JP2806522B2

JP2806522B2 - 分岐フラクトオリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JP2806522B2
Application number: JP62221347A
Authority: JP
Inventors: 正善村松; 喜輝夫中久; 征四郎貝沼; 泰造三輪
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1987-09-04
Publication date: 1998-09-30
Anticipated expiration: 2013-09-30
Also published as: JPS6463389A; US5334516A; DE3851022D1; EP0307158B1; DE3851022T2; EP0307158A2; ATE109797T1; EP0307158A3

Description

【発明の詳細な説明】「技術分野」本発明は、ショークロースを原料として、アスペルギ
ルス属（Aspergillus）に属する微生物が生産する酵素
を作用させ、特定の構造を有する分岐フラクトオリゴ糖
を製造する方法に関する。「従来技術およびその問題点」近年、フラクトオリゴ糖の有する生理活性が注目され
ている（「化学と生物」、Vol 21.p.291）。例えばフラ
クトオリゴ糖は難消化性であり、腸内の有用細菌、特に
ビフィズス菌によって選択的に利用され、その増殖を促
進し、便通などを良好にする。また、ビフィズス菌によ
って分解されると有機酸を生成し、体内のコレステロー
ル含量を低下させる効果も認められている。フラクトオリゴ糖は、シュークロースをフラクトース
転位酵素（フラクトシルトランスフェラーゼ）に作用さ
せることにより生成されている。フラクトース転位酵素
を生成する微生物としては、酵母、アスペルギルス・ニ
ガー（Aspergillus niger）、オーレオバシディウム・
ブルランス（Aureobasidium pllulans）などが知られて
いる。また、本発明者らが先に提示したように、アスベ
ルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowi）の生産する
フラクトース転移酵素を用いても有効にフラクトオリゴ
糖を得ることができる（特開昭61−187797号参照）。しかし、これらのフラクトース転移酵素は、シューク
ロースに作用して、シュークロースのフラクトース残基
側にβ−1,2結合でフラクトースが数個結合した構造の
フラクトオリゴ糖か、または同結合からなる高分子のポ
リフラクタンを生成するものであった。そして、上記の
ような微生物が生産するフラクトース転移酵素を用い
て、それ以外の構造を有する糖を得た例は、これまでに
報告されていなかった。一方、フラクトオリゴ糖は、種々の植物が生産するこ
とが知られており（「化学と生物」、Vol.18、p.674）
特にアスパラガスの貯蔵根には、重合度３〜15を有する
非還元性のフラクトース重合物が存在することが報告さ
れ、その製造も明らかにされている［N.Shiomi,J.Yamad
a ＆ .M.Izawa,Agric.Biol.Chem.,40 567（1976），43,
1375（1979）,43 2233（1979）］。アスパラガス貯蔵根
中のフラクトオリゴ糖は、シュークロースのグルコース
残基側とフラクトース残基側の両方に分岐錠にフラクト
ースが結合した製造を有するものであり、これらの製造
を有するフラクトオリゴ糖は、微生物を利用して生成し
たフラクトオリゴ糖中には見出されていなかった。「発明の目的」本発明の目的は、これまで高等植物にのみ知られてい
た天然の分岐フラクトオリゴ糖を、微生物の酵素を利用
して工業的に製造できるようにした分岐フラクトオリゴ
糖の製造方法を提供することにある。「発明の構成」前述したように、本発明者らは、シュークロースにア
スペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowi）の菌体
を作用させて、シュークロースのフラクトース残基側に
β−1,2結合でフラクトースが結合した１−ケトースや
ニストースなどのフラクトオリゴ糖が得られることを提
示したが、その後の研究の結果、同様な反応条件下でそ
れらのフラクトオリゴ糖と同時に、シュークロースのグ
ルコース残基側とフラクトース残基側の両方にフラクト
ースが結合した分岐フラクトオリゴ糖が得られることを
見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、アスペルギルス属（Aspergillu
s）に属し、シュークロースに作用してシュークロース
のグルコース残基側とフラクトース残基側の両方にフラ
クトースを転移させるフラクトース転位酵素生産能を有
する微生物の菌体またはその菌体より調製された酵素を
用いて、シュークロースを処理し、下記一般式（Ａ）で
示される分岐フラクトオリゴ糖を生成させることを特徴
とする分岐フラクトオリゴ糖の製造方法である。（上記式中、ｍ＝０〜10、ｎ＝０〜８、３≦ｍ＋ｎ≦12
である。）本発明で用いられる微生物としては、アスベルギルス
属（Aspergillus）に属し、フラクトース転移酵素生産
能を有する微生物であればよいが、特にアスベルギルス
・シドウィ（Aspergillus sydowi）が好ましい。アスペ
ルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowi）としては、
例えばIAM 2544株、IAM 2514株、IAM 2078株、IAM 2009
株（いずれも東京大学応用微生物研究所の保存菌NOであ
る）などが挙げられる。なお、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydo
wi）IAM 2544株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託番号FERM P−15975として寄託されている。アスペルギルス・シドウィの培地としては、固定培地
または液体培地のいずれでもよいが、液体培地の場合、
特に下記のような組成を有する培地が最適である。グルコース 10％（W/V）コーンスティーブリーカー２％ MgSO・7H₂O 0.1％ KH₂PO₄ 0.2％ pH＝6.0 そして、アスペルギルス・シドウィを上記のような培
地に接種し、例えばロータリーシェーカーなどによる振
とう培養、ジャーファーメンターなどによる攪拌通気培
養などにより、好気的な条件で培養を行なう。培養温度
は、30℃前後が適当である。この状態で数日培養すると、培養液中にアスペルギル
ス・シドウィの菌体が多量生成される。そこで、培養を
終了し、遠心分離、濾過などの手段により菌体を集め、
生理的食塩水などで洗浄後、凍結乾燥して菌体を保存す
る。なお、アスペルギルス・シドウィ以外のアスペルギ
ルス属に属する微生物を用いた場合にも、上記とほぼ同
様な方法で菌体を得ることができる。本発明では、上記のようにして得られたアルベルギル
ス属に属し、フラクトース転移酵素生産能を有する微生
物の菌体またはその菌体から調製された酵素を用いてシ
ュークロースを処理することにより、分岐フラクトオリ
ゴ糖を製造する。菌体を用いる場合には、そのまま用いてもよいが、ア
ルギン酸塩、アクリルアミドゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル、光架橋性樹脂、カラギーナン、キトサン、ゼラ
チン通の包括剤を用いて包埋固定した菌体を用いること
もできる。さらに、担体の強度を増すために、グルタル
アルデヒド等の架橋剤で処理してもよい。菌体をそのま
ま用いる場合には、バッチ法により処理する必要がある
が、菌体を固定化して用いる場合には、カラムに充填し
て連続的に通液処理することが可能であり、バッチ法よ
りも効率的に反応を行なうことができる。また、菌体か
ら調製された酵素を用いる場合には、菌体をホモジネー
トして酵素液を抽出し、この酵素液を必要に応じてさら
に精製して用いることができる。また、得られた酵素を
適宜な担体に固体化して用いてもよい。分岐フラクトオリゴ糖を生成させるための酵素反応条
件としては、pHは5.0〜7.0が好ましく、pH5.5〜6.5が最
適である。温度条件は、30〜70℃が好ましく、40〜60℃
がさらに好ましい。原料として用いるシュークロースの
濃度は、30％（W/V）以上が好ましく、50％（W/V）がさ
らに好ましい。また、その際使用するフラクトース点域
酵素の量は、固形分1g当り５単位以上が好ましい。ここ
で、１単位とは、50％（W/V）シュークロース溶液を基
質とし、温度60℃、pH6.0で反応を行ない、１分間に１
μmolのフラクトースをシュークロースまたはフラクト
オリゴ糖に転移する酵素量である。こうして得られた反応液は、例えばメンブレンフィル
ターによりろ過し、脱イオン、脱色した後、濃縮して水
飴としたり、またはスプレードライなどにより粉末化す
ることができる。なお、得られた反応液中には、フラク
トオリゴ糖の他に、グルコース、フラクトースおよび未
反応のシュークロースが合計30〜50％（W/W）含まれる
が、これらは「Bio−Gel」（商品名、バイオラド社
製）、「Toyopearl HW40」（商品名、東洋曹達工業
（株）製）等によるゲルろ過、または強酸性カチオン交
換樹脂カラムクロマトグラフィーなどにより除去するこ
とができる。さらに、１−ケストース、ニストースなど
のフラクトオリゴ糖と、分岐フラクトオリゴ糖とを、上
記と同様の方法で分離し、分岐フラクトオリゴ糖のみを
高純度で得ることも可能である。本発明により得られた分岐フラクトオリゴ糖は、前記
一般式（Ａ）で示したように、シュークロースのグルコ
ース残基側にフラクトースが１〜11個、およびフラクト
ース残基側にフラクトースが１〜９個結合した重合度６
以上のオリゴ糖である。この分岐フラクトオリゴ糖は、
アスパラガスの貯蔵根中に含まれている天然のフラクト
オリゴ糖と同様な構造を有するものであり、極めて安全
性の高いものである。本発明で得られた分岐フラクトオリゴ糖は、従来のフ
ラクトオリゴ糖と同様に、ヒトの腸内におけるヒビダス
菌の増殖作用や、便通を良好にする効果が期待される。
また、生体内消化酵素によって加水分解を受けず、血糖
負荷試験の結果でも血糖上昇が見られないので、糖尿病
患者などへの適用が考えられる。さらに、血中や肝臓中
のコレステロールや中性脂肪の含量を低下させる作用も
認められている。本発明で得られた分岐フラクトオリゴ糖の製品形態と
しては、スプレードライによる粉末品、濃縮した液体な
どとし、これを健康食品として、あるいはバン、ビスケ
ットなどの食品への添加剤として利用することが考えら
れる。「発明の実施例」実施例１下記の液体培値100ml（pH6.0）を坂口フラスコに入
れ、アスペルギルス・シドウィIAM 2544株（東京大学応
用微生物研究所、保存菌NO）をスラントより植菌し、30
℃で５日間往復振とう培養した。培養液を遠心分離した
集菌し、生理的食塩水で数回洗浄した後、凍結乾燥して
供給菌体とした。グルコース 10％（W/V）コーンスティーブリカー２％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ KH₂PO₄ 0.2％ pH＝6.0 次に、50％（W/V）シュークロース溶液（pH6.0）に、
上記菌体を固形分1g当り５単位添加し、温度50℃で攪拌
しながら２日間反応を行なった。次いで、菌体をろ過に
よって除いた後、カーボンカラムクロマトグラフィーに
よって各種フラクトオリゴ糖を分画し、さらに「Toyope
arl HW40S」（商品名、東洋曹達工業（株）製）を用い
たゲルろ過クロマトグラフィーによって精製し、一連の
重合度を有する高純度フラクトオリゴ糖を得た。こうして得られた一連のフラクトオリゴ糖を、0.1N塩
酸またはインベルターゼを用いて加水分解し、グルコー
スとフラクトースのモル比をそれぞれ求めた。その結果
を第１表に示す。第１表に示すように、いずれの加水分解方法によって
も重合度の増加に伴ない、フラクトースのモル比が上昇
しており、これらのフラクトオリゴ糖の構造は、シュー
クロースにフラクトースがβ−フラクトフラノシド結合
で重合したものと推定された。次いで、これらフラクトオリゴ糖を公知の箱守法によ
りメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元し
てグルシトールアセテートにし、さらにキャビラリーガ
スクロマトグラフィーによって分析した。その結果を第
２表に示す。第２表に示すように、得られた部分メチル化糖のピー
ク面積比は、GF_{ｎ＝２−４}では、2,3,4,6TMG:1,3,4,6TM
G:3,4,6TMG＝1:1:n−１であるのに対して、GF
_{ｎ＝５−12}では、2,3,4TMG:1,3,4,6TMG:3,4,6TMG＝1:2:
n−２であった。このことから、得られたフラクトオリ
ゴ糖のうちGF_{ｎ＝２−４}は、下記一般式（Ｂ）で示すよ
うな構造のフラクトオリゴ糖であり、GF_{ｎ＝５−12}は、
前述した一般式（Ａ）で示すような構造の分岐フラクト
オリゴ糖であることが明らかとなった。（上記式中、ｎ＝１〜３である。）以上のように、シュークロースにアスベルギルス・シ
ドウィの菌体を作用させて得られる重合度６以上のフラ
クトオリゴ糖は、新しい分岐フラクトオリゴ糖であるこ
とが明らかである。これら分岐フラクトオリゴ糖は、こ
れまで高等植物であるアスパラガス貯蔵根中に見出され
ていたものであるが、微生物が精製するフラクトオリゴ
糖としては始めて見出されたものである。実施例２実施例１で得られた凍結乾燥菌体を用いて、分岐フラ
クトオリゴ糖の精製に及ぼす基質濃度、菌体の添加量お
よび反応温度の影響について検討した。それらの結果を
第３〜５表に示す。表に見られる如く、基質であるシュ
ークロースの濃度は、30％（W/V）以上が好ましく、菌
体酵素の添加量は、シュークロース固形分1g当り５単位
以上が好ましく、また、反応温度は、40〜60℃が良好な
結果であった。「発明の効果」以上説明したように、本発明によれば、従来、アスパ
ラガス貯蔵根などの高当植物にのみ存在が知られていた
分岐フラクトオリゴ糖を、微生物の菌体またはそれより
調製した酵素を用いて工業的に生産することが可能とな
る。また、得られた分岐フラクトオリゴ糖は、上記天然
の分岐フラクトオリゴ糖と同じ構造を有するものである
から、食品に供する場合の安全性が高いものである、そ
して、この分岐フラクトオリゴ糖は、ヒトの腸内におけ
るビヒダス菌を増殖させて便通を良好にする効果など、
各種の生理活性効果が期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 19/18 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．アスペルギルス属（Aspergillus）に属し、シュー
クロースに作用してシュークロースのグルコース残基側
とフラクトース残基側の両方にフラクトースを転位させ
るフラクトース転位酵素生産能を有する微生物の菌体ま
たはその菌体より調製された酵素を用いて、シュークロ
ースを処理し、下記一般式（Ａ）で示される分岐フラク
トオリゴ糖を生成させることを特徴とする分岐フラクト
オリゴ糖の製造方法。（上記式中、ｍ＝０〜10、ｎ＝０〜８、３≦ｍ＋ｎ≦12
である。）２．特許請求の範囲第１項において、前記微生物がアス
ペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowi）である分
岐フラクトオリゴ糖の製造方法。