JP2722110B2 - 増殖促進剤およびその製造法 - Google Patents

増殖促進剤およびその製造法

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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、乳酸菌およびビフィドバクテリウム菌の増
殖促進剤に関するものである。
〔従来の技術〕
人腸内の菌叢を構成する細菌である乳酸菌やビフィド
バクテリウム菌は、腸内で種々の有益な生理的役割を演
じている。そこで、これらの有用細菌を腸内に供給して
健康増進に役立たせるため、これらの菌の生菌を含有す
る乳酸菌飲料、発酵乳、菌製剤等の摂取が行われてい
る。しかしながら、単に菌製剤等を摂取しただけでは腸
内菌叢の改善にはつながらない場合があるとも言われて
おり、摂取菌を腸内で旺盛に増殖させるためには、その
菌が優先的に資化しうるが人腸内で消化吸収されにくい
選択的糖源を増殖促進剤として同時摂取するのが望まし
いとされている。
従来、乳酸菌については、酵母エキス、ある種のペプ
チド、果実や野菜のジュースなどが増殖促進作用を有す
る物質として知られているが、これらは、発酵乳等の製
造工程における乳酸菌の増殖を促進するために使われる
ことがあるにすぎず、人腸内での乳酸菌の増殖促進に有
効であるとは考えられていない。
ビフィドバクテリウム菌については、乳糖にβ−ガラ
クトシダーゼを作用させたときβ−ガラクトシル転移反
応によって生成する下記一般式のガラクトオリゴ糖が、
in vivoにおいても有効な増殖促進剤として提案され
(特公昭58−20266号公報)、実用化されている。
Gal−(Gal)n−Glc (但しGalはガラクトース残基、Glcはグルコース残基、
nは1〜4の整数を表す。) このガラクトオリゴ糖は、ビフィドバクテリウム菌の
選択的糖源であり、乳酸菌には利用されないとされてい
る。
乳糖をβ−ガラクトシダーゼで処理した場合、上記ガ
ラクトオリガ糖とともに加水分解反応による単糖類と転
移反応による二糖類も生じる。生成する二糖類は、一般
式Gal−Glc(ただし、ガラクトース残基とグルコース残
基との結合は、乳糖においてはβ1→4結合であるのに
対し、β1→6結合、β1→3結合、またはβ1→2結
合である。)で示されるもの、および一般式Gal−Galで
示されるものである(この明細書では、これら乳糖から
転移反応によって生成する二糖類をガラクトシル二糖と
いう。)。
ガラクトシル二糖はまた、ヨーグルトやラクターゼ処
理乳に微量含まれていることが報告されている。
しかしながら、ガラクトシル二糖が腸内細菌とくに乳
酸菌やビフィドバクテリウム菌に対していかなる作用を
するのかは知られていなかった。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、乳酸菌にもビフィドバクテリウム菌
にも有効な、新規な増殖促進剤およびその製造法を提供
することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用さ
せて生成させた種々のガラクトシル二糖をカラムクロマ
トグラフィーによって分離し、乳酸菌、ビフィドバクテ
リウム菌をはじめとする各種腸内細菌や酪農乳酸菌によ
る資化性を調べた。その結果、ガラクトシル二糖は人由
来のすべての菌種のビフィドバクテリウム菌、および乳
製品や整腸剤に利用されている乳酸菌のすぐれた生育栄
養源となることを見いだした。さらに、腸内での増殖が
難しいとされている乳酸菌について、人の糞便培地を用
いた増殖試験の結果、腸内での増殖の律速因子はビタミ
ンやペプタイドなどの微量要素ではなくて炭素源である
こと、および、ガラクトシル二糖を炭素源としたときに
特に生育が良好であることを確認した。
本発明は上記知見に基づくものであって、一般式Gal
−Glcで示されるガラクトシル二糖および一般式Gal−Ga
lで示されるガラクトシル二糖からなり(ただし両式に
おいてGalはガラクトース残基、Glcはグルコース残基を
表す)、上記一般式Gal−Glcで示されるガラクトシル二
糖はガラクトース残基とグルコース残基との結合がβ1
→6結合、β1→3結合、またはβ1→2結合である3
種類の異性体の混合物であることを特徴とする、乳酸菌
およびビフィドバクテリウム菌の増殖促進剤を提供する
ものである。なお、上記ガラクトシル二糖において、Ga
l−Galの場合は、ガラクトース残基同士の結合位置は問
わない。
ガラクトシル二糖、特にGal−Glc型のものは、化学構
造が乳糖と類似しているが、人の消化酵素による分解性
を乳糖のそれと比較すると、いずれもはるかに分解され
にくいことが確認されている(Burvall.Aら,Food Chem.
5,189,1980)。したがって、経口摂取されると消化吸収
されることなく小腸下部に達して乳酸菌およびビフィド
バクテリウム菌の栄養源となり、これら有用細菌の増殖
を促進することができる。
本発明の増殖促進剤は、乳糖のβ−ガラクトシダーゼ
処理により製造することができる。この場合に用いる酵
素としては、ガラクトシル二糖生成率が高いストレプト
コッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ブルガリ
クス、等の細菌、アスペルギルス・オリゼ等のカビによ
り生産されたβ−ガラクトシダーゼが好ましいが、これ
らに限定されるわけではない。β−ガラクトシダーゼ
は、上記微生物の細胞内にあるものをそのまま利用して
もよい。
原料の乳糖としては、食品用に市販されているものを
そのまま使用することができる。乳糖のほか、乳糖を含
む乳汁、粉乳等を用いてもよい。
乳糖のβ−ガラクトシダーゼで処理は、望ましくは濃
度約4.5〜80%w/v、温度約5〜80℃の乳糖溶液に酵素を
加えることにより行う。必要な反応時間は、用いた酵素
の種類や反応条件によって異なる。反応時間が長すぎる
と生成したガラクトシル二糖も加水分解されてしまうの
で、反応液中の糖組成の変化を高速液体クロマトグラフ
ィーで確認しながらガラクトシル二糖の濃度が最大にな
る時点で反応を打ち切ることが望ましい。生成するガラ
クトシル二糖の種類や量比、ガラクトオリゴ糖など他の
糖との量比も、酵素の種類や反応条件によって多少異な
るものとなる。ガラクトシル二糖は、たとえば活性炭カ
ラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂やゲル濾過剤
を用いたクロマト分離などにより、他の糖類と分離する
ことができるが、ガラクトシル二糖の作用を阻害するも
のが副生することはないので、本発明の増殖促進剤には
他の生成糖類や未反応乳糖が混在するものをそのまま使
用することができる。
上記製造法によるほか、本発明の増殖促進剤は、ガラ
クトースまたはガラクトース−グルコース混合物にβ−
ガラクトシダーゼを作用させ、この酵素の持つ逆合成作
用を利用することによっても製造することができる。ま
た、ガラクタンを酵素的に、または酸で、加水分解し、
Gal−Galを生じさせる方法や、酵素を用いない化学合成
法によっても製造することができる。
本発明の増殖促進剤は、乳酸菌やビフィドバクテリウ
ム菌を含有する飲食品、たとえば発酵乳や飲料に添加
し、これら飲食品中の有用細菌の腸内における増殖性の
よい、保健効果の高い製品とすることができる。また、
各種飲食品に添加して、腸内に常在する有用乳酸菌やビ
フィドバクテリウム菌の増殖促進に役立たせることがで
きる。さらに、動物飼料に混入して、整腸作用のある飼
料とすることもできる。
〔実施例〕
実施例1 食品乳糖60kgを温水60に溶解し、リン酸カリウム緩
衝液1およびMg2+を濃度10ppmになるように加え、ス
トレプトコッカス・サーモフィルスの菌体酵素6万単位
を加えて、60℃で16時間反応させた。
得られた反応液中の糖組成は、三糖類以上のオリゴ糖
が24.4%、ガラクトシル二糖が21.5%、乳糖が6.5%、
グルコースが33.4%、ガラクトースが14.2%であった。
この反応液を3倍に希釈した液400mlに、マルトエキ
ス液体培地300mlで培養したサッカロミセス・セレビジ
ェの洗浄菌体を加えて資化させることにより単糖類を除
いた。その後、処理後の糖液を脱塩、脱色してから活性
炭カラムに吸着させ、水で溶出することにより、二糖類
画分および三糖類以上のガラクトオリゴ糖画分を採取し
た。
得られた二糖類画分は、二糖類純度が97.3%で、その
うち乳糖が8.6%、主要ガラクトシル二糖は、Gal(β1
→6)Glcが37.0%、Gal(β1→2)Glcが14.3%、Gal
(β1→6)Galが13.4%、Gal(β1→3)Glcが12.2
%であった。
上記二糖類画分およびガラクトオリゴ糖画分につい
て、種々の腸内細菌および酪農乳酸菌による利用性をみ
る発酵試験を下記の方法により行なった。その結果を表
1に示す。なお、二糖類画分の場合、ガラクトシル二糖
のみの利用性をみるため、共存する乳糖に相当する量の
乳糖を含む培地による発酵試験を別に行なって補正した
ので、表1ではガラクトシル二糖の利用性として表示し
た。
発酵試験:基本培地として、BCP試薬を加えた糖無添加
のVL液体培地を嫌気的に調製して滅菌した。この基本培
地に、無菌濾過した供試糖液を1%になるように加えた
後、供試菌(107/チューブ)を接種して、常法により嫌
気培養を行なった。
糖の利用性は培地の色調変化と濁度により判定し、培
地が黄変するのに要した日数が1日以内のものを強陽性
(+++)、2日のものを中陽性(++)、3日のもの
を弱陽性(+)、色調変化のないものを陰性(−)とし
た。
また、腸内における乳酸菌の増殖モデルとして、糖添
加糞便培地による次のような培養実験を行なった。
糞便培地による培養実験:便を4倍に希釈し、ガーゼで
濾過し、滅菌する。これに、リン酸カリウム緩衝液に糖
を溶解して0.45μmのフィルターで無菌濾過した糖溶液
を等量混合して、糞便培地を調製する(糖としての添加
率0.5%)。糖としては、上記乳糖を含有するガラクト
シル二糖のほか、対照用にガラクトオリゴ糖を用いる。
この糞便培地に各種乳酸菌を接種し、37℃で嫌気的に培
養し、経時的に一部をサンプリングしてpHと生菌数を測
定する。対照用に、糖無添加の糞便培地により、同様の
試験を行う。
実験結果を図1〜5に示した。図中、カッコ内の数値
は24時間培養後の培地pHである。ガラクトオリゴ糖添加
培地では菌種による増殖の相違が顕著であったが、ガラ
クトシル二糖添加培地ではいずれの乳酸菌もよく増殖し
た。乳酸菌は栄養要求性が厳しいが、腸内ではビタミ
ン、窒素源等は足りており、資化可能な糖が増殖の律速
因子になっていることがわかる。
さらに、前記二糖類画分を15g/1日の割合で3日間、
昼食後に紅茶に入れて摂取させる試験を、健常成人4名
を被験者として行なった。摂取前3日間および3日間の
摂取期間中、被験者の糞便を採取し、糞便中の菌叢を検
索した。
その結果は表2のとおりであって、ガラクトシル二糖
投与により腸内のビフィドバクテリウム属菌数およびラ
クトバチルス属菌数が増加するのが認められた。なお、
表中の数値は糞便1g(湿重量)当たりの菌数の対数値で
あって、平均値±標準偏差を示す。
実施例2 乳糖115kgを脱イオン水69に溶解し、アスペルギル
ス・オリゼ起源のβ−ガラクトシダーゼ115万単位を加
えて70℃で4時間反応させた。その後、加熱して反応を
停止してから脱イオン水46を加えて希釈し、硫酸マグ
ネシウムとリン酸カリウム緩衝液を加えてpHを6.8に調
整し、乳糖培地で培養したストレプトコッカス・サーモ
フィルスの菌体酵素を16時間作用させた。
反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、全糖に占める二糖類の割合は25%であった。
この反応液をイオン交換樹脂で脱イオン処理し、濃度
を25%に調整後、その10mlをBio−gel P−2のカラム
(44×90cm)に加え、60℃の温水で溶出させた。これに
より、純度99%、糖含量500mgのガラクトシル二糖画分
を得た。この糖組成は、Gal(β1→6)Glc21%、Gal
(β1→6)Gal19%、Gal(β1→2)Glc7%、Gal
(β1→3)Glc3%などが主なもので、外に、乳糖32%
を含有するものであった。
市販のラット小腸アセトン粉末(SIGMA社製)から調
製した酵素およびラクターゼ活性の高い幼若ラットから
調製した酵素を用いて上記ガラクトシル二糖の消化実験
を行なったところ、消化率は、それぞれ乳糖の1/6およ
び1/8であった。
〔発明の効果〕
本発明による増殖促進剤は、上述のようにビフィドバ
クテリウム菌にも乳酸菌にも有効で、しかもさわやかな
甘味を有するものであるから、飲食品等に添加して腸内
有用細菌の増殖を促進し、健康増進に役立たせるのに好
適なものである。
【図面の簡単な説明】
図1〜図5は実施例1における培養実験の結果を示すグ
ラフである。 各グラフの横軸は培養時間、縦軸は培地1ml中の菌数の
対数である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:01) (C12N 1/38 C12R 1:225) (C12N 1/38 C12R 1:23) (C12N 1/38 C12R 1:245) (C12N 1/38 C12R 1:25) (72)発明者 木村 一雅 東京都港区東新橋1―1―19 株式会社 ヤクルト本社内 (72)発明者 伊藤 正紀 東京都港区東新橋1―1―19 株式会社 ヤクルト本社内 (56)参考文献 特開 平2−286079(JP,A)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】一般式Gal−Glcで示されるガラクトシル二
    糖および一般式Gal−Galで示されるガラクトシル二糖か
    らなり(ただし両式においてGalはガラクトース残基、G
    lcはグルコース残基を表す)、上記一般式Gal−Glcで示
    されるガラクトシル二糖はガラクトース残基とグルコー
    ス残基との結合がβ1→6結合、β1→3結合、または
    β1→2結合である3種類の異性体の混合物であること
    を特徴とする乳酸菌およびビフィドバクテリウム菌の増
    殖促進剤。
  2. 【請求項2】乳糖または乳糖含有物質を、細菌起源もし
    くはカビ起源のβ−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラク
    トシダーゼを含有する細菌で処理することを特徴とする
    請求項1記載の増殖促進剤の製造法。
JP1117360A 1989-05-12 1989-05-12 増殖促進剤およびその製造法 Expired - Lifetime JP2722110B2 (ja)

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