KR100607319B1

KR100607319B1 - 갈락토만난-올리고당, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100607319B1
Application number: KR1020027007798A
Authority: KR
Inventors: 쿤쯔마르크바르트; 보겔만프레드; 클링게베르그미하엘; 루드비그에바; 뮤니르모하마드; 리티그프랑크
Original assignee: 쥐드주커 아게 만하임/옥센푸르트
Priority date: 1999-12-18
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2006-07-28
Also published as: DE50008164D1; EP1303632B1; IL150257A0; RU2281331C2; AU3157501A; JP2003516757A; MXPA02006044A; WO2001044489A2; DE19961182A1; ATE278799T1; IL150257A; AU779681B2; DE19961182B4; PT1303632E; ES2228661T3; CA2394640A1; EP1303632A2; KR20030026921A; DK1303632T3; US20030162300A1

Abstract

본 발명은 갈락토만난 화합물의 가수분해 방법 및 그 가수분해물의 다양한 용도에 관한 것이다.

Description

갈락토만난-올리고당, 이의 제조방법 및 이의 용도{GALACTOMANNAN OLIGOSACCHARIDES AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF}

본 발명은 갈락토만난-올리고당, 이의 제조방법 및 식품과 약품에서의 용도에 관한 것이다.

식품 및/또는 약품용 활성 성분 및/또는 첨가제를 얻기 위한 차세대 천연 원료에 대한 요구가 꾸준히 있었다. 또한 천연 유래의 원료로부터의 높은 허용성 또한 그 제조시 환경보호 측면에 대한 요구도 있었다. 글루코만난 및 갈락토만난과 같은 만난 및 그 유도체는 이와 같은 천연 원료로 이루어져 있다. 만난은 글루코스 단위체 대신에 만노오스로 구성되는 폴리오스(polyoses)이다. 만노오스-사슬은 β-1,4-결합된 만노오스-단위체로 이루어져 있다. 갈락토만난은 β-1,4-결합된 만노오스-단위체 이외에, 동시에 α-1,6-결합된 갈락토스-단위체를 보여주고 있어 만노오스- 및 갈락토스 구성요소로 이루어져 있다. 이와 같은 갈락토만난은 시판되고 있는 구아검, 카시아검 및 캐럽 열매 가루(carob seed flour) 형태이고, 예를 들어 식품 산업 및 약품 산업에서 사용되고 있는 정제 동물성 보조제를 들 수 있다 (Industrial Gums, R. L. Whistler und J. N. BeMiller, Herausgeber, 3. Auflage 1992, Academic Press, New York). 다양한 원천으로부터 얻어지는 갈락토만난은 만노오스 및 갈락토스의 상대적 함량에 의해 실질적으로 구별된다.

식품에 유용한 원료를 제조하기 위해, 폴리오스는 작은 단위체로 분해된다. 다양한 온도에서 약산에 의해 다당류가 가수분해된다는 것은 이미 공지되어 있다. 갈락토만난을 가수분해하면, 만노오스 및 갈락토스와 같은 단량체의 혼합물이 된다.

갈락토만난을 효소적으로 가수분해하기 위해, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 얻어진 엔도-β-만나나아제(E.C. 3. 2. 1. 78)가 공지되어 있다(H. Uhlig, Enzyme arbeiten fur uns, Carl Hanser Verlag Munchen, Wien, 1991). 캐럽 열매 가루로부터 얻어진 갈락토만난이 단지 부분적으로만 가수분해되는 반면, 상기 효소는 구아검으로부터 얻어진 갈락토만난을 가수분해한다. 그 원천에 따라, 갈락토만난은 가수분해에 대해 상이한 적합성을 나타낼 수 있다.

아지사카 등(Ajisaka et al., Carbohydrate Research 270 (1995), 123-130)에 의하면, 아스페르길루스 니게르로부터 분리된 α-만노시다아제에 의한 만노비오스 및 만노트리오스의 효소적 합성 방법이 공지되어 있다. 이러한 합성은 효소의 통상적인 가수분해 반응의 전환에 의해 수행되는데, 기술적으로 바람직하지 않은 약 2 %의 수율을 가진다. 이 생성물은 어떠한 갈락토오스-단위체도 함유하지 않는다.

뉴먼(K. Newman, Biotechnology in the Feed Industry, Proc. Of Alltech's 10^th Symposium (1994), 167-174)에 의하면, 병원균의 만노오스 특이성 렉틴과 특이 적으로 결합되는 글루코-만노-단백질 복합체가공지되어 있다. 이들 생성물은 갈락토오스 단위체를 전혀 함유하지 않으므로, 갈락토오스 특이성 렉틴과 어떠한 결합도 매개할 수 없다.

상기 기술적 문제점을 기초로 한 본 발명은 갈락토만난을 제조할 수 있는 물질 및 그 제조방법으로 이루어지며, 그 유리한 이용 가능성은 당연히 약학 및 식품 기술 분야에 있다.

본 발명이 기초로 하고 있는 상술한 기술적 문제점은 갈락토만난으로부터 만노오스- 및 갈락토오스- 함유 올리고당의 제조방법을 제공함으로써 해결되며, 이때 갈락토만난의 수용액 또는 현탁액이 제조되고, 박테리아 유래의 효소 활성, 특히 박테리아 유래의 효소 작용물질의 사용에 의해 가수분해되어 중합도 (DP) 15 미만, 특히 2 내지 7을 갖는 만노오스- 및 갈락토오스- 함유 올리고당의 혼합물이 수득된다. 본 발명은 중합도 15 미만, 특히 2 내지 7을 갖는 β-1,4-결합된 만노오스-단위체 및 α-1,6-결합된 갈락토오스-단위체로 구성된 갈락토-만노-올리고당을 제공한다. 이러한 갈락토-만노-올리고당은 식료품, 식품, 기호품 및 약품의 용도에 있어서, 질병의 예방 및 치료가 가능하고, 병적 상태의 개선을 위해 놀랄만큼 유리한 방법으로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 기호품 및 식품의 당혈증 지수를 낮추고, 장 질환을 극복 및/또는 방지할 수 있으며, 인간 및 동물의 상피세포에 병원균이 퇴적되는 것을 방지 또는 감소시킬 수 있으며, 염증성 만성 장 질환을 극복 및/또는 방지할 수 있으며, 장암 또는 결장암의 발병을 방지할 수 있고/있거나 극복할 수 있으며, 대부분의 감염원에 대한 면역력을 강화시킬 수 있고, 면역력을 조절할 수 있으며, 염증성 질환을 극복할 수 있고/있거나 방지할 수 있고, 칼슘 흡수를 개선할 수 있어 특히 골다공증을 방지할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 기관 또는 전체 유기체에서 생활 과정의 방해는 질병에 의해 이해되는데, 이는 주관적인 인식 또는 객관적인 확인, 신체 또는 정신적인 변화가 당연히 필요하게 된다. 본 발명과 관련하여 결핍 상태 또한 질병에 의해 이해된다.

본 발명과 관련하여, 생물체 또는 그 일부에서 생물학적 활성을 야기하는 물질은 활성 성분에 의해 이해된다. 상기 활성성분은 질병의 예방, 경감, 치료 또는 진단을 위해 사용되는 약품에 의해 이해될 수 있다. 인간 또는 동물에서 약품의 소정의 조제형태는 약제에 의해 이해된다.

본 발명과 관련하여, 생활 기능의 1차적인 유지는 식료품 또는 식품에 의해 설명되는 반면, 기호품은 섭취시 형성되는 안정을 설명한다.

본 발명은 또한 갈락토-만노-올리고당으로 표시되기도 하는 중합도(DP) 15 미만, 특히 2 내지 7을 갖는 만노오스- 및 갈락토오스- 함유 올리고당에 관한 것으로, 이때 만노오스-단위체 β-1,4 및 갈락토오스-단위체는 상기 만노오스-단위체와 α-1,6-결합된다. 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 구강, 위장 및 소장 부위의 가수분해 조건하에서 안정하고, 따라서 실질적으로 변하는 것 없이 대장에 도달할 수 있고, 대장에서 원하는 건강 촉진 활성을 발휘할 수 있다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 소장의 가수분해 조건하에서 안정할 뿐 아니라, α-글로코시다아제(글루코아밀라아제/말타아제 및 사카라아제/이소말타아제)를 더욱 억제한다. 따라서, 이들은 본 발명에 따라 기호품 및 식품의 당혈증 지수를 낮추기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 상피세포에서의 병원균 고착을 감소시키거나 방지할 수 있고, 이를 통한 감염 질병을 예방하고, 그 경과를 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 장내 비이커 세포로부터 점액 분비를 자극하고, 다양한 장내 질환의 경과를 양성으로 만든다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 소장에서 가수분해되지 않고, 변하지 않고 대장에 도달하므로 대장에 존재하는 미생물에 의해 저급 지방산, 특히 부티레이트로 발효된다. 이러한 발효의 결과로서 발생하는 pH 저하 현상은 예를 들면 클로스트리튬과 같은 유해 미생물의 서식 환경을 악화시키고, 동시에 유해 비피도박테리아 및 락토바실루스와 같은 미생물의 서식 환경을 개선시킨다. 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 생활성을 나타내기도 한다. 부티레이트의 생성이 증가함에 따라, 결장암의 생성 및 성장이 감소되거나 저지될 수 있다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 장 부위에서 무기 식료품 성분으로부터의 칼슘 흡수를 개선시키고, 특히 이에 따른 골다공증, 특히 폐경기 후 또는 노인성 골다공증과 같은 초기 골다공증 또는 후기 골다공증의 예방 및 방지를 위해 사용될 수 있어 대단히 유익하다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 한편으로는 면역력을 강화시키고 다른 한편으로는 면역력을 조절하여 염증성 진행을 방지 또는 억제할 수 있어 세포성 면역체계와의 직접 상호작용으로서 유익하게 사용된다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당이 함유되어 있는 기호품, 식품 또는 식료품 및 기타 잘 알려진 기능성 식품에 관한 것이다. 이러한 식품은 예를 들면 버터, 요구르트, 치즈, 과자, 스프 및 소스와 같은 우유 제품, 식빵, 마아가린, 쇼트닝, 잼, 무알코올성 음료수 등을 들 수 있다. 기호품으로서는, 예를 들면 경성 또는 연성 캬라멜, 츄잉껌, 쵸콜릿, 비스켓, 얼음, 포말 당 제품, 당의정, 알코올성 및 무알코올성 음료수 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 갈락토-만노-올리고당이 경우에 따라 약리학적 적절한 기제, 첨가제 또는 보조제와 함께 약제학적 유효량으로 함유되는 약품에 관한 것이다. 이러한 기제, 보조제 또는 첨가제는 예를 들면, 슬립제, 분해제, 증점제, 안정화제, 유제, 보존제, 레시틴, 다용도 감미료, 감미제, 염료, 향료, 방향제, 벌크제, 충전제 등일 수 있다.

상기 약제는 예를 들면, 환제, 캡슐, 정제, 당의정, 좌약, 용액, 현탁액, 유제, 주사액, 주입액, 소적, 즙, 연고, 크림, 겔, 에어로졸, 흡입제 또는 기타 투약형태일 수 있다.

본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체의 외과학적 또는 치료학적 처리를 위한 방법에 사용하기 위한 상기 본 발명에 따른 상기 갈락토-만노-올리고당에 관한 것이다. 본 발명은 또한 제 II형 당뇨병, 감염 질환, 장 질환, 결장 질환, 염증성 질환 및 골다공증의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 따른 상기 갈락토-만노-올리고당의 용도, 및 상술한 목적을 위한 약품의 제조를 위한 상기 갈락토-만노-올리고당의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 박테리아 유래의 효소 활성 물질, 특히 박테리아 유래의 효소학적 작용물질을 사용하여 갈락토만난-함유 원료, 특히 구아검 예를 들면 구아 분말, 카시아검 또는 요하니스빵 밀가루로부터 제조된 갈락토만난의 수용액 또는 현탁액을 가수분해하고, 중합도 15 미만, 바람직하게는 2 내지 7을 가진 만노오스 및 갈락토오스-함유 올리고당으로부터 혼합 수용액을 얻는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 상기 갈락토-만노-올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 동일한 정도의 높은 효율을 가진 갈락토만난-함유 원료, 예를 들면 구아검, 카시아검 및 캐럽 열매 가루로부터 얻어진 갈락토만난을 박테리아 유래의 효소 활성을 이용하여 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당으로 가수분해할 수 있다.

상기 수용액에서 갈락토만난의 농도는 바람직하게는 1 내지 5 %이고, pH 수치는 바람직하게는 5 내지 8이고, 용액의 온도는 바람직하게는 30 내지 40 ℃이다.

본 발명과 관련하여, 효소학적 활성 작용물질 하에서, 거의 또는 부분적으로 정제된 효소 또는 박테리아, 특히 바실루스-세포 또는 살아있거나 죽은 박테리아로부터 얻어진 조추출물은 갈락토만난을 특히 중합도 15 미만, 바람직하게는 2 내지 7을 가진 갈락토-만노-올리고당으로 가수분해할 수 있다. 상기 조추출물은 기계적 용해 방법, 예를 들면 볼밀, 프렌치 압착, 화학적 또는 예를 들면 전기장 또는 초 음파 처리를 통한 전기적 용해 방법과 같은 상술한 방법을 사용하여 얻을 수 있다.

특히 바람직한 본 발명의 실시형태는 바실루스 서브틸리스(Basillus subtilis) 종의 박테리아, 특히 브라운슈바이크 소재의 독일 미생물 및 배양세포 기탁기관에 1999년 12월 6일자로 기탁된 기탁번호 DSM 13182의 바실루스 서브틸리스가 바람직하게 사용된다.

사용된 박테리아는 자연 변형 또는 유전자 변형된 박테리아, 특히 바실루스일 수 있음은 명백하다. 효소 활성 작용물질을 간단히 제조하기 위해, 예를 들면 상기 사용된 박테리아는 항생물질에 대해 내성을 가질 수 있다. 이것은 박테리아 유래의 효소로부터 자연 유래 또는 야생종(wild-type) 아미노산 서열을 나타낼 수 있지만, 자연 변형된 효소에 대해서는 아미노산 변형, 예를 들면 아미노산 결손, 삽입, 역위, 교환 또는 부가를 보이거나 또는 특수 아미노산일 수 있다. 상기 효소는 경우에 따라 글리코실화 등과 같은 개질을 나타낼 수도 있다. 상기 효소는 또한 다른 단백질 또는 펩티드를 갖는 융합 단백질 또는 효소 단편으로서 갈락토만난을 상술한 산물로 가수분해할 수 있다.

본 발명은 또한 갈락토만난의 가수분해를 위한 효소 활성 작용물질의 용도에 관한 것으로, 상기 효소 활성 작용물질은 가수분해를 위해 유리 형태 또는 고정상 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 박테리아, 바람직하게는 바실루스 서브틸루스의 휴지기 세포로 가수분해를 수행할 수 있다. 또한 안정성이 있는 비활성 매트릭스(matrix)에 세포를 고정시킨 다음, 생성된 갈락토만난의 가수분해용 생물 촉매(bio catalyst)를 사용하는 것을 예상할 수 있다. 본 발명에 따르면, 효소 는 또한 박테리아 또는 조추출물이 고정된 효소일 수 있다. 상기 고정화는 기제 결합, 교차결합, 봉입 또는 캡슐화에 의해 수행될 수 있다. 상기 교차결합은 예를 들면 글루타르알데히드로 수행될 수 있다. 기제 결합은 흡착 결합 또는 공유 결합에 의해 수행될 수 있고, 상기 봉입은 예를 들면 겔, 마이크로캡슐 또는 섬유 형태를 갖는 반투과성 막이 사용될 수 있다. 상기 캡슐화된 효소 또는 미생물은 반투과성막을 통하여 기제 용액 및 생성물 용액으로 분리된다.

본 발명은 또한 만노오스 및 갈락토오스-함유 올리고당으로부터 얻어진 혼합물이 크로마토그래피 분리 처리되어, 소정의 중합도를 갖는 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 보다 유리한 구성은 하기 청구범위에 기재되어 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다:

실시예 1: 생물 촉매(biocatalyst)의 제조

바실루스 서브틸리스 SZ 100 (DSM 13182)을 카세인 펩톤(15/g/L), 대두 분말 펩톤(5/g/L), NaCl (5/g/L) 및 구아검(1/g/L)로 이루어진 배지를 갖는 교반 플라스크내 한천-배양액에 접종하고, 교반하 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다.

그후, 상기 교반 배양액을 10 ℓ-발효기로 이송하여, 그와 동일한 조성물의 배지에서 더 배양하였다.

24 시간 동안 성장시킨 다음, 그 세포들을 원심분리하고, 3 % 알긴산 나트륨 용액에서 현탁시킨 다음, 2 %의 염화칼슘 용액에 교반하에서 적가하였다. 바실루 스 서브틸리스(DSM 13182) 세포와 함께 형성된 알긴산 칼슘구(생체 촉매)를 세척, 건조시키고, 냉각시켰다.

실시예 2: 구아검의 가수분해

실시예 1에 따라 제조된 생체 촉매를 구아검-수용액(농도 1 내지 5 %)에서 확대시키고, 온도 37 ℃의 칼럼에 충전시켰다. 다음, 칼럼을 통해 구아검 용액을 흘려줌으로써 연속해서 구아검의 가수분해를 실시하였다. 이러한 흐름을 통해 단당류, 올리고당 및 다당류 함량이 HPLC 분석되고, 다음과 같은 조성이 얻어졌다:

단당류 2 %

올리고당 70 %

다당류 28 %

또한 가수분해는 반(半)연속적 또는 불연속적으로 수행될 수 있다. 후자의 경우, 실시예 1에 따라 제조된 생체 촉매를 구아검-용액이 들어있는 교반 반응기에 접촉시켜 사용한다.

가수분해하기 위해 바실루스 서브틸리스(DSM 13182)로부터 얻어지는 효소 조추출물을 사용할 수 있다. 이때, 발효 후 생체량을 원심분리에 의해 분리하고, 인산-완충액에서 현탁한 다음, 분쇄(초음파, 프렌치 압착기, 볼밀 등)하였다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하고, 더 이상의 정제없이, 얻어진 조추출물이 구아검 용액의 가수분해를 위해 사용된다.

경우에 따라 가수분해한 후, 얻어진 수용액은 원하는 DP가 15 미만, 특히 2 내지 7을 갖는 갈락토-만노-올리고당 이외에, 소량의 고분자량의 구성성분을 함유 한다. 이것은 예를 들면 칼슘이 충전된 크로마토그래피, 강산성 양이온 교환 또는 분별 알코올성 침전 또는 한외여과와 같은 공지된 분리방법에 의해 쉽게 제거될 수 있으므로, DP가 15 미만, 특히 2 내지 7을 갖는 갈락토-만노-올리고당이 수용액 상태에서 순수한 형태로 얻어지고, 공지된 방법(예를 들면, 분무 건조법)으로 건조되어 수득될 수 있다.

실시예 3: 구강, 위장 및 소장에서 갈락토-만노-올리고당의 안정화

구강에서의 안정화

실시예 2에 따라 얻어진 본 발명의 올리고당을 구강-미생물에 대하여 구강 부위에서 부패된 박테리아 유래의 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) DSM 20523 및 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) NCTC 10922 및 치석을 대상으로 검사하였다.

스트렙토코쿠스 뮤탄스 및 스트렙토코쿠스 소브리누스는 액상 DSM-배지92에서 혐기성 조건하, 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 성장 말기에, 세포를 원심분리(15 분, 4000×g)하고, 10 % 20 mM 탄산 완충액, pH 7.5에서 현탁하였다. 이어서, 본 발명의 올리고당 용액(20 mM 탄산 완충액 내 1 %, pH 7.5) 9 ㎖를 1 ㎖ 박테리아-현탁액으로 접종하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 다양한 시점에서, 샘플링하여 올리고당 함량을 검사하였다 (하기 결과를 참조):

3 일 동안 이를 닦지 않은 3 명의 자발적인 남성을 대상으로 치석을 샘플링하고, 그 때 1 ㎖ 올리고당 용액(20 mM 탄산 완충액 내 1 %, pH 7.5)으로 10 ㎎의 치석을 현탁시켰다. 2 시간 동안 37 ℃에서 배양하는 동안, 경과 샘플링을 실시하 였고, 그 올리고당 함량을 조사하였다.

결과:

대조군으로서, 사카로오스를 120 분 이내에서 2 개의 스트렙토코쿠스와 치석의 혼합 배양을 통해 가수분해하는 동안, 2 시간 후 본 발명에 따른 올리고당의 분리를 식별할 수 없었다.

위장에서의 안정성:

위장 통과시 물질의 안정성은 pH 1.0 또는 2.0에서 가수분해를 측정함으로써 알 수 있었고, 대조군으로서 사카로오스를 비교하였다:

이때, 1 % 갈락토-만노-올리고당 용액을 pH 1.0(0.1 M HCl) 및 pH 2.0(0.01 M HCl), 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 60, 120 및 180 분 후, 반응 침전물로부터 샘플링하고, 이로부터 HPAEC를 분석하였다. 이때, 사카로오스 및 1-케스토오스를 대조군으로서 사용하였다.

결과: 가수분해율로서 표시(%):

물질	pH	배양시간[분]
물질	pH	60	120	180
사카로오스	1 2	24 1	55 2	61 7
1-케스토오스	1 2	90 16	100 30	100 43
갈락토-만노-올리고당	1 2	< 1 < 1	< 1 < 1	< 1 < 1

상기 표 I로부터, 갈락토-만노-올리고당은 위장-통과시 손상되지 않았음을 알 수 있었다.

췌장-효소에 대한 안정성:

췌장-분비물은 α-아밀라아제, 바람직하게는 말토오스와 말토올리고당으로 분리되는 α-1,4-글루칸(전분, 글리코겐)과 같은 다른 탄수화물 분리 효소하에서, 대부분의 가수분해효소(hydrolase)를 함유하고 있다.

췌장-효소에 대한 갈락토-만노-올리고당의 안정성 시험을 다음과 같이 실시하였다:

필요한 용액:

·20 mM Na-인산-완충액, pH 7.0과 6 mM NaCl (용액 1)

·용액 1 내 1 % 전분 용액 (줄코브스키(Zulkowski)에 따른 용해성 전분)

·용액 1 내 1 % 갈락토-만노-올리고당

·용액 1에 용해된 0.2 % 췌장액(Fa, 시그마)

반응 침전물:

성분	시험군	대조군
갈락토-만노-올리고당 용액 전분-용액 효소-용액	3.0 ㎖ - 0.1 ㎖	- 3.0 ㎖ 0.1 ㎖

37 ℃에서 열 혼합기(간헐적 교반)에서 210 분간 배양한 후, 15 분에 걸쳐 반응시켰다. 95 ℃까지 가온하고, HPAEC에 의해 시험군을 분석하였다. 이때, 전분 함유 시험군은 미리 95 ℃의 1 M HCl에서 3 시간에 걸쳐 가온하여 완전히 가수분해시켰다.

결과:

물질	분해율(%)
전분 갈락토-만노-올리고당	77 0

상기 표 III은 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당이 췌장 효소에 의해 부식되지 않았음을 나타내고 있다.

실시예 4: 소장-α-글로코시다아제에 의한 분해성

소장에 존재하는 효소 착물 사카라아제/이소말타아제 및 글로코아밀라아제/말타아제에서 생체 내 실험하였다. 소장에 도달하는 이당류 말토오스 및 사카로오스에서 말토올리고당의 일부는 단당류로 분해되고, 이와 같이 혈액 순환시 장벽에 도달할 수 있었다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 효소에 대한 안정성 시험을 다음과 같이 실시하였다:

효소 분리:

효소-착물 사카라아제/이소말타아제 (SI-착물) 및 글루코아밀라아제/말타아제 (GM-착물)를 헤이만(H. Heymann, 논문, 하노버, 1991)의 방법에 따라 돼지-소장으로부터 분리하였다.

소장-α-글로코시다아제에 의한 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 분해성을 다음과 같이 측정하였다:

필요한 용액:

·트리에탄올아민 (TRA) - 완충액, 0.1 M, pH 7.0

·갈락토-만노-올리고당, TRA-완충액 내 1 % 용액

·말토오스, 또는 대조군 물질로서 사카로오스, TRA-완충액 내 1%

·TRA-완충액에 용해된 점액-효소

반응 침전물:

37 ℃ 온도의 1.2 ㎖의 탄수화물 용액에 t = 0에서 효소 착물 사카라아제/이소말타아제 또는 글루코아밀라아제/말타아제의 0.7 U를 부가하고, 혼합하며, 37 ℃에서 배양하였다. 95 ℃까지 15 분간 가열하여 2 시간 후, 반응을 종료하였다. 형성된 단당류 및 사용된 시험 물질을 HPAEC를 이용하여 정량적으로 측정하였다.

결과:

탄수화물	효소 착물	가수분해율(%)
사카로오스 말토오스 말토오스 갈락토-만노-올리고당 갈락토-만노-올리고당	SI SI GM SI GM	98 95 96 < 1 < 1

상기 결과는 SI-효소 착물의 경우, 사카로오스 또는 말토오스, GM-효소 착물의 경우 말토오스의 거의 모든 가수분해의 선택된 조건하에서, 갈락토-만노-올리고당은 상기 2개의 효소 착물에 의해 실질적으로 분해되지 않았음을 보여주고 있다.

실시예 5: 분리된 효소-착물(SI-착물 및 GM-착물)에 의한 분해성

돼지-소장으로부터 분리된 효소 착물 사카라아제/이소말타아제(SI-착물) 및 글루코아밀라아제/말타아제(GM-착물)(실시예 4 참조)는 SI-착물의 경우 사카로오스 또는 말토오스를, GM-착물의 경우 말토오스의 기재 존재하에서 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 억제 시험을 수행하였다. 기재-억제제-비는 모든 경우 10:1 로 하였다.

침전물: - 0.7 ㎖ 기재 용액, 0.1 M Na-인산-완충액 중 1.43 %, pH 7.0

- 0.1 ㎖ 갈락토-만노-올리고당, 1 %

- 0.1 ㎖ 0.1 M Na-인산-완충액, pH 7.0

전(前)배양: 15 분, 37 ℃

바탕 시험의 제거

개시: 0.1 ㎖ 효소용액(침전물 중 0.5 U/ml 말타아제-활성물질)

샘플링: 각각 30 분 및 60 분 후 0.15 ㎖ 샘플링

반응 종료: 95 ℃에서 2 분

분석: HPAEC, 글루코오스, 프룩토오스 각각 10 ppm, 사카로오스, 말토오스 각각 20 ppm 표준용액

결과:

% 억제율	배양 시간
% 억제율	30 분	60 분
SI/사카로오스	24	25
SI/말토오스	26	18
GM/말토오스	0	0

표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 갈락토-만노-올리고당의 존재하에서 SI-효소-착물에 의한 사카로오스 또는 말토오스의 분해가 억제되었다. 이와는 반대로, GM-착물에 의한 말토오스-분해는 갈락토-만노-올리고당의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다.

실시예 6: 상피세포에서 병원균의 축적 방지

상피세포

아침 소변을 원심분리하여 인간 비뇨기계 상피세포를 얻었다.

병원균

각각 10⁹ 병원균/㎖를 가진 현탁액으로서 스타필로코쿠스 아우레우스 2 균주 및 E. 콜라이 2 균주.

시험 방법

상피 세포 및 병원균 현탁액을 분해하고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이후, 고착되지 않은 병원균의 상피세포를 막 여과(8 μ)법에 의해 분리하였다. 생리식염수를 사용하여 상기 필터를 수 차례 세척하고, 그 안에 상피세포를 현탁시켰다. 생리 식염수 내 현탁액을 원심분리한 후, 슬라이드 상에 펠렛을 놓고, 김사(Giemsa) 염색하였다. 50 개의 상피세포 상에 고착된 병원균의 수를 세었다. 이 수치를 정지 값(quiescent value)으로 하였다. 대조군으로서, 병원균 현탁액을 첨가하지 않은 상피세포를 사용하였다.

먼저, 다양한 농도의 갈락토-만노-올리고당 용액으로 상피세포를 1, 2 또는 3시간 동안 배양하였다. 이후, 이들을 병원균 현탁액으로 분해시키고, 상술한 바와 같이 더 처리하였다. 50개의 상피세포에 대해 고착된 병원균의 수를 측정값으로 하였다.

결과:

비교를 위하여, 예를 들면 라피노오스, 니스토오스 및 이소멜레지토오스와 같이 사용된 "중성" 탄수화물은 병원균 축적에 있어서 어떠한 감소도 확인되지 않았다. 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당으로, 시험된 모든 미생물의 고착을 거의 완전히 방지될 수 있었다.(저지율: > 95%)

실시예 7: 대장에서의 점액 분비 촉진

막 도살된 돼지의 대장에서 말단부로부터 1 ㎠ 면적의 조각을 완전히 세척하였다. 이렇게 준비된 조각을 클로로암페니콜 및 암피실린(각 50 ㎍/㎖)을 첨가한 한크스-완충액(Hanks-buffer)에서 산소 기류하, 37 ℃에서 5 시간 동안 교반하면서 배양하였다. 상기 완충액은 본 발명에 따라 제조된 갈락토-만노-올리고당의 점액 분비에 대한 촉진 효과의 1 %를 포함하였다. 대조군으로서, 시험 침전물 내 비교를 위해 10 개의 장(腸) 조각을 사용하였다. 상기 침전물 중 하나는 염증성 장 질환의 치료를 위해 통상적으로 사용되는 하이드로코티존(hydrocortison)을 함유시켰다.

점액 분비를 높이기 위해, 전체 탄수화물 함량의 증가를 측정하였다. , 다양한 시점에서 배양 시험 중에 샘플 10 ㎕에 레소르신 용액 20 ㎕(6 ㎎/㎖) 및 100 ㎕ 75 % 황산을 부가하고, 60 분간 80 ℃에서 배양한 후, λ 450 nm에서 흡광(extinction)을 측정하였다.

결과:

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당은 대조군에 비해 약 2.4 배 정도 점액 분비를 상승시켰다. 하이드로코티손에 의한 상승은 약 5.3 배에 달했다. 코르티코스테로이드(corticosteroide)와 같은 물질에 대한 새로운 시험을 통해, 세포배양 에 있어서 상기 물질이 내인성(endogenous) 점액 분비를 자극한다는 사실을 결장 상피-생체검사로부터 알 수 있다(Finnie I. A., et al. Clinical Science, 91 (996), 359-364). 따라서, 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당으로 이루어진 식료품 성분이 염증성 장 질환에 대하여 유익한 영향을 주었음을 알 수 있었다.

실시예 8: 대장 내 미생물에 대한 영향

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 대장내 미생물 조성에 대한 영향을 조사하기 위해, 인간 분(糞)에서 발생하는 박테리아의 다양한 순수배양물을 유일한 탄소원으로서 갈락토-만노-올리고당을 갖는 하기 조성의 배지에서 배양하였다:

트립티카아제/트립톤 1.50 g

효모-추출물 1.00 g

KH₂PO₄ 0.24 g

Na₂HPO₄ 0.24 g

(NH₄)₂SO₄ 1.24 g

NaCl 0.48 g

MgSO₄·7H₂O 0.10 g

CaCl₂·2H₂O 0.06 g

FeSO₄·7H₂O 2 ㎎

레자주린 1 ㎎

시스테인/HCl 0.50 g

비타민 용액 (DSM 141에 의함) 0.50 ㎖

추적 원소(trace element) 용액(DSM 141에 의함) 9.00 ㎖

NaHCO₃ 2.00 g

갈락토-만노-올리고당 5.00 g

증류수 1000 ㎖까지, pH 7.0

이 시험은 하기 미생물을 대상으로 시험하였다:

박테로이데스 아사카롤리티쿠스(Bacteroides asaccharolyticus)

박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis)

박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)

박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides tetaiotaomicron)

비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)

비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)

비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)

비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)

비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum)

에우박테리움 렌툼(Eubacterium lentum)

에우박테리움 리모숨(Eubacterium limosum)

락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei)

락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum)

클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)

클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)

클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens)

엔테로박테르 클로아카에(Enterobacter cloacae)

에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)

클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)

살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)

세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)

스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)

상기 미생물들은 혐기성 조건하 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 검사 중에, 소정의 시점에서 pH 수치와 올리고당 농도를 조사하였다. 이외에, 시각적 밀도를 통해 세포 수의 증가를 측정하였다.

다만, 비피도박테리아와 2 개의 락토바실루스는 본 발명에 따른 갈락토-만노 -올리고당을 물질 변화시킨 후, 성장시키기 위해 사용하였다. 기타 모든 시험 박테리아는 배지에서 어떠한 성장도 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 갈락토 -만노-올리고당을 함유하는 식료품은 대장-미생물의 조성을 양성으로 변화시킬 수 있다.

실시예 9: 면역력의 강화

식균작용의 강화

식균세포(단핵 백혈구, 과립성 백혈구)의 기능에 대한 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 영향을 식균성 분석을 통해 조사하였다. 식균작용-자극을 위해 갈락토-만노-올리고당으로 식세포를 사전에 배양하였다(100 ㎍ 글리칸/0.11 ㎖ 순혈종, 37 ℃, 10 분). 정지 값을 위해, 얼음조에서 10 분 동안 배양하였다. 이후, 하기 조건하에서 식균성 분석을 수행하였다:

전배양 용액 0.11 ㎖를 10 분 동안 얼음조에 방치한 다음, 옵소닌(opsonin)화하지 않은 E. 콜라이(플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지, ㎖ 당 10⁹, ORPEGEN) 또는 0.01 ㎖의 옵소닌화하지 않은 스타필로코쿠스 아우레우스(㎖ 당 15×10⁶, FITC-표지, MOLECULAR PROBES)를 첨가하였다. 침전물을 37 ℃에서 10 분간 배양하였다. 침전물을 3 ㎖ 세척 완충액(ORPEGEN)으로 2 회 세척하고, 5 분 동안 4 ℃에서 250xg에서 원심분리하였다.

침전물 중 적혈구의 용균을 2 ㎖ 용균 완충액(ORPEGEN)으로 20 분간 상온에서 실시한 다음, 침전물을 1 회 세척하였다. 침전시키기 위해, 0.2 ㎖ DNA-염색 용액(Propidiumjodid)을 사용하였고, 10 분 동안 얼음조에 방치하였다.

순환 혈구계산기(circulatory cytometer, 여기 상태: 488 nm, 방출 FL-1: 520 nm)로 측정하였다. 이때, 단핵 백혈구와 과립형 적혈구 사이에 분리되지 않고 구별될 수 있다(전방 산란 (FSC) 대 양방향 산란(ESC)). 결과들을 식균 양성 세포의 %로서 나타낸다(하기 표 6 참조).

식균 활성이 없는 대조 물질로서 라피노오스를 사용하였다.

식균성 분석

갈락토-만노-올리고당의 영향(100 ㎍/침전물)
세포 유형	단핵 백혈구	과립형 백혈구
박테리아 형태	E. 콜라이	E. 콜라이	스타필로코쿠스 아우레우스
	비-옵소닌화	비-옵소닌화	비-옵소닌화
대조군 4 ℃ 대조군 37 ℃ 갈락토-만노-올리고당 라피노오스	8.0 21.5 35.0 22.0	1.0 19.5 33.5 17.0	0.5 27.0 42.5 30.0

상기 결과는, 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당을 가진 단핵 백혈구 또는 과립형 백혈구의 전배양 후, 식균작용이 자극됨을 보여주고 있다.

고착 분석

고착분석에서, 상피 세포(결장암-세포주 HT 29) 상에서 B-세포주(예를 들면 R도) 및 정상 인간 B-림프구의 고착 거동에 대한 본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당의 영향을 측정하였다. 형광 측정을 위해, 사용된 오버레이 분석(Overlay-assay)에서 림프구를 칼세인(Calcein) 표지하였다.

먼저, 고착된 결장 세포주(HT 29)로 덮었다. 동일유량이 형성될 때까지 배양하였다(37 ℃에서 철야). 이때 무-혈청 배지에서 실시될 수 있다. 침전물: 1×10⁴ 세포. 이때, 고착된 세포를 하기 분석 전에 PBS(인상 완충된 생리 식염수) 용액으로 세척하고, 이어서 PBS + 1 % 소혈청-알부민(BSA)으로 상온에서 1 시간 동안 저지하였다.

시험하기 위한 B-세포주 또는 분리된 B-림프구를 칼세인 형광 표지하고(2 ㎖ RPMI-배지 + HEPES + 10 ㎕ 칼세인 AM 중 1×10⁷ 세포, 30 분, 37 ℃, 이후 2× HBSS(한크스-완충액) + 0.25 % BSA 세척) 및 0.5 ㎖ PBS + 0.25 % HBSS 중 1×10⁶ 세포를 1시간 동안 배양하였다. 교반기 상에서 10 초간 배양판을 위치시키고, PBS 중 0.5 ㎖ 0.2 % 글루타르알데히드 + 0.2 % BSA를 첨가하고, 교반기 상에서 10 분간 배양하였다. 상기 판의 형광은 형광측정장치에서 측정하였다(494, 517 nm).

최초의 측정은 100 % 수치에 상응한다. 다음은, 상기 판을 4 번 세척하고, 새로이 측정하였다. 이 측정이 자가 형광치(표지되지 않은 세포)를 제하고 100 %에 대한 %로 주어지는 특정 고착에 해당한다. 대조물질로서 갈락토오스 또는 글루코오스를 사용하였다.

결장 세포주 HT 29에 대한 Reh의 고착

갈락토-만노-올리고당의 영향

(10 ㎍/침전물)

당	평균치(%)	SD	지수
탄소화물	46	6.3	1.00
D-글루코오스	47	6.0	1.11
D-글루코오스	51	7.0	1.12
갈락토-만노-올리고당	93	9.7	2.02

대조물질에 대하여, D-글루코오스 및 D-갈락토오스는 갈락토-만노-올리고당의 존재하에서 결장 세포주 HT 29에 대한 B-세포주(Reh)의 명백히 강화된 고착 거동을 보여주었다.

실시예 10: 칼슘 흡수의 개선

시험 준비:

약 100 g 중량의 웅성 스프래그-돌리 래트를 탈염수 및 4 일간 익숙토록 한 하기 표준 식이에 자유로운 접근이 가능하도록 유지하였다:

카세인 250 g

옥수수유 50 g

광물성 염 혼합액 (Ca 및 Fe 없음) 25 g

탄산칼슘 7.5 g

비타민 혼합액 10 g

비타민 E 1 g

콜린비타르타레이트 4 g

사카로오스 1000 g까지

이후, 이들을 2 개의 군으로 나누었다. 제 1 그룹은 위장을 거의 제거하였고 (위장-분비-군), 제 2 그룹은 대조군으로서 사용하였다(대조군). 수술 후, 상기 래트를 24 시간 동안 식료품과 물이 없는 조건에서, 2 내지 3 일간은 우유로, 또한 14 내지 16 일간은 4 일간의 익숙토록한 표준 식이를 유지하였다:

시험 방법

시험군을 다시 2 개의 군으로 나누었다. 상기 군 중 1 군을 표준식이로 더 유지시킨 반면, 다른 1 군은 갈락토-만노-올리고당을 부가한 식이(50 g/㎏ 식이)를 유지하였다. 3 주간의 시험 기간 중, 3 일간 분(糞) 샘플을 회수하고, 분리된 칼슘을 검사하였다. 검사 말엽에, 맹장(caecum)의 함량을 분석하였다.

결과:

표준 식이로 유지된 위장-분비-군의 칼슘 흡수는 대조군의 칼슘 흡수의 약 1/4에 불과하였다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당을 혼합한 경우, 위장-분비군의 칼슘 흡수는 약 2 배로 증가하여 대조군의 약 50 % 정도로 상승하였다.

본 발명에 따른 갈락토-만노-올리고당-함유 식이로 유지되는 래트는 칼슘 함량의 분석에서 상당히 증가된 프로피온산 농도를 나타내었다. 이것은 측정된 칼슘 흡수와 유의적인 관련이 있다.

Claims

갈락토만난의 수용액 또는 현탁액을 제조하고, 이를 DSM에 기탁번호 13182로 기탁된 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 종 균주의 박테리아로부터 얻어진 효소 활성 작용 물질에 의해 가수분해하여, 중합도(DP) 15 미만을 갖는 만노오스- 및 갈락토오스- 함유 올리고당의 혼합물의 수용액을 얻는 단계를 포함하는,

갈락토만난으로부터 만노오스- 및 갈락토오스- 함유 올리고당을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 중합도(DP)가 2 내지 7인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효소 활성 작용 물질이 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 종의 박테리아로 구성되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효소 활성 작용 물질이 이들 박테리아의 세포로부터의 조추출물의 갈락토만난-가수분해 효소인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효소적 가수분해가 이들 박테리아의 고정상 세포, 고정상 조추출물, 또는 고정상 효소로 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 얻어진 갈락토만노-올리고당의 혼합물이 크로마토그래피 분리 방법에 의해 처리되는 방법.
중합도 15 미만을 갖는 β-1,4-결합된 만노오스-단위체와 α-1,6-결합된 갈락토오스-단위체를 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 따라 구아검으로부터 제조될 수 있는 갈락토만노-올리고당.
제 7 항에 있어서, 중합도 2 내지 7을 갖는 갈락토만노-올리고당.
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 DSM 13182로부터 생산되고, 구아검, 카시아검, 및 캐럽 열매 가루의 갈락토만난을 동등한 효율로 가수분해할 수 있는 효소.
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 DSM 13182의 박테리아의 세포 파쇄에 의하여 생산되고, 구아검, 카시아검, 및 캐럽 열매 가루의 갈락토만난을 동등한 효율로 가수분해할 수 있는 조추출물.
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 DSM 13182.
제 7 항에 따른 갈락토만노-올리고당과 약제학적으로 허용되는 기제를 포함하며, 감염 질환의 예방, 장 질환의 예방, 결장암 발병의 예방, 일반 감염원에 대한 면역력의 강화, 염증성 질환의 예방 또는 골다공증의 예방을 위한 약제학적 조성물.
제 7 항에 따른 갈락토만노-올리고당을 포함하는 식품 또는 기호품.
제 13 항에 있어서, 상기 식품 또는 기호품이 식품 또는 기호품의 당혈증 지수(glycemic index)를 낮추기 위한 것임을 특징으로 하는 식품 또는 기호품.
제 13 항에 있어서, 상기 식품 또는 기호품이 감염 질환의 예방, 장 질환의 예방, 결장암 발병의 예방, 일반 감염원에 대한 면역력의 강화, 염증성 질환의 예방 및/또는 골다공증의 예방을 위한 것임을 특징으로 하는 식품 또는 기호품.
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