HU228010B1 - Fruktozil-transzferáz aktivitású enzimeket kódoló nukleinsav-molekulák és alkalmazásuk - Google Patents

Description

Frukteiihtransxferáz aktivitású enzimeket kódoló Tmtdeinsav-mölekuíáfc és alkelmazáeuk

A találmány tárgyát fruktozil-transzferáz enzimaktivitású poiipeptideket kódoló nukleinsav-m-olekulák képezik, A találmány tárgyát képezik továbbá ilyen nukleinsav-molekulákat tartalmazó vektorok ás -gazdaszervezetek. Szintén a találmány tárgyát képezik fruktozil-tra-nszferázt előállító eljárások és különböző gazdaszervezetekben vagy in vitro az inul in típusú poli ,f ruktözok előállítása ugyanúgy, mint a leirt nukleinsav-molekuia által kódolt fruktozil-transzferáz, amely felhasználható az inul in típusú poiifruktózok előállítására.

Vízoidhatö lineáris polimerek változatos alkalmazásokat tesznek lehetővé, például a viszkozitás növelését vizes rendszerekben, detergensként, sznszperdálbszerkánt vagy a krüiepedés gyorsítását, viz komplexálását és akár megkötését is. Szacharin alapú polimerek, úgymint fruktozii-poliszacharidok különösen fontos nyersanyagok, mivel biológiailag lebonthatók.

Az ipari termelés és átalakítás regenerálható nyersanyagaiként történő alkalmazáson kívül fruktozil polimerek lehetnek élelmiszerek adalékai is, például mint édes!tőszerek. A különbőzé felhasználásokhoz különböző lánc-hosszúságú polimerek szükségesek. Míg a rövid és közepes láncú polimereket különösen az élelmiszeripar részesíti előnyben, technikai felhasználásokhoz úgymint felületaktív anyagok előállításához - nagy polimerizációs fokú (degree of polymerízatíon ~ DP; polimerek szükségesek.

Különböző eljárásokat írtak már le fruktán poliszacharidok előállítására növényekben bakteriális eredetű fruktozil-transz2 ferázok kifejezésével vagy közepes szénláncú porifraktózok előállítására növényi eredetű fruktozil-transzferázok kifejezésével. A PCT/US'8'9/02729 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírják szénhidrát polimerek - különösen dextrán vagy poli£rnktóz szintézisének lehetőségét transzgén növényi sejtekben, specifikusan transxgén növények gyümölcseiben< Ilyenformán módosított növények előállítása. céljából ajánlják mikroorganizmosckböi - különösen áe.robacter Ievanicum-hői, Strepcoooccu.s sa1 ivarius~böi és Saoii.ins sahtílis-ből - származó lévén szacharózok vagy

Lenconostoc mssenteroíöes-böl származó dextrán szacharózok felhasználását. Nem írják le sem a leván vagy dextrán aktív enzimeinek kialakulását, sem a transzgén. növények előállítását.

A PCT/EP93/O2.11G számú nemzetközi szabadalmi bejelentés közli az örxinia .árny! óvóra Grsm-negativ baktériumból származó lován szacharóz lse génjét kifejező transzgén növények előállítási módszerét. A növények nagymolekulájű, erősen elágazó ievánt termelnek .

Ά PCT/bL71/002?9 számú nemzetközi szabadalmi bejelöntésben leírják növények transzformálását a Bacilins subtiiís-böl származó sac8 gént tartalmazó kimére génekkel. Az ilyen transzgén növények elágazó ievánt állítanak aló. .A PCT/US89/02'729,

FCT/EP93/02110 és PC7/NL93/0Ö2?S számú nemzetközi szabadalmi.

bejelentésekben alkalmazott bakteriális £ruktozil-transzferázok Ievánt, számos β-2,1 elágazással rendelkező 0-2,6 kötésű fruktozíl polimert szintetizálnak. A számos elágazásnak köszönhetően azonban a levánnak az ipari feldolgozás szempont iából döntő hátrányai vannak, és ezért sokkal kevésbé keresett technikai kiindulási * V ν»« ** « A * · ♦ * * * « ♦ AAAA A anyag, mint a 0-2,1 elágazásokat tartalmazó inuiin. Jelenleg csak egy olyan bakteriális gén ismert, amelynek gén terme ke részt, vesz az ínul.in szintézisében, nevezett gén a Streptococcus mutáns ftf génje, A PCT/JLya/Q027S számú nemzetközi -szabadalmi bejelentés leírja növények transzformálását a nevezett génnel, amelyek azután nagymolekaiájó inulint szintetizálnak, de olyan kis mennyiségben, hogy gazdasági felhasználása nem jöhet szóba, Λ 2CT/SP97/02195 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szintén inul int termelő, a Streptocoocus mutáns ftf génjét hordozd transzgeníkus növények előállítására szolgáló eljárást ir le. Hasonlóan a ?CT/HL9ö/0027á szarná nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt növényekhez, a nagymolekulájú inul in hozama alacsony. Jóllehet a gén kifejezése lehetséges növényekben, előző genetikai módosítás után, a transzgeníkus növényekből kinyerhe tő ínul in hozama olyan alacsony, hogy gazdasági, hasznosítása nem jöhet számításba.

á ŰCT/NL9Ú/00012: számú nemzetközi szabadalmi bejelentés továbbá szénhidrát polimereket szintetizáló enzim-eket kódoló DNS szekvenciákat tesz közzé, valamint ezen DNS szekvenciák segítségévei létrehozott transzgén növények előállítását. A közzétett szekvenciák deiisnthus tuóerosus-ból származnak. A PCT/NLy6/Q0012 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint a közzétett szekvenciák felhasználhatók petúnia és burgonya, de maga a átélianfhus tuberosuo fruktán profiljának módosítása céljából is. A szacharóz-függő szacharóz fraktozil-transzferázt (sucrose-dependent szorosé fiructosyltransferase ~ SSTj vagy fruktán-függő fruktán fruktozi. 1 -transzferért ífruotan fructosyi transferase FFT) kódoló közzétett szekvenciák kifejezése transzgeníkus nővéÍJ 50/30

ΦΦ »« nyekken lehetővé teszi Inaién termelését. Az inuiin átlagos poiimerzzáoíós foka azonban DP - 6-10 között van. ilyen polimerizációs fokkal az ínulin nem tekinthető hosszú láncúnak, A PCT/NL96/00Ö12 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módszer nem teszi lehetővé nagymoiekuiájú inulln előállítását.

Eddig Rshm és munkatársai fú. Baoteríol. 180, 1305-1310

Í199S)J számoltak be oiigoszacharidők létrehozásáról élesztőben áspergiiius foetidas SS? génjének bevezetésével, A kapott termék polimerizácíös foka azonban csak DP - 3 volt.

A DE 19798770.1 számú szabadalmi Irat 1-kesztóznak és nisztőznak fruktozii polimeráz aktivitású enzimek alkalmazásával történő előállításával foglalkozik. A tri- és tetraszaoharid előállítható transzgenikus növényekben. A hozam magas és horgonyában megfelel a celluiáris szacharóz tartalomnak. Hosszabb széniáncú inoiin termeléséről azonban nem számolnak be. Poiifruktózok szintéziséről gombákban szintén beszámolnak sok publikációban . Sarthomeuf es Pourrat például egy olyan Fenici .Illem ruguiosum enzim készítményt Írnak le (Biotechnoi. Lett. 17, 911-916 (1995)], amely frnktoziI-transzferáz aktivitással rendelkezik. A készítmény különböző enzim sajátságokat mutat és ezért nem. reprezentál tiszta fruktozil-transzferázt. A fruktozii-transzferár gén DNS szekvenciája nem ismert. Calrns és munkatársai tri-, tetra- és pentaszacharidok átmeneti szintézisét írják le (New Phytologist 129, 299-3ÖS (1995)] szacharózból Monograpnella ni válás tápoldatában. Az enzimaktivitás alapvetően hídroiitíkosnak tűnik, mivel az enzim a polifraktárokat növekvő szubsztrát kimerítés mellett lebontja, Mivel a DNS szekvencia

» «ν«φ nem ismert, nem lehetséges annak felbecsülése ~ referenciaként a f ruktof uranozídáz.okkal (invertázokkal ? való homolögiára támaszkodva ~ vajon a £ruktozii-transzferáz a megfelelő szensz vagy fordított helyzetben van-e jelen.

Aspergi 11 us sydovl IÁM 2544 fonalas gomba esetében, kimutatták, hogy képes inuiin típusé polifruktózok termelésére. Harada és munkatársai inuiin szintézisét például Aspergillus sydowi konídíumokkai Írják le (ín: Kishlnari and. Dói (edse.), Food Hydrocolloids: Strnctures, Properties and Functions, Plenum, New York 77-32 (1791·). 125 g konídiumot inkubáituk 25 liter 20%-os szacharóz oldatban. A kapott terméket HPLC-vel tisztították. Ez az eljárás azonban önmagában nem vezetett inuiin nagy léptékű előállításához, Erukto-olígoszacharidok előállítását írják le baramatsu és munkatársai (Agric. Bioi. Chem. 52, 1303-1304 í 1980} j ugyanezen fonalas gomba <A. Sydovl Σ&Μ 2544} micéiiumaival, 3-13 közötti polimerizáolós fokról számolnak be. Az ebben az eljárásban részt vevő enzimeket nem vagy csak részben tisztították, A megfelelő gének DNS szekvenciái illetve a levezethető aminosavszekvenciák nem ismertek. A fehérjék tisztításához nem vagy nem teljeskörűen adnak utasításokat.

A találmány alapjául szolgáló probléma olyan nukleinsav molekulák és módszerek biztosítása, amelyek lehetővé teszik inuiin típusú polifruktózok termelésére képes, genetikailag módosított szervezetek előállítását.

E probléma megoldását szolgálják az igénypontokban jellemzett megvalósítási formák.

Ilyenformán tehát a találmány tárgyát képezik fruktozíi2.3S?/3£/?ASip2 $·γ * **« ν*· ·** » * ' * « « #

V* ** ♦ « ♦ ♦ χ« ««

-transzferárakat kódoló nuklai.n.sav-m.oiekulák., amelyeket a követke tőket tartalmazó csoportból választunk:

a) a 2. számú szekvenciában bemutatott amznosav-szskvenciát tartalmazó fehérjét kőbőló nukleinsav-molekulák;

bí az 1. számú szekvenciában bemutatott, a kódoló régió nukieotid-szekvencráját tartalmazó nukleinsav-molekulák vagy azoknak megfelelő ríbonukleotíd-szekvencra;

ο) az a? vagy b? pontban említett nukieznsav-moiekuiák komplementer szálával hibridízáló nukleínsav-moiekulák; és

d) olyan nukleinsav-molekulák, amelyeknek nukieotfd~szekven~ olaja a genetikai kód degeneráitsága tévén eltér a c> pontban említett nukieinsav-molekniák szekvenciájától;

valamint az ezekkel komplementer nukleinsav-molekulák.

Az 1. számú szekvenciában bemutatott szekvenoia Aspergiilus sydovi-ból származó szacharóz-függő fruktán £ruktozii-transzferást kódol, amely növényi sejtekben inuiin típusú, hosszú láncú poiifruktánok szintéziséhez vezet. Meglepő módon azt találtuk, Hogy nevezett szekvenciák felhasználáséval lehetőség van magas hozammal inuiin típusú, hosszú láncú polrfruktánok termelésére gazdaszervezetekben, specifikusan transzgenikus növényekbán, baktériumokban vagy gombákban.

A találmány oltalmi körén belül előírásókat dolgoztunk ki as sydovi-bói származó enzim tisztítására. Az enzimet homogenitásig tisztítottuk úgy, hogy lehetőség legyen aminosavszekvenciák meghatározására. A kapott szekvencia információ alapján primereket terveztünk polimeráz láncreakcióhoz (PCR-hez).

Ezen primerek segítségével olyan géntragmentumokat sokszoroztunk ' Ó __ f; d

meg (amo I i fikaltunk) , amelyeket fe Ihásznál tünk cDNS könyvtárak szűrésére. A RC'R termékekkel homoiog szekvenozá j u néhány cDNS molekulát preparáltunk és összehasonlítottunk, A kapott cDNs molekulák legtöbbje ugyanolyan méretű inszertúrnőket tartalmazott. A cDNS molekulák teljességét a DNS szekvencia Saccharo;syoes~ben vagy burgonyában történő tun kei ónál is kifejezésével erősítettük meg.

Au enzimek tisztítását, a ACA primerek tervesesét, a oDNs molekulák azonosítását és a heterclóg expressziét a példákban írjuk le, Az izolált DNS szekvenciát és az abból származtatható fehérje szekvenciát az 1. számú és a 2. számú szekvenciában mutatjuk be. A találmány szerinti DNS szekvencia az első, gombából származó szacharóz-függő fruktán fruktozíl-transzferáz» A DNS .szekvencia es az általa kódolt fehérje szekvencia nagymértékben eltér a már ismert fruktozii-transsterázofcat kódoló DNS szekvenciáktól. Az Asnergilius naesiundii íev i gombából származó fruktozí 1-transzferázzal például csak 22.,6% és 39% azonosságot mutat a fehérje illetve a DNS szintjén. Míg az Aspergi./../. a s niger invertáz göncével a fehérje és a DNS szintjén külon-külön tál és úü, 6% az azonosság, a. nevezett gén által kódolt fehérje teljesen eltérő enzimákéivázással rendelkezik. Sz azt mutatja, hogy a nukleinsav-moiekulák és az általuk kódolt fruktos.il-transzferé zok olyan molekulák, amelyeket eddig még nem Írtak le.

A találmány összefüggésében f ruktoz.il-trans zferás alatt olyan fehérjét értünk, amely fruktóz egységek közötti β-s,I-giükozrdos és/vagy β-2,ú-glükoziöos kötések katair zárására. képes. Az átviendő fruktozil maradék szacharózból származik.

? r, ^;3 ’ ~ / sz

A találmány szerinti szacharóz-függő fruktán frukto-zil-transzíeráz által katalizált reakció a következők szerint Írható ie:

n \ G · h j —> G ~ F_n + (n - z! G ahol G ~ glükóz, F ~ fruktóz és G-f = szacharóz, azaz az enzim fruktóz maradékokat visz át szacharózról olyan polifruktánra, amely szacharóz molekulából kiindulva képződik β~2,l~glükozidos kötésekkel, amelyben (i~2,6-glü.koz.idos kötések is előfordulhatnak. A találmány szerinti nukisinsav-molekula által kódolt, fruktoz.il-transz'feráz aktivitású polipeptid polifruktőzok és különösen növényi sejtekben az inulin típusú polifraktárok szintéziséhez vezet (innentől inuiinként is említve)♦

A találmány összefüggésében polifrnktóz alatt olyan polifruktánt értünk, amelynek polimer!zációs foka (DF) > 4, előnyösen DP > G és specifikusan. DP > 8. Az „inulin típ-usú poli fruktóz·' vagy „inulin olyan hosszúiáncű fruktán polimerre utal, amelynek molekulái főleg 8-2,1-glükozi.dos kötésekkel kapcsolódnak és adott esetben. 8-2,6 elágazásokat is tartalmaznak. A „hosszúláncú' kifejezés 20-nál nagyobb, előnyösen 50-nél nagyobb,, még előnyösebben 100-nál nagyobb és legelőnyösebben 200-nál nagyobb pollmerizáciös fokot (DP-tí jelent. A. fruktozli polimer tartalmazhat olyan terminális glükóz maradékot, amely a glükóz C~1 PH—csoportján és a fruktozli maradék C-2 OH-csoportján keresztül kapcsolódik, Ebben az esetben egy molekula szacharózt tartalmaz a fruktozli polimer.

Ha az enzimet polifruktán in vitro szintézisére használjuk, oligomez terméket kapunk (DP ~ 4-10').

A találmány szerinti nukleinsav-mclekulák által kódolt enzim az ismert fruktozll-transzferázoktői főleg a katalizált reakció

δ alapján különböztethető meg. Az ismert növényi SST~k például a következő reakciót katalizálják:

G- h 4 G-F —> G~1‘—F v G

A növényi fruktán-rüggó fruktán fruktozil-transzferázok viszont a következő reakciót katalizálják;

4· o — —> ví—e.jj+.j e —Cjn-i , amely reakció teljesen reverzibilis..

Bakteriális fraktozii-transzferázok, például a Bacilias sirötllis sa c.B génje által, kódoltak szintén a következő típusé reakciót katalizálják;

n(G-Fj -4 G-F.·. a ín-liG

Ezek az enzimek azonban leránt szintetizálnak, azaz β-2,6-giükozidos kötésekkel kapcsolt polífruktánt β-2,1 elágazásokkal,

A Sireptococcus mutáns ftf génje által kódolt fehérje (FTF) néhány millió Daiton mólókulatömegű inulin szintézisét indukálja. Az ftf gén vagy as általa kódolt fehérje azonban nem mutat érzékelhető homolögiát az 1. szánté szekvenciában bemutatott nukleinsav-szekvenciával (csak 37,3%) vagy a 2, számú szekvenciában bemutatott amínosav-szekvenoiável (csak 22,6%).

A találmány összefüggésében a „hibridizáció kifejezés hagyományos hibridizációs körülmények között, előnyösen szigorú körülmények között végzett hibridizációt [Sambrook et al., Moíecular Cloning, A Laboratory Manaal :2^Γ!<1 ed.., Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] jelent. Egy példa szigorú hibridizációs körülményekre a hibridizáció 50% formamid, 5x SSC, 5x Denbardt-féie oldat, 40 mM nátrium-foszfát

Z2.0C77SS/SAZip2 (ph S,á;, 0, 53 {tömeg/fér fogatí HSA, 1/ < tömeg/tér fogat) SDS, 0, i mg/ml ner ingsperma DNS keverékében, 42 C-on es o ötötök ezt követő mosása 0,5x 023/3,5! 5DS~ben 50 °C~on.

Egy példa szokásos, .nem szigorú körülmények között végzett hibridizációra a fentiekben amiitettek szerinti hibridizáció 50% helyett 30%-os formamidban és a szűrők mosása 2x SSC/0,5! sósban 56 ‘'C-oa. A találmány szerinti molekulákkal hibridizáió nukle :.ncav-mo lekciák Izolálhatok például előnyösen gombákból készített genomiális vagy eDNS könyvtárakból. Ilyen neklelnsav-molekulák azonosíthatók és izolálhatok a találmány szerinti molekulák vagy ezen molekulák fragmentumainak vagy ezen molekulák reverz komplementjeinek felhasználásával, például standard módszerek szerint végzett hibridizációval (Sambrook et al., Molacuiar Clonlng, A babona tory Hanual 2^,:'^! ed., Cold Spring Harbor haböratory Press, Cold Spring Harbor, KY {1935}]. bakiéinsav-molekulák felhasználhatok olyan hibridizációs próbaként, amely pontosan vagy lényegében ugyanazzal a nukleotid-szekvenciávai rendelkezik, mint az 1. számú szekvenciában bemutatott szekvencia vagy ennek a szekvenciának fragmentuma. A hibridizációs próbaként felhasznált fragmentumok lehetnek szintetikus fragmentumok Is, amelyeket szokásos szintézis technikákkal állítottunk elő, és amelyeknek a szekvenciája lényegében azonos a találmány szerinti nukleinsav-molekula szekvenciájával. A találmány szerinti nukleinsav-molekulákkai hibridizáió molekulák tartalmaznak olyan fragmentumokat, származékokat és a fent leirt nukleinsavmolekulák alléi változatait is, amelyek találmány szerinti fehérjét kódolnak. „Fragmentumok kifejezés alatt a nukiernsav1

moLekuiak olyan részért értjük, amelyek elég hosszúak rocteh-transzferár aktivitású lekérje kódolásához. A taááimányőan leÍrtak, szedne a „ származék art jelenti, Hogy ereknek a molekuláknak a szekvenciája a fent leírt nukieinsav-moiekuiák szekvenciájától egy vagy néhány pozícióban eltér, viszont nagyfokú homolőgiát mutatnak erekkel a szekvenciákkal. A homoiőgia legalább úOő-oa, főleg legalább őOs-os, előnyösen több mint SOő-os ös még előnyösebben több mint 90h~os szekvencia azonosságot jelent. Ezen nukieinsav-moiekuiák által kódolt fehérjék legalább huő-os, előnyösen legalább 70%-os, főleg legalább 80%-os, különösen előnyösön legalább vöc-os és legelőnyösebben legalább 95%~ os szekvencia azonosságot mutatnak a 2. számú amzncsav-szekvenciával, A fent leírt nukieinsav-molekuláktöl való eltérések előiöézbefők például deiecióval, szubsztitúcióval, inszerciöval és/vagy rekombinációval. A találmány szerinti nukieinsav-molekólák lehetnek a gomba eredetű szekvenciák egyéb származékai. A szekvenciák származtatásánál, követelményként szükség lehet a kifejeződés megkönnyítésére bizonyos gazdaszervezetekben.

A fent leírt molekulákkal homológ nukieinsav-molekoiák és amelyek nevezett molekulák származékait reprezentálják rendszerint ezen molekulák olyan változatai, amelyek ugyanazon biokémiai funkcióval rendelkező módosulatok. Ezek a változatok előfordulhatnak a természetben, például más törzsekből vagy szervezetekből származó szekvenciák vagy mutációk. Ezek a mutációk bekövetkezhettek természetes körülmények között vagy specifikus mutagenezissei, A változatok lehetnek szintetikusan előállított szekvenciák ís. Az alléi változatok, lehetnek a természetben elő'?/ ,43 «♦* forduló variánsok vagy szintetikusan vagy rekombznans DNS teehna ká kka1 lét; sebt zc tf ak ,

A találmány szerinti nukleinsav-molekulák különböző változatai által kódolt fehérjék előnyösen bizonyos közös tulajdonságokkal rendelkeznek, úgymint, enzimaktivitás., molekulatömeg, immunológiai reakciökészség vagy konformáció vagy fizikai sajátságok, mint as aiektroforetikus mobilitás gélelektroforézisnéi, kromatográfiás viselkedés, scadxmentáciős koefficiens, oldhatóság, spekt.rostkőpiai tulajdonságok, stabilitás, pH optimum, vagy hőmérséklet optimum.

Sicnybon restes i tett megvalósítási formában a ta lálmány szerinti nukleinsav-molekulák olyan polipeptídet kódolnak, amely gomba iraktozíL~transzfezáz sajátságokkal rendelkezik, különösen előnyben testesítünk áaperg.íiius-bői, 'legelőnyösebben Aspergzilus syocvl-bcl származó frákhozii~transz£erázt,

A találmány szerinti nukleinsav-molekulák lehetnek DNS vagy DNS molekulák·, Megfelelő DNS molekulákra példák g-enomiális DNS vagy cDNS molekulák, A találmány szerinti nukleinsav-molekulák izolálhatok természetes forrásokból, például gombákból, főleg .Aspergil.2us-ból és előnyösen Aspergiiiss sydoeü-böi, vagy ismert módszerekkel szintetizálhatok,

A találmány szerinti nukieinsav-moiekuiákba bevezethetők különböze mutációk is szokásos molekuláris biológiai módszerekkel [Sambrook et al., Moieouiar tréning, A Laboratory Manoai i'“ ed,, Cold Sprlng Harbor Laboratory Press, Cold Sprlng Harbor, NY •1989)j. Ilyen bevezetés elindítja potenciálisan módosított biológusi sajátságokkal rendelkező fehérjék szintézisét. Egyik meg/2 .cws « φφ »»» *χ« ΦΦΦ

9 9 φ Φ » φ

ΦΦΦΚ ΑΧ Μ Φ» X*- X* ke ce ίι tes delóozos mutánsok előállítása,. ame iyne i. a kódoló időd szekvencia 5' vagy 3’ végén ptcgresat.iv deiécíékat tar fc a Imazö nuk le insav~mo léke Iákat botank létra, amely megfelelően csonkolt teher tek .szintéziséhez vezet, agy másik megkéseli tés szignálszekvenciák hozzáadása révén különböző kompartmentekben .lokalizáló-dó enzimek specifikus előállítása. Annak elérése érdekében, hogy a találmány szerinti fehérjék a citoszolfcan foka 1izálódjauak, n i ncs szükség a 2 . számé szekvenciához ssrrgoá 1 ~szétverne rák hozzáadására. Másreszt pontmutációk is bevezethetők olyan helyeken, ahol az aminosav-szekvenoia módosítása befolyásolja például az enzimaktivítást vagy az enzim szabályozását. Ilyen módon készíthetők például módosított K_w értékkel rendelkező mutánsok vagy olyan mutánsok, amelyekre már nem hatnak a sejtben általában előforduló a 1.Lösztérikus szabályozó mechanizmusok vagy kovalens módosítások. Továbbá eiőái.lítbatók .módosított szubsztrát- vagy termékspeoiftkus mutánsok:. Előállíthatok módosított aktivitás-hőmérséklet profillal, rendelkező mutánsok is.

A prokarióta sejtekben történő genetikai manipulációhoz a találmány szerinti nukleinsav-molekuiák vagy ezek fragmentumai beépíthetők olyan piazmidokba, amelyek lehetővé teszik a mutagenezist vagy szekvencia módosítást DNS szekvenciák rekombinációjával. Standard módszerek segítségévei [Sambrook et ai-, Molecular Cloníng, A Laboratory Manna! 2^r!'^: ede, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring üarbor, NY (1989}] báziscsérék végezhetők vagy hozzáadhatok természetes vagy szintetikus szekvenciák. A DNS fragmentumok összekötéséhez adapterek vagy linkerek kapcsolhatók a fragmentumokhoz, Továbbá elvégezhetők

7? . 237 Pű i 4

4 «4 * ΑΧ χ « V 4 4 « * 44 444 4.-4-4 4»

4 4 4 4 4 «4 4Χ ΛΧ a »« XX 44 olyan műveletek, as'eiyek megfelelő restrikciós hasítási helyeket biztosítanak vagy amelyek eltávolítják a fölösleges uPő-t vagy restrikciós hasítási helyeket. Bárhová ahol szükség lehet inszertumokra, dotációkra vagy szubsztitúciókra, alkalmazható In vitro mutagenezis, „primer javítás, restrikciós hasítás vagy iigáciő. Analízis céljából általában szekvencia analízist, restrikciós analízist vagy további biokémiai, molekuláris biológiai mődszeneket alkalmazunk.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti nukieinsav-molekulákat tartalmazó vektorok. Ezek a vektorok előnyösen ptazmidok, kozmidok, vírusok, bakteriofágok és egyéb a genetikai munkában szokásos vektorok.

A találmány szerinti ir.;kieinsav~molekula a találmány szerinti vektorban működőképesen kapcsolódik olyan szabályozó elemekkel, amelyek lehetővé teszik lefordítható (translatablei RNS- átírását ítranscription! és szintézisét prokariőta ás/vagy eukariőta sejtekben. A találmány szerinti vektor például a következő elemeket tartalmazza;

1. üownstream kódoló régióknak a gazdaszervezet sejtjeiben történő transzkripcióját biztosító promótert és adott esetben fokozó (enhancer! elemeket.

2. Kódoló régiét a promőterhez kapcsolva, amely legalább egy nyílt leolvasási keretet tartalmas a polipeptid transzlációjához. A jelen találmányban a kódoló régió a találmány szerinti nukleinsav-molekula.

3. Adott esetben további szekvenciákat a kódoló régióhoz kapcsolva, például transzkripciós termináciős szignálokat, -c .uvík:

amennyiben ezek .szükségesek a sikeres génkifejezőbsshez bizonyos gazdaszervezetben# vagy a géntérmék szabceiluláris elhelyezkedését befolyásoló vagy a fehérje kiválasztását (szekrécióját) elindító szignál-szekvenciákat.

Egy ilyen vektor tartalmazhat további géneket, úgymint a vektor szelekcióját alkalmas gazdasejtben és megfelelő 'körülmények között lehetővé tevő markér géneket. A. találmány szerinti nukleinsav-molekula kifejeződése magában foglalja a nukleinsavmolekula átírását lefordítható: mPKS-sé. A nukleinsav-molekula prokariota. és eukarióta sejtekben történő kifejeződését elősegítő szabályozó elemek ismertek a szakember számára. A találmány szerinti nukleinsav-molekula prokariota gazdasejtekben történő kifejezéséhez alkalmas# szőbajöhető szabályozó elemek közé tartozik például a lac# trp vagy tac promé-tér £. coli-ban, Különösen előnyben részesítjük a lacl promotér használatát# amely IPTG-vel indukálható £. ocli-oan. Példák olyan szabályozó elemekre, amelyek eukarióta gazdasejtekben teszik lehetővé a kifejezést. az A0X1. és a GÁLI promöterek élesztőben vagy a CMV, .SVACb RSV prombterek, CMV fokozó, SViO fokozó, vagy globin ín trón emlős vagy egyéb állati .sejtekben. Élesztőben történő kifejezéshez előnyösen a Saccharo2s.yce.s carevisiae alkohol dehidrogenáz génjének promőterét használjuk, amely élesztőben nagyon aktív. További alkalmas vektor rendszereket is leírtak már a szakmában [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory bánnál 2^ns ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (19S9) és Ausnbel, Current Protocols in Molecular Biology, Green

Publishing Associates and Kiiey Interscíenee, KY (1989)].

zz. ouvsa/moUín

A találmány szerinti nukleinsav-moiekaia növényi sejtekben történő kifejezéséhez elvben bármilyen, növényi sejtekben aktiv promóter, fokozó, terminátor stb. leket szabályozó elem. A promóter kiválasztható oly módon, hogy a kifejeződés állandóan megtörténjen (konstifutIván) vagy bizonyos szövetben, a növény fejlesésének bizonyos időpontjában vagy külső körülmények által meghatározott időpontban. A növényre nézve a promoter lehet homológ vagy heterolőg.

Konstitutív kifejezéshez alkalmas promoterek példán! a karfiol mozaikvirus 35S RNS promótere (lásd például az O.S.7. 0,352,605 számú szabadalmi iratot? és az ubikvitin promóter {lásd például az U,S,P. 5,614,399 számú szabadalmi iratot). Burgonyában gumóspecifikus kifejezéshez a patai in gén promótere 833' [Rocha-Sosa, SM80 o. 3, 23-29 (1939)1 vagy a kifejezést csak fotoszintetikusán aktiv szövetekben biztosító promóter, például az ST-LSl promoter tStockhaus, Rroc. Kati. Acad. Sói, USA ujj, 7943-794? {1937); Stockhaus, EH8G ül y, 2445-2401 (1989;l, a Ca/b promóter (lásd például az 2.S.R. 5,606,496 és 5,639,952 számú szabadalmi iratokat) (Bansal, Broo, háti. Acad. Sor. USA 39, 3659-3050 (1992)1 és a Rubisco SBC promoter (lásd például az ü.S.P. 5,034,322 és 4,962,023 számú szabadalmi iratokat). Használhatók azonban olyan promoterek is, amelyek csak külső körülmények által meghatározott, bizonyos időpontban aktiválódnak (lásd például a WO 93/107279 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést) . Egyszerű indukciót lehetővé tevő hősokk fehérje promoterek szintén specifikus érdeklődésre tarthatnak számot. Mag-specifikus promoterek szintén használhatók, úgymint a váci a fába USB promótere, amely

* *·♦

4» 4 4*4 «,« 4 <4 4 *♦* 4 * 4

4*4 j,a *9 *t < *4 X* * »X44 * » ♦

X««« « 4 4 4*

Ζ:η O ,·,pOC i. l. ZSUS Ki.íe )ΟΖΟΟ'ύΟΟ £§S2 iári6tÖVé i:,U>.! tSr'.-.í ··OSU OS i''aS növényekben ( Fiedlör, Plánt Koi< Bioi, .7, 669-679· (1693?;

Baumiein, Hol. Geo. Génét. 225, 459-967 {1991)] . Továbbá alkalmazhatók gyümölcs-s-p-ecif ikus promó terek a WO 91/01373 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint. Érésben levő paradicsomban történő kifejezéshez alkalmasak példáéi a paradicsom poligalakturonáz promőterének cisz szabályozó eleme)., amelyek aktivak a külső vagy belső tor:katplomban ( termes faiban) ( lllchoiaas et al., Plánt Mól. Bioi. 23, 423-935 (1995) ; bcntgomery et al,, Plánt Ceii 5, 1049-1062 {199.3)) . Egy másik gyümölcs-specifikus promőtért paradicsomhoz Van Haaren és munkatársai Írnak le { Plánt Mól. Bioi. 21, 625-640 ().995)) .

Továbbá használhatók prométerek endosperm-spec1fikus kifejezéshez, úgymint a gittel in prcmoter í neisy, Plánt bői. Bioi. 14, 41-50(1990); aheng, Plánt J. 4, 357-366: (1393)], a búza HMG prométere, az OSP promóter, a fazeoiin proizoter vagy kukorica zein génjeinek ρromoterei ) federseo, Ce.il 2 3, 1015-1026 (1982);

Quattrocchio, Plánt bői. Bioi. 15, 81-93 (1990)) vagy a kukorica shrunken-1 prométere (sh-1) ( Werr, EHBO u, 9_, 1373-1330 (1985)] ,

A találmány szerinti nukieínsav-molekulák kifejezése különösen előnyös a növénynek azon részeiben, amelyeknek, megnövekedett szacharóz tartalma van vagy amelyek szacharózt tárolnak. Ilyen szervek például a cukorrépa gyökere vagy a cukornád és édes cirok szára. Különösen előnyösek tehát a kifejeződést ezekbe a szervekbe közvetítő promóterek, úgymint a Soianuw toberosum 333 parafán promötere. A cukornád szárában történő specifikus kifejeződéshez használható az ufoikvrtin promóter kombinálva az V .ÍÖO3S első * *·♦ intrónnal,

A találmány szerinti, vektorok rendelkezhetnek olyan további tunkorős egységekkel is, amelyek befolyásolják a vektor stabilitását a gazdaszervezetben, úgymint bakteriális replikáéiba origót vagy a 2-mikron-DNS-t stabilizációhoz ás autonóm replikáéióhoz élesztőben. Agrobaktérium T-DNS „bal oldali határ és „jobb oldali határ szekvenciáit ís tartalmazhatjak, amelyek stabil beépülést tesznek lehetővé a növények genomjába. Termináoiós szekvencia is lehet, amely a transzkripció helyes iermínáciőját szolgálja vagy poii-A farkat ad a transskriptumokhcz stabilizálandó azokat. Ilyen elemeket leírnak az irodalomban (Gie.len, EMBO J. b, 23-29 (1939)1 és ezek egymással, szabadon kicserélhet ők.

Előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti vektorban levő nukieinsav-moiekuia olyan régiót tartalmaz, amelyben a kódolt enzim: kiválasztásához funkcionális szignálszekvencia van. Ilyen szekvenciák ismertek.

Egy példa olyan szignál-szekvenciára, amely lehetővé teszi a fehérje lokalizációját a vskuőlomban, az élesztőből származó karboxi-peptrdáz Y (carboxypeptidase Y -= CPY; szignál peptld. A megfelelő gént például Valis és munkatársai Írták le [Ceri 43, 887-8991« dévényi szignál-szekvenciák például az árpa lektin gének [űaikhel and bemer, Dev. Génét, 12, 255-269 (1991)} vagy a bab érett fitohemagglutinin K-terminális régiójától számított 4 3 aminosav [Tagúé et al,, Plánt Coll 2, 533-546 {1990}). Példa C-hermináiis szignál pepiidre a kitinázé (beuhaus et al., Plánt J. 5, 4 5-54 (19941}.

Előnyben részesített szignál-szekvencia például a proteináz inhibitor II gén szignái-szekvencíája burgonyában. Használható

azonban bármilyen egyéb, a polip-sptídnek a. választott gazdaszervezetben. történő kiválasztódásához: vezető szignál-szekvencia. A kiválasztott £ruktozil-transzferáz kinyerhető a tápoldatbói és f e 1 h a s z: n á 1 h a t ő in vit.ro szintezi se kh e z,

Különösen előnyben részesített megvalósítási formában a vektorban levő nuklsinsav-molekula olyan régiét tartalmaz, amely a növényi sejtek vakuölurnában történő lokalizációhoz kódol szignál—szekvenciát, előnyösen ilyen a patatin géné burgonyában ['Sonn.ewa.Id, Plánt J. 1, 95-106 (1998)1, Ez lehetővé teszi a fruktozí1-transzferáz szubceiluiáris lokalizációját a genetikailag módosított növényi sejtek és növények vakuólumában, például cukorrépában vagy burgonyában, és· ínulín típusú nagymolekóláiú poii'fruktózok felhalmozódását a vakuólnmokban. További vakuóluxához kapcsolódó szignál-szekvenciákat ír le például az alábbi publikációk [Matusoaka, J, Exp, Sofcany 50, 155-174 (1559);

Chrispeels, Cell 86,, 613-816: {1992}; Matusoaka, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88, 334-838 {1991); Bodnárok, Plánt Cell 3, 1195-1288 (199.1) ; Na.kamu.ra, Plánt Phys. 101, 1-5 {1993} j .

A találmány egy másik megvalósítási formájában a vektorban levő nukleínssv-molekula olyan régiót tartalmaz, amely növényi sejtek plasztidjaiban történő lokalizációhoz kódol szignál-szekvenciát. Szignál-szekvenciaként alkalmazható például a spenét ferrodoxin:NADP(t}-oxidoreduktáz (FERI szignál-szekvenciája. A szekvencia tartalmazza az 3 nem-transzlált régiókat ugyanúgy, mint a spenót ferrodoxin :EAD? (R) -oxidorednktás (FNR) piasztiőiális fehérje szegélyező tranzit-peptid. szekvenciáit (-171-4165.

nnkleotidok) [ő'anson, Current Genetios 13, 517-522 (1988}].

7Z. aZ7/WSAKi.U

« φφ * ♦««*

A kukorica viaszszerü fehérjéjének tranzit-peptidje és az érett viaszszerű fehérje első 34 aminosava is használható szignál-szekvenciaként íKloegen, Mól. Gén. Génét. 217, 155-161 Í19B9)j. A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a kukorica víaszszerü fehérjéjének tranzít-peptídjét használjuk az érett viaszszerű fehérje első 34 aminosava nélkül.

Különösen előnyben részesített megvalósítási formában a találmány oltalmi körébe tartoznak a pSK-asl, pll2~asl, pá'?~asl, p35-asl, p35-s3~asl plammidok, amelyeknek a szerkezetét a példákban (1-5.! Írjuk le,

A találmány szerinti nukieínsav-moiekuiák és expressziós vektorok lehetővé teszik inulin típusú polifruktözok előállítását különböző gazdaszervezetekben, különösen növényekben, gombákban és baktériumokban. A kódolt enzimek felhasználhatók a gazdaszervezeten kívül is inulin típusú polifruktözok előállítására. Azaz különösen lehetőség van a találmány szerinti nukleinsav-molekulák felhasználására az általuk kódolt fehérje előállításához bármilyen gazdasejtben, a fehérje kinyerésére a gazdasejtből és/vagy a szaporító tápoldatből, majd alkalmazására in vitro körülmények között Inulin szintézisére<

Például az a-1 kohol-dehidrogenáz promötert tartalmazó szerkezet és a találmány szerinti nukieínsav-molekuia felhasználható Sacöhsromyces oerevisiae transzformációjához. Mivel élesztők nem tudnak szacharózt felvenni, olyan sejteket kell használni, amelyek heterológ ühS szekvencia bevezetésének köszönhetően szacharóz transzportért fejeznek ki. Ilyen sejtek előállítását írják le Ríesmeher és munkatársai [EHBO J, 11, 4705-4713 (1392) j , A fent leírt szerkezettel transzformált élesztők inuiin típusú hosszúláncű polífrnktőzokat képeznek. Mivel az AspergzíJ es sydomi-ból származó fruktozil-transzferáz nem rendelkezik szignál peptiddel, nem választódik ki. Ilyenformán élesztősejtökben termelhetek hosszúiáncú poiifruktőzok. Ezeket a polifraktözokat tartalmazó élesztők közvetlenül felhasználhatók élelmiszer adalékként. ha a polifruktózoknak fermentativ úton a tápoldatba történő kinyerése a cél, akkor a találmány szerinti nukleinsavmolekulához a kiválasztódás elősegítésére szignál-szekvenciát keli hozzákapcsolni.

Ά találmány tárgyát egy másik regvalósítási formában olyan gazdasejtek képezik, amelyek átmenetileg vagy stabilan tartalmazzák a találmány szerinti nukleínsav-moiekólákat vagy vektorokat, vagy amelyek ilyen sejtből származnak. A „pazdasejt kifejezés olyan szervezetre utal, amely képes in vitro előállított rekombináns DNS felvételére és adott esetben a találmány szerinti nukieinsav-molekulák által kódolt fehérjék szintézisére. A gazdasejtek lehetnek prokariöták vagy eukariőták. A „prokarióta kifejezés mú.nden olyan baktériumot felölel, amely a találmány szerinti nukleinsav-molekulával transzformáihatő ítransfornd vagy átfertezhatö (tr-ans-fect) és amely előnyösen lehetővé teszi fraktozil-transzferáz aktivitással rendelkező fehérje kifejeződését. Prokaríőta gazdasejtek közé tartoznak például Gram-negatív és Gram-pozrtiv baktériumok, úgymint £h coli, S, typhimuríam, oerratia merrcescens és Bacilias subtiiis. Az „eukariőták közé tartoznak rovarsejtek, gombasejtek, növényi sejtek, állati és humán sejtek. Előnyben részesített gombasejfek 72.03Vi5E/KAZipZ φφ φφφφ « X φ XXX Φ Φ « ΧΧΦ φφφ χ»χ « φ φ φφφ >

φφ például azok, amelyek fermentációhoz hasznáiatcsak nagy használhatok, főleg öeocsaromyces -- különösen előnyben részesítjük a S. oerevisrse~t -, Eduyveromyces, Pichia stb. Ilyen gombásé j-t lehet előnyösen az Aspergílías nemzetségből való sejt és különösen előnyben részesítjük az Aspergíllus niger fejt. Különösen fontos a találmány szerinti fruktoziI-transzferáz kifejezése ezekben a sejtekben, kombinálva például az Aepergifiss foetidus patatin génjének vagy az 1-59T génnek szekréciós szignál --szskvensra javai (Rohm ef aí,, eh Bac, L8Ö, 1305-1319 (199-8) 1, amely lehetővé teszi o ftükrözi b-íranszferáz kiválasztását a tápoiöutba. Előnyösen olyan sejteket használnak, amelyeknek csökkent vagy egyáltalán nincs szekréciós rnvertáz aktivitásuk, Saját rnvertáz aktivitással nem rendelkező gombafaj például a 'fr rcöocerma ráesel. β-fruktoturanozidaz (A. néger inveréázi ki fej résére Írnak le eljárást Sergés és munkatársai íCurr. Génét. 24, 53-59 ílS93)j .

Fruktezíi-franszfezaz aktivitású fehérjét kódoló, találmány .szerinti nukieiusav-moiekuiávai vagy megfelelő vektorral a szakember hagyományos technikák segítségével képes gazdasejt transzformálására vagy átfertczésére. Fuzionált, működőképesen összekapcsolt gének előállítására és megfelelő gazdaszervezetben történő kifejezésükre szolgáló eljárások jól Ismertek a szakember számára és megtalálhatók például az alábbi összefoglaló irodalmakban [Sambrook et ai., Kolecuiar Cloning, A Lafooratory Manual 2'' ed., Coid Spring Karbor Lsboratory Press, Coid Spring Karbor, NY (1989; és Ausobel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley interscience, NY (1389;; .

Előnyben részesített gazdaszervezetek E. sori, gombák, ?2.30 vsa különösen élesztők és növényi sejtek,

A találmány szerinti nukleinsav-molekulák növényekben való kifejezésekor .általában az fordul elő, hogy a szintetizált fehérje a növényi sejt valamelyik kompariméntiében iokaiizálödik. Specifikus koppárámentben történő lokalizáció elérése érdekében a találmány szerinti nukleinsav-molekula hozzáköthető olyan DNS szekvenciához, amely biztosítja a kívánt kompartmentben történő elhelyezkedést; lásd fent. Ilyen szekvenciák ismertek, lásd például az alábbi hivatkozásokat [Braun, EMBO li 11, 3219-3227 (1992); Wolter, űrön. Kati. Acad, Scí. USA 35, 646-850 (1938);

Sonnewald, Plánt 31 1, 95--106 (2991); Pocha-Sosa, SÖBO J, 8, 23-29 (1989)). A találmány szerinti gazdaszervezetek magukban foglalnak transzgeníkus növényi sejteket, egy vagy néhány találmány szerinti nukleinsav-molekulával transzformált növényi szöveteket vagy növényeket ugyanúgy, mint az ily módon transzformált sejtekből származó transzganikus növényi sejteket. Az ilyen sejtek egy vagy néhány olyan nufcleinsav-molekulát tartalmaznak, amelyek előnyösen a növényi sejtben történő transzkripciót biztosító szabályozó DNS elemekhez, főleg promóterhsz kapcsolódnak. Az ilyen sejtek abban különbözhetnek a természetben előforduld növényi sejtektől, hogy legalább egy találmány szerinti, nukieinsav-molekulát tartalmazlak, amely természetes körülmények között nem fordul elő ezekben a sejtekben, vagy az ilyen molekula a genomnafc olyan fókuszán foglal helyet, ahol természetes körülmények között nem helyezkedik el, azaz eltérő genomiáiis környezetben ,

A találmány egy másik megvalősitási formáját képezik olyan

♦ ♦♦» növényi sejtek, amelyek citoszoljakban tartalmazzák a találmány szerinti f ehérj ét , Ehhez a megvalósítási .formához a 2. .számú szekvenciában bemutatott szekvenciát használjuk további szignálszekvenciák nélkül,

Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány tárgyát olyan növényi, sejtek képezik, amelyek a találmány szerinti fehérjét plasztikjaikban tartalmazzák,

A találmány szerinti fehérje piasztidiális lokálinációjának előidézése érdekében a találmány szerinti, nukleinsav-moleknlák. és/vagy vektorok módosíthatók a fent leirt módon.

Mivel a vakuóium általában képes nagy mennyiségű. - a találmány szerinti fehérje szubsztrátjáui szolgáló — szacharóz tárolására, ez a kompartment tökéletesen alkalmas olyan növényi sejtek létrehozására, amelyek a találmány szerinti fehérje aktivitásának köszönhetően poiifruktózt termelnek a vakuolumokban.

Különösen előnyben részesített megvalósítási formában a találmány tárgyát olyan növényi sejtek képezik, amelyek vakuöiumaikban tartalmazzák a találmány szerinti fehérjét. A fentiekben már elmagyaráztuk, hogyan keli összeáilitaní a találmány szerinti nukleinsav-moiekul.á.kat és/vagy vektorokat ahhoz, hogy a találmány szerinti fehérje lokalizációja a vakuolumokban megtörténjen,

A transzgenikus növényi sejtek és növényi szövetek teljes növényekké regenerálhatok a szakember számára ismert módszerekkel, A találmány szerinti transzgenikus növénye sejtekből regenerálással kapható növények szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány egy másik tárgyát képezik olyan növények, amelyek a 52'. erV3E/J®2ip2 * ♦ fentiekben .leirt transzgenikus növényi sejteket tartalmazzák. A találmány szerinti növények bármilyen növényfajba tartozhatnak, előnyösen egyszikű vagy kétszikű növények. A növényi sejtek előnyösen mezőgazdaságiiag hasznosítható növényekből, azaz élelmiszer vagy technikai ·- különösen ipari célú - felhasználás céljából termesztett növényekből származnak. A találmány tárgyát előnyösen száltermeiö növények (például len, kender, gyapot), olajat raktározó növények (például repce, napraforgó, szójabab), cukrot felhalmozó növények (például cukorrépa, cukornád, édes cirok, banán) és fehérjét raktározó növények (például hüvelyesek) képezik.

Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány tárgyát takarmánynövények (például abrak, széna, lucerna, lóhere, stb,), zöldség- és gyümölcsfélék (például dinnye, paradicsom, banán, cikória, póréhagyma, spárga, sárgarépa) vagy keményítőt raktározó növények (például búza, árpa, zab, rozs, burgonya, kukorica, rizs, borsó, kasszava, mungobab) képezik.

Egy másik megvalósítási formában a találmány tárgyát szacharóz tartalmú növényekből (például cukorrépából, burgonyából, rizsből, búzából, cukornádból stb.) származó növényi sejtek képezik. Különösen előnyben részesítjük a cukorrépát, cikóriát,, rizst, kukoricát, burgonyát, cukornádat es búzát. Szintén a találmány oltalmi körébe tartozik a találmány szerinti növények szaporifőanyaga és termése, például gyümölcsök, magok, gumók, gyökérdarabok, magoncck, dugványok, kalluszok, sejtkultúrák stb.

A találmány tárgyát képezik transzgenikus növények előállítására irányuló eljárások is, amelyekben ?2.03?/BEZSASip.2 ♦

2ο a; a növényi sejtet a találmány szerinti nukieínsav-molekulával és/vagy a találmány szerinti vektorral genetikailag módosítják; és

b) a növényt regeneráljuk a sejtből; és adott esetben

c) további növényeket hozunk létre a b) szerinti növényből.

A találmány Összefüggésében a „genetikailag módosított'’' kifejezés azt jelenti, hogy a. növényi sejt genetikai információját a találmány szerinti nukleínsav-molekula bevezetésével módos ltjuk és a találmány szerinti nukleinsav-molekuia jelenléte vagy kifejeződése fenotípusos módosítást eredményez. A fenotípusos módosítás előnyösen kimutatható változást jelent a sejtek egy vagy néhány funkciójában. Például a találmány szerinti genetikailag módosított növények találmány szerinti fehérje aktivitást vagy megnövekedett átfogó fruktozil-transzferáz aktivitást mutatnak .

A növények regenerálhatok a fo} lépés szerint a szakemberek számára jól ismert módszerekkel,

További növények létrehozása a találmány szerinti eljárás c) lépése szerint kivitelezhető például vegetatív úton (például dugványok, gumók vagy kailusz kultúrák felhasználásával és teljes növények regenerálásával} vagy termesztéssel. Termesztéses szaporítás előnyösen ellenőrzött körülmények között történik, azaz specifikus tulajdonságokkal rendelkező növényeket keresztezünk egymással és szaporítjuk.

A találmány szerinti eljárásokkal megkapható növények szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

?2,Ö37/S8ZPA2ip2

€.

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti növények szaporítóanyagai ugyanúgy, mint a találmány szerinti eljárással létrehozott transzgenikus növények. Ά „szaporítóanyag kifejezés a növény olyan részeit jelenti, amelyek vagy vegetatív vagy generatív úton alkalmasak utódok létrehozására. Vegetatív szaporításhoz például a gyümölcsök, magok, magoncok, protopiasztok, sejtkultúrák stb. A szaporifőanyagok előnyösen gumók és magok.

Egy másik megvalósítási formában a találmány tárgyát a találmány szerinti növények betakarítható növényi részei képezik, úgymint gyümölcsök, levelek, raktározó gyökerek, gyökerek, virágok, rügyek, csirák vagy szárak, előnyösen magok vagy gumók.

Egy másik megvalósítási formában a találmány tárgyát olyan állati és/vagy humán élelmi anyagok képezik, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti növények betakarítható növényi részeit, előnyösen magokat vagy gumókat.

A találmány szerinti növényi részek elfogyasztásuk után előnyösen jótékony hatásúak az állatok és/vagy az ember egészségére összevetve olyan megfelelő növényi részekkel, amelyeket génétifcsilag nem módosítottunk a találmányban leírt módon. Ugyanez vonatkozik a találmányban leírt állati es/vagy humán élelmi anyagra. Emberekben a találmány szerinti élelmiszer fogyasztása például megjavíthatja a bélflóra összetételét, különösen a bifádébakferlumok mennyiségének növekedését okozhatja a bélben, amely valószínűleg pozitív hatású az emberi egészségre Πζζο, Trenös ín Food Ser, and Technoi, 9, 255-257 (1998)1,. Ezek e pozitív hatások előnyösen megelőző hatások vagy az élelmiszer hasznosítását elősegítő hatások.

7.2.ö3t/3£/M2ip2

44'

A. találmány egy másik tárgyát olyan gazdasejtek előállítására irányuló eljárások képezik, amelyekben alkalmas gazdasejleket transzformálunk a találmány szerinti nukleinsav-moiekulával vagy vektorral. Különböző gazdasejtek transzformációjára eljárások ismertek a szakember számára.

Egy másik megvalósítási formában a találmány tárgyát fruktozíi-transzferáz előállítására szolgáló eljárások kepezik, ahol a találmány szerinti gazdaszervezetet a találmány szerinti nukleinsav-molekula kifejeződéséhez kielégítő körülmények között tenyésztjük és azután a £ruktozil-transzferázt izoláljuk a tenyészetből, azaz a sejtekből és/vagy az esetleg jelenlevő tápoldatból, A. fent említett eljárásnál a transzf ormait vagy átfertőzött gazöasejbeket tenyésztjük, például fementorokban az optimális sejtsűrüség eléréséig. Adott esetben, indukálható promőterek esetén a találmány szerinti nukieinsav-molekula által kódolt fehérje kifejeződését csak a fermentációs lépés végén idézzük elő, Az ily módon kifejezett fehérje azután tisztítható a tápoldatból, sejtlizátumfcól vagy eeliuláris membrán frakciókból a szokásos technikák szerint. A például mikroblálísan kifejezett fehérjék izoláihatók és tisztíthatok preparatív kromatográfiás vagy immunológiai tisztítási módszerekkel, például olyan monoklonális vagy poliklonális antitesteket használva, amelyek felismerik a találmány szerinti nukieinsav-molekula által kódolt fehérjét. Ebben az összefüggésben megemlítendő, hogy a fruktozii-transzferáz aktivitású és a találmány szerinti nukieinsav-molekula által kódolt fehérje tartalmazhat további funkciós aminosav-szekvenciákat, például fehérje toldalékokat (GST-t, GFP-t, Flag-ot, HA. pepiidet, Kis-toldalékoth, amelyek származhatnak heterol.og

72.237/SE,-''PÁSrí?2 ♦ «** fehérjékből vagy lehetnek szintet ikusan előállítottak.

A találmány tárgyát képezik továbbá fruktozil-transzferáz aktivitásé fehérjék, azaz a találmány szerinti nukleinsav-zioáekulák által kódolt vagy találmány szerinti, eljárással kapható fruktozil-transzferázok, A találmány szerinti fruktozil-transzferázok előnyösen felhasználhatók inulín típusú polifruktózok előállítására. Szolgálhatják olyan antitestek előáll!sását is, amelyek felhasználhatók fruktozil-transzierázok kimutatására és/vagy tisztítására,

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban olyan nukleinsav-molekulák képezik, amelyek fruktozil-transzferázt kódolnak, és specifikusan hibrid!sálnak a találmány szerinti nukleinsavmolekuiákkai vagy azok fragmentumaival, ahol a hibridizáció a következő körülmények között történik; hibrídizáiás 50% formamidban, S x SSC, 5 x Denhardfc-o.Id.at, /0 mó nátrium-foszfát (pH 6,8}., 0,51 (tőm./térő. 0 ŰSA, 1% (töm./téré.) Sós, 0,1 mg/ml heríngsperma-DOS 42*G fcibridizáiási hőmérsékleten és a szűrő ezt követő mosása u, 5 x SSC/0,5% SDS-foen 60°C~O'n. Itt előnyösen legalább íö, főleg legalább 15 és különösen előnyösen legalább 50 nnkleotid hosszúságé oligonnkieotidőkről van szó. A találmány szerinti oligonnkieotidők felhasználhatók például POR reakcióban primerekként, hibridizációs próbákként vagy hasonlókként.

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban főleg inulin típusú polifruktózok előállítására szolgáló eljárások képezik, ahol a találmány szerinti gazdasejteket vagy az ezeket tartalmazó gazdaszervezeteket olyan körülmények között szaporítjuk, amely lehetővé feszi a találmány szerinti fruktozil-transzferáz kifejeződését, valamint polifruktóz szintézisét,

72,037/SE/SASi»Z

Ί» á tninlmary szerinti nukieinsav-moiekuiák rendelkezésre boosatasávni lehetővé vélt polífruktőzos, különösen murin típusúak élőéi Lírása géntechnológiai módszerekkel olyan szervezetekben, amely eddig hagyományos módszerekkel nem volt lehetséges. Ilyenformán tehát lehetővé vált a találmány szerinti nukleinsavmolekulák kifejezése baktériumokban, gombákban vagy növényi sejtekben a megfelelő fruktozil-transzferáz aktivitásának növelése vagy olyan sejtekbe történő bevezetése céljából, amelyek normális esetben nem fejezik ki nevezett enzimet. Legalább egy, találmány szerinti nukieinsav-molekuia kifejezésének vagy ráadásként történő kifejezésének köszönhetően a találmány szerinti gazdasejtek pol ifruktözt szintetizálnak, főleg inulin típusút. A találmány ogy másik tárgyát képezik tehát a főleg inuíin típusú polífruktözok, amelyek a találmány szerinti gazdssejtekböi, valamint a találmány szerinti növényekből, azok szaporítóanyagaibői és terméseiből nyerhetők.

A találmány tárgyát tehát főleg az inuíin típusú polifruktözok előállítása képezi, amely tartalmazza:

ái a találmány szerinti gazdasejt vagy ilyen sejtet tartalmazó gazdaszervezet tenyésztését olyan körülmények között, amely lehetővé teszi fruktozii-transzferáz előállítását és — adott esetben kívülről adagolt ~ szacharóz vagy ekvivalens szubsztrát inulin típusú polífruktőzzá történő reakcióját; és bi az így termelt polifruktóz kinyerését a tenyésztett gazdssejtekböi, gazdaszervezetekből vagy a tápoldatböl.

A gazdasejtek előnyösen növényi sejtek és a gazdaszervezetek előnyösen növények, Polifruktözok, főleg inulin típusúak nővé™

Ό.Ι V/SS *·».

*· <·* «··*<$

Λ Λ * * » * 4 * ♦*

X * 9 * > Ο .

<;* λ *·· ¢4- φ **» >' ;* nyékből történő előállítására szolgáló módszert írnak le példáéi o alábbiakban [Vegei, in: inaién and Inul i.n~ooufai.cing Crops,

Sl.sev.ier Science Pubiishers B.V. Amsterdam, A, Fuchs (ed.) SS-P5 :1995b .

A találmány egy másik tárgyát főleg az inulin típusé polifruktózok előállítására szolgáló in vitro eljárás képezi, amely tartalmazza:

a) szacharóz vagy ekvivalens szubsztráz érintkeztetését a találmány szerinti fruktozii-transzferázsai olyan körülmények kozott, amely lehetővé teszí a palitruktózzá történő átalakulást/ es

b) az ily módon kapott polifruktóz kinyerését.

A szacharózzal ekvivalens szubsztrát például a gazdasejt vagy enzim (ek) által szacharózzá alakítható- szubsztrát. A szacharózzal ekvivalens szubsztrát lehet olyan dí- vagy oligoszaoharid is, amelyet a találmány szerinti frnktozii-transzferár alternatív szubsztrátként fel tud használni. Egy példa ilyen szacharrdra a raffrnóz triszacharid. Szacharóz származék is felhasználható. A fent említett eljárással, kapott Írtul in előnyösen hosszúiáncn rnulin és DP >20, előnyösen OP >50, főleg OP >100 és különösen előnyösen OP >200 polímerizácios fokkal rendelkezik.

A találmány tárgyát képezi továbbá főleg inulín típusú polifruktóz előállítására irányuló eljárás, amely tartalmazza a polifruktóz kinyerését a fent leírt, találmány szerinti nővényekböl/növényi sejtekből és/vagy ilyen növények részeiből, Egy ilyen eljárás előnyösen tartalmazza a termesztett növények és/vagy ezen növények részeinek betakarítását a polifruktóz kie. orvsa p·*, 5»k- ***· «r«. .* * vonása -óvc ás különösen előnyben részesítjük a találmány szerinti. növényét termeszteset a betakarítás lépésé előtt- Polifruktbzok kivonására a növényekből vagy növényi részekből ismert a szakemberek számára és leírták például a következő irodalmakban ( Gíbson, Int. Sugár a. 96, 381-38? (19.94); Vogel, Etűd.

Plánt Sói. 3, Inulin and InoIin-OOntainiog Crops, 65-75 (1393)) .

Tehát a találmány tárgyát főleg olyan inulin típusú polizroktőzok képezik, amelyek megkaphatok a találmány szerint): gazdasejtekből vagy a zent leírt, találmány szerinti eljárással. Ez a poiifrnkfóz előnyösen felhasználható felületaktív anyagok élőéi iz lására, vizes rendszerek viszkozitásának növelésére, detergensként, szaszpendáiószerként, szedimentáciőt gyorsítóként és v í <·. m e g kő lésére v a g y komplexé iá sóra.

A találmány szerint.·., főleg Inulin típusú pollfruktőzt szintetizáló gazdasejtek felhasználhatók élelmiszer adalékként is.

Ez a felhasználás azért előnyös, mert a fruktánok pozitív hatásúak az egészségre [ soberfroid et al., oh Nutr. 128, 11-19 (1998); Kleesen et al., ám. J. Clin, Kutr. 85, 1397-1402 (1997); .

A találmány tárgyát képezi továbbá főleg inulin típusú poiifruktőz előállítására irányuló eljárás, amely azzal jellemezhető, hogy gomba fruktozii-transzferázt vagy gomba fruktözíl-transz™ férést kifejező gazdaszervezetet használunk polifruktőz előállítására. Előnyösen a találmány szerinti fruktozii-transzferázok vagy a találmány szerinti gazdasejtek alkalmazhatók. A találmány mutatja be először, hogy ilyen gomba fruktozil-transzferázok felhasználhatók inulin típusú polifruktözok előállítására.

r. os'? / SE ·»♦♦·« 4 4 Η Λ ♦ 4 * « «« »4« 4 «

X 4 «··» <♦ 4* »♦*

Végűi a találmány tárgyat képezi gomba fruktozli-transztatásak felhasználása főleg inulin típusú polifruktöz előállítására ,

Ezek és más megvalósítási tormák nyilvánosak és nyilvánvalóak a szakember számára és benne foglaltatnak a találmány leírásában és példáiban. További irodalom a fent leírt, a találmányban alkalmazható módszerek bármelyikéről, táptalajokról és felhasználásról hozzáférhető korábbi szakmai leírásokból, például könyvtárakból, például az elektronikus média felhasználásával.

Erre a célra hozzáférhetők adatbázisok, mint például az interneten a http:Z/www.ncbi.nim.nih.gov/BubHed/meói iné.html címen elérhető „hediine. További adatbázisok és címek ismertek a szakemberek számára, és megtalálhatók az interneten, például a http://www.lyocs.oom cím alatt. Biotechnológiai szabadalmak vagy szabadalmi bejelentések forrásainak és információinak áttekintését adja Berks [ TŐBTECB 12, 352-364 (1954)} .

As ábrák leírása

1. ábra: mutatja a pSX-asl összeállítását baktériumok transzformálására.

2. ábra: mutatja a. pllz-así plazmíd összeállítását élesztősejtek transzformálására.

3. ábra: matatja a pá7-asi összeállítását növényi sejtek transzformálására.

4. ábra: mutatja a p35-asl Összeállítását növények transzformálására .

5. ábra: mutatja, a »35~s3~asl összeállítását növények transzformálására.

~Z .ΟΙ’'/SS > Λ

4 * 0 4 4 0

C* X «+ X* X*

6, ábra: pSh-asl-gyei transzformált £. coli analízisét mutatja vékonyréteg kromatografiával, Az .1. sáv kontroll kísérletet mutat pBiuescript SK rnszertum nélküli vektorral. A 2. sáv olyan pasi piazmrdos kísérletet mutat, amelyben az asi kódoló régió nincs keretben a iaol génnel (2, sáv}. Ebben az esetben az asi kódoló régió transzlációja nem játszódik le a h-giükuroniPáshoz való fúzióként, hanem az endogén start kódon tó .1 kiindulva csökkent hatékonysággal halad. A 3-6. sávok a pSK-asl szerkezet különböző transz formátumaival végzett kísérleteket mutatnak. Miután a szaporodó baktériumok optikai denzifása elérte az OD,._0<r«

0,4 értéket, a tenyészeteket 100 mM IPTG-vei indukáltuk, 2 órás undokom: után a sejteket kinyertük és 50 mM nátrium-foszfátban (pH 6,0} .'Lizáitok. A fehérje kivonatokat 12 órán keresztül 600 md szacharózzal inkubáltuk 3? ’’C-οη. A vékonyréteg kromatográfiéhoz standardként I-késztózt (7,}, szacharózt (8 ,} és fruktózt (9.) alkalmaztunk külön-külön (7-9. sávok).

7. ábra: a pli2-asl (2. sávi vagy pll2~ssIL (3. sáv) piazmröot tartalmazó transzformált élesztősejtek vékonyréteg-kromatográfiás analízisét mutatja. A pil2-asIL vektor tartalmazza a spenót szacharóz transzporterének 5' vezér-szekvenciáját. Az 1, sáv nem-transztormáit élesztősejtekkei végzett kontroll kísérletet mutat. Fruktozil-transzé eráz. aktivitást mutattunk ki az élesztősejtokból származó fehérje kivonatokban. Standardként fruktózt (4. sáv), l-kesztoz, nisztóz és fruktozil-nisztőz keverékét (5. sáv) és szacharózt {6. sáv) alkalmaztunk.

3, ábra: a pAl-asi plazmidot tartalmazó növényi sejtek vékonyréteg kromatográfiás analízisét mutatja. Az I. sáv mutatna a * *

ρ.Α7 rnszertum nélküli vektorral (50 tg) történt transzformációt. A2 -1 , távok mutatják a pAÜ-asi vektorral (2. sav: 10 5. sav ug; 4, és 5, sav: 50 ug) történt transzformációt. Standardként l-kesztoz, nisztőz és fruktozil-nisztőz keverékét (0. sáv), szacharózt P. sáv) ás frak tózt <3. sáv) alkalmaztunk.

'Minden kísérlethez öööQöö protopiasztot használtunk fel. A protopiasztokat a transzformációt követően 2 napig 25 C-on ínkubáituk, azután kinyertük a fehérje kivonatot 50 oki nátriumfoszfátban {pH 6,0; _f amelyet 20 órán keresztül 28 ‘'C-on 500 mb szacharózzal Ínkubáltunk. A keverék l/10~es higítmányanak 4 síét használtuk fel.

9. ábra: a 35-asl szerkezettel transzformáit növények vékonyréteg kromatográfiás analízisét mutatja. 12 növényt választottunk ki véletlenszerűen. Mindegyikből 2Ό mg levél anyagot extraháltunk 200 ui vízben. A kivonat 4 sí-ét használtuk fel.

Standardként fruktözt (F sáv) , szacharózt (S sáv) és l-kesztöz, nisztőz és fruktozri-nisztóz keverékét (St sáv) alkalmaztuk.

10. ábra: a 35-33-asl szerkezettel transzformált növények vékonyréteg kromatográfiás analízisét mutatja. 1.2 növényt választottunk ki véletlenszerűen. Mindegyikből 20 mg levél anyagot extraháltunk 200 pl vízben. A kivonat 4 pi-ét használtuk fel.

Standardként fruktözt (F sáv), szacharózt (S sáv) és I-kesztőz, nisztőz és fruktoz il--nisztóz keverékét (St sáv) alkalmaztuk.

11. ábra: fenii-szuperéz oszlop „400-0 mM ananőnium-szulfát gradiens eiuátumát mutatja, amelyet fruktozii-transzferázban feldúsított Aspergillus sydosvi -bői származó fehérje kivonattal (S sav) töltöttünk fel. Az M jelű sávokban méret markert küiöním. o'.n/8E

3S

Φ * X « tettünk ei. A. sarker fehérjék molekulatömegét jobboldalon muharjuk küaiton-ban.

A találmányt a következe példákkal szemléltetjük.

Aspergdllus sydowi-feól száosassó afl-SST tisztítása

Aspergliius sydovi IÁM 2544 törzset szaporítottunk 2% malátukivonatot, 0,51 peptont és 2% szacharózt tartalmazó tápközegben. A tápközeget 2% agat hozzáadásával szilárdítottuk. Spórákat szőlész téttünk és a tenyészetet 25 ⁱ³C~on tartottuk, amíg a lemezek teljesen megszáradtak. Konidiumckat gyűjtöttünk a Lemezekről, és 50 mM nátrium-foszfátban (pH a,0) szuszpentíáítűk azokat. A konídiumok Izzása „Erench Pressere Ceil készüléken való háromszori átvezetéssel történt.

Tisztításhoz a homogenazátumot Sepharose Q oszlopon abszorbeáltuk,. A megkötött fehérjét 0-1000 mM SCI lineáris gradiensével· elváltuk. Szaoharoíitikusan aktív frakciókat 500 és 700 mM

KC1 között kaptunk. Ezeket a frakciókat összegyűjtöttük és nátrium-foszfáttal (pH 6,0)- szemben díalizáituk. A fehérje feldúsitásához újból adssorbeáituk Sepharose Q oszlopon (ágytérfogat 2 mi; és 10- ml térfogatban előéltük. Az citátumot 2 M ammőnium-szulfátra állítottuk be, és abszorbeáltuk fenil-szuperözon. 2 M ammönium-szulfáttal, 100 mM nátrium-fosztáttai (pH 7,0) történt mosás után végeztünk elúciót 2-0 M ammónium-szül fát lineáris gradiensével. Aktív frakciókat 400-0 mM ammónium-szuifát eiucíös gradiensnél kaptunk. A kapott fehérje keveréket 3D5~?AGE~veI analizáltuk. Az eredményt a 11. ábrán mutatjuk be. Szaoha.roό ,«.m/sz « > XX XX X Φ Φ Φ *: * φ χ * «

X φφ φφφ «φφ * χ * * » Φ *»φ» φ» φ>· *# üti kus- aktivitás hasonló feidüsuiásat ~ de ásoergliius sydo;<i vicelA.umáve 1 - mór leírták Muramatsu és Nakakuki ( Biosci.

Biotech. Biochem. 59, 208-212 Π.905)] . A tisztítás nem. eredményezett homogén fehérjét, amely alkalmas lett volna például szektánál ásra.

Fruktozii-transzferáz azonosítására félig natív poliakrilamid gélt használtunk, amelyre a fenii~szuperöz oszlop eluátúrnának 10 ug fehérjéjét 0,12 SOS, 10¾ glicerin, 5Ö mM Tris, pH 6,8 keverékében vittük fel. Eiektroforézis után a gélt újra puftetőitek háromszor 10 percig 50 mM nátrium-foszfát (pH 6,0} es 11

Triton x 100 keverékében és azután 30 percig Inkubáltuk 50 mM nátrium-foszfát (pH 6,0), 13 Triton x 100 és 500 mM szacharóz keverékében. Ezután a gélt 0,11 (w/v) 2,3,5-tr.ifeni.i-tetraz.ólium-kiorid (TTC) és 0,5 M iíaOh keverékében forraltuk. Ily módon a

TTC vörös színű formazánná alakul a redukáló cukorral, A 11. ábrán megjelölt fehérje sáv a fehérje szacbarolitikus aktivitásának köszönhetően színes foltot eredményezett, amely ilyenformán

Aspergillus sydovi fruktozil-transzferázként azonosítható. A sávot izoláltuk a preparatív gélből, a fehérjét előéltük a gélből és felhasználtuk szekvenáláshoz. Mivel a fehérje N-terminálisan blokkolt, Ly sC és AspN endopeptidázokkai végeztünk has Írásokat. A peptideket BBLC-vei tisztítottuk és Edmann-féie szekvenáiasnak vetettük alá. A következő szekvenciákat kaptuk:

LysC: VLFSTSQASBK (3. számú szekvencia)

AspNb BD1VTYB. (4. számú szekvencia)

DPYYFQNHEV (5, számú szekvencia)

A. gén klónozásához oDOS könyvtárat hoztunk létre Lambd-a lap Ό.037/SS *χ

ΣΙ tagban (Stratagene, Heideiberg). Mivel RNS preparálása a konidiumokboi nem volt Lehetséges, a rzice L inmbo 1 preparáltunk RNS-t Logemann és munkatársai leírása [ Anal- Biochem. 163, 16-20 (198?) j szerint. PoliA’-RNS-t kaptunk a polyATraet System, segítségévei (Rromega., Hadi són, USA}. A cöNS szintézisét és Lombba Lap II-be történő klónozásét a gyártó (Stratagene, Heideiberg) utasításai szerint végeztük el. A fehérje szekvenciáknak megfelelően a következő primereket terveztük;

asp 19 lefelé irányuló primer:

ö' --GAYGAYYTNGTNACNTAyMG (6. számú szekvenoia) aspl9 felfelé irányuló primer:

5' -CKRTANGTNAGNARRTCRTC (7. számú szekvenoia) aspol lefelé irányuló primer;

5' -GTNTTYCARAAYCAYGARG <8. számú szekvenoia) asp3I felfelé irányuló primer;

'5' -TGRTTYTGRAANACRTANGG (9. számú szekvenoia) lysl felfelé irányuló primer:

5' -GCYTGNSNNGTNShNGG <10. számú szekvencia)

PCR reakcióban a teljes eDNS könyvtárral, mint mátrixszal és az asp!9 le/asp3i fel primer kombinációval (anneaiing hőmérséklet 4 0 ’^;C) egy körülbelül 350: bp DNS fragmentumot kaptunk. Nevezett fragmentumot radioaktív jelölés (Megaprime Kit, Boehringer Mannheim, Han.nheim) után felhasználtuk a eDNS könyvtár szűrésére. A kapott klánokat ín vivő kivágás után pSiuescrípt plazmátokként ampli.fikáitűk (megsokszoroztuk) . A eDNS inszertumokat restrikciós hasítás után összehasonlótott.uk és egy klón inszer··· turnáit teljes egészében szekvenáltuk. A eDNS inszertum szervenműé i,: . számi.; szekvenciában mutatjuk be, A belőle levezenett feherje szekvenciája a 2- száma szekvencia.

Gomba fruktozil-transzferáxok kódoló régióit tartalmazó szerkezetek előállítása különböző prokariőta és eukarióta gazdasejtek transzformációjához

Különböző gazdasejtek gomba fruktozil-franszferázza1 történő transz formációjához számos különböző szerkezetet készítettünk molekuláris biológiai standard technikák szerint (Sambrook et al., Moleeular Clonin-g, A Lafooratory Manna! 2^,i,! ed., Cob.i Spring Karbot haboratory Press,· Cold Spring Karbor, NY (1989;]. A szerkezeteket az 1-5. ábrákon mutatjuk be. Az egyes szerkezeteket specifikusan a következők szerint készítettük el:

oóK-asl: ez pasi származéka, amelyet Aspergriius s-ycfowí cDNS könyvtárának tanoda lap II klánjából kaptunk in vivő kivágásként. pasi tartalmazza a ctKS ScoRI/XhoI fragmentumát. p3K-asl-t pasl-ből kapjuk BamKI és Smal hasítással, feltöltve a BamKI tapados végbe és taligáivá a vektort. Az asl kódoló régiója 4 nukieotid iának eltávolításával átkapcsol a lacZ gén leolvasású, keretére (1. ábra).

pll2~aal: a pll2AlKE vektorba (. Eiesmeier et al.., EM30 J. 11, 4705--4713 (1.992)]., amelyet BamHl-gyel hasítottunk, feltöltöttünk és azután boti-gyei hasítottunk, pasl-ből származó asl fragmentumot íAsp7l-3~ca.I hasítva, feltöltve és Notl-gyel hasítva; klónoztunk (2. ábra).

pA7~a:sl: pA7~böl hoztuk létre pasi kódoló régiójának - mint ovii· *· χ.χ χχ * ♦ * * » * -* ♦' * »-«- *·#>* »'«χ *«« ♦ * X X ♦ « χ >««» Ί»« ♦♦♦ «β» «Φ>

urnaI/.Asp? 18 fragmentumnak, amelynek fapados végeit feizolzöttük - a vektor feltöltött Acp718 és ónul restrrkciós hasítasz helyeire történő klónozásával. A fragmentum helyes orientációját hindin restrikciós enzimes hasítással erősítettük meg, amely egy körülbelül 1900 bp fragmentumot eredményezett. pA7 a pUCIS származéka, amely EcoRI és Asp718 hasítási helyek között a karfiol mozaikvirus 358 RNS promőterét íüaMV 528 bp; 3909--74.37 . nukleotidok) [ Iránok et al., Gall 21, 295-294 (1980);, valamint

5ph.I és Hi.nd.III kozott az Agrobacterium tumefaciens oktopin szintetáz gén terminátorát ( Gielen et ai,, EMBO <J. 3, 835-846 (1934)1 tartalmazza (8. ábra).

p35-asi: pűinAR-böl hoztuk létre a pasi-hői származó asi fragmentumnak {Asp'718/NotI-gyel hasítva és feltöltve) egy olyan vektorba történő íigálásával, amelyet előzőleg Smal-gyel hasítottunk. pBinAR pBinlü származéka (Bevan, Noel, Acid Rés. 12, 8711 (1984)), amely HooRI és Asp7i8 között a karfiol mozaikvirus 355 RNS promőterét (Ga-M7 523 bp; 6909-7437. nukleotidok), valamint Sphi és hindin között az Agrobacterium tumoráéiens oktopin szintetáz gén terminátorát [Gielen et ai.,(1984)( tartalmazza.

(4. ábra) .

puo-So-asl: ezt két lépésben klónoztuk . Először pasl-ből 8amHI/Asp718 fragmentumot — amelynek fapados végeit T4 polimerászai fel. tői.töt tők -- a 53 vektorba ki ónoz tűk, amelyet előzőleg BamHI-gyel hasítottunk és azután feltöltöttünk. így kaptuk pS3asl-et. A pS3 vektor tartalmazza a patatin gén 533 PCR fragmentumát [Rosahi et al., Mól. Gén, Génét, 203, 214-220 (1986), amely tartalmazza a 725-1400, nukelotidokat. A PCR fragmentumnak a . í; T? .-·· ·>£ *4*» *

s van egy Asp'718 restrikciós helye iGGTACCí a 725. unkLeótidná1,

UGG szekvencu.a)o az 1400. nufcieotidnái, amely az 1305, és 1400, nukleot 1 dokkal, kombinálva Hcol restrikciós helyet ad. A PCR fragmentum az Asp71S és a Smal restrikciós hely közé van beszúrva íinszertum). pSa-asi-böi Sacl(feltöltött)/Xbal fragmentumot készítettünk, amely tartalmazza a fúziós Sd-asl-et. Ezt a fragmentumot klónoztuk a pBinAR Sraal és Xba.I restrikciós helyei közé ·: 5 . ábra),

A megfelelő gazdaszervezetet standard technikákkal transzformáltuk. 3. coli-z transzformáltunk Hanatan módszere szerzet íj, dől. Bioi. 166, 557-530 (1933)3 , dsccheromyces cerevisiae-t transzformáltunk Dohmen és munkatársai módszere szerint i Yeast

7, 691-602 (1001)) , dohány protoplasztokban átmeneti génexpresszrót végeztünk Damm és hilimitzer módszere szerint idol.

Gén, Génét. 213, 15-20 (1989)) és burgonya növények stabil zransziormácrögát Dietze és munkatársai módszere szerint [in:

Potrykus, I. and G. Spangenberg (ed.) Gene transfer to piants xx ii a 3 64. (1905), 24-20, Soringer-veriag Berlin, Germany; NY, bee

York USA, ISBN 3-543-58405-4) ,

Gomba frukborii-transzferált kifejerő transzgeníkus gardasejtek vagy gazdaszervesetek fruktozil-transzferáz aktivitásának analízise inai in in vivő szintézise

Gomba fraktozil-transzferázt kifejező transzganikus gazdasejteket vagy gazdaszervezeteket tenyésztettünk 2% szacharózzal C. OAs:

Οφ φφ ♦·»·*·♦ φ φ * φ φ φ * φ » φφ «.·»« φφφ .#».φ * * X 9 4 9 » «»·♦♦ φ» *»* X* ** kiegészített tapköregben kiveve, hu növényi szövetről volt szó.

Macáér;.céla coli öli törzs, mmt gazdaszervezet esetében az 2á coli szacharóz perneszt ködeié funkciós escb gént vezettük be szerkezetként a pACfClSf vektorba. Seceharomvess oereviaaae esetében a spenót szacharóz transzportér génjét vezettük be a pl· 12A1NE vektorba ; R.iesmeier et al·., ΈΜΒΟ J. 11, 470.5-4713 (1392)} . A sejteket légiébe 24 órán keresztül· szacharóz jelenléteken tenyésztettek, szatén kinyertük és 50 mM natzmm-foszfátban (pH 6,0} történt mosás áfán feltártak.

Gomba 1 ruktozi)-tranazferázt kifejező növényeket talajban neveltünk. Négy hét után leveleket és más szövetmintákat gyűjtöttünk és 1 ml viz/g icits tömeg kivonatot készi tettenk oldhatatlan poli(viníi-pirroiidon} jelenlétében, a sejttörmeléket senor i f u g á 1. ássa .1. t á ve .111 o 11 u k el.

Minden egyes kivonatból 4 pl-t vittünk fai szíiikagéire precast DC filmekre (3ch.Iei.cher and Schüii, Dassei, Cermany) és kétszer kifejlesztettük aceton/víz 87:13 arányú eiegyáben. A fruktozil. maradékokra történő vizsgálatot karbamíd - foszfofsov reagenssel végeztük ( Röber et al ,, elanta 199, 528-536 (1992)1 .

Ijíü-Xirt ín vibro

Gomba fraktozil-transzférést kifejező sejteket tártunk fel SO mM nátrium-foszfát (pH 0,0}, 50 pM PMSF, 1 mM DIT, 10% (v/vj efiléngiikol keverékében. A sejtkivonatokat 50 mM nátriumfoszfát (pH 0,0), 500 mM szacharóz, 50 uM PMSF, 1 mM DTT, 0,02% (w/v; MahG, 10% (v/v) etüénglfkoi keverékében inkubáituk 12 órán keresztül 25 °C-on. A keveréket Xí 10; arányban vízzel higitoftuk, azután 4 ui-t vittünk fel pre-east szilikagéi DC filmekre c/ova *« (Ectleícher and Schüii, Dassei, Germany; és kétszer kafe;lesztettük aceton/viz 87/13 a legyében , A fruktozii maradékokra történő: vizsgálatot karbamid/foszforsav reagenssel végeztük [ köbér et al., (1992)1 .

Az. egyes analízisek eredményeit a 6-10,. ábrákon mutatjuk be. Az ábrák sziiikagél filmeket mutatnak az inkubációs keverékek vagy sejthomogénizátumok vékonyréteg kromatográfiáját követően ez fruktóz tartalmú cukorral meg testve. Az aceton/viz (87/13) eiegyében kifejlesztett vékonyréteg kromatográfia segítségévei méret szerint elkülönülnek a mono-, oiigo- és polimer szénhidrátok. A fruktóz tovább vándorol, mint a szacharóz, amely viszont tovább vándorol a kesztóznái stb. A DP >7 oligomerek nem különülnek el és a felvitel helyén maradnak.

A 6, ábrán látható, hogy pSluescript vektorral transzformált A. coli klánok inszextum nélkül nem képesek a szacharóz átalakításéra il. sáv), míg a pasi plazmáddal transzformáltak a kesztőz triszacharidőt szintetizálják. A pSK-asl plazmáddal transzformált kiónok szintén képesek nagyobb oiigomerek szintézisére í36. sávok). Ezzel egyidőben a fruktóz maradékok vízre szállítódnak és fruktóz keletkezik, Nevezett átalakulást az Aspergi.i.ius sydovi-bói származó SFT katalizálja. A 7. ábra azt mutatja, hogy a pl12-as1 plazmáddal transzformáit élesztők fehérje kivonatai fruktánt szintetizálhatnak. Ezekben az élesztőkben nagyobb volt a frakiozil-transzferáz aktivitás, Mint a 112-aslL szerkezettel transzformáltakban. Az utóbbi - a kísérlet során rendelkezésre álló idő alatt elért kisebb fruktozii-transzfaráz aktivitásnak köszönhetően — csak a triszachaxidőt tudja szintetizálni. A

·. :.U n ** φφ φφ*χ »χ. φφ ♦ * * * X Φ φ φ XX *χ·χ X** ΦΧφ

Φ Φ X X X φ Φ

X ΦΦ *χ φφ* «Μ- Φ* szintetizált fruktánok mérete a reakció idejétől és a fruktoziizranszferáz aktivitástól függ. A 8, ábra azt mutatja, hegy a transzformált dohány protorlasztok kivonatában szintetizált fruktán mérete a megadott reakcióidőnél az elért fruktozii•transzferáz aktivitás nagyságától függ, amely viszont a transztormáit pA'?~asi plazmid mennyiségének függvénye. A 3-5. sávokban látható, hogy DD >7 oiigo- és polimerek szintet!záródtak, amelyek kromarográ£iásan nem vándorolnak ei a felvitel helyűről. Ugyanez bizonyult igaznak stabilan transzformáit növényekből származó növényi kivonatokra, ahogyan az a 9. és 10. ábrán látható.

*» *4 4X»« 44 »:_v * * 4 X * * *4 *4 444 4 44 XX* * 4 4 4 4 X «

4* XX 4« 4 ** 4* (SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)

SEQUENCE LIST1NG <110> bax~Placek-Geaeilechaft zűr Corderung dér Wissenachattec c.V.

<t20> Nucieic acid mciecuies encoding enzymes 'fo.av.ing fmctosyltransferase acti.vi.ty, and éheit ase <I30> C 1056 PCT <14Q>

<I41>

<16O> 10 <17-0> Patent In Ver. 2.1 <21O> 1 <211> 2197 <2!.2> DNA <213> Aapergillés s-.ydowi <400> 1 gaatteggca egaggcegce atgaagctcc cctcttcact ggacattctt ctcgccagac 60 ageeggttgg cggtaeégag gtegactacg actcaccacc. ccctgaccfcg acgacgcfccc 120 ctgagaactc gctgtfccgag aecfcggagac ceaagatcea cgttetgccc ecaaatggce 180 aaatcgggga cccatgegct cattacaatg acccggcgac gggtttgttc catgtcggat 240 tcctecacaa tggcaeegge a tt fcccagcg te tacaccga tgacctggfcg acctategtg 300 atatcaatcc taacggcggc tacattattg ttgcfeggfcgg ccccaatgac cccgaagccg 360 tetttgatgg atetgteate cccagcggaa fccgatgacct gcccacgctc ctfcfcafcaccfc 420 ctgtgaeatc gtfcgccaafcc cactggaotc taccttatac ccccggaagc gagactcagt 480 cactggccgt aagtgaegat ggtggtcaec: acttcgafaa gcttgaccga ggeceagtea 540 ttccacttcc gecagafcgga etegatgtta cagccttccg tgacccfctat gtatfcecaga 600 aecacgaggt agacgaagfct accggtagtg aoccagafcac atggtatgcc gccatatccg· 660 ggggtgtcca tgatgtaggg cccggaatet ttctctaccg caaceaagac tcctcctfctg 720 agaactggga atatetagge gagtggtggc aagaacccgc caactegact tggggtgacg 780 gcacttgggc caaacgctgg ggctacaatfc fcegaaaccgg caacgtcttc tetetegate 890 gagaagggta caacgttgac ggccacacgt ttatgactat tggagttgag ggtgeataeg 000 cgcccatcca gcceteggtt acatctatgc atgecatget gtgggcagcg ggaaatgttt 960 cctcagagaa tggcgaaaac gtfcaecttca egeettatafc ggccggtgcfc ttggactggg 1020 gcatggecgc atacgccggt gctggaaagg tfcefcacccag caeateteag gcfctofcgaga 1080 agagtggage gcccgaccgc ttcatctcgt gggtttggct taeaggtgat gaattcggtg 1140 ctgccgctgg a.tttcctgct gcccagcagg ggtggcagaa tactetcctg cttccgcgtg 1200 aattgagtat aeaeaeaatc cagaatgtgg tcgacaacga acteatccae gagactgcat 1260 ectggcgcgt ggcagaacat ggeggegaga ggagatctgg tggtgtcgag ctggagacae 1320 fcgggaateaa éaétgcgagg gagacctacg atgcaatcgt cfccttcfcggg aoctcgtcfcg 1380 aggagccttc gcgagacatt aatgaatccg geaeeatéec atttgagegc tcgcccacta 1440 gcagqtfcctt cgcccttgaa gceeaaatct ccttccceca gtetgegega gactcggaag 1500 éccagtccgg atttcaaatc ettgettetg aactcgagtg gacgacgafcc tattatcagt 1560 tétegaatga gtcgattgte attgaccgta accacacaag tgctgcgtcc gagactacac 1620 ctggtctcgg tactgtgact gagtctggcc gfateegget tttegatate gogggtggtt 1680 gcgatcatga tggacatggc ggccacgatg gcggcaacga tgatcaccac aaeggtgacg 1740 gtgatcatag eggtgaeggr. gaccacaatg acgatgatga ccataacgtc gaeggegatg 1800 acaaggagcg tgetegttae eaaaagegag atggeccttg cgataaagae catgataagg 1860 ttgagacatt ggatctcace attgtegteg ataactcagt. gettgaagtt taegccaact 1020 cacgatttgt ggtgtcgaoc tgggttcggc ctéggtacac caatteaaeg gagatteget 1980 veres·;:

tcttocaoaa cggcgagggt gaggtcagct ttgacaacat tgcggctxat. gatggtctgt 2040 atgatgoata tooggaoagg gacaaetgaa gatttcactg gttgatotat. tagcttgoga 2100 gotataaaga. Lggogataat tagtagattt aatccaatga attacctgcc gagattgcag 2180 etttattett aeaaaaaaaa aaaaaaaaaa aotogag 210?

<2iO> 2 <21 i> 032 <212> BRT <213> Aspergiiius sydoei <400> 2

Met 1

Lys

Lee

Pro

Ser 5

Se r

Len

Asp

1 le

Leu 10

Leu

Alá

Arg

Gin

Aia 15

Va 1

ο t y

Gly

Th :·

Gin 2G

Va 1

Asp

Tyr

Asp

Ser 25

Pro

Pro

Pro

Asp

Le a 30

Thr

Thr

Lee

Pro

G1 u

Asn

Ser

Leu

Phe

Glu

Thr

Trp

Arg

Pro

LyS

lie

His

Val

3 5

40

4 5

Lee

Pro

P ro

Asn

Gly

Gin

lie

Gly

Asp

Pro

C y s

Aia

His

Tyr

A s n

Asp

50

55

60

Pro

Alá

Thr

Gly

Leu

Phe

His

Val

Gly

Phe

Leu

His

Asn

Gly

Th r

G1 y

65

70

75

80

lie

Ser

Ser

Val

Τρι-

Thr

Asp

Asp

Leu

Val

Thr

Tyr

Arg

A s ρ

1 le

Asn

Ο 5

00

95

Pro

Asn

Gly

Gly

Tyr

lie

lie

Val

Alá

Gly

Gly

Pro

Asn

Asp

Pro

G r u

100

105

110

Alá

Val

Phe

Asp

Gly

Ser

Val

lie

Pro

Sor

Gly

lie

Asp

Asp

Leu

Pro

115

120

125

Thr

Lee

Le u

Tyr

Thr

Ssr

val

Thr

Ser

Leu

Pro

Lie

His

Trp

Thr

Leu

130

135

140

Pro

Tyr

Thr

Pro

Gly

Ser

Gitt

Thr

Gin

Se r

Leu

Aia

Val

Ser

Asp

Asp

145

150

155

160

Gly

o .1 y

His

His

Phe

Asp

Lys

Leu

Asp

Arg

G1 y

Pro

Val

ile

Pro

Leu

165

17 0

17 5

Pro

Pro

Asp

Gly

Lee

Asp

Val

Thr

Alá

Phe

Arg

Asp

Pro

Tyr

Val

Phe

ISO

135

190

Gin

Asn

His

Gin

va 1

Asp

Glu

Val.

Thr

Gly

Ser

Asp

Pro

Asp

Thr

Trp

135

200

205

Tyr

Alá

Aia

lie

Ser

Gly

e .t. y

Val

His

.Asp

Val

Gly

Pro

Gly

Ile

Phe

210

215

220

Lee

Tyr

Arg

As n

üi n

Asp

Ser

Ser

Pite

Glu

Asn

Trp

Gin

Tyr

Leu

oly

225

230

235

240

•?a .03

? 7 SS

** KX *«*·* N« ♦' * * V » X ·* X * *-K«r * * ♦ 9 tt * tt **** ».* X»* «* X* ’ ·. ; £*> -- ·’3 ·· t; ? i, .. .

24':

Ara Tru tt·' “ O f·'. i ;3. M .3 Π U *3 £

Thr

Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly Mis Thr Phe Met 275 2SO 235

Val Glu Glv Aia Tvr Alá Pro lle Gin Pro Ser Val Thr Ser Met His non ' ?95

Mer tan

Alá

310

Gly Asn Val Ser Ser Gin 315

Asn ·*( x\

Val Thr Phe Thr Pro Tvr Met Alá Giy Alá tea Asp Tro Glv Met nia Tvr Aia Giv Aia Glv uv

330

Len Pro Ser 34 5 k J 3:

*T^ í»\ <a >Y* z\ >·· ? ' } «·\ A 1 κ · : Γ χ Λ4 κ \.í 1 : : Λ l.<4

Glv Alá Pro Asp Arg Phe Ile Ser Trp Vei Trp Lee Thr o

Giv

Phe Glv Alá Alá Alá Giy Phe Pro Aia Aia

i. V

Or neu neu 2 on a / a

Leu

Pro Ara

3S0 ílu Leu Ser '< o 3 : 1 $a>.

400

Gin Asn Val Val Asp Asn Glu Leu ile His Glu Thr Alá Ser Trp

/] A Λ 1 Λ Λ ί £ ν χ3 ··: λ κ? 4 s?

ÍV1S

4? η

Glv Glu Arq Arq Se·· kíi’/' vv.íV V val Gi:u Leu <0 :l '·4 χ v '^j ·~ y

Τ5

Ile Asn lle Aia Arg Gin Thr Tvr Asp Aia lle Val

440

Phe Glu Glu Pro Ser Ara Asp lle Asn Glu Ser i« VJ

Pro Phe Glu Arg a 7h

Ser Pro Thr Ser Arg Phe Phe

Aia teu giu

485

Gin ile te u A1a se:

Ser Alá Arg Asp Ser 4 50 lu Leu Giu Trp Thr 505 <τ t a ve. :

:

- -t .·\ ? Λ V se;

a <v bér v ;

Ile Val Ile Asp Arg Asn ni a

2./U

5

51u Thr Thr Pro Gly Leu Glv Thr Val Thr Glu Ser Glv Ars r i y •s. s

* 4 <« 4*

* ♦ 4** 5

lle 5 4 3

Arg

Le·.;

Phe

Asp

lle 550

Aia

Ό i y

Giy

Gys

Asp 555

His

Asp

Giy

H is

G1 y 560

<.! i 7

His

Asp

Giy

Gly 585

Asn

Asp

Asp

ASp

His 570

Asn

Giy

Asp

Giy

Asp 575

Kis

Ser

Gly

Asp

Gly 580

Asp

Kis

Asn.

Asp

Asp 535

Asp

Asp

His

Asn

Vai 590

Asp

Giy

Asp

Asp

.evs 395

Glu

Arg

Aia

Lrg

Tyr 500

Gin

Lys

Arg

Asp

Giy 605

Pre

Gys

Asp

Lys

Asp 610

Kis

Asp

Lys

Vei

G la 315

Thr

Leu

Asp

Leu

Thr 620

lle

Va i

Vai

Asp

Asn

Ser

Val

Leu

Glu

Val 630

Tyr

Aia

Asn

Ser

Arg 635

Phe

Val

Vai

Ser

Thr 69 0

Trp

Val

Arg

Pro

Trp 64 5

Tyr

Thr

Asn

Ser

Thr 6 5 0

Glu

lle

Arg

Phe

Phe 635

Kis

Aí; fi

Gly

Glu

G r y 6 ή 0

Glu

Vai

Ser

Phe

Asp 665

Asn

lle

Alá

Vai

His 670

Asp

G iy

Leu

Tyr

Asp

Aia

Tyr

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

675 680 <210> 3 <2il> 11 <212> PÉT <213> Aspergilius sydowi <900> 3

Val Leu Pro Ser Thr Ser Gin Alá Ser Glu Lvs 1 5 10 <2I0> 4 <21i> 7 <212> PRT <213> Aspergilius sydowi <400> 4

Asn Ase Leu Vai Thr Tvr Arg 1 5
<210> 5 <2Ü> 10 <212> PRT <213.> Aspergrl.ius	sydewr

-US / SE *· χΖ.. * <<00> .5

Asp Pro Tyr val Phe Gin Asn His Glu. Var 1 5 10 <21ö> β <210 20 <2f2> DMA <213> Artificiai sequence <220>

<223> Oascripticn of the artificiai sequence: artificiai seqoence <400> 8 gaygayytng tnacntayrag <210> 7 <2il> 20 <212> DMA <213> A.rti.ficia.1 sequence <220>

<223> Doscripticn of the artificiai sequsnce: artificiai sequence <400> 7 ckrtangtna cnarrtcrtc <210> 8 <21O 10 <212> 7HA <213> Artificiai sequence <220 <223> Description of the artificiai seguence: artificiai sequence <400 8 gtnttycara aycaygsrg <210 9 <21I> 20 <212> DMA <233> Artificiai sequence <220>

<223> Description of the artificiai sequence: artificiai sequence <4 0 0> 9 tgrttytgra anacrtangg

Ό . Ό /2·;

Φφ 04 »4 *«. Φφ

Φ ΑΧ * Φ * 9 φ

Φ ΦΦ ΦΧφ +φτφ χχ« * * φ Φ Φ * $

Φ**» χχ χχ* 04 -00

i. ·

'') ?

' 7 '7 V.

ueserxpt.

sequencs on ot the artitxcxax segnence

Ví~ * ·ί* * Λ~» Α» Ο- Λ- -c Ο azno'-s ί η

Λ k.' V··^ Φ· 'ν' qcytanawηg h nswngg

Claims (26)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Fruktozil-transzferázt kódoló nukleinsav-molekuia, amely: a? a 2. számú szekvenciával megadott aminosav-szekvenciát tartalmazd fehérjét kódoló nukleinsav-moiekuiák;

   b; a kódoló régiónak az 1. számé szekvenciával megadott nukleotid-szekvenoiáját tartalmazó nukleinsav-molekulák vagy egy megfelelő r 1 bon u k 1 eo fc i d —s 2·® k ven c i a;

   cl egy a) vagy b) pontban említett nukleinsav-molekuia komplementer szálával hibridizálö és az a} vagy b) pontban említett nukleinsav-molekuiával legalább 60%-ban azonos nukleinsavmole-kulák; és

   d) olyan nukleinsav-molekulák, amelyek nukleotid-szekvenciája a genetikai köd degeneráltsága miatt eltérő egy o) pontban említett nuklelnsav-molekuláétól;

   és ezekkel komplementer nukleinsav-molekulák által alkotott csoportból kiválasztott.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti ntkisinsav-moiekuia, amely DNS- vagy RNS-molekola.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsav-molekuia, amely egy gombából származó polipeptidet kódol.
4. 4. A 3. igénypont szerinti nukleinsav-molekuia, ahol a gomba az Aspe.rg.Xi.l'U.s nemzetségből való.
5. 5. Vektor, amely egy 1-4... igénypontok bármelyike szerinti nnkieinsav-molekulát tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti vektor, ahol a nukleinsav-molekula működőképesen kapcsolódik olyan. szabályozó elemekkel, amelyek biztosítják a transzkripciót és egy transzlatálható RNS szintézisét prokarióta és/vagy eukariőta sejtekben.

   72.3O? /Sí:Zi'Aóip2 κο
7. 7. Α 6. igénypont szerinti vektor, ahol a nukleinsav-rnolekula egy olyan régiót tartalmaz, amely agy olyan szignál-szekvenciát kódol, amely a fruktozii-transzieráz intra- vagy extracelluláris lokalizációját befolyásolja.
8. 8. Gazdasejt, amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-moíekaiát vagy egy 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz, ahol a nufcleinsav-moiekuia a gazdasejtre vonatkoztatva heterológ.
9. 9. A 8. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy bakteriális vagy gombasejt.

   lö, Növényi sejt, amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukieinsav-moleknlát vagy egy 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz, ahol a nokleinsav-moleknla a növényi sejtre vonatkoztatva heterológ.
10. 11. Eljárás növény előállítására, ahol

    a) egy növényi sejtet genetikailag módosítunk egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukíeinsav-molekula és/vagy egy 5-7, igénypontok bármelyike szerinti vektor bevitelével, ahol a nukieinsav-moiekuia a. sejtre vonatkoztatva heterológ; és

    b) egy sejtből egy növényt regenerálunk; és adott esetben

    c) a fo}· szerinti növényből további növényeket hozunk létre.
11. 12. Növény, amely a lön igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz.
12. 13. A 12. igénypont szerinti növény, amely haszonnövény.
13. 14. Egy 12. vagy 13. igénypont szerinti növény szaporítóanyaga, ahol a szaporítóanyag a 10. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz,
14. 15. Egy 12. vagy 13. igénypont szerinti növény betakarítható növényi részei, ahol a növényi részek a IC. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaznak.

    75: _v 0:2?

    φ

    **·* >5 $3
15. 16. Állati eledel és/vagy élelmiszer, amely a 15, igénypont szerinti betakarítható növényi részeket tartalmaz.
16. 17. Eljárás a 8, vagy 9, igénypont szerinti gazdasejtek előállítására, ahol alkalmas sejteket egy '1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-molekulával vagy egy 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektorral transzformálunk.
17. 18. Eljárás fruktozil-transzferáz előállítására, amelynek során egy 8. vagy 8, igénypont szerinti gazdasejtet vagy egy 10. igénypont szerinti növényi sejtet olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek /evezővé teszik a fruktozil-transzferáz szintézisét, és a fruktozil-transzferázt eiküü.őnit jak a tenyésztett sejtekből és/vagy a tápk.özegből.
18. 19. Fruktozil-transzferáz, amelyet egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-moiekuia kódol vagy a 18. igénypont szerinti eljárással nyerhető.
19. 20. Nukieínsav-molekuia, amely egy fruktozii-transzferázt kódol, és amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulával vagy annak komplementer szálával specifikusan hibridizál, ahol a hibridizáció a következő körülmények, között történik;

    hibrídizáiás 50% formamidban, 5 x ssc, 5 x Denhardt-oldat, 40 női nátrium-foszfát (pH 6,8} , Cg 5% (töm,/térf,} BSA, 1% (tőm./térf.') SOS, 0,1 mg/ml heríngsperma-DNS 42*C hibridizációs hőmérsékleten és a szűrő ezt kővető mosása 0,5 x SSC/0., 5% SDS-foen, δΟ'Χ-οη.
20. 21. Eljárás polifruktóz előállítására, amely magában foglalja; a). egy 8. vagy 9, igénypont szerinti gazdasejt vagy ilyen sejtet tartalmazó gazdaszervezet tenyésztését olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik fruktozil-transzferáz termelését és adott esetben kívülről hozzáadott szacharóz vagy ekvivalens szubsztrát polifruktózzá történő átalakítását; és ?2.037/3£/KASip2 « * ♦ » > > ·» ***« * -**·»' ♦ ♦ -* » **<·* » β» **

    b) az igy termelt poliíruktóz kinyerését a tenyésztett sejtekből, a gazdaszervezetből vagy a tápközegből.
21. 22. Eljárás poliíruktóz előállítására, amely magában foglalja:

    a) szacharóz vagy ekvivalens szubsztrát érintkeztetését egy 19. igénypont szerinti £rnktozli-transzferázzal olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a polifroktőzzá történő átalakulást; és

    b) az így előállított polifruktőz kinyerését,
22. 23. Eljárás polífruktőz előállítására, amely magában foglalja a polifruktöznak egy 10, igénypont szerinti növényi sejtből, egy 12. vagy 13, igénypont szerinti növényből vagy ilyen növény részeiből való kivonásának lépését,
23. 24. Eljárás tenzidek előállítására, amely magában foglalja a 21. vagy 22. igénypontok szerinti eljárás a) és b) eljárási lépéseit vagy a 23. igénypont szerinti eljárás extrakeiós lépését.
24. 25. A 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejtek vagy a 10, igénypont szerinti növényi sejtek alkalmazása élelmiszeradalékként.
25. 26. A 19, Igénypont szerinti fruktozíl-transzferáz alkalmazása polifruktőz, különösen inulin típusú polífruktőz előállítására.
26. 27. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polífroktóz alkalmazása tenzidek előállítására, vizes rendszerek viszkozitásának növelésére, detergensként, szuszpendálószerként, szedímentáció gyorsítására és viz komplexbe vitelére vagy megkötésére,