MX2011004920A - Bacteria productora de acido sialico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere de manera general al campo de los ácidos siálicos, en particular al campo de productos alimenticios enriquecidos con ácido siálico y sus usos. Una modalidad de la presente invención se refiere a un producto alimenticio enriquecido con bacteria productora de ácido siálico de grado alimenticio y/o una fracción de la misma que contiene ácido siálico.

Description

BACTERIA PRODUCTORA DE ÁCIDO SIÁLICO La presente invención se refiere de manera general al campo de los ácidos siálicos, en particular al campo de los productos alimenticios enriquecidos con ácido siálico y sus usos. Una modalidad de la presente invención se refiere a un producto alimenticio enriquecido con bacteria productora de ácido siálico de grado alimenticio y/o una fracción de la misma.

Los ácidos siálicos (SiAc) son una familia de monosacáridos de nueve átomos de carbono con carga derivados a partir de ácido neuramínico (NeuAc). El NeuAc es el único ácido siálico formado normalmente en los seres humanos. En otros vertebrados, también están presentes por ejemplo ácidos N-glicolilneuramínicos (NeuGc).

Los SiAc son indispensables para las principales funciones celulares funciones en los vertebrados. Como componentes funcionales y estructurales de los gangliósidos, son sintetizados en todos los tejidos en los mamíferos. Sin embargo, las células y tejidos de crecimiento rápido sujetos a altos índices apoptoticos y de renovación pueden necesitar NeuAc adicional, proporcionado por ejemplo por la dieta.

Por lo tanto, en la actualidad, los ácidos siálicos son utilizados de manera frecuente, en particular en el campo de la nutrición infantil. Por ejemplo, una posible participación del SiAc en el desarrollo cognitivo de los infantes fue resumida por Wang (Wang, B. and Brand-Miller, J. (2003) Eur.J.CIin.Nutr. Nov; 57(11 ):1351 -69). En resumen, los estudios que comparan a los infantes amamantados y los infantes alimentados con formula demuestran un mayor contenido de NeuAc de la leche materna en comparación con una fórmula infantil normal se correlaciona con un contenido incrementado de NeuAc en la saliva y el cerebro de los infantes. Sin embargo, no están disponibles los efectos conductuales de la complementación de NeuAc en los seres humanos. Se especula entre tanto que la complementación de la leche de vaca con NeuAc proporcionaría a la leche de vaca los atributos de la leche humana, lo cual puede tener un impacto en el desarrollo cerebral de los niños.

Las fuentes naturales ricas en SiAc, como el NeuAc, son, por ejemplo, la leche humana, la leche de elefante, la leche de búfalo, carne, huevos y pescado. Sin embargo, estas fuentes o bien no son suficientes, no son apropiadas y/o son demasiado costosas, por ejemplo para la complementación de productos lácteos con SiAc en la industria alimenticia actual.

Por lo tanto, existe una necesidad general de una fuente de SiAc alternativa. Los inventores de la presente han resuelto esta necesidad.

En consecuencia fue un objeto de la presente invención proporcionar a la técnica una fuente de SiAc que sea fácil de utilizar en los ambientes industriales, relativamente económica y que permita aislar el SiAc en una forma pura o como una fracción que puede ser utilizada en un producto alimenticio.

Los inventores encontraron de manera sorpresiva que podrían lograr este objeto mediante un uso de acuerdo con la reivindicación 1 y 10 y mediante un alimento reforzado con ácido siálico de acuerdo con la reivindicación 9.

Los inventores encontraron que el SiAc puede ser suministrado con facilidad a partir de Fuentes bacteriales en una forma adecuada para productos alimenticios.

Los SiAc son componentes de superficie de ciertos patógenos, los cuales actúan como factores de virulencia. Se considera que funcionan como una molécula de antireconocimiento al permitir que se enmascare el microorganismo sialilatado, evitando de este modo los mecanismos inmunes del huésped. Sin embargo, el ácido siálico obtenido a partir de organismos patógenos evidentemente no es apropiado para productos alimenticios, en particular para productos alimenticios destinados a la nutrición infantil.

De manera sorpresiva, los inventores de la presente han identificado ahora microorganismos de grado alimenticio que sintetizan SiAc, por ejemplo NeuAc, en particular cuando son cultivados en un medio estándar.

La presente invención se refiere por tanto al ácido siálico obtenido a partir de bacterias de grado alimenticio.

En consecuencia, una modalidad de la presente invención es el uso de bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico de presentes de manera natural o por lo menos una fracción de las mismas para reforzar un alimento con ácido siálico.

La invención se refiere también al uso de ácido siálico obtenido a partir de bacterias de grado alimenticio y/o de una fracción de bacteria de la bacteria de grado alimenticio que contiene ácido siálico para reforzar un alimento con ácido siálico.

El alimento puede ser enriquecido con bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico, inactivadas o vivas, y/o con una fracción de las bacterias y/o su cultivo de crecimiento.

Bacterias de "grado alimenticio" son bacterias que están aprobadas para consume humano o animal.

Una "fracción" de bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico incluye cualquier parte de las bacterias y/o del cultivo bacterial que comprende ácidos siálicos. El término una "fracción" de bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico incluye también el medio, las bacterias de grado alimenticio que fueron cultivadas en el, o partes del mismo, ya que este medio contendrá de manera automática SiAc bacterial. Además, el término "fracción" de bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico incluye también cualquier fracción que contiene SiAc que se obtiene cuando se purifica SiAc a partir del cultivo bacterial.

En una modalidad preferida de la presente invención las bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico presentes de manera natural son viables en los alimentos. Esto tiene la ventaja de que las bacterias pueden continuar produciendo ácido siálico en el cuerpo, incluso después del consumo del alimento. Además, si las bacterias se mantienen viables en el cuerpo, se multiplicarán y en consecuencia la cantidad de ácido siálico proporcionada por las bacterias al cuerpo se incrementará de modo significante.

Para productos estériles, se puede preferir también si las bacterias están presentes en una forma inactivada, o si el producto está enriquecido con SiAc bacterial puro o con una fracción de un cultivo de bacterias productoras de SiAc que no contiene cualesquiera bactenas vivas.

En particular, si las bacterias de grado alimenticio son viables en el producto, las bacterias o por lo menos una fracción de las mismas serán efectivas en cualquier cantidad. Si las bacterias llegan vivas al intestino, una bacteria individual puede ser suficiente para lograr un poderoso efecto mediante colonización y multiplicación.

Sin embargo, para el alimento de la presente invención se prefiere de manera general si las bacterias o por lo menos una fracción de las mismas son utilizadas en una cantidad suficiente para obtener en el producto alimenticio un incremento de 0,05-2% en peso seco, de preferencia de 0,4-1 ,5% de peso seco, de modo preferible 0,6 - 1 % en peso seco.

El alimento de la presente invención puede ser una composición nutricional, un nutracéutico, una bebida, un aditivo alimenticio o un medicamento. Un aditivo alimenticio o un medicamento pueden estar en la forma de tabletas, cápsulas, pastillas o un líquido por ejemplo.

El alimento es seleccionado de manera preferible a partir del grupo que consta de alimentos en base a leche, en particular leche, suero lácteo, yogurt, queso, productos fermentados, fórmulas infantiles; alimento sólido para bebés; fórmulas de seguimiento; bebidas para niños que empiezan a caminar; jugos de fruta por lo menos parcialmente solubles; mezclas de bebidas en forma en polvo tales como bebidas malteadas, bebidas de chocolate, capuchino, bebidas de café; chocolate; productos de cereal; dulces; galletas; gelatinas.

La leche puede ser cualquier leche que se puede obtener a partir de fuentes animales o vegetales y de preferencia es leche de vaca, leche humana, leche de vaca, leche de cabra, leche de caballo, leche de camello o leche de soya.

En lugar de la leche, se pueden utilizar también fracciones de proteína derivados de la leche o calostro.

El alimento puede contener además hidrocoloides protectores (tales como gomas, proteínas, almidones modificados), aglutinantes, agentes formadores de película, agentes/materiales de encapsulamiento, materiales de pared/capa, compuestos de matriz, recubrimientos, emulsificadores, agentes tensioactivos, agentes de solubilización (aceites, grasos, ceras, lecitinas, etcétera.), adsorbentes, vehículos, rellenos, co-compuestos, agentes dispersantes, agentes de humectación, auxiliares de procesamiento (solventes), agentes de flujo, agentes de enmascaramiento de sabor, agentes de compensación, agentes de gelificación, agentes de formación de gel, antioxidantes y antimicrobiales. Pueden contener también aditivos y auxiliares farmacéuticos convencionales, excipientes y diluyentes, que incluyen aunque no se limitan a, agua, gelatina de cualquier origen, gomas vegetales, lignínsulfonato, talco, azúcares, almidón, goma arábiga, aceites vegetales, polialquilen glicoles, agentes sabo zantes, conservadores, estabilizadores, agentes de emulsificacion, soluciones reguladoras, lubricantes, colorantes, agentes de humectación, rellenos, y similares. Además, pueden contener un material de vehículo orgánico o inorgánico adecuado para administración oral o enteral así como vitaminas, elementos de traza de minerales y otros micronutrientes de acuerdo con las recomendaciones de organismos gubernamentales como la USRDA.

El alimento de la presente invención puede contener una fuente de proteína, una fuente de carbohidrato y/o una fuente de lípido.

Se puede emplear cualquier proteína dietética, por ejemplo proteínas animales (como las proteínas de la leche, proteínas de la carne y proteínas de huevo); proteínas vegetales (como la proteína de soya, proteína de trigo, proteína de arroz, y proteína de chícharo); mezclas de aminoácidos libres; o combinaciones de los mismos. Tienen particular preferencia las proteínas de la leche como la caseína y el suero lácteo, y las proteínas de soya.

Si el alimento incluye una fuente de grasa, la fuente de grasa proporciona de modo preferible 5% hasta 40% de la energía de la fórmula; por ejemplo 20% hasta 30% de la energía. Se puede agregar DHA. Se puede obtener un perfil de grasa adecuado utilizando una combinación de aceite de cañóla, aceite de maíz y aceite girasol ácido con alto contenido oleico.

Una fuente de carbohidratos puede proporcionar de mayor preferencia entre 40% hasta 80% de la energía de la composición. Se puede emplear cualquier carbohidrato adecuado, por ejemplo sacarosa, lactosa, glucosa, fructosa, sólidos de jarabe de maíz, maltodextrinas, y mezclas de los mismos.

Las bacterias de grado alimenticio se seleccionan de manera preferible a partir del grupo que comprende los lactobacilos.

Los inventores encontraron que los lactobacilos producen en particular grandes cantidades de SiAc si los lactobacilos están produciendo N-acetilneuraminato liasa y/o N-acetilneuraminato aldolasa.

Las especies de lactobacilos de particular preferencia que pueden ser utilizados para el propósito de la presente invención son Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum y/o Lactobacillus salivarius. Se pueden obtener resultados particularmente buenos con bacterias seleccionadas a partir del grupo que comprende Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936, Lactobacillus plantarum NCC 252 o mezclas de los mismos.

Se puede emplear cualquier fracción bacterial para el propósito de la presente invención. Las bacterias de particular preferencia son fracciones que se pueden obtener mediante cultivo de las células en un medio de cultivo, recolección de las células, hidrolizado de las células bajo condiciones ácidas y recolección del sobrenadante.

Por ejemplo, se puede usar uno de los siguientes métodos: Método 1 : Después de 16h de cultivo a 37°C en medio API (peptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, polisorbato 800.1 %, citrato de amonio 0.2%, acetato de sodio 0.5%, sulfato de magnesio 0.01 %, sulfato de manganeso 0.005% y fosfato dipotásico 0.2%, glucosa 1 %), se recolectaron las células, y fueron lavadas una vez con agua. Los ácidos siálicos fueron liberados desde las células mediante hidrólisis en 2M ácido acético a 80°C durante 3h. El sobrenadante obtenido después del centrifugado fue liofilizado.

Método 2: Las células fueron cultivadas en medio API (véase arriba) durante 16h a 37°C. En 11 del medio de fermentación, se agregaron 250g de ácido triclórico y se sometió a agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Después del centrifugado de las células, se agregó 11 de acetona al sobrenadante y fue incubado durante la noche a 4°C y centrifugado de nuevo. El precipitado fue lavado con acetona al 50% y suspendido de nuevo en agua. El pH fue ajustado a 7 y se centrifugó de nuevo. El extracto fue sometido a diálisis contra agua y liofilizado.

Método 3: Después de 16h de cultivo a 37°C en medio API (véase arriba), las células bacteriales fueron lavadas dos veces con solución salina regulada con fosfato fría (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8.1 mM Na2HP04, 1.5mM KH2P04, pH7.4) y una vez con 0.1 M acetato de piridina (pH5). Las bacterias fueron suspendidas nuevamente en 0.1 V de acetato de pirimidina pre-calentado (0.1 M, pH5) e incubadas a 37°C durante 1 h. El sobrenadante obtenido después del centrifugado fue liofilizado.

Se puede utilizar cualquier ácido siálico para los propósitos de la presente invención. Sin embargo, se prefiere si el ácido siálico tiene la siguiente fórmula R1 puede . ser seleccionado a partir del grupo que comprende H, acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, ácido anhidrosiálico, fucosa, glucosa y/o galactosa.

R2 puede ser seleccionado a partir del grupo que comprende N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo, y/o N-glicolil-O-metilo.

R3 puede ser seleccionado a partir del grupo que comprende H, galactosa, N-acetilglucosima, N-acetilgalactosamina, ácido siálico, y/o ácido n-glicolilneuramínico.

Los grupos en la posición R1 pueden ser idénticos o diferentes entre sí. De modo similar, los grupos en la posición R2 pueden ser idénticos o diferentes entre ellos al igual que los grupos en la posición R3.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico con R1 = H, R2 = N-acetilo y R3 = H.

La presente invención se refiere también a un alimento reforzado con ácido siálico que comprende bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico presentes de manera natural o una fracción de las mismas. El alimento reforzado con ácido siálico puede tener las mismas características que se describieron con anterioridad para el uso de la presente invención.

Un alimento es reforzado con ácido siálico, si se agrega el ácido siálico o bacterias que producen ácido siálico al alimento. Por ejemplo, mediante el refuerzo la cantidad de ácido siálico que puede estar presente de manera natural en el alimento se incrementa por lo menos en 10% en peso, de preferencia al menos 50% en peso, incluso de mayor preferencia al menos 100% en peso.

El alimento de la presente invención puede ser utilizado para proporcionar nutrición a un sujeto, por ejemplo a fin de contrarrestar una falta de producción de ácido siálico endógeno. En particular en el cultivo de organismos los requerimientos de ácidos siálicos con frecuencia exceden la producción de ácido siálico endógeno propia del cuerpo. Por tanto los alimentos complementados con ácido siálico ayudarán a soportar el desarrollo de un sujeto. Sin embargo, una falta de producción de ácido siálico endógeno también puede ocurrir en sujetos, que ya no están creciendo.

La presente invención se refiere también en consecuencia al alimento de la presente invención para uso en el suministro de nutrición a un sujeto. El alimento puede emplearse para contrarrestar una falta de producción de ácido siálico endógeno.

En consecuencia, la materia en cuestión de la presente invención está destinada para seres humanos o animales, en particular animales de compañía, mascotas y/o ganado. La materia en cuestión de la presente invención en general no está limitada a cualquier grupo de edad particular. El alimento puede ser administrado a madres durante el embarazo y la lactancia, para tratar al infante. También puede ser administrada a infantes, niños, adolescentes, adultos o ancianos. Sin embargo, se prefiere suministrar el alimento a infantes.

El rol y potencial de ácido siálico en la nutrición humana fueron resumidos por Wang, B. y Brand-Miller, J. (2003) Eur.J.CIin.Nutr. Nov; 57(11 ): 351 -69.

Los inventores de la presente han encontrado recientemente que la administración del alimento de la presente invención a un sujeto conduce a una elevada sialilación en el cerebro, en particular en sujetos ancianos. Esto se observa por ejemplo mediante una sialilación incrementada de preparaciones cerebrales enriquecidas con gangliósido (sialil-lactosilceramidas). La sialilación y en especial los gangliósidos son factores importantes en la estabilización de la integridad neuronal y para permitir la plasticidad neuronal en el sistema nervioso central y periférico.

Se encontró también que la administración del alimento de la presente invención, de preferencia a ancianos, conduce a una sialilación elevada en el tracto gastrointestinal (GIT), en particular en la mucosa próxima y distal del colon. Aquí la modificación de la sialilación de mucina afecta las propiedades fisicoquímicas de la barrera de la mucosa. Adicionalmente, se encontró que se aumenta la sialilación del enlace-glicolípido como se ve por los niveles incrementados de gangliósidos en el colon.

Se observe además la administración del alimento de la presente invención a un sujeto conduce a una respuesta inmune mediada por células mejorada. De manera concomitante, se aumentaron los niveles de II-2 en la estimulación in vitro de esplenocitos mediante lectin ConA en sujetos que consumieron el alimento de la presente invención en comparación con los sujetos de control. Este efecto fue más pronunciado en infantes y niños que en los ancianos.

El alimento de la presente invención y/o el ácido siálico obtenido a partir de las bacterias de grado alimenticio pueden ser utilizados consecuentemente para el tratamiento o prevención de la neurodegeneración, en particular en adultos. Pueden ser empleados también para mejorar el rendimiento cognitivo y/o para mantener el desarrollo cerebral, en particular en niños.

Aplicaciones adicionales del alimento de la presente invención y/o el ácido siálico obtenido a partir de bacterias de grado alimenticio son el soporte del sistema inmune, en particular para impulsar la inmunidad, y/o para mejorar el funcionamiento intestinal.

Las patologías clínicas particulares que pueden ser tratadas o prevenidas con el alimento de la presente invención y/o el ácido siálico obtenido a partir de bacterias de grado alimenticio incluyen por ejemplo enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome intestinal, patologías degenerativas del sistema nervioso tales como demencia o enfermedad de Alzheimer, enfermedades inmunes autodestructivas post-infecciosas, y/o degradación de neurona del TGI.

En consecuencia, el alimento de la presente invención y/o el ácido siálico obtenido a partir de las bacterias de grado alimenticio puede, por ejemplo, promover el crecimiento saludable y el envejecimiento saludable; mantener el desarrollo cerebral en infantes y niños; mejorar el funcionamiento cognitivo; evitar o contrarrestar el deterioro cognitivo y/o la neurodegeneración, por ejemplo debidos al envejecimiento, enfermedad o tensión; mantener la maduración inmune y la homeostasís; incrementar la sialilación, por ejemplo en personas ancianas, por ejemplo al proporcionar NeuAc dietético para inmunoprotección; para reducir las inflamaciones de menor grado; para mejorar la barrera intestinal; y/o para suprimir las inflamaciones sistémicas.

El alimento complementado con ácido siálico de la presente invención puede contribuir a suministros óptimos de SiAc al recién nacido, por ejemplo en la leche materna o fórmulas infantiles; a un óptimo desarrollo del SNC; a la restauración de un déficit circunstancial de SiAc, por ejemplo, durante el embarazo, lactancia, y/o en casos de desnutrición.

Aquellos con experiencia en la técnica comprenderán que pueden combinar libremente todas las características de la presente invención descritas en la presente, sin apartarse del alcance de la invención como se describió. En particular, las características descritas para los usos de la presente invención pueden ser aplicadas al alimento de la presente invención y vice versa.

Ventajas y características adicionales de la presente invención son evidentes a partir de los siguientes Ejemplos y Figuras.

La Figura 1 muestra cromatogramas de diclorhidrato de 1 ,2-Diamino-4,5-metilendioxibenceno (DMB): L plantarum NCC2936 (A); NCC2936 enriquecido con NeuAC y NeuGc estándar (B); y NeuAC y NeuGc estándar (C).

Ejemplos: MÉTODOS Cepas bacteriales y su producción Se obtuvieron cepas bacteriales a partir de Nestle Culture Collection (NCC) y fueron cultivadas en medio API (peptona 1 %, extracto de levadura 0.5%, polisorbato 80 0.1 %, citrato de amonio 0.2%, acetato de sodio 0.5%, sulfato de magnesio 0.01 %, sulfato de manganeso 0.005% y fosfato dipotásico 0.2%, glucosa 1 %). Después de 16h de cultivo a 30°C, se recolectaron las bacterias y fueron secadas por congelación.

Detección de SiAc Se detectó SiAc utilizando un método modificado de Jourdian et al. (1971 ) J Biol Chem 246: 430-435. En resumen, 10 µ? de 0.04M ácido periódico se mezclaron con 50µ? de muestra o 50µ? de NeuAc estándar (0, 20, 40, 60, y 100 µg/m\) e incubado durante 35 minutos en un baño de hielo. 125 µ? de la mezcla fresca compuesta de 0.04 mg de CuS04 en 6ml 28% HCI + 1 ml 6% resorcinol + 3 mi H20 fueron agregados e incubados durante 5 minutos a 4°C. Las muestras fueron calentadas a ebullición durante 15 minutos y enfriadas. Se agregaron 125 µ? de ter-butanol al 95% e incubados durante 3 minutos a 37°C para estabilizar el color. La valoración se efectuó de manera visual, mediante comparación de la intensidad del color . azul de las muestras con los estándares de diferentes concentraciones.

Cuantificación de SiAc Método de diclorhidrato de 1 ,2-D¡amino-4,5-metilendioxibenceno (DMB): Se disolvió una muestra bacterial en agua para obtener una concentración total de ácido siálico esperada de aproximadamente 2 pg/mL. Una alícuota 200 pL de esta solución fue hidrolizada mediante adición de 200 pL de ácido fórmico (1.0 M) y calentando a 80°C durante 2 h para liberar todos los ácidos siálicos enlazados. Los ácidos siálicos fueron derivados después con diclorhidrato de 1 ,2-diamino-4,5-metilenedioxibenceno (DMB), una etiqueta fluorescente que es específica para ácidos a-ceto. La derivación se llevó a cabo mediante adición de 200 pL de una solución de DMB (7.0 mM en 1.4 M ácido acético que contiene 0.75 M 2-mercaptoetanol y 18 mM de hidrosulfito de sodio) a una alícuota 200 pL de la muestra hidrolizada, la mezcla fue calentada después a 80°C durante 50 minutos. Las muestras derivadas (5 µ?) fueron inyectadas a una columna HPLC de fase invertida (Zorbax SB-Aq, 3.5 µ??, 4.6 x 50 mm) y eluidas utilizando una fase móvil de agua/metanol/ácido acético (75/25/0.05(v/v/V)) que fluye a 2.0 mlJmin. El eluyente de columna fue monitoreado utilizando detección de fluorescencia (Aex = 373 nm, Aem = 448 nm). La cuantificación se realizó mediante preparación de una curva de calibración a partir de ácido siálico de concentración conocida y comparando las áreas pico a partir de la muestra con aquellas de los estándares.

Identificación de NeuAc (Análisis GC-MS) Se prepararon glucósidos de metilo a partir de una cantidad pesada de muestra mediante tratamiento con 1 M HCI en metanol (25 gotas) a 80°C durante 15 h seguido por re-A/-acetilación con piridina (5 gotas) y anhídrido acético (5 gotas) en metanol (20 gotas) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las muestras fueron per-O-trimetiIsililatadas mediante el tratamiento con Tri-Sil (10 gotas, Pierce) a 80°C (15 minutos). Estos procedimientos se llevaron a cabo como se describió de forma previa (Merkle, R. K. and I. Poppe (1994) Methods Enzymol. 230:1 -15; York, W.A. at al (1986) Methods Enzymol 1 18:3-40). El análisis GC/MS de los TMS metil glucósidos se realizó en un HP 5890 GC en interfaz para un 5970 MSD, utilizando una columna DB-1 (30m x 0.25 mm ID).

RESULTADOS Detección de bacteria productora de SiAc Las bacterias a partir de Nestle Culture Collection fueron tamizadas para la producción de SiAc utilizando un método periódico. Se identificaron las siguientes cepas como particularmente eficientes en la producción de SiAc y fueron depositadas de conformidad con el tratado de Budapest.

Lactobacillus sakei NCC 121 (número de depósito CNCM I-4020) Lactobacillus sakei NCC 2935 (número de depósito CNCM I-4064) Lactobacillus sakei NCC 2934 (número de depósito CNCM I-4025) Lactobacillus sakei NCC 166 (número de depósito CNCM I-4066) Lactobacillus sakei NCC 170 (número de depósito CNCM I-4067) Lactobacillus sakei NCC 1393 (número de depósito CNCM I-4022) Lactobacillus sakei NCC 1428 (número de depósito CNCM I-4023) Lactobacillus sakei NCC 151 1 (número de depósito CNCM I-4024) Lactobacillus sakei NCC 2937 (número de depósito CNCM I-4065) Lactobacillus plantarum NCC 2936 (número de depósito CNCM I-4026) Lactobacillus plantarum NCC 252 (número de depósito CNCM 1-4021 ) Identificación de tipo SiAc Los polvos secados de las cepas productoras de SiAc se prepararon como se describe en Material y Métodos. Los mismos polvos fueron analizados utilizando dos métodos diferentes: DMB y GC-MS: . a) La Figura 1 representa el cromatograma típico de las cepas analizadas (NCC 2936) producidas utilizan do el método DMB. Usando este método se identificó un pico que opera casi durante el mismo tiempo de retención que el ácido N-acetil neuramínico (NeuAc), aunque mostrando un ligero desplazamiento del tiempo de retención. No se detectó un pico visible cercano al ácido N-glicolil neuramínico (NeuGc). Dicho desplazamiento puede ocurrir si la muestra contiene algo que se enlace a la fase estacionaria de la columna. Dicho enlace reduce la interacción del analito con la fase estacionaria y por tanto desplaza el tiempo de retención. De manera alternativa, el SiAc puede ser modificado por medio de la adición de un grupo químico y, por lo tanto, muestra un tiempo de retención alterado.

Para probar si los picos fueron desplazados debido a compuestos de interferencia en la muestra, se realizó un experimento de "adición". Se agregó una cantidad definida de NeuAc estándar a una preparación de muestra y la muestra opera de nuevo en HPLC. El tiempo de retención del pico observado en la muestra agregada fue mucho más cercano a aquel del pico NeuAc estándar debido probablemente a un efecto de dilución. Sólo se detectó un pico en la muestra adicionada NeuAc, lo que indica que el estándar agregado a la muestra opera en la misma posición con el pico muestra original. Por tanto, concluimos que este pico representa más probablemente a NeuAc y que el desplazamiento de tiempo de retención observado inicialmente se debió de modo probable a compuestos de interferencia en la muestra y no por causa de una modificación de NeuAc. b) se obtuvo una evidencia adicional de que la bacteria produce NeuAc en un análisis GC-MS. Utilizando este método, se analizó la composición de glicosilo de muestras bacteriales (Cuadro 1 ). Como resultado, el SiAc presente en las muestras bacteriales fue confirmado como NeuAc.

Cuadro 1 : Análisis de Composición de Glicosilo de Muestras Bacteriales Muestra Residuo de Glicosilo : Masa (uq) Mol %1 L. sakei Ribosa (Rib) 4.0 4.3 NCC 2934 Galactosa (Gal) 23.2 20.7 Glucosa (Glc) 42.8 38.3 N-acetil glucosamina (GIcNAc) 40.2 36.0 Ácido N-acetil neuramínico (NANA) 1J> 0.7 ?=1 1 1.7 L. sakei Ribosa (Rib) 1.8 6.4 NCC 2935 Galactosa (Gal) 1 .7 4.9 Glucosa (Glc) 16.9 49.8 N-acetil glucosamina (Glc NAc) 12.8 37.8 Ácido N-acetil neuramínico (NANA) 0.6 1.1 ?=33.8 L. sakei Ribosa (Rib) 1 .8 6.2 NCC 2937 Ramnosa (Rha) 4.7 14.6 Galactosa (Gal) 1.4 4.1 Glucosa (Glc) 9.7 27.3 N-acetil glucosamina (GIcNAc) 16.4 46.4 Ácido N-acetil neuramínico (NANA) 0.6 1 .4 ?=34.6 L. plantarum Ribosa (Rib) 3.9 5.3 NCC 2936 Galactosa (Gal) 5.9 6.8 Glucosa (Glc) 56.4 64.8 N-acetil glucosamina (GIcNAc) 8.2 21 .0 Ácido N-acetil neuramínico (NANA) 2.3 2.1 ?=86.7 Valores son expresados con porcentaje molar de carbohidrato total.

Cuantificación de SiAc La cuantificación de SiAc en muestras bacteriales se realizó con el método DMB y el método de prueba periódica. DMB es un método cuantitativo, en tanto que se utilizó la prueba periódica para análisis semi-cuantitativo de las muestras. No fue posible la cuantificación precisa utilizando la prueba periódica debido al elevado color de fondo que interfirió con la lectura espectrofotométrico de los resultados. Los resultados de la cuantificación realizada en el mismo lote de bacterias se presentan en el Cuadro 2.

Cuadro 2: Contenido NeuAc en muestras bacteriales El contenido de SiAc es expresado cómo % de materia seca bacterial.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1 . Uso de bacterias de grado alimenticio de presencia natural productoras de ácido siálico o por lo menos una fracción de las mismas que contiene ácido siálico para reforzar un alimento con ácido siálico.

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque las bacterias de grado alimenticio de presencia natural productoras de ácido siálico son viables de manera que producen ácido siálico en el cuerpo después del consumo del alimento.

3. Uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las bacterias o por lo menos una fracción de las mismas son usadas en una cantidad suficiente para obtener en el producto alimenticio un incremento del contenido del ácido siálico de 0,05-2% % en peso seco, de preferencia 0,4-1 ,5% en peso seco, de mayor preferencia 0,6 - 1% en peso seco.

4. Uso de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las bacterias son seleccionadas a partir del grupo de lactobacilos, en particular lactobacilos productores de N-acetilneuraminato Nasa y/o N-acetilneuraminato aldolasa, incluso de manera más preferible Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum y/o Lactobacillus salivarius.

5. Uso de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque las bacterias son seleccionadas a partir del grupo que consta de Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936, Lactobacillus plantarum NCC 252 o mezclas de los mismos.

6. Uso de conformidad con las reivindicaciones 1 -5, caracterizado porque la fracción bacterial se puede obtener mediante un proceso que comprende las siguientes etapas: cultivar las células en un medio de cultivo, recolectar las células, hidrolizar las células bajo condiciones ácidas y recolectar el sobrenadante el cual contiene el ácido siálico.

7. Uso de conformidad con las reivindicaciones 1 -6, caracterizado porque el ácido siálico tiene la siguiente fórmula R1 = H, acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, ácido anhidrosiálico, fucosa, glucosa y/o galactosa. R2 = N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo, y/o N-glicolil-O-metilo. R3 = H, galactosa, N-acetilglucosima, N-acetilgalactosamina, ácido siálico, y/o ácido n-glicolilneuramínico, y de preferencia es ácido N-acetilneuramínico (R1=H, R2=N-acetil, R3=H).

8. Alimento reforzado con ácido siálico que comprende además bacterias de grado alimenticio de presencia natural productoras de ácido siálico o una fracción de las mismas como se describe en las reivindicaciones 1 -7.

9. Alimento reforzado con ácido siálico de conformidad con la reivindicación 8 para uso en el suministro de nutrición a un sujeto.

10. Alimento reforzado con ácido siálico de conformidad con la reivindicación 8 utilizado para contrarrestar una falta de producción de ácido siálico endógeno.

1 1 . Alimento reforzado con ácido siálico de conformidad con la reivindicación 8 para uso en el tratamiento o prevención de la neurodegeneración, en particular en adultos.

12. Alimento reforzado con ácido siálico de conformidad con la reivindicación 8 para uso en el soporte del sistema inmune, en particular para impulsar la inmunidad, y/o para mejorar la función intestinal.

13. Alimento reforzado con ácido siálico de conformidad con la reivindicación 8 para uso en el mejoramiento del rendimiento cognitivo y/o en el mantenimiento del desarrollo cerebral, en particular en niños.

14. Bacterias de grado alimenticio productoras de ácido siálico seleccionadas a partir del grupo que consta de Lactobacillus sakei NCC 121, Lactobacillus sakei NCC 2935, Lactobacillus sakei NCC 2934, Lactobacillus sakei NCC 166, Lactobacillus sakei NCC 170, Lactobacillus sakei NCC 1393, Lactobacillus sakei NCC 1428, Lactobacillus sakei NCC 1511, Lactobacillus sakei NCC 2937, Lactobacillus plantarum NCC 2936 y Lactobacillus plantarum NCC 252.

15. Ácido siálico obtenido a partir de bacterias de grado alimenticio.