JP4382295B2 - ウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿素の加水分解を触媒するウレアーゼを不活性化する組成物及び飲食品に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウレアーゼは尿素を加水分解してアンモニアと二酸化炭素を生成する酵素であり、植物や微生物に広く分布することが知られている。
【０００３】
ヒトでは肝臓で生成された尿素の約２０％は循環によって腸管に達し、さらに腸管の内部に拡散して細菌のウレアーゼによる分解を受け、その結果、アンモニアが合成される。ヒトの肝性脳症や肝性昏睡は、重度の肝機能不全状態においてアンモニアを解毒できず、血中に残存する高レベルのアンモニアによって脳が障害される疾患である［マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、第５３巻、第８５乃至１０８頁、１９８９年］。肝性脳症や肝性昏睡の発病機構は完全に解明されてはいないが、腸管に存在する尿素分解性細菌が産生するアンモニアの関与が示唆されている。微生物のウレアーゼによって産生されるアンモニアは腸内腐敗産物の一種でもあり、多量のアンモニアは宿主に対して毒性を示し、老化を早める要因になると考えられている（腸内細菌学、光岡友足編、朝倉書店、第１０２及び４０１頁、１９９０年）。
【０００４】
微生物のウレアーゼは、病原因子および宿主への定着因子としても機能することが知られている［マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、第５９巻、第４５１乃至４８０頁、１９９５年］。胃炎や胃潰瘍の原因菌であるヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のウレアーゼは、尿素を分解してアンモニアを発生させることで胃酸を中和する役割を担っている。乳児のおむつかぶれの原因の一つには、糞便細菌のウレアーゼが尿中の尿素を分解してアンモニアを発生させ、その結果、おむつのｐＨが上昇し、糞便中の各種蛋白分解酵素や脂質分解酵素が活性化されることが明らかにされている［ペディアトリック・ダーマトロジー（Pediatric Dermatology）、第３巻、第１０２乃至１０６頁、１９８６年］。さらに、微生物のウレアーゼは、失禁症の大人のおむつから発生する悪臭（アンモニア臭）の原因となることも報告されている［ゲロントロジー（Gerontology）、第３０巻、第２６１乃至２６６頁、１９８４年］。
【０００５】
従って、ウレアーゼの効率的な不活性化は健康の維持、感染症の予防に有効であると考えられる。
【０００６】
特開平８−１９５９５号公報では、植物由来のウレアーゼ阻害物質からなるアンモニア発生防止剤（以下、従来技術１と記載する。）が開示されている。しかし、従来技術１のアンモニア発生防止剤では、食品や医薬品としての応用例は無く、経口的に摂取することによる体内のアンモニアの低減効果は一切記載されていない。特開平７−１１８１５３号公報では、抗ウレアーゼ剤（以下、従来技術２と記載する。）が開示されているが、化学合成された化合物であり、長期間投与の点で副作用などが問題となっていた。
【０００７】
このような状況から、少量でウレアーゼを不活化し、しかも安全で副作用が少ない、日常の食生活から摂取することが可能なウレアーゼを不活性化する食品の開発が望まれていた。
【０００８】
パーオキシダーゼは微生物、植物及び動物に広く分布する酵素である［Ｈ．シーゲルおよびＡ．シーゲル編、メタル・イオンズ・イン・バイオロジカル・システムズ（Metal Ions in Biological Systems）、マルセル デッカー、ニューヨーク、第２５乃至７５頁、１９９４年］。補酵素としてヘムを含有するラクトパーオキシダーゼは、母乳や牛乳など、哺乳類の乳に存在し、動物の組織や体液に広く含有されるチオシアン酸を過酸化水素の存在下で酸化して抗菌物質である次亜チオシアン酸を生成させる。またミエロパーオキシダーゼは、哺乳類の白血球の一種である好中球のアズール顆粒に含有されており、貪食胞にアズール顆粒が融合して形成されるファゴリソソームの中で、過酸化水素の酸化力を利用して塩素イオンから抗菌物質である次亜塩素酸を生成する。
【０００９】
ラクトパーオキシダーゼ及びミエロパーオキシダーゼの抗菌・抗ウィルスの作用機構として、微生物の酵素の不活性化が報告されており、例えば、細菌の呼吸鎖の酵素を不活性化すること［フェムス・マイクロバイオロジー・レターズ（FEMS Microbiology Letters）、第１０巻、第６７乃至７０頁、１９８１年］が知られている。また、ラクトパーオキシダーゼは、解糖系の酵素であるヘキソキナーゼを不活性化し［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、第６５８巻、第２３８乃至２４７頁、１９８１年］、ミエロパーオキシダーゼは、インフルエンザ・ウィルスのシアリダーゼを不活性化することが明らかにされている［ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシージーズ（Journal of Infectious Diseases）、第１６４巻、第８乃至１４頁、１９９１年］。
【００１０】
これらパーオキシダーゼは、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素からなる反応系によって様々な効果を発揮している。例えばパーオキシダーゼ−チオシアン酸イオン及び又はハロゲノイオン−過酸化水素系を含む乳酸菌発酵食品の製造法（特開昭６２−２２８２２４号公報）、二酵素系歯みがき（特公平４−２５９２４号公報）、殺菌剤組成物（特開平１−６１４２７号公報）など、すでに多様な用途への応用が開示されている。
【００１１】
しかしながら、これらパーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素からなる反応系がウレアーゼを不活性化させるという報告は未だなされていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒトの健康及び感染症におけるウレアーゼとの因果関係、及びその重要性に注目し、安全性且つ経済性の観点から天然に存在する安価な物質でウレアーゼを不活性化する方法について鋭意研究を行っていたところ、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素の反応系によるウレアーゼの不活性化機構を発見した。その結果、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素のいずれか一つ又は二つの組み合わせでは、ウレアーゼを不活性化する効果は確認されなかったにもかかわらず、三つを組み合わせた系により、ウレアーゼを効果的に不活性化させる性質を見出し、この発明を完成させた。
【００１３】
本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、安全性に優れ、効果的にウレアーゼを不活性化するウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物である。
【００１５】
前記課題を解決する本発明の第一の発明における望ましい態様は、パーオキシダーゼがラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかであることである。
【００１６】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化飲食品である。
【００１７】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第一の望ましい態様は、パーオキシダーゼがラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかであることである。
【００１８】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第二の望ましい態様は、チオシアン酸が植物から供給されることである。
【００１９】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第三の望ましい態様は、過酸化水素が微生物によって産生されること、及び該微生物が乳酸菌であることである。
【００２０】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第四の望ましい態様は、飲食品が発酵乳であることである。
次に、本発明について具体的に説明する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本明細書において百分率（％）は、特に断りのない限り重量による表示である。また、特に低い濃度の表示には百万分率（ｐｐｍ）を用いる。
【００２２】
本発明に使用されるパーオキシダーゼは、哺乳類のヘム・パーオキシダーゼであれば、どのような動物の体液や組織から分離されたものでも可能であるが、中でもラクトパーオキシダーゼ及びミエロパーオキシダーゼが好ましく、特に牛乳から分離されたラクトパーオキシダーゼが最も安価に得られるので好適である。
【００２３】
ラクトパーオキシダーゼの製造は、例えば生菌含有液状組成物（特開平５−４１９８１公報）に開示された方法のように未加熱のホエーまたは脱脂乳から工業的に製造することが好ましく、更に、市販の天然物由来のラクトパーオキシダーゼ、又は組換え型ラクトパーオキシダーゼ｛例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第２７１巻、第８３１乃至８３６頁、２０００年］によって発現・精製された組換え型ラクトパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ラクトパーオキシダーゼ｝を使用することも可能である。
【００２４】
ミエロパーオキシダーゼは、例えばモリタらの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）、第９９巻、第７６１乃至７７０頁、１９８６年］によって、血液中の好中球から精製されたミエロパーオキシダーゼが好ましいが、更に、市販の天然物由来のミエロパーオキシダーゼ、又は組換え型ミエロパーオキシダーゼ｛例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第２７１巻、第８３１乃至８３６頁、２０００年］によって発現・精製された組換え型ミエロパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ミエロパーオキシダーゼ｝を使用することも可能である。
【００２５】
本発明に使用されるチオシアン酸には、チオシアン酸の薬学的に許容される塩類、哺乳類の乳に含有されるチオシアン酸、並びにキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、及びカブ等の１種又は２種以上から選択される野菜に含有されるチオシアン酸など、様々な形態のチオシアン酸を利用することが可能である。尚、食品への使用に関しては、安全性の面を考慮すると、チオシアン酸は植物から供給されることが好ましく、特に野菜を磨り潰す又はミキサーなどで粉砕することなどによって液状化して調製された野菜汁を使用してウレアーゼ不活性化飲食品を製造することが特に好ましい。
【００２６】
本発明に使用される過酸化水素は、試薬の過酸化水素及び過酸化水素塩、並びに低い酸化還元電位を持つため酸素分子を還元することによって過酸化水素の発生源となるヒドロキシヒドロキノン等のポリフェノール、並びにグルコースオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等のオキシダーゼとその基質であるグルコース及びキサンチン等から生成される過酸化水素、並びにラクトバシルス（Lactobacillus）及びストレプトコッカス（Streptococcus）等が産生する過酸化水素など、パーオキシダーゼが基質として利用できる過酸化水素であればよいが、食品への使用に関しては、安全性の面を考慮すると、過酸化水素は乳酸菌から供給されることが好ましい。
【００２７】
パーオキシダーゼ、過酸化水素およびチオシアン酸の反応系によるウレアーゼの不活性化の効果を調べるために使用するウレアーゼは、植物由来のウレアーゼ、及び微生物由来のウレアーゼ等を使用することが可能である。
【００２８】
本発明のウレアーゼ不活性化組成物は、ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアを低減する目的で、おむつの吸収剤に添加したり、トイレやペットの消臭剤に添加して、製品として製造することが可能である。
【００２９】
本発明のウレアーゼ不活性化飲食品は、ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアが原因で起こると考えられる健康へのリスク、感染症、悪臭発生など、体内のアンモニアを低減させる目的で摂取することが可能であり、例えば、加工乳、コーヒー飲料、及び流動食などの液状食品、並びにヨーグルト（プレーンヨーグルト、フルーツヨーグルト、ハードヨーグルト、ドリンクヨーグルト、フローズンヨーグルト）を中心とした発酵乳などのペースト状及びゲル状の食品で行われることを望ましい態様としている。
【００３０】
尚、本発明のウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を製造するにあたっては、本発明の有効成分の供給源の如何に関わらず、ウレアーゼの残存活性が５０％以下となるような効果を示すことが好ましい。植物由来のウレアーゼを不活性化するためには、パーオキシダーゼが０．１３ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．３１ｐｐｍ以上含有することが望ましく、また、微生物由来のウレアーゼを不活性化するためには、パーオキシダーゼが０．０６ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．６３ｐｐｍ以上含有することが望ましいが、ウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を製造するにあたっては、パーオキシダーゼが０．１３ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．６３ｐｐｍ以上含有することが特に望ましい。
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
【００３１】
試験例１
この試験は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含む組成物による、植物由来のウレアーゼに対する不活性化作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
植物由来のウレアーゼであるナタ豆ウレアーゼ、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、及び過酸化水素の各試料は以下のとおり調製した。
【００３２】
即ち、植物由来のウレアーゼは、ナタ豆から精製されたウレアーゼ（和光純薬社製。以下、ナタ豆ウレアーゼ溶液と記載する。）を１００ミリ単位／ｍｌの濃度となるように、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解して調製した。パーオキシダーゼは、精製ウシラクトパーオキシダーゼ（シグマ社製。以下、ラクトパーオキシダーゼ溶液と記載する。）を、１６０ｐｐｍの濃度になるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解してラクトパーオキシダーゼ溶液とし、また、ヒトミエロパーオキシダーゼ（アテンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー社製。以下、ミエロパーオキシダーゼ溶液と記載する。）を１６０ｐｐｍの濃度になるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解してミエロパーオキシダーゼ溶液として調製した。チオシアン酸は、チオシアン酸ナトリウムを５００ｐｐｍの濃度になるように溶解して、チオシアン酸ナトリウム溶液を調製した。過酸化水素は、２００ｐｐｍの濃度になるように、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解して調製した。
【００３３】
（２）試験方法
１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ添加し、次に、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ、チオシアン酸ナトリウム溶液を０．２ｍｌおよび５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１．３ｍｌをそれぞれ添加し、試験群１ａとした。これとは別に、試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液の代わりに、ミエロパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌを添加して行った試験を試験群１ｂとした。次に、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温し、最後に、過酸化水素溶液を０．２ｍｌ添加した。この溶液の最終容量は２ｍｌであり、８ｐｐｍのパーオキシダーゼ、５０ｐｐｍのチオシアン酸ナトリウム、及び２０ｐｐｍの過酸化水素を含む。尚、対照試験として、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素のいずれの成分も添加していない条件である、試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液、試験群１ｂのミエロパーオキシダーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液を、すべて５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して添加した条件で、同様の試験を行って、対照試験群１とした。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止した。この溶液に残存したウレアーゼ活性を、タケベらの方法［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chemical and Pharmaceutical Bulletin）、第３６巻、第６９３乃至６９９頁、１９８８年］に従って測定した。ウレアーゼ活性は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素のいずれの成分も添加していない条件でインキュベートした場合の活性に対する残存活性として求め、試験を３回実施して平均値を計算した。
【００３４】
（３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物のナタ豆由来のウレアーゼに対する作用を示した表である。８ｐｐｍパーオキシダーゼ、２０ｐｐｍ過酸化水素および５０ｐｐｍチオシアン酸から構成される試験群１ａ及び試験群１ｂは、ナタ豆由来のウレアーゼの残存活性を完全に消失させた。ウレアーゼ活性は、アジ化ナトリウムを添加することによってパーオキシダーゼ反応を停止した後に測定したため、ウレアーゼは不活性化されたことが判明した。更に、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物を含有しない対照試験群１は、ウレアーゼの不活性化が認められなかったことから、ウレアーゼの不活性化には、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物が必須であり、その際、パーオキシダーゼはラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれにおいても、ウレアーゼを不活性化させることが判明した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
試験例２
この試験は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含む組成物による、微生物由来のウレアーゼに対する不活性化作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼは以下のとおり調製した。即ち、ヘリコバクター・ピロリ菌ＡＴＣＣ４３５０４株はヤマザキらの方法［ジャーナル・オブ・インフェクション・アンド・ケモセラピー（Journal of Infection and Chemotherapy）、第３巻、第８５乃至８９頁、１９９７年］に従って培養し、６０００×ｇ、１５分間、５℃の条件で遠心分離することによってヘリコバクター・ピロリ菌体画分を回収し、更に菌体に５０ミリモルのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を加えて懸濁した。このとき、菌体懸濁液に含有されるウレアーゼの活性は５４．５ミリ単位／ｍｌであり、これをヘリコバクター・ピロリ菌由来のウレアーゼ溶液（以下、ピロリ菌ウレアーゼ溶液と記載する。）とした。
【００３７】
また、ラクトパーオキシダーゼ溶液、ミエロパーオキシダーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液については、試験例１と同様に試料を調製した。
【００３８】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａ及び試験群１ｂのナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、同様の方法によって試験を行い、試験群１ａ及び試験群１ｂ に対応する試験群を、それぞれ試験群２ａ及び試験群２ｂ とした。また、対照試験は対照試験群１と同様に行い、対照試験群２とした。
【００３９】
（３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物の微生物由来のウレアーゼに対する作用を示した表である。その結果、試験群２ａ及び試験群２ｂは、ヘリコバクター・ピロリ菌由来のウレアーゼの残存活性を完全に消失させた。更に、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物を含有しない対照試験群２は、ウレアーゼの不活性化が認められなかった。
【００４０】
従って、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物は、微生物由来のウレアーゼに対して不活性化の作用を示すことが判明した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
試験例３
この試験は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
パーオキシダーゼとして、ラクトパーオキシダーゼを使用し、ラクトパーオキシダーゼの濃度が、１６０、２０、１０、５、２．６、１．２、０．６及び０．３ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料１ａ、試料１ｂ、試料１ｃ、試料１ｄ、試料１ｅ、試料１ｆ、試料１ｇ、及び試料１ｈとした。植物由来のウレアーゼ溶液として用いるナタ豆ウレアーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様の濃度にそれぞれ調製した。
【００４３】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液を試料１ａ乃至試料１ｈに変更した以外は同様の方法で行い、試料１ａ乃至試料１ｈを用いた試験群をそれぞれ試験群３ａ乃至試験群３ｈとした。試験群３ａ乃至試験群３ｈのラクトパーオキシダーゼの最終濃度は、それぞれ８、１、０．５、０．２５、０．１３、０．０６、０．０３、及び０．０１６ｐｐｍである。また、対照試験は、試料１ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群３とした。
【００４４】
（３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３はラクトパーオキシダーゼの濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は０．１３ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００４５】
【表３】
【００４６】
試験例４
この試験は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例３の試料１ａ乃至試料１ｈを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。チオシアン酸ナトリウム溶液及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００４７】
（２）試験方法
この試験は、試験例３のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例３と同様に試験を行い、試料１ａ乃至試料１ｈを用いた試験群をそれぞれ試験群４ａ乃至試験群４ｈとした。また、対照試験は、試料１ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群４とした。
【００４８】
（３）試験結果
この試験の結果は表４に示すとおりである。表４はラクトパーオキシダーゼの濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は０．０６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００４９】
【表４】
【００５０】
試験例５
この試験は、チオシアン酸の濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との濃度の関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
チオシアン酸としてチオシアン酸ナトリウムを用いて、チオシアン酸の濃度が５００、１２５、６３、３１、１６、７．８、及び３．９ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料２ａ、試料２ｂ、試料２ｃ、試料２ｄ、試料２ｅ、試料２ｆ、及び試料２ｇとした。植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５１】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａのチオシアン酸ナトリウム溶液を試料２ａ乃至試料２ｇに変更した以外は同様の方法で行い、試料２ａ乃至試料２ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群５ａ乃至試験群５ｇとした。試験群５ａ乃至試験群５ｇのチオシアン酸の最終濃度は、それぞれ５０、１２．５、６．３、３．１、１．６、０．７８、及び０．３９ｐｐｍである。また、対照試験は、試料２ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群５とした。
【００５２】
（３）試験結果
この試験の結果は表５に示すとおりである。表５はチオシアン酸の濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の濃度は１．６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００５３】
【表５】
【００５４】
試験例６
この試験は、チオシアン酸の濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との濃度の関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例５の試料２ａ乃至試料２ｇを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。ラクトパーオキシダーゼ溶液及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５５】
（２）試験方法
この試験は、試験例５のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例５と同様に試験を行い、試料２ａ乃至試料２ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群６ａ乃至試験群６ｇとした。また、対照試験は、試料２ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群６とした。
【００５６】
（３）試験結果
この試験の結果は表６に示すとおりである。表６はチオシアン酸の濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の濃度は１．６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００５７】
【表６】
【００５８】
試験例７
この試験は、過酸化水素の濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
過酸化水素の濃度が５０、２５、１２．５、６．３、３．１、１．６、及び０．８ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料３ａ、試料３ｂ、試料３ｃ、試料３ｄ、試料３ｅ、試料３ｆ、及び試料３ｇとした。植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５９】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａの過酸化水素溶液を試料３ａ乃至試料３ｇに変更した以外は同様の方法で行い、試料３ａ乃至試料３ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群７ａ乃至試験群７ｇとした。試験群７ａ乃至試験群７ｇの過酸化水素の最終濃度は、それぞれ２０、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、及び０．０８ｐｐｍである。また、対照試験は、試料３ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群７とした。
【００６０】
（３）試験結果
この試験の結果は表７に示すとおりである。表７は過酸化水素の濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の濃度は０．３１ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００６１】
【表７】
【００６２】
試験例８
この試験は、過酸化水素の濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例７の試料３ａ乃至試料３ｇを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。ラクトパーオキシダーゼ溶液及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００６３】
（２）試験方法
この試験は、試験例７のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例７と同様に試験を行い、試料３ａ乃至試料３ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群８ａ乃至試験群８ｇとした。また、対照試験は、試料３ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群８とした。
【００６４】
（３）試験結果
この試験の結果は表８に示すとおりである。表８は過酸化水素の濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の濃度は０．６３ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００６５】
【表８】
【００６６】
参考例１
キャベツ１ｋｇを家庭用ミキサーにかけ、粉砕して得られた液体を濾紙で濾過することによって野菜汁を作成した。この野菜汁のチオシアン酸濃度をバスらの方法［インディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Indian Journal of Physiology and Pharmacology）、第３０巻、第２４１乃至２４７頁、１９８６年］を用いて測定したところ、４８ｐｐｍであった。
【００６７】
試験例９
この試験は、植物由来のウレアーゼの不活性化における、植物由来のチオシアン酸供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
参考例１の野菜汁に、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を添加して、４０、２０、１０、５、及び２．５％野菜汁を調製し、それぞれ試料４ａ、試料４ｂ、試料４ｃ、試料４ｄ、及び試料４ｅとした。また、植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００６８】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａの方法と同様に行い、試料４ａ乃至試料４ｅを使用する試験群をそれぞれ試験群９ａ乃至試験群９ｅとした。具体的な試験方法は以下のとおりである。即ち、１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、試料４ａ乃至試料４ｅをそれぞれ１ｍｌ添加し、次いで、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ添加した。更に、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を０．５ｍｌ添加した後、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温して、最後に、過酸化水素溶液を０．２ｍｌ添加した。この反応系における試験群９ａ乃至試験群９ｅの野菜汁の最終濃度は、それぞれ２０、１０、５、２．５、及び１．３％である。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止して、残存したウレアーゼ活性を測定した。また、対照試験は、試料４ａ乃至試料４ｅの代わりに、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を１ｍｌ添加して、同様の試験を行って対照試験群９とした。
【００６９】
（３）試験結果
この試験の結果は表９に示すとおりである。表９は、野菜汁に含まれるチオシアン酸による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、チオシアン酸の代わりに野菜汁を添加すると、植物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、チオシアン酸の供給源として植物を利用することが可能であると判明した。また、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の供給源として植物を利用した場合、２．５％以上の野菜汁を含有し、その際のチオシアン酸の濃度は１．２ｐｐｍ以上であればよいと考えられる。
【００７０】
【表９】
【００７１】
試験例１０
この試験は、微生物由来のウレアーゼの不活性化における、植物由来のチオシアン酸供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼとして使用するピロリ菌ウレアーゼ溶液は、試験例２と同様に調製した。また、試験例９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、すべて試験例９で用いる試料を同様に調製した。
【００７２】
（２）試験方法
この試験は、試験例９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に行い、試料４ａ乃至試料４ｅを使用する試験群をそれぞれ試験群１０ａ乃至試験群１０ｅとした。また、対照試験として、対照試験群９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に試験を行って、対照試験群１０とした。
【００７３】
（３）試験結果
この試験の結果は表１０に示すとおりである。表１０は、野菜汁に含まれるチオシアン酸による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、チオシアン酸の代わりに野菜汁を添加すると、微生物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、チオシアン酸の供給源として植物を利用することが可能であると判明した。また、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の供給源として植物を利用した場合、２．５％以上の野菜汁を含有し、その際のチオシアン酸の濃度は１．２ｐｐｍ以上であればよいと考えられる。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
試験例１１
この試験は、植物由来のウレアーゼの不活性化における、乳酸菌由来の過酸化水素供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
乳酸菌は、市販のラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）を使用した。乳酸菌を、２％乳糖を添加したＭＲＳ培地（ディフコ社製）に接種して４２℃で１２時間培養し、６０００×ｇ、１５分間、５℃の条件で遠心分離することによって乳酸菌を回収し、４％グルコースを含む５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に、１０9／ｍｌになるように懸濁して、試料５ａとした。更に、試料５ａを、４％グルコースを含む５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を１０8、１０7、及び１０6／ｍｌとなるように希釈して、それぞれ試料５ｂ、試料５ｃ、及び試料５ｄとした。尚、乳酸菌の菌数は、乳酸菌懸濁液を生理食塩水で１０倍ずつ希釈し、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に混釈して３７℃で３日間培養して、形成されるコロニーを数えることによって測定した。また、植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００７６】
（２）試験方法
試料５ａ乃至試料５ｄを使用する試験群をそれぞれ試験群１１ａ乃至試験群１１ｄとして、以下の試験方法のとおり試験を行った。即ち、１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ添加し、次に、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ、チオシアン酸ナトリウム溶液を０．２ｍｌおよび５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１．３ｍｌをそれぞれ添加した。次に、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温し、最後に、試料５ａ乃至試料５ｄをそれぞれ０．２ｍｌ添加した。この反応系における、試験群１１ａ乃至試験群１１ｄの乳酸菌の最終含量は、それぞれ１０8、１０7、１０6、及び１０5／ｍｌである。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止して、残存したウレアーゼ活性を測定した。また、対照試験は、試料５ａ乃至試料５ｄの代わりに、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を０．２ｍｌ添加して、同様の試験を行って対照試験群１１とした。
【００７７】
（３）試験結果
この試験の結果は表１１に示すとおりである。表１１は、乳酸菌が産生する過酸化水素による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、乳酸菌が産生する過酸化水素によって、植物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用することが可能であると判明した。また、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用した場合、１０6／ｍｌ以上の乳酸菌を含有すればよいと考えられる。
【００７８】
【表１１】
【００７９】
試験例１２
この試験は、微生物由来のウレアーゼの不活性化における、乳酸菌由来の過酸化水素供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼとして使用するピロリ菌ウレアーゼ溶液は、試験例２と同様に調製した。また、試験例１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、すべて試験例１１で用いる試料を同様に調製した。
【００８０】
（２）試験方法
この試験は、試験例１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に行い、試料５ａ乃至試料５ｄを使用する試験群をそれぞれ試験群１２ａ乃至試験群１２ｄとした。また、対照試験として、対照試験群１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に試験を行って、対照試験群１２とした。
【００８１】
（３）試験結果
この試験の結果は表１２に示すとおりである。表１２は、乳酸菌が産生する過酸化水素による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、乳酸菌が産生する過酸化水素によって、微生物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用することが可能であると判明した。また、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用した場合、１０7／ｍｌ以上の乳酸菌を含有すればよいと考えられる。
【００８２】
【表１２】
【００８３】
試験例１３
この試験は、乳酸菌を使用して、発酵乳を製造した際の発酵乳中の過酸化水素濃度を測定するために行った。
【００８４】
即ち、乳脂肪含量３．５％、無脂乳固形分含量９．２％の生乳１０ｋｇを均質化し、９０〜９２℃で１０分間加熱殺菌した。約４２℃に冷却し、スターターとして市販のストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の牛乳カルチャーをそれぞれ１００ｇずつ添加した。発酵タンク内で充分に攪拌し、４２〜４５℃で４時間静置して発酵させた。この発酵乳を攪拌しながら５〜８℃に冷却し、次いでホモゲナイザーで均質化することによって均質化発酵乳を得た。
【００８５】
この発酵乳の過酸化水素濃度をギリランドの方法［ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Dairy Science）、第５２巻、第３２１乃至３２４頁、１９６９年］で測定したところ、１．４ｐｐｍであった。
【００８６】
試験例１４
この試験は、本発明のウレアーゼ不活性化飲食品のウレアーゼ不活性化の効果、及びアンモニア濃度への影響を検討するために行った。
（１） 試料の調製
実施例１の（２）と同様の製造方法により製造したドリンクヨーグルトを試験試料とした。また、実施例１の（２）に記載の製造方法において、ラクトパーオキシダーゼ溶液および野菜汁の代わりに５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を添加して製造したドリンクヨーグルトを対照試料とした。
【００８７】
（２） 試験方法
４週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）を１０匹ずつ２群に分けて糞食防止ネットを配設したケージに入れ、固形飼料で一週間馴化飼育した。次に、水の代わりに試験試料を無菌パック（ムサシ社製）から一週間自由摂取させて飼育したマウスを試験試料群とした。また、試験試料の代わりに対照試料を摂取させて飼育したマウスを対照試料群とした。飼育終了後、各群のマウスを解剖して盲腸を摘出した。盲腸の内容物の重量を測定して、その１０倍量の５０ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して均質化した。該均質化盲腸内容物の一部を、リングらの方法［ジャーナル・オブ・ニュートリション（Journal of Nutrition）、第１２４巻、第１８乃至２３頁、１９９４年］に従って抽出し、試験例１の試験群１ａの方法を参考にしてウレアーゼ活性を測定した。ウレアーゼの活性は、１分当たり１マイクロモルの尿素を分解する量を１単位とし、蛋白質１ｍｇ当たりの単位数で表した。また、該均質化盲腸内容物の残りの一部について、アンモニアテスト・ワコー（和光純薬社製）を使用してアンモニア含量を測定した。
【００８８】
（３） 試験結果
この試験の結果は、表１３に示すとおりである。表１３は、試験試料及び対照試料を摂取したマウスのウレアーゼ活性及びアンモニア濃度の変化を示した表である。その結果、対照試料群では５２ミリ単位／ｍｇのウレアーゼ活性と１０．６ミリモルのアンモニアが検出された。このウレアーゼ活性は、腸内細菌に由来し、ウレアーゼによる尿素の分解でアンモニアが生成されたと考えられる。一方、試験試料群では、２４ミリ単位／ｍｇのウレアーゼ活性と８．７ミリモルのアンモニアが検出され、対照試料群に比して、ウレアーゼ活性及びアンモニア濃度が効果的に抑制された。従って、本発明のウレアーゼ不活性化飲食品は、ウレアーゼ活性及びアンモニア濃度の低減に有効であることが判明した。
【００８９】
【表１３】
【００９０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１
（１）ラクトパーオキシダーゼの製造
未加熱のホエー１０００ｋｇを、１０リットルのＣＭ−セファデックスＣ−５０（ファルマシア社製）を充填したカラムに通液した。次いで水１００ｋｇでセファデックスゲルを洗浄し、０．３モル食塩を含む２０ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０リットルを通液し、セファデックス樹脂に吸着したラクトパーオキシダーゼを溶出した。溶出液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜（旭化成社製）で濃縮して脱塩した。得られた濃縮液約１リットルをメンブランカートリッジ（ナルゲン社製）で無菌濾過し、凍結乾燥して粉末状の無菌ラクトパーオキシダーゼ４０ｇを得た。
【００９２】
このラクトパーオキシダーゼ標品を、アクリルアミド濃度が１０〜２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（シグマ社製）で染色して、画像処理装置（アトー社製）で分析したところ、純度は約５０％であった。
【００９３】
（２）パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含有するドリンクヨーグルトの製造
乳脂肪含量３．５％、無脂乳固形分含量９．２％の生乳１０ｋｇを均質化し、９０〜９２℃で１０分間加熱殺菌した。約４２℃に冷却し、スターターとして市販のストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の牛乳カルチャーをそれぞれ１００ｇずつ添加した。発酵タンク内で充分に攪拌し、４２〜４５℃で４時間静置して発酵させた。この発酵乳を攪拌しながら５〜８℃に冷却し、次いでホモゲナイザーで均質化することによって均質化発酵乳を調製した。
【００９４】
次に、１７％のグラニュウ糖（東洋精糖社製）液５ｋｇにペクチン（三栄源ＦＦＩ社製）６０ｇを添加して、９０〜９２℃で１０分間殺菌した後、５〜８℃に冷却して糖液を調製した。また、キャベツ３ｋｇを家庭用ミキサーにかけて濾紙（ワットマン社製）で濾過し、９０〜９２℃で１０分間殺菌した後、５〜８℃に冷却して野菜汁９００ｇを調製した。更に、前記（１）で製造したラクトパーオキシダーゼ０．８ｇを水４０ｇに溶解し、メンブラン・フィルター（ミリポア社製）で無菌濾過してラクトパーオキシダーゼ溶液を得た。
【００９５】
これらの方法で調製した均質化発酵乳、糖液、野菜汁、及びラクトパーオキシダーゼ溶液のそれぞれ全量をタンク内で十分に混合し、１００ｇずつ紙容器に充填した後、密封してドリンクヨーグルト１００個を製造した。
【００９６】
【発明の効果】
以上記載したとおり、本発明はパーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）天然に存在する物質から構成されるため、副作用がなく、安全性が高い。
（２）植物及び微生物由来のウレアーゼを効果的に不活性化する。
（３）ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアを効果的に低減する。
（４）アンモニアが原因で起こる健康へのリスクや悪臭発生などの局面で摂取することによって、健康の維持に効果的である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿素の加水分解を触媒するウレアーゼを不活性化する組成物及び飲食品に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウレアーゼは尿素を加水分解してアンモニアと二酸化炭素を生成する酵素であり、植物や微生物に広く分布することが知られている。
【０００３】
ヒトでは肝臓で生成された尿素の約２０％は循環によって腸管に達し、さらに腸管の内部に拡散して細菌のウレアーゼによる分解を受け、その結果、アンモニアが合成される。ヒトの肝性脳症や肝性昏睡は、重度の肝機能不全状態においてアンモニアを解毒できず、血中に残存する高レベルのアンモニアによって脳が障害される疾患である［マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、第５３巻、第８５乃至１０８頁、１９８９年］。肝性脳症や肝性昏睡の発病機構は完全に解明されてはいないが、腸管に存在する尿素分解性細菌が産生するアンモニアの関与が示唆されている。微生物のウレアーゼによって産生されるアンモニアは腸内腐敗産物の一種でもあり、多量のアンモニアは宿主に対して毒性を示し、老化を早める要因になると考えられている（腸内細菌学、光岡友足編、朝倉書店、第１０２及び４０１頁、１９９０年）。
【０００４】
微生物のウレアーゼは、病原因子および宿主への定着因子としても機能することが知られている［マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、第５９巻、第４５１乃至４８０頁、１９９５年］。胃炎や胃潰瘍の原因菌であるヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のウレアーゼは、尿素を分解してアンモニアを発生させることで胃酸を中和する役割を担っている。乳児のおむつかぶれの原因の一つには、糞便細菌のウレアーゼが尿中の尿素を分解してアンモニアを発生させ、その結果、おむつのｐＨが上昇し、糞便中の各種蛋白分解酵素や脂質分解酵素が活性化されることが明らかにされている［ペディアトリック・ダーマトロジー（Pediatric Dermatology）、第３巻、第１０２乃至１０６頁、１９８６年］。さらに、微生物のウレアーゼは、失禁症の大人のおむつから発生する悪臭（アンモニア臭）の原因となることも報告されている［ゲロントロジー（Gerontology）、第３０巻、第２６１乃至２６６頁、１９８４年］。
【０００５】
従って、ウレアーゼの効率的な不活性化は健康の維持、感染症の予防に有効であると考えられる。
【０００６】
特開平８−１９５９５号公報では、植物由来のウレアーゼ阻害物質からなるアンモニア発生防止剤（以下、従来技術１と記載する。）が開示されている。しかし、従来技術１のアンモニア発生防止剤では、食品や医薬品としての応用例は無く、経口的に摂取することによる体内のアンモニアの低減効果は一切記載されていない。特開平７−１１８１５３号公報では、抗ウレアーゼ剤（以下、従来技術２と記載する。）が開示されているが、化学合成された化合物であり、長期間投与の点で副作用などが問題となっていた。
【０００７】
このような状況から、少量でウレアーゼを不活化し、しかも安全で副作用が少ない、日常の食生活から摂取することが可能なウレアーゼを不活性化する食品の開発が望まれていた。
【０００８】
パーオキシダーゼは微生物、植物及び動物に広く分布する酵素である［Ｈ．シーゲルおよびＡ．シーゲル編、メタル・イオンズ・イン・バイオロジカル・システムズ（Metal Ions in Biological Systems）、マルセル デッカー、ニューヨーク、第２５乃至７５頁、１９９４年］。補酵素としてヘムを含有するラクトパーオキシダーゼは、母乳や牛乳など、哺乳類の乳に存在し、動物の組織や体液に広く含有されるチオシアン酸を過酸化水素の存在下で酸化して抗菌物質である次亜チオシアン酸を生成させる。またミエロパーオキシダーゼは、哺乳類の白血球の一種である好中球のアズール顆粒に含有されており、貪食胞にアズール顆粒が融合して形成されるファゴリソソームの中で、過酸化水素の酸化力を利用して塩素イオンから抗菌物質である次亜塩素酸を生成する。
【０００９】
ラクトパーオキシダーゼ及びミエロパーオキシダーゼの抗菌・抗ウィルスの作用機構として、微生物の酵素の不活性化が報告されており、例えば、細菌の呼吸鎖の酵素を不活性化すること［フェムス・マイクロバイオロジー・レターズ（FEMS Microbiology Letters）、第１０巻、第６７乃至７０頁、１９８１年］が知られている。また、ラクトパーオキシダーゼは、解糖系の酵素であるヘキソキナーゼを不活性化し［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、第６５８巻、第２３８乃至２４７頁、１９８１年］、ミエロパーオキシダーゼは、インフルエンザ・ウィルスのシアリダーゼを不活性化することが明らかにされている［ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシージーズ（Journal of Infectious Diseases）、第１６４巻、第８乃至１４頁、１９９１年］。
【００１０】
これらパーオキシダーゼは、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素からなる反応系によって様々な効果を発揮している。例えばパーオキシダーゼ−チオシアン酸イオン及び又はハロゲノイオン−過酸化水素系を含む乳酸菌発酵食品の製造法（特開昭６２−２２８２２４号公報）、二酵素系歯みがき（特公平４−２５９２４号公報）、殺菌剤組成物（特開平１−６１４２７号公報）など、すでに多様な用途への応用が開示されている。
【００１１】
しかしながら、これらパーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素からなる反応系がウレアーゼを不活性化させるという報告は未だなされていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒトの健康及び感染症におけるウレアーゼとの因果関係、及びその重要性に注目し、安全性且つ経済性の観点から天然に存在する安価な物質でウレアーゼを不活性化する方法について鋭意研究を行っていたところ、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素の反応系によるウレアーゼの不活性化機構を発見した。その結果、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素のいずれか一つ又は二つの組み合わせでは、ウレアーゼを不活性化する効果は確認されなかったにもかかわらず、三つを組み合わせた系により、ウレアーゼを効果的に不活性化させる性質を見出し、この発明を完成させた。
【００１３】
本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、安全性に優れ、効果的にウレアーゼを不活性化するウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物である。
【００１５】
前記課題を解決する本発明の第一の発明における望ましい態様は、パーオキシダーゼがラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかであることである。
【００１６】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化飲食品である。
【００１７】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第一の望ましい態様は、パーオキシダーゼがラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかであることである。
【００１８】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第二の望ましい態様は、チオシアン酸が植物から供給されることである。
【００１９】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第三の望ましい態様は、過酸化水素が微生物によって産生されること、及び該微生物が乳酸菌であることである。
【００２０】
前記課題を解決する本発明の第二の発明における第四の望ましい態様は、飲食品が発酵乳であることである。
次に、本発明について具体的に説明する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本明細書において百分率（％）は、特に断りのない限り重量による表示である。また、特に低い濃度の表示には百万分率（ｐｐｍ）を用いる。
【００２２】
本発明に使用されるパーオキシダーゼは、哺乳類のヘム・パーオキシダーゼであれば、どのような動物の体液や組織から分離されたものでも可能であるが、中でもラクトパーオキシダーゼ及びミエロパーオキシダーゼが好ましく、特に牛乳から分離されたラクトパーオキシダーゼが最も安価に得られるので好適である。
【００２３】
ラクトパーオキシダーゼの製造は、例えば生菌含有液状組成物（特開平５−４１９８１公報）に開示された方法のように未加熱のホエーまたは脱脂乳から工業的に製造することが好ましく、更に、市販の天然物由来のラクトパーオキシダーゼ、又は組換え型ラクトパーオキシダーゼ｛例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第２７１巻、第８３１乃至８３６頁、２０００年］によって発現・精製された組換え型ラクトパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ラクトパーオキシダーゼ｝を使用することも可能である。
【００２４】
ミエロパーオキシダーゼは、例えばモリタらの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）、第９９巻、第７６１乃至７７０頁、１９８６年］によって、血液中の好中球から精製されたミエロパーオキシダーゼが好ましいが、更に、市販の天然物由来のミエロパーオキシダーゼ、又は組換え型ミエロパーオキシダーゼ｛例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第２７１巻、第８３１乃至８３６頁、２０００年］によって発現・精製された組換え型ミエロパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ミエロパーオキシダーゼ｝を使用することも可能である。
【００２５】
本発明に使用されるチオシアン酸には、チオシアン酸の薬学的に許容される塩類、哺乳類の乳に含有されるチオシアン酸、並びにキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、及びカブ等の１種又は２種以上から選択される野菜に含有されるチオシアン酸など、様々な形態のチオシアン酸を利用することが可能である。尚、食品への使用に関しては、安全性の面を考慮すると、チオシアン酸は植物から供給されることが好ましく、特に野菜を磨り潰す又はミキサーなどで粉砕することなどによって液状化して調製された野菜汁を使用してウレアーゼ不活性化飲食品を製造することが特に好ましい。
【００２６】
本発明に使用される過酸化水素は、試薬の過酸化水素及び過酸化水素塩、並びに低い酸化還元電位を持つため酸素分子を還元することによって過酸化水素の発生源となるヒドロキシヒドロキノン等のポリフェノール、並びにグルコースオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等のオキシダーゼとその基質であるグルコース及びキサンチン等から生成される過酸化水素、並びにラクトバシルス（Lactobacillus）及びストレプトコッカス（Streptococcus）等が産生する過酸化水素など、パーオキシダーゼが基質として利用できる過酸化水素であればよいが、食品への使用に関しては、安全性の面を考慮すると、過酸化水素は乳酸菌から供給されることが好ましい。
【００２７】
パーオキシダーゼ、過酸化水素およびチオシアン酸の反応系によるウレアーゼの不活性化の効果を調べるために使用するウレアーゼは、植物由来のウレアーゼ、及び微生物由来のウレアーゼ等を使用することが可能である。
【００２８】
本発明のウレアーゼ不活性化組成物は、ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアを低減する目的で、おむつの吸収剤に添加したり、トイレやペットの消臭剤に添加して、製品として製造することが可能である。
【００２９】
本発明のウレアーゼ不活性化飲食品は、ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアが原因で起こると考えられる健康へのリスク、感染症、悪臭発生など、体内のアンモニアを低減させる目的で摂取することが可能であり、例えば、加工乳、コーヒー飲料、及び流動食などの液状食品、並びにヨーグルト（プレーンヨーグルト、フルーツヨーグルト、ハードヨーグルト、ドリンクヨーグルト、フローズンヨーグルト）を中心とした発酵乳などのペースト状及びゲル状の食品で行われることを望ましい態様としている。
【００３０】
尚、本発明のウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を製造するにあたっては、本発明の有効成分の供給源の如何に関わらず、ウレアーゼの残存活性が５０％以下となるような効果を示すことが好ましい。植物由来のウレアーゼを不活性化するためには、パーオキシダーゼが０．１３ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．３１ｐｐｍ以上含有することが望ましく、また、微生物由来のウレアーゼを不活性化するためには、パーオキシダーゼが０．０６ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．６３ｐｐｍ以上含有することが望ましいが、ウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品を製造するにあたっては、パーオキシダーゼが０．１３ｐｐｍ以上、チオシアン酸が１．２ｐｐｍ以上、及び過酸化水素が０．６３ｐｐｍ以上含有することが特に望ましい。
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
【００３１】
試験例１
この試験は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含む組成物による、植物由来のウレアーゼに対する不活性化作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
植物由来のウレアーゼであるナタ豆ウレアーゼ、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、及び過酸化水素の各試料は以下のとおり調製した。
【００３２】
即ち、植物由来のウレアーゼは、ナタ豆から精製されたウレアーゼ（和光純薬社製。以下、ナタ豆ウレアーゼ溶液と記載する。）を１００ミリ単位／ｍｌの濃度となるように、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解して調製した。パーオキシダーゼは、精製ウシラクトパーオキシダーゼ（シグマ社製。以下、ラクトパーオキシダーゼ溶液と記載する。）を、１６０ｐｐｍの濃度になるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解してラクトパーオキシダーゼ溶液とし、また、ヒトミエロパーオキシダーゼ（アテンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー社製。以下、ミエロパーオキシダーゼ溶液と記載する。）を１６０ｐｐｍの濃度になるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解してミエロパーオキシダーゼ溶液として調製した。チオシアン酸は、チオシアン酸ナトリウムを５００ｐｐｍの濃度になるように溶解して、チオシアン酸ナトリウム溶液を調製した。過酸化水素は、２００ｐｐｍの濃度になるように、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解して調製した。
【００３３】
（２）試験方法
１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ添加し、次に、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ、チオシアン酸ナトリウム溶液を０．２ｍｌおよび５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１．３ｍｌをそれぞれ添加し、試験群１ａとした。これとは別に、試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液の代わりに、ミエロパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌを添加して行った試験を試験群１ｂとした。次に、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温し、最後に、過酸化水素溶液を０．２ｍｌ添加した。この溶液の最終容量は２ｍｌであり、８ｐｐｍのパーオキシダーゼ、５０ｐｐｍのチオシアン酸ナトリウム、及び２０ｐｐｍの過酸化水素を含む。尚、対照試験として、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素のいずれの成分も添加していない条件である、試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液、試験群１ｂのミエロパーオキシダーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液を、すべて５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して添加した条件で、同様の試験を行って、対照試験群１とした。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止した。この溶液に残存したウレアーゼ活性を、タケベらの方法［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Chemical and Pharmaceutical Bulletin）、第３６巻、第６９３乃至６９９頁、１９８８年］に従って測定した。ウレアーゼ活性は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素のいずれの成分も添加していない条件でインキュベートした場合の活性に対する残存活性として求め、試験を３回実施して平均値を計算した。
【００３４】
（３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物のナタ豆由来のウレアーゼに対する作用を示した表である。８ｐｐｍパーオキシダーゼ、２０ｐｐｍ過酸化水素および５０ｐｐｍチオシアン酸から構成される試験群１ａ及び試験群１ｂは、ナタ豆由来のウレアーゼの残存活性を完全に消失させた。ウレアーゼ活性は、アジ化ナトリウムを添加することによってパーオキシダーゼ反応を停止した後に測定したため、ウレアーゼは不活性化されたことが判明した。更に、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物を含有しない対照試験群１は、ウレアーゼの不活性化が認められなかったことから、ウレアーゼの不活性化には、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物が必須であり、その際、パーオキシダーゼはラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれにおいても、ウレアーゼを不活性化させることが判明した。
【００３５】
【表１】
試験例２
この試験は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含む組成物による、微生物由来のウレアーゼに対する不活性化作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼは以下のとおり調製した。即ち、ヘリコバクター・ピロリ菌ＡＴＣＣ４３５０４株はヤマザキらの方法［ジャーナル・オブ・インフェクション・アンド・ケモセラピー（Journal of Infection and Chemotherapy）、第３巻、第８５乃至８９頁、１９９７年］に従って培養し、６０００×ｇ、１５分間、５℃の条件で遠心分離することによってヘリコバクター・ピロリ菌体画分を回収し、更に菌体に５０ミリモルのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を加えて懸濁した。このとき、菌体懸濁液に含有されるウレアーゼの活性は５４．５ミリ単位／ｍｌであり、これをヘリコバクター・ピロリ菌由来のウレアーゼ溶液（以下、ピロリ菌ウレアーゼ溶液と記載する。）とした。
【００３７】
また、ラクトパーオキシダーゼ溶液、ミエロパーオキシダーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液については、試験例１と同様に試料を調製した。
【００３８】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａ及び試験群１ｂのナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、同様の方法によって試験を行い、試験群１ａ及び試験群１ｂ に対応する試験群を、それぞれ試験群２ａ及び試験群２ｂ とした。また、対照試験は対照試験群１と同様に行い、対照試験群２とした。
【００３９】
（３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２は、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物の微生物由来のウレアーゼに対する作用を示した表である。その結果、試験群２ａ及び試験群２ｂは、ヘリコバクター・ピロリ菌由来のウレアーゼの残存活性を完全に消失させた。更に、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物を含有しない対照試験群２は、ウレアーゼの不活性化が認められなかった。
【００４０】
従って、パーオキシダーゼ、チオシアン酸、過酸化水素を含む組成物は、微生物由来のウレアーゼに対して不活性化の作用を示すことが判明した。
【００４１】
【表２】
試験例３
この試験は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
パーオキシダーゼとして、ラクトパーオキシダーゼを使用し、ラクトパーオキシダーゼの濃度が、１６０、２０、１０、５、２．６、１．２、０．６及び０．３ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料１ａ、試料１ｂ、試料１ｃ、試料１ｄ、試料１ｅ、試料１ｆ、試料１ｇ、及び試料１ｈとした。植物由来のウレアーゼ溶液として用いるナタ豆ウレアーゼ溶液、チオシアン酸ナトリウム溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様の濃度にそれぞれ調製した。
【００４３】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａのラクトパーオキシダーゼ溶液を試料１ａ乃至試料１ｈに変更した以外は同様の方法で行い、試料１ａ乃至試料１ｈを用いた試験群をそれぞれ試験群３ａ乃至試験群３ｈとした。試験群３ａ乃至試験群３ｈのラクトパーオキシダーゼの最終濃度は、それぞれ８、１、０．５、０．２５、０．１３、０．０６、０．０３、及び０．０１６ｐｐｍである。また、対照試験は、試料１ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群３とした。
【００４４】
（３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３はラクトパーオキシダーゼの濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は０．１３ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００４５】
【表３】
試験例４
この試験は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例３の試料１ａ乃至試料１ｈを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。チオシアン酸ナトリウム溶液及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００４７】
（２）試験方法
この試験は、試験例３のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例３と同様に試験を行い、試料１ａ乃至試料１ｈを用いた試験群をそれぞれ試験群４ａ乃至試験群４ｈとした。また、対照試験は、試料１ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群４とした。
【００４８】
（３）試験結果
この試験の結果は表４に示すとおりである。表４はラクトパーオキシダーゼの濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は０．０６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００４９】
【表４】
試験例５
この試験は、チオシアン酸の濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との濃度の関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
チオシアン酸としてチオシアン酸ナトリウムを用いて、チオシアン酸の濃度が５００、１２５、６３、３１、１６、７．８、及び３．９ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料２ａ、試料２ｂ、試料２ｃ、試料２ｄ、試料２ｅ、試料２ｆ、及び試料２ｇとした。植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５１】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａのチオシアン酸ナトリウム溶液を試料２ａ乃至試料２ｇに変更した以外は同様の方法で行い、試料２ａ乃至試料２ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群５ａ乃至試験群５ｇとした。試験群５ａ乃至試験群５ｇのチオシアン酸の最終濃度は、それぞれ５０、１２．５、６．３、３．１、１．６、０．７８、及び０．３９ｐｐｍである。また、対照試験は、試料２ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群５とした。
【００５２】
（３）試験結果
この試験の結果は表５に示すとおりである。表５はチオシアン酸の濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の濃度は１．６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００５３】
【表５】
試験例６
この試験は、チオシアン酸の濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との濃度の関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例５の試料２ａ乃至試料２ｇを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。ラクトパーオキシダーゼ溶液及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５５】
（２）試験方法
この試験は、試験例５のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例５と同様に試験を行い、試料２ａ乃至試料２ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群６ａ乃至試験群６ｇとした。また、対照試験は、試料２ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群６とした。
【００５６】
（３）試験結果
この試験の結果は表６に示すとおりである。表６はチオシアン酸の濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の濃度は１．６ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００５７】
【表６】
試験例７
この試験は、過酸化水素の濃度と植物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
過酸化水素の濃度が５０、２５、１２．５、６．３、３．１、１．６、及び０．８ｐｐｍとなるように５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を使用して希釈した溶液を調製し、それぞれ試料３ａ、試料３ｂ、試料３ｃ、試料３ｄ、試料３ｅ、試料３ｆ、及び試料３ｇとした。植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００５９】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａの過酸化水素溶液を試料３ａ乃至試料３ｇに変更した以外は同様の方法で行い、試料３ａ乃至試料３ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群７ａ乃至試験群７ｇとした。試験群７ａ乃至試験群７ｇの過酸化水素の最終濃度は、それぞれ２０、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、及び０．０８ｐｐｍである。また、対照試験は、試料３ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群７とした。
【００６０】
（３）試験結果
この試験の結果は表７に示すとおりである。表７は過酸化水素の濃度による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の濃度は０．３１ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００６１】
【表７】
試験例８
この試験は、過酸化水素の濃度と微生物由来のウレアーゼの不活性化効果との関係を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例７の試料３ａ乃至試料３ｇを使用し、さらに微生物由来のウレアーゼ溶液は、試験例２のピロリ菌ウレアーゼ溶液と同様に調製した。ラクトパーオキシダーゼ溶液及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００６３】
（２）試験方法
この試験は、試験例７のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は試験例７と同様に試験を行い、試料３ａ乃至試料３ｇを用いた試験群をそれぞれ試験群８ａ乃至試験群８ｇとした。また、対照試験は、試料３ａを５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に変更して同様に試験を行い、対照試験群８とした。
【００６４】
（３）試験結果
この試験の結果は表８に示すとおりである。表８は過酸化水素の濃度による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の濃度は０．６３ｐｐｍであればよいと考えられる。
【００６５】
【表８】
参考例１
キャベツ１ｋｇを家庭用ミキサーにかけ、粉砕して得られた液体を濾紙で濾過することによって野菜汁を作成した。この野菜汁のチオシアン酸濃度をバスらの方法［インディアン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー・アンド・ファーマコロジー（Indian Journal of Physiology and Pharmacology）、第３０巻、第２４１乃至２４７頁、１９８６年］を用いて測定したところ、４８ｐｐｍであった。
【００６７】
試験例９
この試験は、植物由来のウレアーゼの不活性化における、植物由来のチオシアン酸供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
参考例１の野菜汁に、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を添加して、４０、２０、１０、５、及び２．５％野菜汁を調製し、それぞれ試料４ａ、試料４ｂ、試料４ｃ、試料４ｄ、及び試料４ｅとした。また、植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及び過酸化水素溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００６８】
（２）試験方法
この試験は、試験例１の試験群１ａの方法と同様に行い、試料４ａ乃至試料４ｅを使用する試験群をそれぞれ試験群９ａ乃至試験群９ｅとした。具体的な試験方法は以下のとおりである。即ち、１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、試料４ａ乃至試料４ｅをそれぞれ１ｍｌ添加し、次いで、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ添加した。更に、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を０．５ｍｌ添加した後、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温して、最後に、過酸化水素溶液を０．２ｍｌ添加した。この反応系における試験群９ａ乃至試験群９ｅの野菜汁の最終濃度は、それぞれ２０、１０、５、２．５、及び１．３％である。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止して、残存したウレアーゼ活性を測定した。また、対照試験は、試料４ａ乃至試料４ｅの代わりに、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を１ｍｌ添加して、同様の試験を行って対照試験群９とした。
【００６９】
（３）試験結果
この試験の結果は表９に示すとおりである。表９は、野菜汁に含まれるチオシアン酸による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、チオシアン酸の代わりに野菜汁を添加すると、植物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、チオシアン酸の供給源として植物を利用することが可能であると判明した。また、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の供給源として植物を利用した場合、２．５％以上の野菜汁を含有し、その際のチオシアン酸の濃度は１．２ｐｐｍ以上であればよいと考えられる。
【００７０】
【表９】
試験例１０
この試験は、微生物由来のウレアーゼの不活性化における、植物由来のチオシアン酸供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼとして使用するピロリ菌ウレアーゼ溶液は、試験例２と同様に調製した。また、試験例９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、すべて試験例９で用いる試料を同様に調製した。
【００７２】
（２）試験方法
この試験は、試験例９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に行い、試料４ａ乃至試料４ｅを使用する試験群をそれぞれ試験群１０ａ乃至試験群１０ｅとした。また、対照試験として、対照試験群９のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に試験を行って、対照試験群１０とした。
【００７３】
（３）試験結果
この試験の結果は表１０に示すとおりである。表１０は、野菜汁に含まれるチオシアン酸による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、チオシアン酸の代わりに野菜汁を添加すると、微生物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、チオシアン酸の供給源として植物を利用することが可能であると判明した。また、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、チオシアン酸の供給源として植物を利用した場合、２．５％以上の野菜汁を含有し、その際のチオシアン酸の濃度は１．２ｐｐｍ以上であればよいと考えられる。
【００７４】
【表１０】
試験例１１
この試験は、植物由来のウレアーゼの不活性化における、乳酸菌由来の過酸化水素供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
乳酸菌は、市販のラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）を使用した。乳酸菌を、２％乳糖を添加したＭＲＳ培地（ディフコ社製）に接種して４２℃で１２時間培養し、６０００×ｇ、１５分間、５℃の条件で遠心分離することによって乳酸菌を回収し、４％グルコースを含む５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に、１０9／ｍｌになるように懸濁して、試料５ａとした。更に、試料５ａを、４％グルコースを含む５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を１０8、１０7、及び１０6／ｍｌとなるように希釈して、それぞれ試料５ｂ、試料５ｃ、及び試料５ｄとした。尚、乳酸菌の菌数は、乳酸菌懸濁液を生理食塩水で１０倍ずつ希釈し、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学社製）に混釈して３７℃で３日間培養して、形成されるコロニーを数えることによって測定した。また、植物由来のウレアーゼ溶液として使用するナタ豆ウレアーゼ溶液、ラクトパーオキシダーゼ溶液、及びチオシアン酸ナトリウム溶液は、試験例１と同様に調製した。
【００７６】
（２）試験方法
試料５ａ乃至試料５ｄを使用する試験群をそれぞれ試験群１１ａ乃至試験群１１ｄとして、以下の試験方法のとおり試験を行った。即ち、１２穴マイクロタイタープレート（ファルコン社製）に、ナタ豆ウレアーゼ溶液を０．２ｍｌ添加し、次に、ラクトパーオキシダーゼ溶液を０．１ｍｌ、チオシアン酸ナトリウム溶液を０．２ｍｌおよび５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）１．３ｍｌをそれぞれ添加した。次に、マイクロタイタープレートを３７℃で１０分間予備的に加温し、最後に、試料５ａ乃至試料５ｄをそれぞれ０．２ｍｌ添加した。この反応系における、試験群１１ａ乃至試験群１１ｄの乳酸菌の最終含量は、それぞれ１０8、１０7、１０6、及び１０5／ｍｌである。各溶液を添加してから１時間経過した時点で、１０ミリモルアジ化ナトリウム溶液を２ｍｌ混合することによってパーオキシダーゼ反応を停止して、残存したウレアーゼ活性を測定した。また、対照試験は、試料５ａ乃至試料５ｄの代わりに、５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を０．２ｍｌ添加して、同様の試験を行って対照試験群１１とした。
【００７７】
（３）試験結果
この試験の結果は表１１に示すとおりである。表１１は、乳酸菌が産生する過酸化水素による植物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、乳酸菌が産生する過酸化水素によって、植物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用することが可能であると判明した。また、植物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用した場合、１０6／ｍｌ以上の乳酸菌を含有すればよいと考えられる。
【００７８】
【表１１】
試験例１２
この試験は、微生物由来のウレアーゼの不活性化における、乳酸菌由来の過酸化水素供給能を調べるために行った。
（１）試料の調製
微生物由来のウレアーゼとして使用するピロリ菌ウレアーゼ溶液は、試験例２と同様に調製した。また、試験例１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は、すべて試験例１１で用いる試料を同様に調製した。
【００８０】
（２）試験方法
この試験は、試験例１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に行い、試料５ａ乃至試料５ｄを使用する試験群をそれぞれ試験群１２ａ乃至試験群１２ｄとした。また、対照試験として、対照試験群１１のナタ豆ウレアーゼ溶液をピロリ菌ウレアーゼ溶液に変更した以外は同様に試験を行って、対照試験群１２とした。
【００８１】
（３）試験結果
この試験の結果は表１２に示すとおりである。表１２は、乳酸菌が産生する過酸化水素による微生物由来のウレアーゼの不活性化の割合を示す表である。その結果、乳酸菌が産生する過酸化水素によって、微生物由来のウレアーゼは不活性化されることが確認された。従って、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用することが可能であると判明した。また、微生物由来のウレアーゼを不活性化する好ましい活性である、ウレアーゼ残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、過酸化水素の供給源として乳酸菌を利用した場合、１０7／ｍｌ以上の乳酸菌を含有すればよいと考えられる。
【００８２】
【表１２】
試験例１３
この試験は、乳酸菌を使用して、発酵乳を製造した際の発酵乳中の過酸化水素濃度を測定するために行った。
【００８４】
即ち、乳脂肪含量３．５％、無脂乳固形分含量９．２％の生乳１０ｋｇを均質化し、９０〜９２℃で１０分間加熱殺菌した。約４２℃に冷却し、スターターとして市販のストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の牛乳カルチャーをそれぞれ１００ｇずつ添加した。発酵タンク内で充分に攪拌し、４２〜４５℃で４時間静置して発酵させた。この発酵乳を攪拌しながら５〜８℃に冷却し、次いでホモゲナイザーで均質化することによって均質化発酵乳を得た。
【００８５】
この発酵乳の過酸化水素濃度をギリランドの方法［ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Dairy Science）、第５２巻、第３２１乃至３２４頁、１９６９年］で測定したところ、１．４ｐｐｍであった。
【００８６】
試験例１４
この試験は、本発明のウレアーゼ不活性化飲食品のウレアーゼ不活性化の効果、及びアンモニア濃度への影響を検討するために行った。
（１） 試料の調製
実施例１の（２）と同様の製造方法により製造したドリンクヨーグルトを試験試料とした。また、実施例１の（２）に記載の製造方法において、ラクトパーオキシダーゼ溶液および野菜汁の代わりに５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を添加して製造したドリンクヨーグルトを対照試料とした。
【００８７】
（２） 試験方法
４週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）を１０匹ずつ２群に分けて糞食防止ネットを配設したケージに入れ、固形飼料で一週間馴化飼育した。次に、水の代わりに試験試料を無菌パック（ムサシ社製）から一週間自由摂取させて飼育したマウスを試験試料群とした。また、試験試料の代わりに対照試料を摂取させて飼育したマウスを対照試料群とした。飼育終了後、各群のマウスを解剖して盲腸を摘出した。盲腸の内容物の重量を測定して、その１０倍量の５０ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して均質化した。該均質化盲腸内容物の一部を、リングらの方法［ジャーナル・オブ・ニュートリション（Journal of Nutrition）、第１２４巻、第１８乃至２３頁、１９９４年］に従って抽出し、試験例１の試験群１ａの方法を参考にしてウレアーゼ活性を測定した。ウレアーゼの活性は、１分当たり１マイクロモルの尿素を分解する量を１単位とし、蛋白質１ｍｇ当たりの単位数で表した。また、該均質化盲腸内容物の残りの一部について、アンモニアテスト・ワコー（和光純薬社製）を使用してアンモニア含量を測定した。
【００８８】
（３） 試験結果
この試験の結果は、表１３に示すとおりである。表１３は、試験試料及び対照試料を摂取したマウスのウレアーゼ活性及びアンモニア濃度の変化を示した表である。その結果、対照試料群では５２ミリ単位／ｍｇのウレアーゼ活性と１０．６ミリモルのアンモニアが検出された。このウレアーゼ活性は、腸内細菌に由来し、ウレアーゼによる尿素の分解でアンモニアが生成されたと考えられる。一方、試験試料群では、２４ミリ単位／ｍｇのウレアーゼ活性と８．７ミリモルのアンモニアが検出され、対照試料群に比して、ウレアーゼ活性及びアンモニア濃度が効果的に抑制された。従って、本発明のウレアーゼ不活性化飲食品は、ウレアーゼ活性及びアンモニア濃度の低減に有効であることが判明した。
【００８９】
【表１３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１
（１）ラクトパーオキシダーゼの製造
未加熱のホエー１０００ｋｇを、１０リットルのＣＭ−セファデックスＣ−５０（ファルマシア社製）を充填したカラムに通液した。次いで水１００ｋｇでセファデックスゲルを洗浄し、０．３モル食塩を含む２０ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０リットルを通液し、セファデックス樹脂に吸着したラクトパーオキシダーゼを溶出した。溶出液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜（旭化成社製）で濃縮して脱塩した。得られた濃縮液約１リットルをメンブランカートリッジ（ナルゲン社製）で無菌濾過し、凍結乾燥して粉末状の無菌ラクトパーオキシダーゼ４０ｇを得た。
【００９２】
このラクトパーオキシダーゼ標品を、アクリルアミド濃度が１０〜２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（シグマ社製）で染色して、画像処理装置（アトー社製）で分析したところ、純度は約５０％であった。
【００９３】
（２）パーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を含有するドリンクヨーグルトの製造
乳脂肪含量３．５％、無脂乳固形分含量９．２％の生乳１０ｋｇを均質化し、９０〜９２℃で１０分間加熱殺菌した。約４２℃に冷却し、スターターとして市販のストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の牛乳カルチャーをそれぞれ１００ｇずつ添加した。発酵タンク内で充分に攪拌し、４２〜４５℃で４時間静置して発酵させた。この発酵乳を攪拌しながら５〜８℃に冷却し、次いでホモゲナイザーで均質化することによって均質化発酵乳を調製した。
【００９４】
次に、１７％のグラニュウ糖（東洋精糖社製）液５ｋｇにペクチン（三栄源ＦＦＩ社製）６０ｇを添加して、９０〜９２℃で１０分間殺菌した後、５〜８℃に冷却して糖液を調製した。また、キャベツ３ｋｇを家庭用ミキサーにかけて濾紙（ワットマン社製）で濾過し、９０〜９２℃で１０分間殺菌した後、５〜８℃に冷却して野菜汁９００ｇを調製した。更に、前記（１）で製造したラクトパーオキシダーゼ０．８ｇを水４０ｇに溶解し、メンブラン・フィルター（ミリポア社製）で無菌濾過してラクトパーオキシダーゼ溶液を得た。
【００９５】
これらの方法で調製した均質化発酵乳、糖液、野菜汁、及びラクトパーオキシダーゼ溶液のそれぞれ全量をタンク内で十分に混合し、１００ｇずつ紙容器に充填した後、密封してドリンクヨーグルト１００個を製造した。
【００９６】
【発明の効果】
以上記載したとおり、本発明はパーオキシダーゼ、チオシアン酸および過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物及び飲食品に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）天然に存在する物質から構成されるため、副作用がなく、安全性が高い。
（２）植物及び微生物由来のウレアーゼを効果的に不活性化する。
（３）ウレアーゼが触媒する尿素の加水分解によって発生するアンモニアを効果的に低減する。
（４）アンモニアが原因で起こる健康へのリスクや悪臭発生などの局面で摂取することによって、健康の維持に効果的である。
Claims (7)
- ラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかと、チオシアン酸及び過酸化水素とを有効成分として含有する抗ウレアーゼ剤。
- ラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかと、チオシアン酸及び乳酸菌とを有効成分として含有する、請求項１に記載の抗ウレアーゼ剤。
- 乳酸菌が１０６／ｍｌ〜１０９／ｍｌの菌数で含有されている、請求項２に記載の抗ウレアーゼ剤。
- ラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかと、野菜汁及び過酸化水素とを有効成分として含有する、請求項１に記載の抗ウレアーゼ剤。
- 野菜汁が２．５％〜２０％の濃度で含有されている、請求項４に記載の抗ウレアーゼ剤。
- ラクトパーオキシダーゼ又はミエロパーオキシダーゼのいずれかと、野菜汁及び乳酸菌とを有効成分として含有する、請求項１〜５の何れかに記載の抗ウレアーゼ剤。
- 請求項１〜６の何れかに記載の抗ウレアーゼ剤を含んでなる、アンモニア発生防止剤。
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