinu.

Tak například konstrukt, který obsahuje promotor alkoholdehydrogenázy a molekulu nukleové io kyseliny podle vynálezu se užije pro transformaci Saceharomyces cerevisiae. Jelikož kvasinky nejsou schopny přijímat sacharózu, užijí se buňky, které exprimují přenašeč sacharózy díky vnesené heterologní sekvenci DNA. Příprava takových buněk byla popsána např. v publikaci

Riestneier a kol. (EMBOJ. ll (1992). 4 ⁷05 4 7/3). Kvasinky transformované výše popsaným konstruktem vytvářejí polvfruktózy s dlouhým řetězcem inulinového typu. Jelikož fruktosyl15 transferáza z Aspergillus svdowi neobsahuje signální peptid, není seccrnována. Polvfruktózy $ dlouhým řetězcem se tudíž, tvoří uvnitř kvasinkové buňky. Tyto kvasinky obsahující polyfruktózy mohou být užity přímo jako přísada do krmivá. Pokud mají být polvfruktózy získávány z kultivačního média, musí se molekula nukleové kyseliny podle vynálezu fúzovat se signální sekvencí, aby došlo k sekreci.

Rozsah předmětného vynálezu zahrnuje rovněž hostitelské buňky přechodně nebo trvale obsahující molekuly nebo vektory podle vynálezu nebo z nich odvozené buňky, Termín „hostitelské buňky“ se týká organismu, který je schopen in vitro přijmout rekombinantní DNA a případně syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buň25 ky jsou prokaryotického nebo eukary Otického původu. Termín „prokaryolický“ zahrnuje všechny bakterie, které mohou být transformovány nebo transfekovány molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu a výhodně umožňují expresi proteinu s fruktosyltransferázovou aktivitou. K prokarvotickým hostitelským buňkám patří jak gram-negativní tak i gram-pozitivní bakterie jako například E. coli, .V. typhimuriutn, Serratiu tnarceseens a Bacillus subtilis. Termín „eukaryotieký“ zahrnuje buňky hmyzu, hub, rostlin, zvířat nebo lidí. Výhodné jsou buňky z hub, například takové, které se mohou užít pro fermentaei jako například Saccharotnyces, zvláště výhodně buňky ,S’. cerevisiae, Schizosaeeharotnyces, Kluyverotnyees. Piehia apod. Výhodně jsou houbové buňky z hub rodu Aspergillus a zvláště výhodně z druhu Aspergillus niger. Zvláště zajímavá je exprese fruktosyltransfcrázy podle vynálezu v těchto buňkách v kombinaci se sekretoriekou signální sekvencí, například signální sekvencí palat i nového genu nebo genu 1 -SST z. Aspergillus foetidus (Rehm a kol.. J. Bac. 180 (1998/. 1305 1319), která umožňuje sekreci fruktosyltransfcrázy do média. Výhodně se užijí buňky, které mají sníženou nebo nemají žádnou aktivitu secernovanou invertázovou aktivitu. K druhům hub. které nemají vlastní inverertázovou aktivitu, patří například Trichoderma reesei. Protokol pro expresi β-fruktofuranosidázy (invertázy lA. niger) byl popsán to například v Bergés a kol. (Curr. (Jenet. 24 (1993), 53-59).

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují protein s fruktosyltransferázovou aktivitou. nebo odpovídající vektor, mohou být vneseny transfckci nebo transformací do hostitelských buněk, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Postupy, jak připravit fúzní, opera45 tivně spojené geny a exprimovat je ve vhodných hostitelských buňkách jsou odborníkům v oboru známy, přičemž byly popsány například v publikacích Sambrook a kol. nebo Ausubel a kol. (viz výše). Výhodné hostitelské buňky jsou buňky E. coli, hub. zejména kvasinek, a také rostlinné buňky.

Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že vnesená nukleová kyselina je heterologní vzhledem k transformované buňce. tzn. že se přirozeně v této buňce nevyskytuje, nebo že je lokalizována v lokusu genomu odlišném od lokusu odpovídající přirozeně se vyskytující sekvence.

V případě, kdy je molekula nukleové kyseliny podle vynalezu exprimována v rostlině, je obecně možné, aby syntetizovaný protein byl přítomen v kterémkoliv kompartmentu rostlinné buňky.

Aby bylo dosaženo lokalizace ve specifickém kompartmentu, molekula nukleové kyseliny podle vynálezu se spojí s DNA sekvencí, která zajistí lokalizaci do požadovaného kompartmentu. jak již bylo popsáno výše. Takové sekvence jsou odborníkům známy (viz například Braun, 'EMBOJ. 11 U992//3 219-3 227: Walter, Proč. Natí Acad Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sotwewald, Planí J. 1 (1991/. 95 106; Rochu-Sosa, EMBOJ. 8 (1989/, 23-29).

K hostitelům podle vynálezu tedy patří buňky transgenních rostlin, rostlinná pletiva a celé rostli10 ny. které jsou transformované jednou nebo několika nukleovýmt kyselinami podle vynálezu, a také transgenní rostlinné buňky, které pocházejí z takto transformovaných buněk. Tyto buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukieové kyseliny podle v> nálezu. které jsou výhodné spojeny s DNA regulačními elementy, které umožňují transkripci v rostlinné buňce, zejména promotory', lakové buňky mohou byt odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu podle vynálezu, která se přirozeně nevyskytuje v takové buňce, nebo se liší tím. že taková molekula je lokalizována v lokusu genomu buňky, kde v přirozeném stavu lokalizována není. tj. je vjiném gcnomickcm prostředí.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostlinné buňky obsahující v cytosolu protein

2(i podle vynálezu. Pro toto provedení vynálezu se užije sekvence uvedená zde jako sekvence id. c. 2 bez dalších signálních sekvencí.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostlinné buňky obsahující protein podle vynálezu v plastidech. Aby byl protein podle vynálezu nasměrován do plastidu, molekula nukleové kyseliny nebo vektor podle vynálezu se modifikují výše popsaným způsobem.

Jelikož vakuola je obvykle schopna skladovat velká množství sacharózy. která slouží proteinu podle vynálezu jako substrát, tento kompartment je perfektně vhodný k tomu, aby byly vytvořeny rostlinné buňky, které díky aktivitě proteinu podle vynálezu tvoří polyfruktózu vc vakuole.

Ve zvláště výhodném provedení rostlinné buňky obsahují vc vakuole protein podle vynálezu. Bylo již vysvětleno výše, jak je třeba konstruovat molekuly nukleové kyseliny a vektory podle vynálezu, aby bylo dosaženo lokalizace proteinu podle vynálezu ve vakuole.

Transgenní rostlinné buňky a rostlinná pletiva se mohou regeneroval na celé, úplné rostliny metodami. které jsou odborníkům v oboru známy. Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostliny získané regenerací transgenních rostlinných buněk. Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostliny obsahující výše popsané transgenní rostlinné buňky. Rostliny podle vynálezu jsou obecně jakékoliv rostliny, výhodně jednoděložné nebo dvouděložné rostliny. Výhodně io rostlinné buňky pocházejí z hospodářsky významných rostlin, tj. rostlin, které člověk pěstuje protože poskytují potraviny nebo jako technické, zejména průmyslové využití. Výhodně se vynález týká rostlin produkující vlákna {například len, konopí, baví nik), olejnin (například řepka, slunečnice, sója), akumuluj ících cukry (například cukrová řepa, cukrová třtina, cukrový čirok.

banány) a akumuluj ících proteiny (například luštěniny).

Vjiném výhodném provedení vynález zahrnuje pícniny (například krmné nebo picni trávy, vojtěšku, jetel a pod ), zeleninu (například melouny, rajčata, banány; čekanku, pór, chřest, karotku) nebo rostliny akumuluj ící škrob (pšenice, ječmen, oves. žito, brambory, kukuřice, rýže, hrách, maniok, fazole mungo).

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostlinné buňky z rostlin obsahujících sacharózu (například cukrová řepa, brambory; rýže, pšenice, cukrová třtina apod.). Zejména výhodné jsou cukrová řepa, čekanka. rýže, kukuřice, brambory, cukrová třtina a pšenice. Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rozmnožovací materiál a sklizňové produkty z rostlin podle vynálezu.

například plody, semena, hlízy, kořenové řízky, semenáčky, řízky, kalusy, buněčné kultury a pod.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsob přípravy transgenních rostlin, kdy

a) rostlinná buňka se geneticky modifikuje vnesením molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a/nebo vektoru podle vynálezu.

b) z buňky se regeneruje rostlina, a případně

c) z rostliny v bodě b) se regenerují další rostliny.

Termín „geneticky modifikovaná podle vynálezu znamená, že rostlinná buňka je modifikovaná ve své genetické informaci tím. že do ní byla vnesena molekula nukleové kyseliny podle vynálezu a že přítomnost nebo exprese nukleové kyseliny podle vynálezu vede k fenotypové modifikaci. fcnotypová modifikace výhodné znamená detekovatelnou modifikaci jedné nebo více funkcí i? buňky. Tak například geneticky modifikované rostliny podle vynálezu vykazují aktivitu proteinu podle vynálezu nebo zvýšenou fruktosyltranslerázovou aktivitu.

Rostliny se mohou regenerovat podle kroku b) metodami, které jsou odborníkům dobře známy.

Vytváření dalších rostlin v kroku c) podle vynálezu se provádí například vegetativním rožni nožo20 váním (například regenerací úplných rostlin pomocí řízku, hlíz nebo kalusových kultur) nebo generativním rozmnožováním. Generativní rozmnožování se výhodně provádí řízeným způsobem, tj. kříží se a rozmnožují se vybrané rostliny mající požadované specifické vlastnosti.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostliny získatelné tímto postupem podle vyná25 lezu.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje rostlinné rozmnožovací materiály a také transgenní rostliny připravené způsobem podle vynálezu. Termín „rozmnožovací materiál^ podle vynálezu zahrnuje ty části rostliny, které jsou vhodné k přípravě následných generací buďto vegetativní nebo generativní cestou. Pro vegetativní rozmnožování jsou to například plody, semena, semenáčky, protopíastové nebo buněčné kultury. Výhodným rozmnožovacím materiálem jsou hlízy a semena.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje skliditelné části rostlin podle vynálezu, jako jsou například plody, listy, zásobní kořeny, kořeny, květy, pupeny, výhonky nebo stonky, a výhodně semena nebo hlízy.

Rozsah předmětného vynálezu rovně/, zahrnuje krmivá pro zvířata a/nebo potravin pro člověka, které obsahují skliditelné části rostlin podle vynálezu, výhodně semena nebo hlízy.

Π)

Výhodně rostlinné části podle vynálezu pro konzumaci mají výhodu, že vykazují příznivý účinek na zdraví člověka nebo zvířete ve srovnání s odpovídajícími částmi rostlin, které nebyly geneticky modifikovány podle vynálezu. To samé platí pro potraviny nebo krmivá podle vynále/u. Konzumace potravin podle vynálezu vede u člověka například ke zlepšení složení intestinální flóry, zejména ke zvýšení obsahu bifldobakterií ve střevu, což má pozitivní účinek na lidské zdraví (Izzo, Trends in Food Science & Technology 9 (199S), 255 257). Tyto pozitivní účinky jsou výhodně profylaktické účinky nebo účinky podporující využití živin.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsoby přípravy hostitelských buněk, kdv jsou vhodné hostitelské buňky transformovány molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu nebo vektorem podle vynálezu. Způsoby transformace různých hostitelských buněk jsou odborníkům v oboru známy.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsoby produkce fruktosy Itransferázy, kdy se hostitel podle vynálezu kultivuje ve vhodných podmínkách pro expresi molekul nukleové kyse.> CZ 300084 B6 líny podle vynálezu a z kultury se pak izoluje fruktosyltransferáza, například z buněk a/nebo případně kultivačního média. Ve výše zmíněných způsobech podle vynálezu se transformované nebo transťekované hostitelské buňky kultivují například ve fermentoru. dokud není dosaženo optimální hustoty . Případně je. v případě indukovatelného promotoru, exprese proteinu kódová5 ného molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu indukována pouze na konci fermentační fáze. Protein exprimovaný tímto způsobem může být purifikován z média, buněčných lyzátů nebo frakce buněčných membrán známými metodami. Proteiny, které byly takto exprimovány, například v mikroorganismech, se izolují a puntíkují preparativní chromatografií nebo imunologickými puriílkačními metodami, například užitím monoklonálních nebo polyklonálníeh protilátek.

které rozpoznávají protein kódovaný nukleovou kyselinou podle vynálezu. V této souvislostí je třeba zmínit, že protein s fruktosyltransferázovou aktivitou, který je kódován molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, může obsahovat další funkční aminokyselinové sekvence, například proteinové značky (GST, GFP, Flag, I IA peptide. Ilis-tag), pocházející z heterologních proteinů nebo synteticky připravené.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje proteiny, které mají fruktosy Itransférázovou aktivitu, tj. fruktosyItransferáz kódovaných molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu nebo zí skat el ných způsoby podle vynálezu. Fruktosy 1 transferázy podle vynálezu se výhodně užívají k výrobě póly fruktóz inulinového typu. Mohou se užít také pro přípravu protilátek, které jsou

2d vhodné k detekci a/nebo purifikaci fruktosy Itransferáz.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, které specificky hybridizují s molekulami nukleových kyselin podle vynálezu nebo jejich fragmenty. Tyto molekuly jsou výhodně oligonukleotidy dlouhé alespoň 10, výhodně 15 a zvláště výhodně ales25 poň 50 nukleotidů. Tylo oligonukleotidy podle vynálezu se mohou užít například jako primery pro PCR (polymerázovou řetězovou reakci) nebo jako hybridizační sondy.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsoby výroby póly fruktóz, zvláště póly fruktóz inulinového typu. kdy hostitelské buňky podle vynálezu, nebo hostitelské organismy, které je obsahují, jsou kultivovány v podmínkách, které umožňují expresi íruktosyltransferázy podle vynálezu a také syntézu polyfruktózy.

Užitím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu je umožněno produkovat, a sice metodami genové technologie, polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulinového typu, vlakových organis35 mech, ve kterých to dosud při použití konvenčních metod nebylo možné. Takže je možné exprimovat molekuly nukleové ky seliny podle vynálezu v hostiteli jako jsou např. bakterie, houby nebo rostlinné buňky, aby se zvýšila aktivita odpovídající íruktosyltransferázy nebo aby se fruktosyltransferáza vnesla do buněk, kde normálně tento enzym není exprimován. Díky expresi nebo dodatečné expresi alespoň jedné molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu hostitelská io buňka podle vynálezu syntetizuje polyfruktózu. zejména polyfruktózu inulinového typu. Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou proto polyfruktózy, zejména inulinového typu, získatclné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo získatelné z rozmnožovacího materiálu a nebo v případě rostlin, získatelné z rostlin nebo sklidilelnýeh rostlinných produktů.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsob výroby póly fruktóz. zvláště póly fruktóz inulinového typu, který' obsahuje kroky, kdy (a) se kultivují hostitelské buňky podle vynálezu, nebo hostitel obsahující tyto buňky, v podmínkách, které dovolují produkci fruktosy Itransferáz a následuje reakce sc sacharózou, případně dodanou z vnějšího prostředí buňky, nebo substrátem ekvivalentním polyfruktózám inulinového typu. a (b) polyfruktózy takto produkované se získají z kultivovaných hostitelských buněk, hostitelských organismů nebo z média.

Hostitelské buňky jsou výhodně rostlinné buňky a hostitelem jsou výhodně rostliny. Způsob získání póly fruktóz. zejména inulinového typu, z rostlin byl popsán například v publikaci Vogei (in: Inulin and Jnulin-containing Crops, Elsevier Science Publishers Β. V. Amsterdam, A. Ettchs (Ed.) (1993), 65 75).

- 14CZ 300084 B6

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje in vitro způsob produkce polyfruktóz, zejména inulinového typu. který' obsahuje kroky, kdy se sacharóza nebo ekvivalentní substrát přivede do kontaktu s fruktosvltransferázou podle vynálezu v podmínkách, které dovolují konverzi na polv5 fruktó/u. a oddělí se polyfruktóza.

Substrát ekvivalentní saeharóze je například substrát, který je konvertován na sacharózu hostitelskou buňkou nebo jedním nebo více dalšími enzymy. K substrátům ekvivalentním saeharóze patří například také di- nebo oligosacharidy. které alternativně mohou být užity jako substráty pro io fruktosyltransfcrázu podle vynálezu. Příkladem takových cukru je například trisacharid rafinóza.

Ale lze užít i derivatizovanou sacharózu. Výhodně je inulinem získaným výše popsaným způsobem inulin s dlouhým řetězcem a výhodně má stupeň polymcrizace DP > 20. výhodné DP > 50. zejména DP > 100, a zvláště výhodný stupeň polyroerizace je DP > 200.

i? Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsoby výroby polyfruktóz, zvláště inulinového typu, obsahujících krok, kdy se polyfruktóza extrahuje z jedné zvýše popsaných rostlin/rostlinnýeh buněk podle vynálezu nebo zčásti rostlin podle vynálezu. Výhodně tyto způsoby obsahují krok sklizení pěstovaných rostlin a/nebo jejich částí předtím, než se provede extrakce polyfruktóz a zvláště výhodně krok pěstování těchto rostlin podle vynálezu předtím, než se sklidí. Vlastní způsoby extrakce poly fruktóz z rostlin nebo částí rostlin jsou odborníkům známy a byly popsány v odborné literatuře (Gihson, Internationa} Sugar Journal 96 (1994), 3S1-3S7/ Vogel, Stud. Plant Se i. 3 (1993), Inulin and Inulin-containing Crops, 65-75).

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulinového typu. které jsou získatelné z hostitelských buněk podle vynálezu způsobeni podle vynálezu, jak bylo popsáno výše. Polyfruktózy se výhodné užívají k výrobě surfaktantů, pro zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentů. suspendačních činidel, pro urychlení sedimentace a vytvářeni komplexů, nebo k vázání vody.

.ta Hostitelské buňky podle vynálezu, které syntetizují polyfruktózu. zvláště polyfruklózu inulinového typu. se mohou užít jako potravinové nebo krmivové doplňky. Takové užití je výhodné, neboť fruktany mají pozitivní účinek na zdraví (Boberfroid a kol., J. of Nutrií ion 12S (199S). 11-19: Kleesen a kol., Λm. .1. Clin. Nntr. 65 (1997), 1397 1402).

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje způsoby produkee polyfruktózy, zvláště inulinového typu. kdy se pro produkci polyfruktózy užije fruktosyltransferáza z houby nebo hostitelský organismus exprimujíeí fruktosyltransfcrázu zhouby. Výhodně se užije fruklosyllransferáza podle vynálezu nebo hostitelské buňky podle vynálezu. Předkládaný vynález poprvé ukázal, že jc možné užít fruktosyltransferázu z houby k produkci polyfruktózy inulinového typu.

Rozsah předmětného vynálezu rovněž zahrnuje i použití fruktosyltransferázy z houby pro výrobu polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulinového typu.

Odborníkovi je zřejmé, že v rámci popisu a příkladů jsou možná ještě další provedení podle vynálezu. Další odbornou literaturu týkající se použitých metod a médií pro použití podle vynálezu je možno nalézt ve stavu techniky ve veřejných knihovnách a např. na elektronických médiích. Pro tento účel lze využít např. veřejně přístupné databáze jako je například „Medline. která je přístupná prostřednictvím internetu například na adrese: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medlinc.html. Další databáze a adresy jsou odborníkům v oboru známy a lze je najít na internetu např. na adrese: http://www.lycos.com. Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentů nebo patentových přihlášek uvádí Berks, Í1BTECH 12 (1994), 352-364.

- 15CZ 300084 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje konstrukci vektoru pSK-asl pro transformaci bakterií.

Obr. 2 ukazuje konstrukci vektoru pl 12-asl pro transformaci kvasinkových buněk.

Obr. 3 ukazuje konstrukci vektoru pA7-as1 pro transformaci rostlinných buněk.

Obr. 4 ukazuje konstrukci plazmidu p35-asl pro transformaci rostlin, io

Obr. 5 ukazuje konstrukci plazmidu p35--s3-asl pro transformaci rostlin.

Obr, 6 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě E. coli transformované pSK asi. Dráha 1 je kontrolní pokus s vektorem bez inzertu pBluescript SK. Dráha 2 ukazuje experiment is s plazmidem pásl, kde kódující úsek asi není ve shodném čtecím rámci s genem lacZ. V tomto případě nedochází k translaci kódujícího úseku asi ve formě fúze s β-glukuronidázou, ale probíhá se sníženou účinností z endogenního startovacího kodonu. Dráhy 3 až 6 ukazují experimenty s různými transformanty konstruktu pSK-asl. Po nárůstu bakterii do OD_6(M, 0,4 byly kultury indukovány 100 mM 1PIG. Po dvouhodinové indukci byly buňky sklizeny a lyžovány v 50 mM fosforečnanu sodném s pH 6.0. Proteinové extrakty pak byly inkubovány 12 hodin sóOOmM sacharózou ve 37 °C. Jako standardy pro ehromatografii na tenké vrstvě byly v drahách 7 až 9 užity 1-kestóza (7). sacharóza (8) a fruktóza (9),

Obr. 7 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě transformovaných kvasinkových buněk obsahujících plazmid pl 12 asi (dráha 2) nebo pl 12-aslL (dráha 3). Vektor pl 12-asl I. obsahuje 5' vedoucí sekvenci přenašeče (transportéru) sacharózy ze špenátu. Dráha 1 ukazuje kontrolní experiment s netransformovanými kvasinkami. FruktosyItransferázová aktivita byla detekována v proteinových extraktech z kvasinkových buněk. Jako standard byly užity fruktóza (dráha 4). směs l-kestózy. nystózy a fruktosyl-nystózy (dráha 5) a sacharóza (dráha 6).

1(1

Obr. 8 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlinných buněk obsahujících plazmid pA7-asl. Dráha 1 ukazuje transformaci vektorem bez inzertu pA7 (50 pg): dráhy 2 až 5 ukazují transformaci vektorem pA7-asl (dráha 2: 10 pg; dráha 3: 20 pg; dráhy 4 a 5: 50 pg). Jako standard byly užity směs l-kestózy. nystózy a fruklosyf-nystózy (dráha 6), sacharóza (dráha 7) is a fruktóza (dráha 8). V každém experimentu bylo užito 500,000 protop lastů. Protoplasty byly po transformaci inkubovány dva dny při 25 °C pak byly proteinové extrakty získány v 50 mM fosforečnanu sodném s pH 6,0 a proteinové extrakty pak byly inkubovány 20 hodin s 500mM sacharózou ve 28 °C. Byly naneseny 4 pl při ředění 1/10.

4o Obr. 9 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlin transformovaných konstruktem 35—as 1. Náhodným způsobem bylo vybráno 12 rostlin. 20 mg listové hmoty bylo extrahováno ve 200 pl vody. pak byly naneseny 4 pl extraktu. Jako standard byly užity fruktóza (dráha 1 ), sacharóza (dráha S) a směs l-kestózy. nystózy a fruktosyl nystózy (dráha St).

Obr. 10 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlin transformovaných konstruktem 35-S3as1. Náhodným způsobem bylo vybráno 12 rostlin. 20 mg listové hmoty bylo extrahováno ve 200 pl vody, pak byly naneseny 4 pl extraktu. Jako standard byly užity fruktóza (dráha I ). sacharóza (dráha S) a směs l-kestózy. nystózy a fruktosy l-nystózy (dráha St).

5o Obr. 11 ukazuje eluáty „400 až 0 mM síranem amonným z kolony s fenylsuperose, na kterou byl nanesen proteinový extrakt z Aspergillus sydowi obohacené fruktosyItransfcrázou (dráha P). V drahách označených M je markér velikostí. Molekulární hmotnosti markerových proteinů jsou ukázány vpravo v kDa.

Předkládaný vynález je ilustrován následujícími příklady.

- 16CZ 300084 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Purifikace afl-SST z Aspergillus sydowi

Aspergillus sydowi 1AM 2544 byl kultivován na médiu obsahujícím 2% sladový extrakt.

0,5% pepton a 2% sacharózu. Médium bylo zpevněno přidáním 2%agaru. Spory byly vysety a kultura byla udržována při 25 °C. dokud plotny nebyly úplně suché. Konidie byly sklizeny z ploten a rozpuštěny v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném s pH 6.0. Lýze konidii byla provedena trojitým průchodem Francouzskou tlakovou komůrkou. Pro purifikaci byl homogenát adsorbován na Sepharózu Q. Navázaný protein byl eluován lineárním gradientem 0 až

1000 mM KCI. Sacharózolvtické frakce byly získány mezi 500 a 700 mM KCI. Tyto frakce byly sloučen} a dia lyžovány proti hydrogenfosforečnanu sodnému s pH 6,0. Pro obohacení proteinu se opakovala adsorpce na Sepharose Q (objem lože 2 ml) a eluce do objemu 10 ml. Eluát byl upraven na 2M síran amonný a adsorbován na fenylsuperóze. Po propláchnutí 2M síranem amonným byla provedena eluce 100 mM hydrogenfosforečnanem sodným s pil 7,0 a lineárním gradientem 2M až 0M síranu amonného. Aktivní frakce byly získány v elučním gradientu mezi 400 a 0 mM síranem amonným. Získaná proteinová smés byla analyzována na SDS-PAGE. Výsledky jsou ukázány na obr. 11. Podobné obohacení sacharózolyt ickou aktivitou bylo popsáno, avšak smycéliem Aspergillus sydowi. v publikaci Muramalsu a Nakakuki (Biosei Biolech ?_5 Biochem 59 (1995), 208-212). Purifikace neposkytla homogenní protein, který by byl vhodný např. pro sekvencování.

Pro identifikaci fruktosyltransferázy b}l použit seminativní polyakrylainidový gel. na který byly naneseny vzorky obsahující 10 pg proteinu zeluátu z fenylsuperózové kolony \ 0.1%SDS. sn 10% glycerolu a 50mM Tris pH 6,8. Po elektroforéze byl gel znovu pufrován třikrát po minutách v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném pi l 6,0. I % Triton XI00 a pak inkubován minut v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném pH 6,0. 1 % I riton XI00 a 500 mM sacharóza.

Gel byl pak povařen v 0.1% (hmot./objem) 2,3.5,-tri feny Itetrazol imnehlorid (TTC).

0,5MNaOlL TTC za těchto podmínek vytváří červené formazanové barvivo společně 55 s redukovanými cukry. Označený protein pás na obr. 1 I vznikl v důsledku sacharózolytickc aktivity proteinu, který byl tímto identifikován jako fruktosyltransferáza z Aspergillus sydowi.

Pás byl izolován z preparativního gelu, protein byl z gelu cínován a použit pro sekvencování.

Jelikož je protein N-koncově blokován, byla provedena štěpení endopeptídázami EysC a AspN. peptidy byly puri Ukovány na HPLC a pak podrobeny sekvencování podle Edmana. Byly získány následující sekvence;

EysC: VEPSTSQASEK

AspN: DDLVTYR

DPYVFQNHEV (sekvence id. č. 3) (sekvence id. č. 4) (sekvence id. č. 5)

Pro klonování genu byla zkonstruována cDNA knihovna ve fágu Lambda Zap II (Stragene. Heidelberg). Jelikož nebylo možné připravit RNA z konidií, byla RNA připravena zmycélia postupem podle Logemann a kol. (Anal. Biochem. 163 (1987), 16-20). Póly A - RNA byla získána užitím soupravy polyATract System (promega, Madison, IJSA). Syntéza cDNA a klonování do Lambda Zap 11 byly provedeny postupem podle pokynů výrobce soupravy (Stratagene, Heidelberg). Ve shodě s proteinovou sekvencí byly připraveny následující oligonukleotidové primery:

- 17C7. 300084 B6

Primer asp19down:

5- GAYGAYYTNGTNACNTAYMG (sekvence id. č. 6)

5 Primer asp!9up:
5-CKRTANGTNACNARRTCRTC	(sekvence id. č.	7)
Primer asp3l~down: 0 5 -GTNTTyeARAAYCAYGARG	(sekvence id. č.	S)
Primer asp3 lup: 5 5-TGRTTYTGRAANACRTANGG	(sekvence id. č.	9)

Primer lys lup:

5' -GCYTGNSWNGTNSWNGG (sekvence id. c. 10)

2(i

V PCR reakci s celou cDNA knihovnou jako templátem a kombinací primerů asplddown/asp31 up (teplota pro nasednutí primerů 40 °C) byl získán fragment velikosti 350 bp. Tento fragment byl po radioaktivním označení (Megaprime Kit, Boehringer Mannheim, Mannheim) použit pro screening cDNA knihovny. Získané klony byly amplifikovaný po vystřižení in vivo jako plazmidy pBlucscript. cDNA inzerty byly porovnány po restrikčním štěpení a inzerty klonu byly plně sekvencovány. Sekvence cDNA inzertů je uvedena jako sekvence id. č. I. Odvozená sekvence proteinu je uvedena jako sekvence id. č. 2.

3o Příklad 2

Příprava konstruktů obsahujících kódující úseky fruktosyltransferázy zhub vhodných pro transformaci různých prokaryotiekýeh a eukaiy otických hostitelských buněk

Pro transformaci různých hostitelských buněk fruktosvltransferázou z hub byla připravena řada konstruktů metodami, které jsou v oboru molekulární biologie známé (Sambrook a kok, 1989, Cold Spring Barbor Laboratory Press). Konstrukty jsou uvedeny na obr. 1 až 5. Konkrétné byly konstrukty připraveny následujícím způsobem:

to pSK-asl ρ 112-as 1 so pA7-as1 je derivát pásl, ktetý byl získán vystřižením in vivo z klonu Lambda Zap 11 cDNA knihovna Aspergi//us sydowi. pásl o bsah uj e c DN A j a kožto fragment EcoRI/XhoI. pSK-asl byl připraven z pásl štěpením BamHl a Sinal, doplněním kohezivního konec BamHl a znovuspojením vektoru. Odstraněním 4 nukleotidů z kódujícího úseku asi vedlo k „přepojení na čtecí rámec genu laeZ (obr. 1).

Do vektoru pl 12AINL (viz Ríesmeier a kol., EMBO J. 11 (1992), 4 705-4 713), který' byl štěpen BamHl, doplněn a pak štěpen Notl. byl klonován fragment asi z pas I (štěpeného Asp718, doplněného a pak znovu štěpeného Notl) (obr. 2).

byl připraven z pA7 klonováním kódujícího úseku z pásl jako fragmentu Smal/Asp718, jehož kohezivní konce byly doplněny, do doplněných míst Asp718 a Smál ve vektoru. Správná orientace fragmentu ve vektoru byla potvrzena štěpením Hindlll, které poskytlo fragment velikosti přibližně 1900bp. pA7 je derivát pUCI 8, který obsahuje mezi místy EcoRI a Asp718 promotor 35S RNA z viru mozaiky květáku (CaMV; 528 bp; nl 6 909-7 437, Lranck a kol.. Cell 21 (1980).

- 18C7. 300084 Ró

285-294), a mezi místy Sphl a JlindlII terminátor z genu oktopinsyntázy z AgrobítcteriMtt tumefaciens (Gielen a kol.. EMBO J. 3 (1984). 835-846) (obr. 3).

P35-as 1 byl připraven z pBinAR ligaeí fragmentu asi z pásl (štěpeného Asp718/NotI a pak doplněného) do vektoru, který' byl štěpen Smál. pBinAR je derivát pBin 19 (Bevan.

Nucl. Acids Res. 12 (1984). 8 711), který obsahuje mezi místy EcoRI a Asp718 promotor 35S RNA viru mozaiky květáku (CaMV; 528 bp; nt 6 909-7 437. Franěk a kol., tamtéž) a mezi místy Sphl a Hindlll terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium tumefuciens (Gielen a kok, EMBO j, 3 (1984). 835-846) (obr. 4).

lt)

P35-s3-as 1 byl klonován ve dvou krocích. Nejdříve byl fragment Baml Il/Asp718 z pásl . jehož kohezivní konce byly zaplněny T4 polymcrázou, klonován do vektoru pS3. který byl štěpen BamHi a pak doplněn. Tak byl získán pS3-as I. Vektor pS3 obsahuje PCR fragment z genu patalinu B33 (Rosahl a kol.. Mol. Gen. Genet. 203 (1986).

(5 214-220). obsahující nukleotidy 725 až 1400. PCR fragment je opatřen restríkčním místem Asp7l8 (GGTACC) v poloze nt 725, sekvencí ATGG v poloze nt 1400. která v kombinaci s nt 1399 a 1400 poskytuje restrikční místo Neol. PCR fragment je vložen mezi restrikční místa Asp718 a Smál. Z pS3-as 1 bvl připraven fragment Sad (zaplněno))/Xbal. který' obsahuje fúzi S3-asi. Tento fragment byl klonován mezi restrikční místa Smál a Xbal v pBinAR (obr. 5).

Odpovídající hostitele byli transformováni standardními postupy. E. coít byly transformovány postupem podle Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983). 557-580), Soccharomyces cercvisioe byly transformovány podle Dohmen a kol. (Yeast 7 (1991), 691-692), transientní (dočasná) genová exprese v tabáku byla provedena postupem podle Damm and Willmitzer (Mol. Gen. Genet. 213 (1989), 15-20), trvalá transformace brambor byla provedena postupem podle Dietze a kol. (in: Potrykus, 1. and G. Spangenberg (Ed,). Gene transfer to plants. xxii U36I (1995), 24-29; Springer Verlag: Berlin, Germany: New York, New York, USA. ISBN 3 540-58406^1).

Příklad 3

Analýza fruktosy Itransferázové aktivity transgenních hostitelských buněk nebo organ ismů exprimujících houbovou fruktosy ltransferázu

Syntéza inulinu in vivo

Transgenní hostitelské buňky nebo organismy, které exprimují houbovou fruktosy ltransferázu, byly kultivovány v médiu s obsahem 2 % sacharózy pokud se nejednalo o rostlinné pletivo, τι V případě, že hostitelským organismem byly bakterie Escherichia coli K.12, funkční gen cscB kódující sacbarózapermeázu z£. coli byl vnesen jako konstrukt do vektoru pACYCI84. V případě Succharotnyces cerevisiae byl vnesen do vektoru pll2AlNE (Riesmeier a kol.,

EMBO.I. 11 (1992). 4 705-4 713) gen pro sacharózový přenašeč. Buňky pak byly kultivovány alespoň 24 hodin v přítomnosti sacharózy, pak sklizeny a po opláchnutí v 50 mM hydrogenfosfo45 reěnanu sodném s pH 6.0 rozrušeny.

Rostliny exprimující fruktosyltransfcrázu zhouby byly pěstovány v půdě. Po čtyřech týdnech byly odebrány vzorky z listů i jiných pletiv a extrahovány ve vodě, 1 ml vody/l g čerstvé hmotnosti vzorku, v přítomnosti nerozpustného polyvinylpolypyrrolidonu, a buněčné zbytky byly odstraněny centrifugách 4 μ! každého extraktu bylo aplikováno na silikagel na již hotové DC filmy (Schleicher and Schůll, Dassel, Germany) a vyvinuty dvakrát ve směsi acelon/voda (87:13). Pak byl proveden test na fruktosylové zbytky s močovinou a kyselinou fosforečnou jako činidly (Róber a kol.. Planta 199 (1992).528-536).

- 19CZ 300084 B6

Syntéza inulinu in vitro

Buňky exprimující fruktosy Itransferázy zhouby byly rozrušeny v pufru obsahujícím: 50 mM hydrogenfosforečnan sodný, pH 6,0, 50 μΜ PMSF. 1 mM DTT. 10% (objem.)) ethylenglykol.

Buněčné extrakty byly inkubovány v pufru obsahujícím: 50 mM hydrogenfosforečnan sodný. pH 6.0, 500 mM sacharózu. 50 μΜ PMSE, 1 mM DTT, 0.02% (hmot./objem) NaN₃, 10% (objem.)) ethylenglykol po 12 h při 25 °C. Smčsi byly naředěny 1:10 ve vodě a pak 4 μΙ byly naneseny na již hotové silikagelové DC filmy (Schleicher and SchulI. Dassel, Germany) a vyvíjeny dvakrát ve směsi accton/voda (87:13). Pak byl proveden test na fruktosylové zbytky s nioěoviio nou a kyselinou fosforečnou jako činidly (Róber a kol.. Planta 199 (1992), 528-536).

Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny na obr. 6 až 10. Na těchto obrázcích jsou ukázány silikagelové filmy po chromátografii na tenké vrstvě směsí nebo buněčných homogenátů a barvení na cukry obsahující fruktózu. Pomocí chromatografie na tenké vrstvě ve směsi aceton/voda (87:13) se sacharidy, mono . oligo- i polymery rozdělí podle velikosti. Fruktóza migruje dále než sacharóza, která zase naopak migruje dále než kestóza atd. Oligomery s DP>7 a vy šším nejsou separovány a zůstávají na startu.

Na obr. 6 je viděl, že klony E. eo/i transformované vektorem pBlueseripl bez inzertu nejsou

2() schopny přeměňovat sacharózu (dráha I), zatímco klony transformované plazmidem past syntetizují trisacharid kestózu. Klony transformované plazmidem pSK-asl jsou také schopné syntetizovat vyšší oligomery (dráhy 3 až. 6). Současné fruktózové zbytky jsou přenášeny na vodu, čímž se vytváří fruktóza. Tato přeměna je katalyzována SFT z Aspergillus sydowi.

Obr. 7 ukazuje, že proteinové extrakty z kvasinek transformovaných plazmidem 112-asl mohou syntetizovat fruktan. Aktivita fruktosy Itransferázy je v těchto kvasinkách vyšší než. v kvasinkách transformovaných konstruktem 112-asl L. Tyto kvasinky, vzhledem k nižší fruktosyItransfe rázové aktivitě v průběhu času vymezeného pro experiment, syntetizovaly pouze tri sacharidy. Velikost syntetizovaných fruktanů závisí na reakční době a na fruktosy Itransferázové aktivitě.

Obr. 8 ukazuje, že velikost fruktanu syntetizovaného v extraktech z transformovaných tabákových protoplastů závisí při dané reakční době na fruktosyItransferázové aktivitě, což zase závisí na množství plazmidu pA7 asi užitého pro transformaci. V drahách 3 až 5 je vidět, že by ly syntetizovány oligo- a polymery s DP>7, které se chromatografií nerozdělily. Totéž platí pro rostlinné extrakty z trvale transformovaných rostlin, jak je ukázáno na obr. 9 a 10.

SEZNAM SEKVENCÍ

-io <210> 1 <21 ]> 2197 <212> DNA <213,> Aspergillus sydowi <400> 1

-20CZ 300084 B6

gaattcggca	cgaggccgcc	atgaagctcc	cctcttcact	ggacattctt	ctcgccagac	60
aggcggttgg	cggtactgag	gtcgactacg	actcaccacc	ccctgacctg	acgacgctcc	120
etgagaactc	gctgttcgag	acctggagac	ccaagatcca	cgttctgccc	ccaaatggcc	180
aaatcgggga	cccatgcgct	cattacastg	acccggcgac	gggtttgttc	catgtcggat	240
tcctccacaa	tggcaccggc	atttccagcg	tctacaccga	tgacctggtg	acctatcgtg	300
atatcaatcc	taacggcggc	tacattattg	ttgctggtgg	ccccaatgac	cccgaagccg	360
tctttgatgg	atctgtcatc	cccagcggaa	tcgatgacct	gcccacgctc	ctttatacet	420
ctgtgacatc	gttgccaatc	cactggactc	taccttatac	ccccggaagc	gagactcagt	480
cactggccgt	aagtgacgat	ggtggtcacc	acttcgataa	gcttgaccga	ggcccagtca	540
ttccacttcc	gccagatgga	ctcgatgtta	cagccttccg	tgacccttat	gtattccaga	600
accacgaggt	agacgaagtt	accggtagtg	acccagatac	atggtatgcc	gccatatccg	660
ggggtgtcca	tgatgtaggg	cccggaatct	ttctctaccg	caaccaagac	tcctcctttg	720
agaactggga	atatctaggc	gagtggtggc	aagaacccgc	caactcgact	tggggtgacg	780
gcacttgggc	caaacgctgg	ggctacaatt	tcgaaaccgg	caacgtcttc	tctctcgatc	840
gagaagggta	caacgttgac	ggccacacgt	ttatgactat	tggagttgag	ggtgcatacg	900
cgcccatcca	gccctcggtt	acatctatgc	atgccatgct	gtgggcagcg	ggaaafcgttt	960
cctcagagaa	tggcgaaaac	gttaccttca	cgccttatat	ggccggtgct	ttggactggg	1020
gcatggccgc	atacgccggt	gctggaaagg	ttctacccag	cacatctcag	gettetgaga	1080
agagtggagc	gcccgaccgc	ttcatctcgt	gggtttggct	tacaggtgat	gaatttggtg	1140
ctgccgctgg	atttcctgct	gcccagcagg	ggtggcagaa	tactctcctg	cttccgcgtg	1200
aattgagtat	acacacaatc	cagaatgtgg	tcgacaacga	actcateeac	gagactgcat	1260
cctggcgtgt	ggcagaacat	ggcggcgaga	ggagatctcc	tggtgtcgag	ctggagacac	1320
tgggaatcaa	tattgcgagg	gagacctacg	atgcaatcgt	ctcttctggg	acctcgtttg	1380
aggagccttc	gcgagacatt	aatgaatccg	gcaccattcc	atttgagcgc	tcgcccacta	1440
gcaggttctt	cgcccttgaa	gcccaaatct	ccttccccca	gtctgcgcga	gactcggaag	1500
tccagtccgg	atttcaaatc	cttgcttctg	aactcgagtg	gacgacgatc	tattateagt	1560
tttcgaatga	gtcgattgtc	attgaccgta	accacacaag	tgctgcgtcc	gagactacac	1620
ctggtctcgg	tactgtgact	gagtctggcc	gtatccggct	tttcgatatc	gcgggtggtt	1680
gcgatcatga	tggacatggc	ggccacgatg	gcggcaacga	tgatgaccac	aacggtgacg	1740
gtgatcatag	cggtgacggt	gaccacaatg	acgatgatga	ccataacgtc	gacggcgatg	1800
acaaggagcg	tgctcgttac	caaaagcgag	atggcccttg	cgataaagac	catgataagg	1860
ttgagacatt	ggatctcacc	attgtegtcg	ataactcagt	gcttgaagfct	tacgccaact	1920
cacgatttgt	ggtgtcgacc	tgggtccggc	cttggtacac	caattcaacg	gagatteget	1980
tcttecacaa	cggcgagggt	gaggtcagct	ttgacaacat	tgcggttcat	gatggtctgt	2040
atgatgcata	tccggacagg	gacaactgaa	gatttcactg	gttgatgtat	tagcttgcga	2100
gctataaaga	tggcgataat	tagtagattt	aatccaatga	attacctgcc	gagattgeag	2160
atttattctt	acaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	actcgag			2197

-21 C7. 300084 B6 <210>2 <211> 682 <212> PRT <213> Aspergillus sydowi 5 <400>2

Met Lys Leu Pro Ser Ser Leu Asp Ile Leu Leu Ala Arg Gin Ala Val 15 10 15

Gly Gly Thr Glu Val Asp Tyr Asp Ser Pro Pro Pro Asp Leu Thr Thr 20 25 30

Leu Pro Glu Asn Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ilé His Val 35 40 45

Leu Pro Pro Asn Gly Gin Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Asn Asp 50 55 60

Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly 65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Tyr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Ile Asn 85 90 95 . -n.

CZ 300084 Bó

Pro Asn Gly Gly Tyr Ile Ile Val Ala Gly Gly Pro Asn Asp Pro Glu 100 105 110

Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Asp Leu Prů 115 120 125

Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu 130 135 140

Pro Tyr Thr Pro Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ser Asp Asp

145 150 155 160

Gly Gly His His Phe Asp Lys Leu Asp Arg Gly Pro Val Ile Pro Leu

165 170 175

Pro Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe 180 185 190

Gin Asn His Glu Val Asp Glu Val Thr Gly Ser Asp Pro Asp Thr Trp 195 200 205

Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Gly Ile Phe 210 215 220

Leu Tyr Arg Asn Gin Asp Ser Ser Phe Glu Asn Trp Glu Tyr Leu Gly

225 230 235 240

Glu Trp Trp Gin Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asp Gly Thr Trp

245 250 255

Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Phe Ser Leu 260 265 270

Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly His Thr Phe Met Thr Ile Gly 275 280 285

Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gin pro Ser Val Thr Ser Met His .

290

Ala Met Leu Trp Ala 305

Val Thr Phe Thr Pro

325

Ala Tyr Ala Gly Ala

340

Glu Lys Ser Gly Ala 355

Gly Asp Glu Phe Gly

370

Trp Gin Asn Thr Leu

385

Gin Asn Val Val Asp

405

Val Ala Glu His Gly

420

Thr Leu Gly Ile Asn.

435

Ser Gly Thr Ser Phe 450

Thr Ile Pro Phe Glu

465

Ala Gin ile Ser Phe

485

295

Ala Gly Asn Val Ser Ser 310 315

Tyr Met Ala Gly Ala Leu 330

Gly Lys Val Leu Pro Ser

345

Pro Asp Arg Phe Ile Ser

360

Ala Ala Ala Gly Phe Pro

375

Leu Leu Pro Arg Glu Leu 390 395

Asn Glu Leu Ile Hie Glu

410

Gly Glu Arg Arg Ser Gly 425

Ile Ala Arg Glu Thr Tyr

440

Glu Glu Pro Ser Arg Asp

455

Arg Ser Pro Thr Ser Arg

470 475

Pro Gin Ser Ala Arg Asp 490

300

GlU Asn Gly Glu Asn

320

Asp Trp Gly Met Ala 335

Thr Ser Gin Ala Ser

350

Trp Val Trp Leu Thr 365

Ala Ala Gin Gin Gly

380

Ser Ile His Thr Ile

400

Thr Ala Ser Trp Arg

415

Gly Val Glu Leu Glu

430

Asp Ala Ile Val Ser

445

Ile Asn Glu Ser Gly 460

Phe Phe Ala Leu Glu

480

Ser Glu Val Gin Ser

495 . 73 .

CZ 300084 Bó

Gly Phe Gin Ile Leu Ala Ser Glu 500

Gin Phe Ser Asn Glu Ser Ile Val

515 520

Ala Ser Glu Thr Thr Pro Gly Leu

530 535

Ile Arg Leu Phe Asp Ile Ala Gly 545 550

Gly His Asp Gly Gly Asn Asp Asp 565

Ser Gly Asp Gly Asp His Asn Asp

580

Asp Asp Lys Glu Arg Ala Arg Tyr 595 600

Lys Asp His Asp Lys Val Glu Thr 610 615

Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala 625 630

Trp Val Arg Pro Trp Tyr Thr Asn 645

Asn Gly Glu Gly Glu Val Ser Phe

660

Leu Glu Trp Thr Thr Ile Tyr Tyr

505 510

Ile Asp Arg Asn His Thr Ser Ala

525

Gly Thr Val Thr Glu Ser Gly Arg 540

Gly Cys Asp His Asp Gly His Gly 555 560

Asp His Asn Gly Asp Gly Asp His 570 575

Asp Asp Asp His Asn Val Asp Gly

585 590

Gin Lys Arg Asp Gly Pro Cys Asp 605

Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp

620

Asn Ser Arg Phe Val Val Ser Thr 635 640

Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe His 650 655

Asp Asn Ile Ala Val His Asp Gly 665 670

Leu Tyr Asp

Ala Tyr Pro Asp

Arg Asp Asn

675

680

C.7. 300084 Bó <2210>3 <211> 11 <212> PRT <213> Aspergillus sydowi <400> 3

Val Leu Pro Ser Thr Ser Gin Ala Ser Glu Lys 15 10 <210>4 <211>7 io <2I2> PRT <213> Aspergi/fus sydowi <400>4

Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg 1 5 <21 0> 5 <211> 10 <212> PR I <213> Aspergi/lus sydowi <400>5

Asp Pro Tyr Val Phe Gin Asn His Glu Val ^{1 5 10} <210>6 <211> 20 <212> DNA <213 > Artefieiálηí sekvence <220>

<223 > Popis artefieiální sekvence: arlefíciáln í sekvence <400>6 gaygayytng tnacntaymg 2.0 so <210>7 <211> 20 <212> DNA <213> Artefieiální sekvence <220>

<223> Popis artefieiální sekvence: artefieiál ní sekvence <400> 7 ckrtangtna cnarrtcrtc 20

-26CZ 300084 Bó <2I0> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence <400> 8 gtnttyeara aycaygarg 13 <2I()>9 <211> 20 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence <400> 9 tgrttytgra anacrtangg 2C <2I0> 10 <2I1>17 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence <400> 10 gcytgnswng tnswngg 17

Claims (13)

1. FATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula nukleové kyseliny kódující fniktosyltransfcrázu. která je vybrána ze skupiny 35 zahrnující:

   (a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2;

   (h) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku uvedenou 4o zde jako sekvence id. č. 1 nebo odpovídající ríbonukleotidovou sekvenci;

   (c) molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s řetězcem komplementárním k molekulám nukleové kyseliny podle (a) nebo (b). kde použité podmínky zahrnují: 50% formám id. 5 x SSC?, 5 x Denhardtův roztok. 40 mM hydrogensfosforcČnan sodný, pil ó.8: 0.5% (hmotn./objcm) BSA, i? 1% (hmotn./objem) SDS. 0,1 mg/ml DNA ze spermatu sledu, při hybridizační teplotě 42 °C a následné promývání filtrů v 0,5 x SSC/0.5% SDS při 60 °C; a dále které jsou přinejmenším ze ó() % identické s molekulou nukleové kyseliny uvedenou ad (a) nebo ad (b);

   -27CZ 300084 B6 (d) molekuly nukleové kyseliny jejichž nukleotidová sekvence se liší od sekvence molekuly nukleové kyseliny podle (c) v důsledku degenerace genetického kódu:

   (e) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci

   5 přinejmenším zc 70 % identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v id. Č. 2;

   a k nim komplementární molekuly nukleové kyseliny,
2. 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného io proteinu je z více než identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.
3. 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu jc z více než 90 % identická s aminokyselinovou sekvencí id. č. 2.

   15
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1. kde aminokyselinová sekvence kódovaného proteinu je z více než identická s aminokyselinovou sekvencí id. Č. 2.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4. kteráje DNA nebo RNA.

   2(i
6. 6. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5. která kóduje polypeptid z houby.
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, kde houba je z rodu Aspergillus.

   25
8. 8. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
9. 9. Vektor podle nároku 8. kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťuj i transkripci a syntézu trans lato vatě Inc RNA v prokaryotických a/nebo eukaryoliekýeh buňkách.
10. 10. Vektor podle nároku 9. kde molekula nukleové kyseliny obsahuje usek, který kóduje signální sekvenci, která ovlivňuje intracelulární nebo extracelulární lokalizaci fruktosy Itransferázy.
11. 11. Hostitelské buňky transformované molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z náro55 ků 1 až 7 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 nebo které pocházejí z takových buněk.
12. 12. 1 lostitelská buňka podle nároku 11, která je bakteriální buňka nebo buňka houby.

    40 13. Rostlinná buňka, kteráje transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároku 1 až 7 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 nebo která pochází z takové buňky.

    14. Způsob přípravy rostliny, vyznačující se t í m . že se provede následovně:

    (a) rostlina se geneticky modifikuje vnesením molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 a/nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10. a (b) z buňky se regenerují rostliny, a případně (C) se generují další rostliny z rostliny podle (b).

    15. Rostlina připravitelná způsobem podle nároku 14.

    55 16. Rostlina podle nároku 15. kteráje užitková rostlina.

    CZ 30()084 B6

    17. Rozmnožovací materiál rostliny podle nároku 15 nebo 16 obsahující rostlinné buňky podle nároku 13,

    18. Skliditelné části rostliny podle nároku 15 nebo 16 obsahující rostlinné buňky podle nároku

    5 13,

    19. Krmivo pro zvířata nebo potraviny pro člověka, vyznačující se t í m , že obsahují skliditelné části rostlin podle nároku 18.

    in 20. Způsob přípravy hostitelských buněk podle nároku 11 nebo 12. vyznačující sc tím. že se vhodné buňky transformují molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároku 8 až 10.

    21. Způsob výroby fruktosy ltransferázy, vyznačující se t í m . že se hostitelská buňka

    15 podle nároku 11 nebo 12 nebo rostlinná buňka podle nároku 13 kultivuje v podmínkách, které dovolují syntézu fruktosy ltransferázy a izolování fruktosy ltransferázy zkultivovaných buněk a/nebo z kultivačního média.

    22. Fruktosyltransferáza kódovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků

    2<> 1 až 7 nebo připrav ile! ná způsobem podle nároku 21.

    23. Způsob výroby polyfruktózy, zvláště inulinového typu, vyznačující se t í m , že se:

    (a) kultivují hostitelské buňky podle nároku 11 nebo 12 nebo hostitel obsahující takové buňky

    25 v podmínkách, které dovolují produkci fruktosyllransferázy a přeměnu saeharózy případně přidané, nebo substrátový ekvivalent na polyfruktózu, (b) takto produkovaná polyfruktóza se získá z kultivovaných buněk, hostitele nebo kultivačního média.

    24. Způsob výroby polyfruktózy, zvláště inulinového typu, vyznačující se t í ni, že se:

    (a) sacharóza nebo ekvivalentní substrát přivede do kontaktu s fruktosy lt ran sferá/ou podle nároku 22 v podmínkách, které dovolují přeměnu na polyfruktózu, a (b) získá se takto produkovaná polyfruktóza.

    25. Způsob výroby polyfruktózy. zvláště inulinového typu. vyznačující se t í m , že obsahuje krok, kdv se polyfruktóza extrahuje z rostlinné buňky podle nároku 13, z rostliny podle

    40 nároku 15 nebo 16 nebo z Části takové rostliny.

    26. Způsob výroby surfaktantů, vyznačující se t í m , že obsahuje kroky (a) a (b) podle nároku 23 nebo 24 nebo extrakční krok podle nároku 25.

    45 27. Použití hostitelských buněk podle nároku 11 nebo 12 nebo rostlinných buněk podle nároku
13. 13 jako potravinového/krmivového doplňku.

    28, Použití fruktosyllransferázy podle nárt)ku 22 pro výrobu polyfruktózy. zejména polyfruktózy inulinového typu.

    29. Použití polyfruktózy připravené podle kteréhokoliv z nároků 23 až 25 pro výrobu surfaktantů, ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentu, jako suspendačního činidla, k urychlení sedimentace a komplcxaci nebo vázání vody.