JP4338356B2 - フラクトシルトランスフェラーゼを生成する微生物、及びそれを使用するフラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを、同時に生産可能な新規の微生物に関するものであり、上記微生物を用いて、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを製造するための方法に関するものである。具体的には、本発明は、土壌に由来するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ（ペニシリウム シトリヌム） ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰであって、フラクトシルトランスフェラーゼを生産可能であると共に、ｎが１から５までの整数、Ｇがグルコース、Ｆがフルクトースであるとき、上記フラクトシルトランスフェラーゼを用いて、スクロースを、以下の化学式１
【０００２】
【化３】

【０００３】
で表されるフラクトオリゴ糖に加水分解することができ、ｎが１から５までの整数、Ｇがグルコース、Ｆがフルクトースであるとき、上記フラクトシルトランスフェラーゼを用いて、スクロースを、以下の化学式２
【０００４】
【化４】

【０００５】
で表されるネオフラクトオリゴ糖に加水分解することができるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰに関するものである。また、上記微生物を用いて、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを製造するための方法に関するものである。
【０００６】
【従来の技術】
フラクトオリゴ糖は、それぞれ１ないし３モルのフルクトースがβ−（２,１）結合によりスクロースと結合した１−Ｋｅｓｔｏｓｅ（ＧＦ２）、Ｎｙｓｔｏｓｅ（ＧＦ３）、及びＦｒｕｃｔｏｓｙｌ ｎｙｓｔｏｓｅ（ＧＦ４）を含むオリゴ糖の混合物であり、アスパラガス、玉葱、ジャガイモ、蜂蜜などの多数の植物に含まれている。フラクトオリゴ糖は、オリゴ糖と共に、例えば、低カロリー値であること、乳酸菌やビフィズス菌の増殖促進、腸内の微生物群の促進、病原菌の抑制、腸活動の促進、及び免疫性の強化等の優れた機能により、食品として現在注目を集めている。従って、オリゴ糖は、例えば食品、飲料、製菓、健康食品等の様々な産業において使用されている。
【０００７】
特に、フラクトオリゴ糖が、ジフルクトース無水物ＩＩＩ（ＤＦＡ ＩＩＩ）と共に使用された時、優れたカルシウム吸収効果を示すことが、報告されている（日本国特許公報１１−４３４３８号参照）。米国特許公報５，８２７，５２６号は、一日当り０．５ｇから５ｇのフラクトオリゴ糖を患者に処方することにより、該患者の下痢をしている期間と下痢の再発を減らすことが出来ることを開示している。
【０００８】
韓国公開特許公報２０００−５７５２０号は、フラクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖と様々な食用原料との混合物は、他のオリゴ糖と比較して、腸内の流動を促進し、効果的にｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓを示すことが出来ることを開示している。また、現在、フラクトオリゴ糖は糖尿病患者用治療食についての研究開発のテーマとなっている。これは、フラクトオリゴ糖が、人の腸内の正常な微生物群を形成するバクテリアの一つである、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓの増殖を促進することで腸活動を促進すること、フラクトオリゴ糖を摂取しても、血糖値に影響が出ないこと、消化酵素によって分解されることがないなどの理由による。さらに、フラクトオリゴ糖は、血液中と肝臓におけるコレステロール値を下げることが証明された。従って、フラクトオリゴ糖のその様な効果は、現在注意深く研究されていない。
【０００９】
従来、フラクトオリゴ糖は、フラトシルトランスファラーゼを生成することができる微生物を利用する方法で製造されてきた。例えば、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ菌株を使用する方法、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを使用する方法、ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍとＦｕｓａｒｉｕｍ類の菌株を使用する方法が知られている。しかし、これらの方法で生成されたフラトシルトランスファラーゼには、スクロースの加水分解に対する力価が低いという短所がある。
【００１０】
日本国公開特許公報１０−１６５１９２号には、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４４菌を使用してβ−フラクトフラノシダーゼ（β―ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）を生成する方法を開示している。該方法においては、従来のフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の混合物は、スクロースから生成される。従来のフラクトオリゴ糖と違い、ネオフラクトオリゴ糖は、それぞれ１ないし３モルのフラクトースがβ−（２,６）結合によりスクロースに結合されているネオケストース（ｎｅｏｋｅｓｔｏｓｅ）（６Ｇ−β−フラクトフラノシル−スクロース；６Ｇ−β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−ｓｕｃｒｏｓｅ），ネオナイストース（ｎｅｏｎｙｓｔｏｓｅ）（６Ｇ−β−フラクトフラノシル−ケストース；６Ｇ−β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−ｋｅｓｔｏｓｅ），ネオフラクトシルナイストース（ｎｅｏｆｒｕｃｔｏｓｙｌ ｎｙｓｔｏｓｅ）（６Ｇ−β−フラクトフラノソシル−ナイストース；６Ｇ−β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｓｏｓｙｌ−ｎｙｓｔｏｓｅ）から成る混合物であると説明されている。また、ネオフラクトオリゴ糖は、大変甘いが低カロリーであり、加湿効果及び虫歯を防ぐ効果を持ち、腸内のバクテリアの増殖を促進し、さらに今話題の腸菅内の免疫反応を促進する機能を持つ。それ故、甘味料、機能食品、飼料、医薬品、及び殺虫剤の誘引剤等の様々な分野において利用可能である。
【００１１】
Ｄ．ＧｒｉｚａｒｄらはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ由来の市販の酵素であるＣｙｔｏｌａｓｅ ＰＣＬ５を使って、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖を生産する方法を開示している（Ｄ．Ｇｒｉｚａｒｄ、Ｃ．Ｂａｒｔｈｏｍｕｆ、Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３（１）、９３−１０５、１９９９）。
【００１２】
米国特許５、３３４、５１６号には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ由来の酵素を使用して、従来のフラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖（該公報中では「分岐フラクトオリゴ糖」とされている）を生産する方法が開示されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、これら従来技術について研究調査を重ね、高い収率で、フラクトオリゴ糖を生産する様々な方法について実験を行った。その結果、本発明者らは、遂に、スクロースの加水分解に関して高い力価を持つフラトシルトランスファラーゼを生成することが出来る新規の微生物を同定し、さらに、該微生物を高濃度のスクロース溶液と反応させることにより、従来のフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖を、高い収率で生産することが出来ることを確認した。本発明は、これらの発見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
本発明の目的は、高力価のフラクトシルトランスフェラーゼを生産可能な、新規の微生物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、高濃度のスクロース溶液を上記微生物と反応させることにより、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを高収率で製造するための方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明は、土壌に由来するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰであって、フラクトシルトランスフェラーゼを生産可能であると共に、ｎが１から５までの整数、Ｇがグルコース、Ｆがフルクトースであるとき、上記フラクトシルトランスフェラーゼを用いて、スクロースを、以下の化学式１
【００１７】
【化５】

【００１８】
で表されるフラクトオリゴ糖に加水分解することができ、ｎが１から５までの整数、Ｇがグルコース、Ｆがフルクトースであるとき、上記フラクトシルトランスフェラーゼを用いて、スクロースを、以下の化学式２
【００１９】
【化６】

【００２０】
で表されるネオフラクトオリゴ糖に加水分解することができるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを提供するものである。また、上記微生物を用いた、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを製造するための方法を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを製造するための方法であって、本発明に係る微生物であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを、第１の培地で、２６℃から２８℃の温度で２日間、１００ｒｐｍから２００ｒｐｍの速度で攪拌することにより、上記微生物が活性化するように培養する工程と、上記微生物を、２６℃から２８℃の温度で７２時間、発酵培地内で、２００ｒｐｍから６００ｒｐｍの速度で攪拌し、０．５ｖ／ｖｍから１ｖ／ｖｍの速度で空気を注入することによって大量生産する工程と、得られた微生物を遠心分離により収集し、０．８５％生理食塩水を用いて２回洗浄した後、センサを予め挿入することにより計測された計測値であるスクロース濃度Ｂｒｉｘの範囲が、６０から７７であるスクロース溶液中で、１００ｒｐｍから３００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、３５℃から５０℃の温度の範囲、および５から７のｐＨ範囲で、２０時間から５０時間培養する工程とを含む製造方法を提供することを特徴とするものである。
【００２２】
さらに、本発明は、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを製造するための方法であって、本発明に係る微生物であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを種培養する工程と、種培養された微生物を大量生産する工程と、大量生産された微生物を基材と混合することによりビーズを形成し、上記ビーズをカラムに充填する工程と、スクロース溶液に、上記ビーズが充填されたカラムを通過させる工程とを含む製造方法を提供することを特徴とするものである。
【００２３】
本発明のさらなる特徴は、本発明に係る微生物であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰに由来し、スクロース１ｇに対し、１．５単位のスクロース加水分解力価を有するフラクトシルトランスフェラーゼを提供することである。
【００２４】
本発明の上記の目的、他の特徴、及び長所は、添付の図面と共に下記の詳細の説明を読むことで、より明らかになるであろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の詳細な説明を記す。
【００２６】
本発明者らは、韓国のインチョンに所在する製糖工場周辺の土壌を採取し、その土壌から微生物を分離した。該微生物の内の一種類が高い力価を持つフラトシルトランスファラーゼを生成できることがわかった。その新規の微生物は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ類に属する、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍであると同定された。該微生物は、２００１年２月２７日に、寄託アクセス番号ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰとして、その宛名が韓国テジュン、ユーソング・グ、オン・ドンである韓国生物科学生物工学研究所（ＫＲＩＢＢ：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託され、第三者が利用できるようになっている。
【００２７】
本発明者らは、本発明による該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを、科学的性質と形態について調べた。表２にその結果を示す。該微生物から生成されたフラトシルトランスファラーゼのスクロース加水分解に関する力価を測定した。平均して、スクロース１ｇあたり１．５単位であると分かった。この結果により、本発明による該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰ由来のフラトシルトランスファラーゼは、他の公知の酵素よりも、スクロース加水分解に対する高い力価を持つことが分かった。米国特許５，３３４，５１６号における実験結果によると、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の酵素を使ってスクロースを加水分解した場合、１ｇのスクロースを分解するのに、少なくとも５単位の酵素が必要だった。Ｄ．Ｇｒｅｚａｒｄらによれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ由来の酵素においては、１ｇのスクロースを分解するのに７単位の酵素が必要だった。
【００２８】
本発明による該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを使用することにより、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖を同時に、高い収率で生成することができる。フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の製造方法としては、バッチ式方法や固定連続式方法等を含む。これらの方法は、この分野において公知である。
【００２９】
最も一般に使用される方法であるバッチ式方法においては、フラトシルトランスファラーゼを持つ微生物をスクロース溶液に混ぜることにより、フラトシルトランスファラーゼをスクロース溶液（基質）と反応させ、生成物を得る。一面において、本発明は、本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを使用することにより、高い収率でフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖を生産するバッチ式方法を提供する。
【００３０】
一方、固定連続式方法においては、微生物又は酵素がキャリア（基材）に固定され、基質を基材と接触させることで、気質を微生物又は酵素と反応させる。固定続式方法も今日まで広く使用されている。この方法の長所は、微生物や酵素を再び使用することが出来、連続的な反応が行われることである。しかし、この方法は、酵素を固定する場合、微生物が持つ酵素を抽出して分離させなくてはならず、またこの微生物から抽出された酵素は一般に不安定であるという短所を持つ。それゆえ、現在、微生物が直接基質に固定される、固定された菌細胞を使用する方法が用いられている。この菌細胞固定式方法においては、微生物から酵素を分離する必要がなく、それ故、酵素の抽出時における酵素の活量の減少を防ぐとこができる。また、酵素の抽出と分離の複雑な工程を一工程で行うことが出来るという長所がある。故に、別の面として、本発明は、本発明による該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを基質に固定することでフラクトオリゴ糖及びネオフラクトオリゴ糖を生産する連続式方法を提供する。次に、本発明による該固定連続式方法を説明する。
【００３１】
まず、本発明による該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰの種培養を行う。該種培養された微生物を、培養培地において大量生産する。種培養においては、１００ｒｐｍから２００ｒｐｍの速度で撹拌しながら、２６度から２８度の温度で２日間行うのが好ましい。大量生産においては、２００ｒｐｍから６００ｒｐｍの速度で撹拌し、且つ０．５ｖ／ｖｍから１ｖ／ｖｍで空気を注入しながら、２６度から２８度の温度で、４２時間から７２時間行うのが好ましい。次に、大量生産された微生物を、基材とよく混ぜ合せる。この混合物をビーズに形成し、カラムの中に充填する。アルギナートゲル、光架橋された樹脂、アクリルアミドゲル、ｋ−カラゲナン、キトサン、ゼラチンより選ばれたものが、この基材として好ましいが、これらに限定されず、一般にこの分野で使用されている基材も使用できる。基材の濃度は１％から２％が好ましい。次に、スクロース溶液をビーズが詰ったカラムに通す。ブリックス（Ｂｒｉｘ）が６０から７０の濃度のスクロース溶液を３５oＣから５５oＣの温度で１時間当り１００ｍＬから３００ｍＬの流量で流すのが、好ましい。
【００３２】
表１に、本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを使用して、フラクトオリゴ糖をバッチ式方法と固定連続式方法によって生産した、２つの実験の結果を示す。
【００３３】
【表１】

【００３４】
表１に示すように、バッチ式方法を使用した場合、１００Ｌのフラクトオリゴ糖を生産するのに４００ｇの微生物が必要であり、１Ｌのフラクトオリゴ糖を生産するのに要する反応時間は２４時間だった。しかも、反応が終了してからも生産された該フラクトオリゴ糖を微生物から分離し、反応器を洗浄し、また新たにスクロース溶液と微生物を反応器に満たすのに、さらに１２時間必要だった。一方、固定連続式方法の場合、１００Ｌのフラクトオリゴ糖を生産するのに５０ｇの微生物が必要であった。１００Ｌのフラクトオリゴ糖を生産するのに必要な反応時間は、およそ２５日間であり、生産効率は１日当り４．０２Ｌであった。よって、固定連続式方法を採用した場合、バッチ式方法と比較して、必要とされる微生物の量がより少なく、生産効率が６倍になる。
【００３５】
【実施例】
次に、下記の実施例に示す実施の形態を用いて、本発明の詳細な説明を行う。しかし、本発明を例示する下記の例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】
〔実施例１〕
（微生物の識別）
韓国のインチョンに所在する、製糖工場周辺から採取した土壌より、微生物を入手した。得られた微生物のうちの一種が、高力価のフラクトシルトランスフェラーゼを生産可能であることを見出した。この新規の微生物は、アオカビ属に属する菌類である、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍであると識別された。概微生物は、２００１年２月２７日に、韓国テジュン、ユーソング・グ、オン・ドンに所在する、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）に、委託アクセス番号ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰで委託され、第三者により利用可能となっている。
【００３７】
本発明に係るＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを、当技術分野において、菌類の培養で一般的に使用されている、Ｃｚａｐｅｋ−Ｙｅａｓｔ Ａｌｇａｅ（ＣＹＡ）培地およびＭａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｇａｅ（ＭＥＡ）培地を用いて培養した。これら２種類の培地で培養されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰは、ほぼ同一の性質および外観を有していた。上記微生物の、科学的性質および形態を、以下の表２に示す。
【００３８】
【表２】

【００３９】
〔実施例２〕
（種培養および酵素力価の測定）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰ種子の培養液としては、韓国公開特許公報Ｎｏ．１９８９−１１２７に記載されている、フラクトオリゴ糖を生産可能な微生物を培養するための培地組成を変更したものを使用した。表３に、その変更組成を示す。上記微生物を、容量２５０ｍｌのフラスコ内に投入し、上記培養液５０ｍｌを加えることにより培養を行った。培養は、攪拌発酵槽を、温度２８℃で２日間、攪拌速度１５０ｒｐｍで攪拌することにより行った。
【００４０】
【表３】

【００４１】
そして、培養されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰから生成したフラクトシルトランスフェラーゼの、スクロース加水分解に対する力価を測定した。スクロース加水分解力価の測定は、文献シノハラ・サトシ（日本国公開特許公報１０−１６５１９２）に記載の方法にしたがい行った。酵素力価は、単位時間（分）における、スクロース（糖基質）の加水分解により生産されたグルコース量（μｍｏｌ）により定義される。本発明に係るＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰから生成したフラクトシルトランスフェラーゼは、平均で、１．５単位／１ｇスクロースのスクロース加水分解力価を有することが分かった。この結果は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓから得られた酵素を使用してスクロースを加水分解する場合に、スクロース１ｇを分解するために、酵素が５単位必要である、米国特許Ｎｏ．５，３３４，５１６に記載の実験結果、並びにスクロース１ｇを分解するために、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉから得られた酵素が７単位必要な、Ｄ．Ｇｒｉｚａｒｄ ｅｔ ａｌ．に記載の実験結果を考慮した場合、本発明に係るＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰから生成したフラクトシルトランスフェラーゼは、他の如何なる公知の酵素と比較しても、優れたスクロース加水分解力価を有することを示している。
【００４２】
また、上記微生物のバイオマスによるスクロース加水分解力価の実験により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰのバイオマスが増加するに従って、より多くのスクロースが分解されることが分かった。
【００４３】
〔実施例３〕
（本培養）
実施例２で培養した微生物種子を用いて、容量５Ｌの発酵槽（Ｈａｎｉｌ Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）内で、本培養（大量生産）を行った。発酵槽内の培養液に対し、５％の量（ｖ／ｖ）で、上記微生物を接種した。反応条件については、文献ユー・ムーヨング（韓国公開特許公報１９８９−０１１２７）に記載のものを変更して使用した。図２は、発酵槽内の攪拌器の攪拌速度を３００ｒｐｍから５００ｒｐｍの範囲内で変化させた場合の、培養時間に対する、微生物のバイオマスの変化を示したものである。図２により、微生物量は、攪拌速度を上げるに従い増加することが分かる。図３は、攪拌速度による、細胞内酵素および細胞外酵素の変化量を示すものである。攪拌速度５００ｒｐｍでは、細胞内酵素の量は、５０時間後に低下する傾向を示した。これは、微生物の老化および発酵槽内の環境劣化によるものと考えられる。同様に、攪拌速度４００ｒｐｍでは、細胞内酵素の量は、５０時間後に低下する傾向を示した。しかしながら、細胞外酵素の増加は観られなかった。微生物の分泌による細胞外酵素の増加量は、微量すぎて検出できないが、発酵槽の容量を考慮すると、約２０単位であると予想される。図４は、攪拌速度６００ｒｐｍで攪拌される発酵槽を使用した場合の、本培養における発酵時間に対する、微生物のバイオマスの変化および細胞内酵素量の変化を示すものである。培養時間の経過と共に、微生物のバイオマスおよび酵素量が増加した。発酵槽の攪拌速度を上げた場合では、微生物のバイオマスは増加する傾向を示した。形態学的には、４００ｒｐｍ以上の攪拌速度で、微粒子が観察された。また、２００ｒｐｍ以下の攪拌速度で、球径が２ｍｍである、大きいペレットが観察された。
【００４４】
酵素の生産に関しては、微生物内に存在する酵素量は、微生物１ｇに対して１４００単位であった。また、微生物外に存在する酵素量は、培養液１ｍｇに対して１５０単位であった。したがって、本発明に係る微生物は、シノハラ文献（日本国公開特許公報１０−１６５１９２）に記載の、５００単位／ｇの酵素を含んだＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＦＥＲＭＰ−１５９４４に比べて、２．８倍量の酵素を含んでいた。
【００４５】
〔実施例４〕
（バッチ式方法を用いたフラクトオリゴ糖の生産）
実施例２で得た微生物を、スクロース溶液と反応させることによって、フラクトオリゴ糖を生産した。フラクトオリゴ糖の総含有量（固相％）は、得られた従来のフラクトオリゴ糖、ネオフラクトオリゴ糖、フルクトース、グルコース、および残留スクロースの合計量による除算により計算した。フラクトオリゴ糖の総含有量（固相％）の、攪拌速度、培養時間、スクロース濃度、およびｐＨと温度変化に対する変化を測定した。図５は、得られたフラクトオリゴ糖の全体量の、スクロース濃度に対する変化を示すものである。オリゴ糖の収率は、スクロース濃度Ｂｒｉｘが６０から７０の間で最大であった。スクロース濃度Ｂｒｉｘが７０を超えると、スクロースは、白色沈殿物として結晶化し、フラクトオリゴ糖との反応を阻害した。したがって、産業上の生産において、スクロースの最適濃度はＢｒｉｘ７０までである。ところで、スクロース濃度が低いと、他の微生物が反応に混入するおそれがある。このため、スクロースの最適濃度Ｂｒｉｘは、６５から７０の間であることが見出された。反応時間については、２４時間後の固相率は最大で６５％であり、本発明が、産業上の生産において、問題なく実用化できることを示している。
【００４６】
図６は、本発明に係るフラクトオリゴ糖の含有量（個相％）の、ｐＨ範囲３から７における変化を示すものである。ｐＨ範囲５から７において、フラクトオリゴ糖の収率は高収率であった。
【００４７】
その後の実験において、別個のバッファ溶液を添加することにより、反応のｐＨを調整せずに、スクロース溶液を反応させた。したがって、産業上の生産において、別処理を必要とせずに、ネオフラクトオリゴ糖の製造方法をさらに簡略化できる。
【００４８】
図７は、フラクトオリゴ糖の総含有量（個相％）の、反応時間に対する変化を示すものである。フラクトオリゴ糖の総含有量は、４０℃まで、一定の速度で増加する傾向を示した。反応速度に関しては、反応度は４５℃で最高であった。反応は、２４時間で終了した。培養は高温度で行われたため、他の微生物の混入による問題は解決されると思われる。しかしながら、４５℃での酵素力価は、他の文献に記載されているものより高力価であったにもかかわらず、得られたフラクトオリゴ糖の総量に大きな増加は観られなかった。このことは、従来の理論、つまり、オリゴ糖の生産は、スクロースの加水分解により生産されたグルコースの、反応槽内での蓄積により抑制されることによって説明できる。
【００４９】
このため、グルコースを消費する方法が提案されている。例えば、ブドウ糖酸化酵素または酵母菌を添加することにより、グルコースを消費する方法が提案されている（Ｊｏｎｇ−ｗｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆｔｈｅ Ｋｏｒｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，４０−４７，１９９４参照）。しかしながら、この方法は、不純物が生産されるため、本発明では使用されていない。
【００５０】
図８は、フラクトオリゴ糖の総含有量（個相％）の、攪拌速度に対する変化を示すものである。攪拌速度の増加にともない、反応度の低下が観られた。これは、高速度で回転する攪拌器により生じた気泡により、微生物とスクロース溶液との反応面積が減少したことによると思われる。したがって、最適な攪拌速度は、２００ｒｐｍまでである。本発明では、攪拌速度１００ｒｐｍで、フラクトオリゴ糖を生産した。ネオフラクトオリゴ糖を含むフラクトオリゴ糖を生産するための上記の実験から、フラクトオリゴ糖を生産するための最適な条件は、以下のように定義できる。スクロース濃度Ｂｒｉｘの範囲が６０から６５であり、反応温度が４５℃であり、反応時間が２４時間であり、攪拌速度が１００ｒｐｍである。
【００５１】
〔実施例５〕
（微生物の固定によるフラクトオリゴ糖の連続的な生産）
実施例２で培養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰ種子を、培養液に対して５％の量（ｖ／ｖ）で接種し、容量５Ｌの発酵槽（Ｈａｎｉｌ Ｒ＆Ｄ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、韓国）内で発酵させた。培養の終了後、微生物を収集し、アルギン酸ナトリウム（Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）に固定することにより、フラクトオリゴ糖を生産した。一定濃度の微生物を、一定濃度のアルギン酸と混合した。得られた混合物を、蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、所定の速度で流し、直径１ｍｍおよび長さ２０ｃｍの針を介して、電磁撹拌機により攪拌されている１％塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）水溶液に滴下した。１％塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）水溶液は、溶液内のカルシウムイオン（Ｃａ²⁺）と、アルギン酸のナトリウムイオン（Ｎａ⁺）とのイオン結合反応により、ビーズを形成するために使用した。微生物とアルギン酸との混合における最適濃度を調べるために、２５ｇ／ｌから１００ｇ／Ｌの濃度の微生物を、１％から２％の濃度のアルギン酸と混合した。その結果、５０ｇ／Ｌまでの濃度の微生物を、濃度１．５％までのアルギン酸と混合した場合に、完全な球形のビーズが形成できることが分かった。これらの濃度を超えると、粘度が増大することにより、形状が不均一のビーズが形成された。したがって、本実施例では、５０ｇ／Ｌの濃度の微生物を、濃度１．５％のアルギン酸と混合することによって、ビーズを形成した。得られたビーズを、４℃で１０時間放置した後、蒸留水で洗浄し、濃度Ｂｒｉｘ６０のスクロース溶液に滴下して、４℃で１０時間熟成させた。その後、ビーズを、容量１Ｌのガラスカラムに充填し、濃度Ｂｒｉｘ６０のスクロース溶液をカラムに流した。ここで、反応温度は４５℃であり、スクロース溶液は、蠕動ポンプを用いて、２００ｍｌ／ｈｒの速度で注入した。図９は、固定連続法により生産されたフラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖の、４０日間における、それぞれの変化量を示すものである。得られたフラクトオリゴ糖の総量に対する固形分（％）は、５５％から６０％の範囲内で一定であり、形状および硬度については、初期段階からの変化は観られなかった。ネオフラクトオリゴ糖を含むフラクトオリゴ糖を生産するための上記の実験から、連続固定法によりフラクトオリゴ糖を生産するための最適な条件は、以下のように定義できる。スクロース濃度Ｂｒｉｘの範囲が６０であり、反応温度が４５℃であり、スクロース溶液の流量は１５０ｍＬ／ｈｒから２００ｍＬ／ｈｒである。
【００５２】
〔実施例６〕
（フラクトオリゴ糖の分析）
実施例４および実施例５で得られたフラクトオリゴ糖を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析した。Ｄａｉｓｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）製のＯＤＳカラム（５μｍ、１５０ｍｍ×４ｍｍ）、および屈折率検出器を使用した。従来のフラクトオリゴ糖とは異なる物質が検出されたため、Ｗａｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．社（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）製の、純正分離用高性能液体クロマトグラフィー（Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ）システムを用いて、この生成物を分離した。分離した生成物の構造を調べるために、ＡＲＸ４００ＭＨｚＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、得られた画分をＮＭＲ分析した。その結果を、以下の表４に示す。
【００５３】
【表４】

【００５４】
表に示されるように、本発明に係るＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを用いて生産したフラクトオリゴ糖は、従来のフラクトオリゴ糖（化学式１）に加えて、従来のフラクトオリゴ糖とは異なる構造を有する、ネオフラクトオリゴ糖（化学式２）を含んでなることが確認された。したがって、本発明で使用される微生物Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰは、従来のフラクトオリゴ糖に加えて、それとは異なる構造を有する、ネオフラクトオリゴ糖も同時に生産可能であることが確認された。
【００５５】
【発明の効果】
上述したように、本発明の発明者らは、スクロースを、従来のフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とに加水分解することのできる新規の微生物である、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを発見したものである。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰから生成されたフラクトシルトランスフェラーゼは、従来の微生物に由来する酵素に比べて、非常に高力価のスクロース加水分解力価を有している。したがって、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを使用することにより、フラクトシルオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖を、高収率および低コストで生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に関するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰのバイオマスを変化させた時における、スクロースの加水分解のレベルを示すグラフであり、傾斜（単位／スクロース１ｇ）は、フラトシルトランスファラーゼのスクロースの加水分解に関する力価である。
【図２】撹拌速度を３００ｒｐｍから５００ｒｐｍに変化させた場合における、発酵槽を使用した本培養の培養時間に対する微生物のバイオマスの変化を示すグラフである。
【図３】撹拌速度を３００ｒｐｍから５００ｒｐｍに変化させた場合における、発酵槽を使用した本培養の培養時間に対する細胞内酵素と細胞外酵素の量的変化を示すグラフである。
【図４】撹拌速度が６００ｒｐｍである場合における、発酵槽を使用した本培養の培養時間に対する微生物のバイオマスの変化と細胞内酵素の量の変化を示すグラフである。
【図５】本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰのバイオマスを、５Ｌの反応器中の３Ｌのスクロース溶液に接種し、バッチ生産した場合における、スクロースの濃度に対する、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の生成量の変化を示すグラフである。
【図６】本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰのバイオマスを、５Ｌの反応器中の３Ｌのスクロース溶液中に混入し、バッチ生産した場合における、水素イオン濃度（ｐＨ）に対する、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の生成量の変化を示すグラフである。
【図７】本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰのバイオマスを、５Ｌの反応器中の３Ｌのスクロース溶液に接種し、バッチ生産した場合における、温度に対する、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の生成量の変化を示すグラフである。
【図８】本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰのバイオマスを、５Ｌの反応器中の３Ｌのスクロース溶液に接種し、バッチ生産した場合における、撹拌速度に対する、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の生成量の変化を示すグラフである。
【図９】本発明によるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｍ ＫＣＴＣ １０２２５ＢＰを、アルギナートに固定して高濃度のスクロースと連続的に反応させた場合における、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖の生成量の変化を示すグラフである。

Claims (10)

1. 土壌に由来するペニシリウム・シトリヌム（penicillium citrinum）ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰであって、フラクトシルトランスフェラーゼを生産可能であると共に、上記フラクトシルトランスフェラーゼを用いて、スクロースを、以下の化学式１
   

   

   （なお、化学式１中ｎは１から５までの整数、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを示す）で表されるフラクトオリゴ糖、および以下の化学式２
   

   

   （なお、化学式２中ｎは１から５までの整数、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを示す）で表されるネオフラクトオリゴ糖に加水分解することができるペニシリウム・シトリヌム（penicillium citrinum）ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰ。
2. フラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖の製造方法であって、フラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖は、請求項１に記載の微生物であるペニシリウム・シトリヌム（penicillium citrinum）ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを用いて、スクロースから同時に生産される製造方法。
3. 請求項２に記載のフラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖の製造方法であって、
   請求項１に記載の微生物であるペニシリウム・シトリヌム（penicillium citrinum）ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを、第１の培地で、２６℃から２８℃の温度で２日間、１００ｒｐｍから２００ｒｐｍの速度で攪拌することにより、上記微生物が活性化するように培養する工程と、
   上記微生物を、２６℃から２８℃の温度で７２時間、発酵培地内で、２００ｒｐｍから６００ｒｐｍの速度で攪拌し、０．５ｖ／ｖｍから１ｖ／ｖｍの速度で空気を注入することによって生産する工程と、
   得られた微生物を遠心分離により収集し、０．８５％生理食塩水を用いて２回洗浄した後、センサを予め挿入することにより計測されたＢｒｉｘが、６０から７７の濃度であるスクロース溶液中で、１００ｒｐｍから３００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、温度が３５℃から５０℃の範囲、およびｐＨが５から７の範囲で、２０時間から５０時間培養する工程とを含む製造方法。
4. 請求項２に記載のフラクトオリゴ糖およびネオフラクトオリゴ糖の製造方法であって、
   請求項１に記載の微生物であるペニシリウム・シトリヌム（penicillium citrinum）ＫＣＴＣ−１０２２５ＢＰを種培養する工程と、
   種培養された微生物を生産する工程と、
   生産された微生物を、アルギナートゲル、光架橋樹脂、アクリルアミドゲル、キトサン、およびゼラチンからなる群より選ばれる基材と混合することによりビーズを形成し、上記ビーズをカラムに充填する工程と、
   スクロース溶液に、上記ビーズが充填されたカラムを通過させる工程とを含む製造方法。
5. 上記種培養工程は、２６℃から２８℃の温度で２日間、１００ｒｐｍから２００ｒｐｍの速度で攪拌することによって行われる請求項４に記載の製造方法。
6. 上記生産工程は、２６℃から２８℃の温度で、４２時間から７２時間、２００ｒｐｍから６００ｒｐｍの速度で攪拌し、０．５ｖ／ｖｍから１ｖ／ｖｍの速度で空気を注入することによって行われる請求項４に記載の製造方法。
7. 前記基材は、１％から２％の濃度で使用される請求項４に記載の製造方法。
8. 前記ビーズは、上記微生物と基材との混合物を、１ｍｍの直径を有する針を介して、１％から２％の塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）水溶液に滴下することにより形成される請求項４に記載の製造方法。
9. 前記スクロース溶液は、Ｂｒｉｘが６０から７０の濃度の範囲である請求項４に記載の製造方法。
10. 前記スクロース溶液は、温度３５℃から５５℃、および速度１００ｍｌ／ｈｒから３００ｍｌ／ｈｒで、前記カラムを通過する請求項４に記載の製造方法。

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