KR860000065B1 - 비피드 박테리움균의 증식 촉진 물질의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

비피드 박테리움균의 증식 촉진 물질의 제조법

제1도 β-갈락토시다제로서 락토오스를 처리했을 때의 반응시간과 당류의 수득량과의 관계를 도시한 그라프.

제2도 올리고당의 겔여과의 결과를 도시한 그라프.

제3도 실시예 2의 실험 결과를 도시한 그라프.

제4도 실시예 3의 실험 결과를 도시한 그라프.

제5도 실시예 4의 실험 결과를 도시한 그라프.

제6도 실시예 5의 실험 결과를 도시한 그라프.

본 발명은 비피드 박테리움균의 증식을 촉진하는 작용을 갖는 물질의 제조법에 관한 것이다.

비피드 박테리움 균의 증식을 촉진하는 작용을 갖는 물질(이하, 비피두스(bifidus) 증식인자라 한다)로서는 종래부터 여러가지가 보고되어 왔으며, 이들의 제조법 또는 이들을 함유시킨 분유 등의 제조법도 다수 제안되어 왔다(특공소 41-32908호, 45-6510호, 45-6865호, 45-21606호, 49-40956호, 49-40957호 등).

그러나 종래 보고된 비피두스 증식인자의 대부분은 생체외의 영양실험에 의해 효과가 확인되었으며, 생체내의 활성에 대해서는 불명하던가 극히 불충분한 것이었다. 비피드 박테리균은 인체 장내에서 생육되는 유용 세균으로, 그의 생리적 의의와 특히 인공영양 유아의 장내 세균중 이 균이 차지하는 비율을 높이는일에 노력이 경주되어 온 것에 대해서는 새삼스럽게 말할 나위는 없는 것이다.

따라서 인위적으로 음식물이나 영양기 등에 함유시키는 비피두스 증식 인자로서는 생체외에 있어서의 비피드 박테리움 균의 배양에만 이용되는 경우는 차치하고라도, 생체내에 있어서도 확실하고 또한 충분한 효과가 기대되는 일은 바람직하고, 이러한 관점에서 보다 우수한 비피두스 증식인자의 개발이 강하게 열망되어 왔다.

본 발명의 목적은 전술한 열망에 호응할 수 있고 생체 내에서 고활성을 나타내는 비피두스 증식인자를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 아스페르길루스. 올리제가 생산한 β-갈락토시다제로서 락토오스 또는 글루코오스 함유 물질을 처리하여 일반식 Gal-(Gal)_n-Glc(단, 식중 Gal은 갈락토오스 잔기, Gal는 글루코오스 잔기 n는 1 내지 4의 정수를 각각 나타냄)로서 표시되는 올리고당을 유효성분으로 함유하는 비피드 박테리움 균의 증식 촉진물질의 제조법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비피드 박테리움균 증식 촉진 물질중의 유효성분 즉, 비피두스 증식인자인 상기 올리고당의 대부분은 본 발명자들이 락토오스에 β-갈락토시다제를 작용시켰을 때에 가수분해 반응과 함께 일어나는 전이반응에 대하여 연구를 행하는 도중에 처음으로 발견해 낸 것이다. 상기 전이반응에 대해서는 1951년에 Wallenfels가 보고한 이래로 다수가 보고되어 왔으나, 현재까지 분리 확인이 보고되어 왔던 전이 올리고당은 Gal-(β-1, 2)-Gal, Gal-(β-1, 3)-Gal, Gal-(β-1, 6)-Gal, Gal-(β-1, 3)-Gal, Gal-(β-1, 6)-Gal의 당류와 Gal-(β-1, 6)-Gal-(β-1, 4)-Gal, Gal-(β-1, 6)-Gal-(β-1, 6)-Glc의 3당류이다(괄호 내는 갈락토시드 결합의 상태를 나타낸 것이다.

4당류에 대해서는 Huber씨들이 그의 존재를 확인하여 왔으나, 구조에 대해서는 명확치가 못하며, 5당류 이상의 다당류의 생성을 확인한 예는 없다. 그리고 이들의 보고 내용은 전이기구의 해명과 생성한 올리고당의 구조연구에 그치는 것에 지나지 않으며, 전이 올리고당과 비피드 박테리움 균의 증식과의 관계에 대하여는 보고되어 있지 않다.

비피두스 증식인자인 상기 일반식을 갖는 올리고당(이하, 간단히 올리고당이라고 말할 때는 이 특정의 올리고당을 가리킨다)은 아스페르길루스, 올리제가 생성한 β-갈락토시다제로서 락토오스를 처리하면 생성된다.

이 처리를 완료한 후의 반응혼합물 중에는 미반응의 락토오스와 가수분해에 의해 생성한 갈락토오스 및 글루코오스도 존재하기 때문에 비피두스 증식인자로서 고활성의 것을 얻기 위해서는 효소처리 종류 후에 적당히 정제하는 방법, 올리고당 생성율이 높은 효소처리 조건을 택하는 방법 또는 이들의 방법을 조합시킨 방법 등에 의해, 올리고당의 함유율이 높은 것으로 하면 좋다.

다음에 본 발명에 의해 비피드 박테리움 균의 증식 촉진 물질을 제조하는 방법에 대하여 상세하게 서술하겠다.

β-갈락토시다제로 처리하는 락토오스로서는 특히 고순도의 것을 사용할 필요는 없고, 통상 시판되고 있는 것을 그대로 사용할 수가 있다. 또 전유, 탈지유와 같이 락토오스를 1성분으로서 함유하는 물질도 원료로서 사용할 수가 있다.

효소처리를 행하는 경우, 기질 농도는 10 내지 50% 정도, pH는 3 내지 6.5, 효소 농도는 1 내지 100units/ml, 온도는 20 내지 50℃가 적당하다.

반응시간을 올리고당의 수율에 큰 영향을 미친다. 효소 처리의 1예에 있어서의 반응 시간과 생성당류의 양과의 관계를 도시한 제1도로 부터 명백한 바와 같이, 반응 초기에는 글루코오스, 갈락토오스 및 올리고당이 거의 직선적으로 증가하지만, 그후는 모두 약간 복잡한 곡선을 나타내며, 올리고당은 어느 시점부터는 서서히 감소하는 경향을 나타낸다. 올리고당의 수율이 최대로 되는 시간은 기타의 반응조건에 따라 다르기 때문에 최적 반응 시간은 실험에 의해 확인하는 것이 바람직하다.

또 반응 혼합물 중의 올리고당은, 이를 테면 박층 크로마토그래피에 의해 기타의 성분과 성분과 분리한 후, Anthrone법에 의해 정량할 수가 있다. 효소반응은 처리액을 약 90℃ 이상으로 5 내지 10분간 가열함으로써 정지시킬 수가 있다.

효소처리를 종료한 반응 혼합물은 그대로 또는 적당히 농축하거나 또는 건조하여 분말화함으로써 비피두스 증식인자 또는 이들을 함유하는 조성물(예를 들면, 유제품)로서 이용할 수가 있으며, 필요에 따라서는 유효성분인 올리고당 농도를 높이기 위한 정제를 행하여도 좋다.

정제는 여러가지의 방법에 의해 행할 수가 있는데, 이를 테면 반응 혼합물을 이온 교환수지로 처리하여 예비적으로 정제한 후, 활성탄 칼럼에 통과시킴으로서 올리고당을 흡착시키고 다음에 알코올 수용액으로 용출시키는 방법이 있다.

또 반응 혼합물에 단당류 및 2당류를 자화하는 미생물을 접종하고 배양하여 단당류 및 2 당류를 소비시킴으로써 올리고당의 단리를 용이하게 하는 방법도 있다.

다음에 본 발명에 다른 조성물 중의 올리고당에 대하여 표준적인 조건에서 행한 후기 실시예 1에 의한 올리고당의 분석예를 기재하여 설명하겠다.

(1) 분자량 분포

Bio-Gel P-2에 의한 겔 여과의 결과를 제2도에 도시하였다. 크로마토그램의 피이크 A, B, C는 각각 3당류, 4당류, 5당류에 상당하며, 이들 피이크의 면적비로 부터 산출한 구성비는 3당류가 약 55%, 4당류가 약 32%, 5당류 이상이 약 13%이었다.

(2) 구성당

락토오스, 올리고당(미분별한 것), 올리고당 중의 3당류 구분과 4당류 구분을 0.5M HCl 중 100℃에서 4시간 가수분해한 경우 및 β-갈락토시다제로서 500℃에서 4시간 가수분해한 경우의 생성당의 몰비를 제1표에 나타내었다. 이 결과로 부터 올리고당중의 3당류, 4당류 및 5당류의 글루코오스와 갈락토오스의 몰비는 각각 1 : 2, 1 : 3 및 1 : 4임을 알 수가 있다.

[제1표]

(3) 구성당의 결합 상태

3당류 중의 주성분(활성탄 칼럼 크로마토그래피로 분리된 것)을 부분적으로 산 가수분해하여 얻은 생성물로 부터 글루코오스와 갈락토오스외에 락토오스와 Gal-(β-1, 6)-Gal이 확인되었다. 이 결과와 완전히 가수분해한 물질에 있어서의 글루코오스와 갈락토오스의 비가 1 : 2인 사실로 부터 이의 3당류의 구조는 Gal-(β-1, 6)-Gal-(β-1, 4)-Glc인 것으로 추정되었다.

똑같이 하여 다수의 올리고당 성분에 대한 분석을 행한 결과 올리고당은 상기 일반식으로 표시되며, 갈락토오스-갈락토오스 간의 결합은 β-1, 3 결합, β-1, 4 결합 또는 β-1, 6 결합으로 β-1, 6 결합이 주이며, 갈락통스-글루코오스간의 결합은 β-1, 3 결합, β-1, 4 결합 또는 β-1, 6 결합으로 β-1, 4 결합이 주라는 것이 확인되었다.

이상 상술한 바와 같은 본 발명의 물질중의 올리고당은 단리된 것에 대하여 검토해본 한도에 있어서, 개개의 올리고당 단독으로 비피두스 증식인자로서 작용함은 물론 각종의 올리고당 혼합물 그대로도 우수한 비피드 박테리움균 증식 촉진작용을 나타낸다.

본 발명의 물질중의 올리고당이 비프두스 증식인자로서 특히 우수하다는 점은 그의 작용이 생체외는 물론 생체내에 있어서도 극히 현저하다.

본 발명에 따른 물질의 비피드 박테리움균 증식 촉진 작용은 비피 박테리움 균의 종류와는 거의 무관계하며, 비피드 박테리움 브리베, 비피드 박테리움, 비피덤, 비피드 박테리움, 인팬티스, 비피드 박테리움, 아돌레 센티스 등 모든 인체장내 정착성 비피드 박테리움 균에 대하여 발휘된다.

본 발명에 따른 물질은 고도로 정제된 올리고당 그 자체외에 올리고당을 1성분으로 함유하는 임의의 혼합물, 예를들면 락토오스 또는 락토오스 함유물질을 β-갈락토시다제로 처리하여 올리고당을 생성시킨 반응생성물 그 자체 또는 그의 가공물로 구성되는 분유, 발효유 등의 음식물, 약제 등 또는 정제 올리고당을 첨가시킨 임의의 음식물, 약제 등을 들 수가 있다.

이하 실시예를 열거하여 본 발명을 설명하겠다.

또 실시예 중에 있어서는 "비피드 박테리움"을 "B"로 약기하였다.

[실시예 1]

3.6kg의 락토오스를 약 6ℓ의 온수에 용해하고, 1M-초산 완충용액(pH 4.6) 50ml, β-갈락토시다제 10만 단위 및 물을 첨가하여 10ℓ로 하고, 37℃에서 5시간 반응시켰다. 다음에 반응액을 가열하여 효소를 변성시키고, 변성 단백질을 여별한 후, 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지의 칼럼을 통과시켰다.

통과액은 30×30cm의 활성탄 충전칼럼에 일야 접촉시키고, 활성탄을 탈이온수 60ℓ로 수세하여 단당류를 용출시킨 후, 5% 에탄올 60ℓ, 다음에 50% 에탄올 60ℓ로 용출시켰다. 이 50% 에탄올 용출구분을 약 7ℓ로 농축하고, 공경(孔徑) 0.2μ의 박막거르게로 무균 여과한 후, 다시 이온 교환하여 투명한 당액을 얻었다. 이것을 다시 2.5μ까지 감압 농축한 점조액을 다시 박막 거르게로 여과하여 여액을 동결 건조시킴으로써 백색의 올리고당 분말(이하, TOS라 한다)을 얻었다.

[실시예 2]

무균 Fischer게 성숙 암컷 쥐 6마리에 인분으로 부터 분리한 세균 10종(B. 브리베 함유)을 투여하여 장내에 이들의 균을 정착시킨 후, (1) 락튜로오스의 3% 수용액 (2) 실시예 1에서 제조한 TOS의 3% 수용액 (3) 락토오스의 3% 수용액을 (1)→(3)의 순번으로 각각 1주간씩 매일 투여하였다. 투여량은 고형물로서 0.6g/일. 꼬리로 하여 투여물질을 교체할 때에는 1주간의 공백기간을 두었다. 이 사이 쥐의 분(糞)을 재취하여 분증의 B. 브리베의 생균수를 측정하였다. 그 결과를 제3도에 도시하였다.

제3도로 부터 명백한 바와 같이 TOS를 투여함으로써 분중의 B. 브리베 균수는 10배로 증가한다. 락토오스 투여에서도 균수증가는 관찰되나 극히 근소하며, 락튜로오스 투여에서는 거의 변화가 관찰되지 않는다.

[실시예 3]

통상의 Fischer게 성숙 수컷 쥐 6마리를 사용하여 다음과 같은 실험을 행하였다. 또 투여한 B. 균은 B. 브리베 또는 B. 인팬티스이며, 이들은 VL-G 배지에서 48시간 배양 후 원심 분리하여 얻은 균체를 우유배지에 부유시켜 투여하였다. 또 투여량은 균수가 2×10⁸/일, TOS가 5% 수용액 20ml/일이다.

(a) 최초에 균액만을 1일만 투여하였다.

(b) 제2주는 균액만을 매일 투여하였다.

(c) 제3주는 균액과 TOS를 매일 투여하였다.

(d) 제4주는 TOS만을 매일 투여하였다.

이 사이에 쥐의 분중의 B균(투여한 균주의 것)의 생균수를 측정한 결과를 제4도에 도시하였다.

제4도로 부터, 균액과 TOS의 병행 투여에 의해 장내의 B균 수는 현저하게 증가되며, 그 후 균액의 투여를 증가하여도 균수가 높게 유지됨을 알 수가 있다.

[실시예 4]

건강한 성인 5인에 대하여 다음과 같은 실험을 행하였다. 또 투여한 균액은 실시예 3의 경우와 같이 하여 얻은 B-브리베의 것이다.

실험일정 :

1주째…균액만 투여 2주째…균액 및 TOS(3g/일)을 투여 3주째…균액 및 TOS(10g/일)을 투여

투여균수 : 10⁹/일

TOS 투여방법 : 미온탕에 용해하여 주식 후에 복용

측정 : 각 주 3일째, 5일째 및 7일째에 각 사람의 대변중의 B. 브리베균수를 측정하여 그 주에 있어서의 평균 균수를 구하였다.

실험의 결과는 제5도에 도시한 바와 같으며, TOS의 투여에 의해 장내의 B균이 현저하게 증가됨을 알 수가 있다.

[실시예 5]

건강한 성인 5인에 대하여 다음과 같은 실험을 행하였다.

실험일정 :

1주째…TOS 무투여 2주째…TOS 3g/일을 투여 3주째…TOS 10g/일을 투여

투여방법 : 실시예 4와 동일

측정 : 실시예 4와 같이 대변중의 총 B 균수를 측정함. 실험 결과를 제6도에 도시하였다. 제6도로 부터 TOS의 투여에 의해 사람의 장내에 항상 존재하는 B균수가 증가됨을 알 수가 있다.

[실시예 6]

환원 탈지유 1000ℓ에 아스페르길루스. 올리제의 β-갈락토시다제 1000만 단위를 첨가하고 2시간 동안 40℃에서 유지한 후, 가열하여 효소를 비활성화 시킴과 동시에 살균하였다. 다음에 배양 탱크에 옮기고, B균의 종군을 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고, 배양종료 후 감미제 등을 첨가하여 균질화 함으로써 올리고당과 B균을 함유하는 발효유를 얻었다.

Claims (1)

1. 아스페르길루수, 올리제가 생산한 β-갈락토시다제로서 락토오스 또는 락토오스 함유 물질을 처리함을 특징으로 하는 일반식 Gal-(Gal)_n-Gal(식중, Gal은 갈락토오스잔기, Glc는 글루코오스 잔기, n은 1~4의 정수를 각각 나타낸다)로 표시되는 올리고당을 유효성분으로 함유하는 비피드 박테리움균의 증식 촉진물질의 제조법.

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