JPH02299582A - 増殖促進剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、乳酸菌およびビフィドバクテリウム菌の増殖
促進剤に関するものである。

〔従来の技術〕

大腸内の菌叢を構成する細菌である乳酸菌やビフィドバ
クテリウム菌は、腸内で種々の有益な生理的役割を演じ
ている。そこで、これらの有用細菌を腸内に供給して健
康増進に役立たせるため、これらの菌の生菌を含有する
乳酸菌飲料、発酵乳、菌製剤等の摂取が行われている。

しかしながら、単に菌製剤等を摂取しただけでは腸内菌
叢の改善にはつながらない場合があるとも言われており
、摂取菌を腸内で旺盛に増殖させるためには、その菌が
優先的に資化しうるが大腸内で消化吸収されにくい選択
的糖源を増殖促進剤として同時摂取するのが望ましいと
されている。

従来、乳酸菌については、酵母エキス、ある種のペプチ
ド、果実や野菜のジュースなどが増殖促進作用を有する
物質として知られているが、これらは、発酵乳等の製造
工程における乳酸菌の増殖を促進するために使われるこ
とがあるにすぎず、大腸内での乳酸菌の増殖促進に有効
であるとは考えられていない。

ビフィドバクテリウム菌については、乳糖にβ−ガラク
トシダーゼを作用させたときβ−ガラクトシル転移反応
によって生成する下記一般式のカラクトオリゴ糖が、ｉ
ｎ　ｖｉｖｏにおいても有効な増殖促進剤として提案さ
れ（特公昭５１１２０２６６号公報）、実用化されてい
る。

Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ （但しＧａｌはガラクトシル二糖、Ｇｌｃはグルコース
残基、ｎは１〜４の整数を表す。） このガラクトオリゴ糖は、ビフィドバクテリウム菌の選
択的糖源であり、乳酸菌には利用されないとされている
。

乳糖をβ−ガラクトシダーゼで処理した場合、上記ガラ
クトオリゴ糖とともに加水分解反応による単糖類と転移
反応による三糖類も生じる。生成する三糖類は、一般式
Ｇａｌ−Ｇｌｃ　（ただし、ガラクトシル二糖とグルコ
ース残基との結合は、乳糖においてはβ１→４結合であ
るのに対し、βｌ→６結合、β１→３結合、またはβ１
→２結合である。）で示されるもの、および一般式Ｇａ
ｌ−Ｇａｌで示されるものである（この明細書では、こ
れら乳糖から転移反応によって生成する三糖類をガラク
トシル二糖という。）。

ガラクトシル二糖はまた、ヨーグルトやラクターゼ処理
乳に微量含まれていることが報告されている。

しかしながら、ガラクトシル二糖が腸内細菌とくに乳酸
菌やビフィドバクテリウム菌に対していかなる作用をす
るのかは知られていなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、乳酸菌にもビフィドバクテリウム菌に
も有効な、新規な増殖促進剤およびその製造法を提供す
ることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本Ｊｉ１者らは、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用さ
せて生成させた種々のガラクトシル二糖をカラムクロマ
トグラフィーによって分離し、乳酸菌、ビフィドバクテ
リウム菌をはじめとする各種腸内細菌や酪農乳酸菌によ
る資化性を調べた。その結果、ガラクトシル三糖は人由
来のすべての菌種のビフィドバクテリウム菌、および乳
製品や整腸剤に利用されている乳酸菌のすぐれた生育栄
養源となることを見いだした。さらに、腸内での増殖が
難しいとされている乳酸菌について、人の糞便培地を用
いた増殖試験の結果、腸内での増殖の律速因子はヒタミ
ンやベプタイドなどの微量要素ではなくて炭素源である
こと、および、ガラクトシル二糖を炭素源としたときに
特に生育が良好であることを確認した。

本発明は上記知見に基づくものであって、一般式Ｇａｌ
−Ｇｌｃまたは一般式Ｇａｌ−Ｇａｌで示されるガラク
トシル二糖からなる乳酸菌およびビフィドバクテリウム
菌の増殖促進剤（ただし、Ｇａｌはガラクトシル二糖、
Ｇｌｃはグルコース残基を表し、Ｇａｌ−Ｇｌｃにおけ
るカラクト−ス残基とグルコース残基との結合はβ１→
６結合、β１→３結合、またはβ１→２結合である。）
を提供するものである。なお、上記ガラクトシルニ糖に
おいて、Ｃａ１−Ｇａｌの場合は、ガラクトース残基同
士の結合位置は問わない。

ガラクトシル二糖、特にＧａｌ−Ｇｌｃ型のものは、化
学構造が乳糖と類似しているが、人の消化酵素による分
解性を乳糖のそれと比較する稈、いずれもはるかに分解
されにくいことが確認されている（Ｂｕｒｖａｌｌ、　
Ａら。

Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　５．１８９．１９８０）　。し
たがって、経口摂取されると消化吸収されることなく小
腸下部に達して乳酸菌およびビフィドバクテリウム菌の
栄養源となり、これら有用細菌の増殖を促進することか
できる。

本発明の増殖促進剤は、乳糖のβ−ガラクトシダーゼ処
理により製造することができる。この場合に用いる酵素
としては、ガラクトシル二糖生成率が高いストレプトコ
ッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ブルガリク
ス、クリベロマイセス・フラギリス、クリベロマイセス
・ラクチス等により生産されたβ−ガラクトシダーゼが
好ましいが、これらに限定されるわけではない。β−ガ
ラクトシダーゼは、微生物細胞内にあるものをそのまま
利用してもよい。

原料の乳糖としては、食品用に市販されているものをそ
のまま使用することができる。乳糖のほか、乳糖を含む
乳汁、粉乳等を用いてもよい。

乳糖のβ−ガラクトシダーゼで処理は、望ましくは濃度
的４．５−８０％ｗ／ｖ、温度約５〜８０°Ｃの乳糖溶
液に酵素を加えることにより行う。必要な反応時間は、
用いた酵素の種類や反応条件によって異なる。反応時間
が長ずざると生成したガラクトシル二糖も加水分解され
てしまうので、反応液中の糖組成の変化を高速液体クロ
マトグラフィーで確認しながらガラクトシルニ糖の濃度
が最大になる時点で反応を打ち切ることか望ましい。生
成するガラクトンル二糖の種類や量比、ガラクトオリゴ
糖など他の糖との量比も、酵素の種類や反応条件によっ
て多少異なるものとなる。ガラクトシル三糖は、たとえ
は活性炭カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂や
ゲル濾過剤を用いたクロマト分離などにより、他の糖類
と分離することができるが、ガラクＩ・シル三糖の作用
を阻害するものが副生ずることはないので、本発明の増
殖促進剤には他の生成糖類や未反応乳糖が混在するもの
をそのまま使用することができる。

上記製造法によるほか、本発明の増殖促進剤は、ガラク
トースまたはガラクトース−グルコース混合物にβ−ガ
ラクトンダーゼを作用させ、この酵素の持つ適合成作用
を利用することによっても製造することができる。また
、ガラクタンを酵素的に、または酸で、加水分解し、Ｇ
ａｌ−Ｇａｌを生しさせる方法や、酵素を用いない化学
合成法によっても製造することができる。

本発明の増殖促進剤は、乳酸菌やビフィドバクテリウム
菌を含有する飲食品、たとえば発酵乳や飲料に添加し、
これら飲食品中の有用細菌の腸内における増殖性のよい
、保健効果の高い製品とすることができる。

また、各種飲食品に添加して、腸内に常在する有用乳酸
菌やビフィドバクテリウム菌の増殖促進に役立たせるこ
とができる。さらに、動物飼料に混入して、整腸作用の
ある飼料とすることもできる。

〔実施例〕

実施例１ 食品乳糖６０　ｋｇを温水６０ｍに溶解し、リン酸カリ
ウム緩衝液ＩＱおよびＭｇ２＋を濃度１０ｐｐｍになる
ように加え、ストレプトコッカス・サーモフィルスの菌
体酵素６万単位を加えて、６０°Ｃで１６時間反応させ
た。

得られた反応液中の糖組成は、三糖類似上のオリゴ糖が
２４．４％、ガラクトシル三糖が２１．５％、乳糖が６
．５％、グルコースが３３．４％、ガラクトースが１４
．２％であった。

この反応液を３倍に希釈した液４００ｍ１に、マルトエ
キス液体培地３００ｍ１で培養したサツカロミセス・セ
レビシェの洗浄菌体を加えて資化させることにより単糖
類を除いた。その後、処理後の糖液を脱塩、脱色してか
ら活性炭カラムに吸着させ、水で溶出することにより、
三糖類画分および三糖類似上のガラクトオリゴ糖画分を
採取した。

得られた三糖類画分は、三糖類純度が９７．３％で、そ
のうち乳糖が８，６％、主要ガラクトシル二糖は、Ｇａ
ｌ（βｌ＋６）Ｇｌｃが３７．０％、Ｇａｌ（β１ｄ）
Ｇｌｃが１４．３％、Ｇａ　Ｉ（ｉｌｌ−＋６）Ｇａ　
ｌが１３．４％、Ｇａ　ｌ（βｌ→３）Ｇｌｃか１２．
２％であった。

上記三糖類画分およびガラクトオリゴ糖両分について、
種々の腸内細菌および酪農乳酸菌による利用性をみる発
酵試験を下記の方法により行なった。その結果を表１に
示す。なお、三糖類画分の場合、ガラクトシル三糖のみ
の利用性をみるため、共存する乳糖に相当する量の乳糖
を含む培地による発酵試験を別に行なって補正したので
、表１ではガラクトシル三糖の利用性として表示した。

発酵試験：基本培地として、ＢＣＰ試薬を加えた糖無添
加のＶＬ液体培地を嫌気的に調製して滅菌した。

この基本培地に、無菌濾過した供試糖液を１％になるよ
うに加えた後、供試菌（１０７／チユーブ）を接種して
、常法により嫌気培養を行なった。

糖の利用性は培地の色調変化と濁度により判定し、培地
が黄変するのに要した日数が１日以内のものを強陽性（
＋＋＋）　、２日のものを中隔性（＋＋）、３日のもの
を東隣性（＋）、色調変化のないものを陰性（−）とし
た。

また、腸内における乳酸菌の増殖モデルとして、糖添加
糞便培地による次のような培養実験を行なった。

糞便培地による培養実験二側を４倍に希釈し、ガーゼで
濾過し、滅菌する。これに、リン酸カリウム緩衝液に糖
を溶解して０．４５μｍのフィルターで無菌濾過した糖
溶液を等量混合して、糞便培地を調製する（糖としての
添加率０．５％）。糖としては、上記乳糖を含有するガ
ラクトシル三糖のほか、対照用にガラクトオリゴ糖を用
いる。この糞便培地に各種乳酸菌を接種し、３７°Ｃで
嫌気的に培養し、経時的に一部をサンプリングしてＩ）
Ｈと生菌数を測定する。対照用に、糖無添加の糞便培地
により、同様の試験を行う。

実験結果を図１〜５に示した。図中、カッコ内の数値は
２４時間培養後の培地ｐＨである。ガラクトオリゴ糖添
加培地では菌種による増殖の相違が顕著であったが、ガ
ラクトシル三糖添加培地ではいずれの乳酸菌もよく増殖
した。乳酸菌は栄養要求性が厳しいが、腸内ではビタミ
ン、窒素源等は足りており、資化可能な糖が増殖の律速
因子になっていることがわかる。

実施例２ 乳糖１１５　ｋｌｉを脱イオン水６９悲に溶解し、アス
ペルギルス・オリゼ起源のβ−ガラクトシダーゼ１１５
万単位を加えて７０°Ｃで４時間反応させた。その後、
加熱して反応を停止してから脱イオン水４６０を加えて
希釈し、硫酸マグネシウムとリン酸カリウム緩衝液を加
えてｐＨを６．８に調整し、乳糖培地で培養したストレ
プトコッカス・サーモフィルスの菌体酵素を１６時間作
用させた。

反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ
、全糖に占める三糖類の割合は２５％であった。

この反応液をイオン交換樹脂で脱イオン処理し、濃度を
２５％に調整後、その１０ｍ１を旧０−ｇｅｌ　Ｐ−２
のカラム（４４Ｘ９０ｃｍ）に加え、６０°Ｃの温水で
溶出させた。これにより、純度９９％、糖含量５００ｍ
ｇのガラクトシル三糖画分を得た。その糖組成は、Ｇａ
ｌ（βｌ→６）ＧＩｃ２１％、Ｇａ　ｌ（βｌ＋６）Ｇ
ａｌｌ　９％、Ｇａ　Ｉ（βＩｄ）Ｇｌｃ　７％、Ｇａ
　ｌ（β１→３）Ｇｌｃ３％などが主なもので、外に、
乳糖３２％を含有するものであった。

市販のラット小腸アセトン粉末（ＳＩＧＭＡ社製）から
調製した酵素およびラクターゼ活性の高い幼若ラットか
ら調製した酵素を用いて上記ガラクトシル三糖の消化実
験を行なったところ、消化率は、それぞれ乳糖の１／６
および１／８であった。

実施例３ 乳糖４０　ｋｇに温水を加えて１００ａとし、リン酸カ
リウム緩衝液でｐＨを７．０に調整し、クリベロマイセ
ス・７ラギリス起源のβ−ガラクトシダーゼを４０万単
位加え、４０°Ｃで１６時間反応させた。その後、反応
液を加熱して酵素を失活させ、粉末活性炭２００　ｇ。

セライト３００ｇを加えて脱色、濾過後、イオン交換樹
脂カラムを通して脱塩した。さらに０．５μｍのフィル
ターを通して無菌化し、ＢＸ７５まで濃縮した。得られ
た無色透明の粘稠な糖液は、ガラクトシル三糖１８％、
乳糖３％、三糖類以上のオリゴ糖１４％、グルコース３
９％、ガラクトース２６％を含有し、されやかな甘味を
有するものであった。

〔発明の効果〕

本発明による増殖促進剤は、上述のようにビフィドバク
テリウム菌にも乳酸菌にも有効で、しかもされやかな甘
味を有するものであるから、飲食品等に添加して腸内有
用細菌の増殖を促進し、健康増進に役立たせるのに好適
なものである。

【図面の簡単な説明】

図１〜図５は実施例１における培養実験の結果を示すグ
ラフである。 各グラフの横軸は培養時間、縦軸は培地１ｍｌ中の菌数
の対数である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式Ｇａｌ−Ｇｌｃまたは一般式Ｇａｌ−Ｇａ
   ｌで示されるガラクトシル二糖からなる乳酸菌およびビ
   フィドバクテリウム菌の増殖促進剤（ただしＧａｌはガ
   ラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表し、Ｇａ
   ｌ−Ｇｌｃにおけるガラクトース残基とグルコース残基
   との結合はβ１→６結合、β１→３結合、またはβ１→
   ２結合である。）。
2. （２）乳糖または乳糖含有物質を、β−ガラクトシダー
   ゼまたはβ−ガラクトシダーゼを含有する微生物で処理
   することを特徴とする請求項１記載の増殖促進剤の製造
   法。