KR101121160B1

KR101121160B1 - 전세포를 이용한 당전이 방법

Info

Publication number: KR101121160B1
Application number: KR1020090015490A
Authority: KR
Inventors: 최재열; 반재구; 정흥채; 주숙자; 박승환; 양희수; 김성희; 오덕근; 김의중
Original assignee: 주식회사 제노포커스
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2009-02-24
Publication date: 2012-03-19
Also published as: KR20100096568A; CN101812493A; CN101812493B

Abstract

본 발명은 전세포를 이용한 당전이 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법, 신규 프로모터 및 내열성 베타갈락토시다제를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 올리고당의 제조방법은 내열성 효소를 이용함으로써, 기존의 정제 효소를 이용한 제조방법과 동일한 올리고당 전환율을 나타내면서도, 효소생산에 있어서 세포 배양 이외의 다른 공정이 필요하지 않아 생산 비용 절감효과가 있다.

올리고당, 코리네박테리움, 내열성 효소

Description

전세포를 이용한 당전이 방법{Method for Transglycosylating Using Whole Cell}

본 발명은 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법, 신규 프로모터 및 내열성 베타갈락토시다제를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.

올리고당(Oligosaccharide)은 단당 2개로 이루어지는 이당류로부터 단당 10개로 이루어지는 십당류까지의 당류를 총칭하는 것으로서, 감미를 가지는 수용성의 결정성 물질이다. 대부분의 당질이 신체 내 소화효소에 의하여 구성 단당으로 분해되어 흡수되는데 반하여 올리고당은 소화효소에 의해 거의 분해되지 않고 대장에 도달되어 장내 유용세균에게 이용되거나 기타 건강에 유리한 효과를 보인다.

설탕보다 낮은 감미도, 비발효성, 보습성, 난흡습성, 침투성, 청량감, 변색방지, 감칠맛보강, 수분활성 저하작용 등의 특성이 있으므로 제품의 목적에 맞게 이용할 수 있으며, 비슷한 기능을 가지는 식이섬유와는 물성이 크게 다르고 고분자 물질이 아니므로 식품에 첨가하여도 물성과 조직감이 크게 달라지지 않는 장점이 있다. 올리고당이 이용되고 있는 식품으로는 음료수, 과자, 캬라멜, 초콜렛, 쿠키, 빵, 아이스크림, 쨈, 젤리, 요구르트, 케이크, 건강식품 등이다.

현재 산업 현장에서 주로 생산되고 있는 올리고당은 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당 등이 있다. 이들 올리고당은 생물공학적 방법으로 기질과 해당 기질을 분해하는 효소를 반응시켜 생산한다. 이들 효소는 미생물을 배양 후 다양한 후처리 공정을 거쳐 액상 또는 분말화되어 생산 현장에 공급된다. 올리고당의 효율적인 대량생산을 위해서는 설비 가동 비용을 줄이기 위해 고농도의 기질 용액이 필요하며, 생산 가동 중 반응기질과 부산물에 의한 미생물 오염을 막아야 한다.

특히, 갈락토올리고당은 락토스를 기질로 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 효소반응으로 생산된다. 락토스는 고농도의 수용액 상태일수록 용해도가 떨어지며, 고농도로 용해 시 고온의 조건이 필수적이다. 또한, 산업 현장에서는 50%(wt/vol) 락토스 용액을 갈락토올리고당 생산을 위한 기질로 사용한다.

한편, 코리네박테리움 글루타미쿰은 예전부터 글루탐산을 포함한 아미노산 및 핵산 생산에 이용되는 유용한 미생물로 이와 같은 방법으로 올리고당 생산에 적용된 예가 없다.

이에 본 발명자들은 내열성 베타 갈락토시다제가 삽입된 벡터를 형질전환 시킨 코리네박테리움 글루타미쿰을 고농도 배양하여, 배양 후공정 없이 코리네박테리움 글루타미쿰 전세포를 락토스 용액과 반응시켜 상업화가 가능한 갈락토올리고당 전환 수율의 결과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터와 내열성 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터와 내열성 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 함유하되, 상기 프로모터와 상기 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 내열성 베타갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 올리고당의 제조방법은 내열성 효소를 이용함으로써, 기존의 정제 효소를 이용한 생산방법과 동일한 올리고당 전환율을 나타내면서도, 효소생산에 있어서 세포 배양 이외의 다른 공정이 필요하지 않아 생산 비용 절감효과가 있다.

본 발명은, 일 관점에서, 전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 상기 전세포는 내열성 당전이 효소를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 당은 락토스, 맥아당 및 설탕으로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있고, 상기 올리고당은 갈락토올리고당, 이소말토올리고당, 프락토올리고당 및 락토슈크로스로 구성된 군에서 선택된 것 일 수 있다.

여기서, 갈락토올리고당은 갈락토오스가 1~4개 결합되어 있는 화학구조를 가지고 있으며, 3당류가 주성분이다. 유당에 베타 갈락토시다제 (β-galactosidase)를 작용시켜 제조된다.

여기서, 이소말토올리고당은 포도당으로 구성되어 α-1,6 결합이 한개 이상 존재하는 소당류로서, 이소말토오즈, 이소말토트리오스, 판노스 등이 주성분이며, 맥아당에 트랜스글루코사다제 (transglucosidase)를 작용시켜 제조된다.

여기서, 프락토올리고당은 설탕의 과당잔기에 1~3개의 과당이 결합된 설탕과 유사한 구조를 가진 당류의 혼합물로서, 주성분은 프락토스 (fructose), 니스토스 (nystose), 프락토퓨라노실니스토스 (fructofuranosylnystose) 등이 주성분이며, 설탕에 베타 프락토퓨라노시아제 (β-fructofuranosidase)를 작용시켜 제조된다.

여기서, 락토슈크로스는 갈락토스, 글루코스, 프락토스가 결합한 3탄당으로서 저칼로리 감미제로서 락토오스와 설탕을 기질로 프락토퓨라노시다제 (fructofuranosidase)를 작용시켜 제조된다.

본 발명에 있어서, 내열성 효소는 고온에서도 안정한 효소를 의미하는 것으로, 본 발명에 따른 올리고당 생산에 적절한 내열성 당전이 효소로는, 락타아제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 트랜스-글루코시다제, 알파-글루코시다제, 프락토실트랜스퍼라제, 텍스트란슈크라제 및 레반슈크라제로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.

일 예로, 상기 베타-갈락토시다제는 술포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus 98/2) 유래일 수 있으며, 최적 활성 온도가 70~80℃이고, pH는 6.0이다.

여기서, 락타아제는 β-갈락토시다아제, 유당분해효소라고도 한다. β-D-갈락토실(1, 4)-D-글루코오스의 구조를 가지고 있는 락토오스를 포도당과 갈락토오스로 가수분해할 때 촉매로 사용되는 효소이다.

여기서, 베타-글리코시다제는 다양한 기질을 이용하여 탄수화물 산업에서 소 당류의 생산, 글리코시드(glycoside) 유도체 합성 등 여러 가지 종류의 탄수화물의 분해에 이용되는 효소이다.

여기서, 트랜스-글루코시다제는 알파-글루코시다제를 포함하는 효소로 말단의 비환원성 알파 1,4 결합의 알파-D-글루코스 단위를 가수분해하며, 말토스를 기질로 하여 이소말토올리고당을 생산한다.

여기서, 프락토실트랜스퍼라제는 트랜스프럭토실레이션(transfructosylation) 반응으로 설탕을 프락토올리고당으로 전환하며, 일반적으로 미생물로부터 정제하여 사용하는 효소이다.

본 발명에서, 상기 내열성 당전이 효소를 코딩하는 유전자의 기원으로는 미생물, 식물, 곤충 및 동물이 포함되며, 일 예로, 내열성 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자는 술포로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus 98/2) 유래인 것일 수 있다.

상기 재조합 미생물은 대장균, 바실러스, 코리네박테리움, 아스퍼질러스, 및 효모로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다. 본 실시예에서는, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 예시하였으나, 이것으로 제한되지 아니한다.

본 발명은, 구체적으로, 상기 재조합 미생물 존재하에 기질인 당을 반응시켜 올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

상기 올리고당은 설탕, 전분, 유당을 원료로 하여 효소로 당화 또는 압출하여 얻은 당액을 가공하여 얻은 것으로, 단당류가 2~8개 결합한 소당류의 일종이며, 장내 소화 효소에 의해 잘 분해되지 않고 저칼로리로 비만, 당뇨 등 설탕 섭취에 제한을 받는 사람에게 적합한 저칼로리 감미료이다. Tea, 빵, 젤리, 비스켓, 카라멜 등에 사용되는 기능성 감미료이다. 천연 올리고당으로는 목화씨 및 콩에 함유되어 있는 3당류인 라피노즈와 4당류인 스타치노즈 등이 있다.

구체적으로, 상기 올리고당의 종류는 설탕분자에 과당분자 1~3개가 결합하여 효소를 작용시켜 얻은 당액을 여과, 정제, 농축한 액상의 프락토 올리고당, 전분분자에 포도당분자가 결합하여 효소로 당화 또는 압출하여 얻은 당액을 가공한 이소말토올리고당, 유당분자에 효소를 작용시켜 얻은 당액을 효소로 당화 또는 압출하여 얻은 당액을 가공하거나, 대두에서 추출한 라피노스, 스타치오스의 당액을 여과 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 갈락토올리고당, 전분분자에 포도당 분자 3~10개를 직쇄결합하여 효소를 작용시켜 얻은 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 분말상의 말토올리고당 등이 있다.

일반적으로, 올리고당은 생물공학적 방법으로 기질과 해당 기질을 분해하는 효소를 반응시켜 생산하고, 이러한 효소는 미생물을 배양 후 다양한 후처리 공정을 거쳐 액상 또는 분말화되어 사용된다. 또한, 올리고당의 효율적인 대량생산을 위해서는 설비 가동 비용을 줄이기 위해 고농도의 기질 용액이 필요하며, 생산 가동 중 반응기질과 부산물에 의한 미생물 오염을 막아야 하는데, 이러한 조건은 고온하에서 가능하다. 따라서, 고온에서도 최적의 활성을 나타낼 수 있는 내열성 효소를 사용하는 것이 올리고당 생산에 적합하다고 할 수 있다.

특히, 올리고당 중 갈락토올리고당의 경우, 락토스를 기질로 베타 갈락토시 다제(β-galactosidase) 효소반응을 이용하여 생산하는데, 기질인 락토스는 고농도의 수용액 상태일수록 용해도가 떨어지므로, 고농도로 용해시 고온의 조건이 필수적이다. 예컨대, 일반 산업현장에서 사용되는 락토스 용액은, 60 내지 70℃에서 약 50%정도의 농도이다.

하기 실시예에서는, 갈락토올리고당 제조의 경우만을 예시하고 있으나, 기질인 당과 유전자를 적절한 것으로 선택하여 본 발명의 방법을 적용할 경우, 이소말토올리고당, 프락토올리고당, 또는 락토슈크로스 또한 용이하게 제조가능할 것이다.

또한, 전세포의 이용은 고농도 세포 배양 후 배양액을 포함한 전세포를 효소로 사용함으로써, 세포분리, 완충용액 첨가, 농축 등의 후처리 공정이 없어지는 장점을 가진다. 일부 전세포를 이용하는 생산방법에는 반응기질의 세포 내 투과성을 높이기 위하여, 톨루엔 또는 알코올 등의 투과유도물질(permeable agent)을 세포에 처리하기도 하나, 이는 대다수가 유기용매로 독성 물질의 잔존 위험성이 있다. 하지만, 고온 조건에서 반응시킬 경우, 용해도나 세포 내 물질의 투과도가 높아지므로, 이러한 투과유도물질의 첨가를 배제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 전세포는 내열성 당전이 효소를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물이고, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터를 함유할 수 있다.

본 발명에 따라, 구체적으로, 상기 내열성 베타 갈락토시다제가 삽입된 재조합 벡터를 형질전환시킨 재조합 미생물, 일 예로, 재조합 코리네박테리움 글루타미 쿰을 고농도 배양하여, 배양 후 공정 없이 코리네박테리움 글루타미쿰 전세포를 락토스 함유 기질과 반응시켜 올리고당을 생산할 수 있다.

상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 상기 내열성 효소는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다. 본 발명에서는 올리고당의 생산에서는 전세포를 사용하기 때문에, 상기 내열성 효소의 분리는 내열성 효소의 세포내 활성과 단백질 전기영동의 확인을 위해 필요할 뿐이다.

본 발명에서 올리고당 기질과의 반응에 효소기능으로서 사용될 전세포는, 상기 재조합 균주의 배양물을 의미하는 것으로, 상기 형질전환 숙주세포의 고농도배양(High density cell culture)에 의해 세포의 OD(Optical density)₆₀₀ 값이 100 이상인 상태를 말한다. 배지에서 생육된 세포들은 OD₆₀₀ 100이상의 농도가 되면 세포내 발현 및 세포외 분비발현을 하는 경우 모두 세포와 배지의 분리가 어려워진다. 따라서, 본 발명에서 고농도배양이 완료된 후 세포와 배지성분이 포함된 상태의 전세포를 기질 부피 대비 2 내지 6% (v/v) 으로 투입하여 바람직하게는 50~80℃ 고온하에서 반응시키는 올리고당을 생산할 수 있다. 또한, 기질로서 설탕, 락토오스, 맥아당의 사용시 고농도의 기질은 생산량 대비 생산 횟수의 절감을 유도하기 때문에 중요하다. 이들 기질은 고농도화 될수록 실온에서 용해도는 떨어지게 되어 용해를 위해 고온의 조건이 필요하게 된다. 전세포를 이용한 올리고당 반응에 상기의 기질 농도는 30~60%(w/v)이 바람직하다. 따라서, 내열성 효소 생산은 형질전환된 숙주세포를 배양하는 것 이외에는 세포파쇄, 세포분리, 농축 등의 과정이나 전세포 사용시 물질의 세포내 출입을 증대시키는 투과성 유도인자(Permeable agent)의 처리 같은 추가적인 어떠한 과정도 거치지 않게 된다.

본 발명은, 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터와 내열성 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 함유하되, 상기 프로모터와 상기 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, "프로모터"란, 전사개시점 (+1) 부터 20～30 염기에 대해 상류에 있고, 정확한 위치로부터 RNA 폴리머라아제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만, 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에, 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함해도 된다.

상기 재조합 벡터는, 재조합 발현 벡터를 의미하는 것으로, 발현 벡터란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 전사를 가능하게 하는 프로모 터, 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자, 미생물 내에 자가 복제가 가능한 유전자 및 목적하는 벡터를 선별하기 위한 항생물질의 유전자 등을 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 또한, 상기 프로모터와 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자는 작동가능하게 연결되도록 제작되며, 구체적으로, 도 1의 개열지도를 가질 수 있다. 목적 유전자를 제외한 상기 유전자들은 벡터의 백본(backbone) 및 선택된 숙주에 따라 달라질 수 있고, 벡터 제작이 있어서 상기 최소한으로 필요한 유전자들은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 유전자 발현 조건 및 목적에 따라 용이하게 선택할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등이 이용가능하며, 일 실시예로써, 상기 벡터의 백본으로서 pUC19를 이용할 수 있다.

추가적으로, 상기 재조합 벡터는 상기 베타-갈락토시다제의 발현을 조절하는 조절서열을 포함할 수 있다. "조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 염기 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 발현 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 상기 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈 내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다. 여기서, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 염기 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 기능적으로 연결되어 있 는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

또한, 벡터는 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다.

또한, 벡터는 선택마커 (selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다.

여기서, 베타-갈락토시다제는, 락타아제라고도 하며, 알릴 및 아릴-D-갈락토시드 외에 락토오스에도 작용하여 갈락토오스를 생성하는 효소이다. 베타-갈락토시다제는 락토오스와 같은 베타-D-갈락토피라노시드에서 비환원 말단 베타-D-갈락토오스를 가수분해하거나, 갈락토오스의 전이반응을 촉매하며 여러종류의 미생물을 비롯하여 식물과 동물에서 두루 발견된다. 이 효소의 가수분해 활성과 당 전이 활성은 모두 산업적 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하며, 유당 불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 비피도박테리아의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당의 제조에 이용된다.

이러한 내열성 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자는 술포로부스, 써머스 속,바실러스 속 및 피로코커스 속으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은, 목적단백질의 발현을 위해 상기한 바와 같은 프로모터와 내열성 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결되도록 제작된 벡터의 숙주세포로, 이는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032와 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 양태로서, 과발현시키고자 하는 목적 유전자가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 상기한 바와 같은 미생물에 제한되는 것은 아니다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 본 발명의 구체적인 양태에서는 전기천공법을 사용한다.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 내열성 베타갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.

상기 베타-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23)는 통상적으로 락토스를 단당류인 D-글루코스 및 D-갈락토스로 가수분해한다. 베타-갈락토시다제의 정상적인 효소 반응에서, 상기 효소는 락토스를 가수분해하고, 갈락토스 단당류를 갈락토스-효소 복합체 중에서 일시적으로 결합하였다가 상기 갈락토스를 물의 히드록실기에 전달함으로써, D-갈락토스 및 D-글루코스를 유리시킨다. 그러나, 락토스가 고농도인 경우, 일부의 베타-갈락토시다제는 트랜스갈락토실화라고 지칭되는 과정을 통해 갈락토스를 D-갈락토스 또는 D-글루코스의 히드록실기에 전달하여 갈락토-올리고당류를 생산할 수 있다. 이와 같이 트랜스갈락토실화할 수 있는 효소는 박테리아 및 효모 등을 비롯한 광범위한 범위의 미생물로부터 확인되어 왔으며, 이들 중 본 발명에 따른 베타 갈락토시다제는 고온에서 트랜스갈락토실화의 기능을 가지는 효소 중 하나이므로, 베타-갈락토시다제 이외에 다른 내열성 당전이효소의 제조 또한 본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용하여 발현시킴으로써 가능할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 내열성 베타 갈락토시다제 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제조

(1) 재조합 벡터 pSG201-Slac의 제조

술포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus 98/2)를 조성이 0.1% 효모 추출물, 0.1% 카사미노 산, 0.3% 제2인산칼륨, 0.25% 황산암모늄, 0.02% 황산마그네슘7수염, 0.02% 염화칼슘2수염에 미량원소(1.8mg MnCl₂?4H₂O, 4.5mg Na₂B₄O₇?10H₂O, 0.22mg ZnSO₄?7H₂O, 0.05 mg CuCl₂?2H₂O, 0.03 mg Na₂MoO₄?2H₂O, 0.03 mg VOSO₄?2H₂O, 0.01 mg CoSO₄?7H₂O/ L)가 일부 첨가되며 최종 pH는 4로 맞추어진 배양배지에서 80℃에서 24시간 배양하였다. 상기 세포로부터 게놈 DNA 500㎍을 분리(Genomic DNA extraction kit; RBC사)하였다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, PCR 산물을 제한효소 NdeI과 AvaI으로 처리하고, 동일 제한효소로 처리된 pET24a(Novagen사) 벡터에 라이게이션(Ligation) 하여 pET24a-Slac를 얻었다.

전방향 프라이머 (서열번호 2): atgtactcatttccaaatag

역방향 프라이머 (서열번호 3): ttagtgccttaatggcttta

서열번호 1의 염기서열로 구성된 프로모터는 KpnI과 ClaI을 양 말단에 부착시켜 올리고 합성(BioNeer사)으로 제작하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 4과 서열번호 5의 프라이머로 PCR을 수행하여 벡터의 복제 개시를 위한 염기서열 부위(Replication origin)를 증폭하였다. 또한, pKK223-3(Pharmacia사)벡터로부터 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머로 rrnB T1 종결자(terminator)를, pUB110(Sigma사)로부터 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머로 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 각각 증폭하였다. 복제 개시 서열 부위는 제한효소 BglII와 DraI을 처리하였으며, 벡터 종결자는 제한효소 Xbal과 SalI으로 처리하였으며, 카나마이신 저항성 유전자는 제한효소 AatII와 SpeI으로 처리하였다. 벡터의 제한효소 동일 부위를 처리하고, T4 리가아제를 이용하여 pUC19 벡터(Invitrogen)에 순차적으로 삽입하였다. 이와 같이 구축된 새로운 발현벡터를 pSG201이라고 명명하였다.

서열번호 4: AAAAACGGTGATCGGATTTT

서열번호 5: GATCTTTGGGAGCAGTCCTT

서열번호 6: GCTTAAATAAAACGAAAGGC

서열번호 7: AAAGAGTTTGTAGAAACGCA

서열번호 8: GTGAATGGACCAATAATAAT

서열번호 9: TCAAAATGGTATGCGTTTTG

상기 구축한 코리네박테리움용 고활성 pSG201 벡터에, 베타 갈락토시다제 유전자의 삽입을 위해서 다음과 같이 프라이머를 제작하였다.

전방향 프라이머 (서열번호 10): ATGTACTCATTTCCAAATAG

역방향 프라이머(서열번호 11): TTAGTGCCTTAATGGCTTTA

상기 제작한 pET24a-Slac을 주형으로 상기 제작한 프라이머들을 이용하여 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 베타-갈락토시다제 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 분리정제키트(RBC사)를 이용하여 순수 정제하였으며, 미리 프라이머 양 말단에 부착시킨 XmaI과 XbaI 염기서열을 각각의 제한효소로 절단한 후 동일 제한효소로 처리된 pSG201 벡터에 접합(ligation) 시킨 다음, 대장균 JM109에 42℃ 열충격 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하였다. 이렇게 분리된 베타 갈락토시다제가 삽입된 pSG201 벡터 구축물을 pSG201-Slac으로 명명하였고, 그 구성은 도 1에 나타난 바와 같다.

(2) pSG201-Slac에 의해 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 제조

상기 제작된 pSG201-Slac의 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032로 형질전환을 위해서 다음과 같이 수행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 LBG (1% 트립톤, 1% NaCl, 0.5 효모추출물, 2% 포도당) 배지 5 ml에 접종하여 30℃에서 하룻밤 배양한 다음 100 ml의 Epo (1% 트립톤, 1% NaCl, 0.5% 효모추출물, 2.5% 글리신, 0.1% Tween 80, 0.4% 이소니코틴산) 배지에 2 ml의 종균을 접종하고 18℃에서 균의 생육이 OD600에 0.8이 될 때까지 배양하였다. 그리고, 4℃에서 4,000×g로 10분간 원심분리한 후 50 ml의 냉각 10% 글리세롤로 현탁하여 동일한 조건으로 원심분리하고, 다시 50 ml의 10% 글리세롤로 같은 과정을 반 복하여 최종부피가 200㎕가 되는 컴피턴트 세포를 만들었다. 이 컴피턴트 세포 200 ㎕와 재조합 벡터 10㎍을 섞어 0.2 cm 전기천공용 큐벳 (electroporation cuvette)에 넣고 얼음에서 5 분간 정치 후 2500volt, 600Ω, 25μF에서 전기천공 (electroporation)을 하여 형질전환 시켰다. 그 후, 즉시 1 mL의 LBHIS (0.5% 트립톤, 0.5% NaCl, 0.5% 효모추출물, 1.85% BHI(Brain Heart Infusion), 9.1% 솔비톨)를 붓고 멸균된 마이크로 원심분리 튜브 (microcentrifuge tube)에 옮긴 후 46℃에서 6 분간 열충격을 가한 후 30℃에서 1 시간 동안 배양후 카나마이신 30 ㎍/ml, X-gal 50 ㎍/ml의 농도로 포함된 LBHIS 한천배지에 적당량을 깔았다.

실시예 2: 형질전환된 재조합 미생물의 고농도 배양

실시예 1에 따른 내열성 베타 갈락토시다제 유전자가 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 고농도 배양을 위하여 다음과 같이 진행하였다.

카나마이신(Kanamycin) 20 mg/L 농도로 함유되어 있는 LB 한천(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, 1.5% 한천) 배지에 도말되어 있는 형질전환 코리네박테리움 글루타미쿰의 콜로니(colony) 1개를 선택하였다. 멸균된 50 ml의 LB배지가 담겨져 있는 500 ml 삼각플라스크에 콜로니를 접종하여 30℃에서 교반속도 200 rpm으로 24시간동안 종(seed) 배지 배양을 하였다.

본 배양은 발효조(Jar-fermentor; KoBioTech사)를 이용하였으며, 배지조성은 표 1에 나타낸 바와 같다.

조성	농도(g/l)
포도당	40
펩톤	28
효모추출물	15
황산암모늄	7
제1인산칼륨	2.5
염화나트륨	0.5
염화칼슘2수염	10
황산마그네슘7수염	0.5

멸균된 1 L의 상기 배양 배지가 담겨져 있는 2.5 L 발효조에 무균적으로 50 ml 종배지 배양물을 접종하였고, 30℃에서 pH 7.0, 교반속도 250rpm, 공기주입 1 VVM(air volume/working volume/min)으로 24시간 배양하였다. pH는 7.0으로 보정을 위해 암모니아수를 자동적으로 첨가하였으며, 30% 용존산소 농도를 일정하게 유지하기 위해 교반속도와 공기주입양은 가변적으로 조정하였다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양 동안 베타갈락토시다제의 발현을 위한 유도 물질의 첨가는 이루어지지 않았다.

24 시간동안 배양의 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양 9시간 이후에 글루코오스의 감소와 동시에 세포의 OD값은 급격히 증가하는 양상을 보였으며, 베타 갈락토시다제 활성은 세포성장과 더불어 같이 증가하였다.

실시예 3: 베타 갈락토시다제의 활성 확인

실시예 2에서 배양된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에서, 베타 갈락토시다제의 발현정도를 확인하기 위해서, 상기에 고농도 배양이 완료된 배양세포를 0.1 M 인산 완충액(pH 6.0)으로 희석해서 OD₆₀₀ 10으로 농도를 맞추었다. 초음파분쇄기(VibraCell사)로 OD₆₀₀ 10으로 농도를 맞춘 세포를 파쇄하여 활성 측정의 시료로 사용하였다. 상기 파쇄된 세포의 일부 시료는 80℃에서 10분간 열처리하여 내열성을 단백질 전기영동으로 간접적으로 확인하였다.

베타 갈락토시다제의 활성 결정은 0.1 M 인산 완충액(pH 6.0) 중에 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드를 용해시켜 이를 기질로 사용하였으며, 80℃에서 반응후 10% (w/v) 다이소듐 테트라보레이트를 이용하여 효소 반응을 중지시키고 발색시켰다. 효소 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인하였다. 베타 갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정하였다.

한편, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 separating gel이 아크릴아미드 (acrylamide)의 농도가 10%가 되도록 만들었고 stacking gel은 아크릴아미드의 농도가 8%가 되도록 만들었다. SDS-PAGE 완충액은 25 mM Tris-base, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, pH 8.3을 사용하였다. 세포 파쇄물의 상등액은 5×sample buffer (60mM Tris-HCl pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)와 혼합하여 100℃, 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치는 Bio-Rad, Mini-ProteanⅡ apparatus를 이용하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 고농도 배양 완료후의 시료를 이용한 단백질 발현양상에서, 대조군인 코리네박테리움 글루타미쿰에 비해서, 베타-갈락토시다제로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 베타-갈락토시다제 발현정도가 뛰어났으며, 특히 80℃에서 10분동안 열처리한 경우, 열처리하지 않은 것과 비교시 거의 동일한 단백질 밴드를 보였다. 이것은 고온하에서 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 베타 갈락토시다제 발현이 안정적인 것을 의미한다.

실시예 4: 갈락토올리고당의 제조

갈락토올리고당의 합성에 있어서 최대한 산업현장에서 생산조건과 동일하게 맞추기 위해, 기질로서 락토스는 500 g/L의 농도로 완충액의 첨가 없이 증류수에 고온을 가해 용해시켰다. 1 L 용량의 반응기에 500 g/L 농도의 락토스 용액 500 ml을 첨가하였으며, 반응온도는 70℃로 고정하고, 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. 베타 갈락토시다제 효소는 상기 실시예 2에서 고농도 배양한 재조합 코리네박테리움 전세포(whole cell)를 사용하였다.

이때 전세포(whole cell)의 투입양은 고농도 배양후의 배양물이 최종 락토스 용액에 희석된 농도가 OD₆₀₀ 5가 되도록 투입하였다. 예컨대, 고농도 배양물의 최종세포 농도가 OD₆₀₀ 100 일때, 500 ml 락토스 용액에 25 ml의 세포 배양물을 투입하였다. 합성시간은 24시간을 수행하였다.

갈락토올리고당의 분석은 폴리아민 II(Polyamine II; YMC사) 컬럼을 사용하여 RI 검출기가 부착된 HPLC(Agilent사)로 측정하였다. 이때 이동상은 아세토니트릴(Acetonitrile)과 정제수의 비율이 65%/35%(v/v)가 되도록 사용하였고, 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min이었다. 상기 전세포 반응 완료 후의 갈락토올리고당의 분석결과는 표 2에 나타내었으며, HPLC 크로마토그램은 도 4에 나타난 바와 같았다.

갈락토올리고당의 전환율은 다음과 같이 계산하였다. 이하 나타내는 양은 HPLC에 측정된 피크(peak) 면적을 나타내며, 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 평가한다.

갈락토올리고당 전환율(%)

=[전체 당의 양]-[글루코스 양]-[갈락토스 양]-[락토스 양]

당 조성	GOS4	GOS3	GOS2	락토스	글루코스	갈락토스	총 GOS
함량(%)	15.6	20.4	19.3	6.6	26.7	11.4	55.3

총 GOS: 전체 갈락토올리고당

GOS4: 4 당류 갈락토올리고당

GOS3: 3 당류 갈락토올리고당

GOS2: 2 당류 갈락토올리고당

상기의 결과와 같이 500 g/L의 락토스 기질로부터 갈락토올리고당은 55.3%의 전환율로 275 g/L의 양이 생성되었다. 이는 현재 상업적으로 시판되는 갈락토올리고당 전환 수율과 근접한 것이다. 따라서, 술포로부스 솔파타리쿠스 유래의 내열성 베타갈락토시다제를 형질전환시킨 코리네박테리움 글루타미쿰의 전세포를 이용한 본 발명에 따른 갈락토올리고당 제조방법은 정제 효소를 사용시와 대등한 수준의 대량 생산이 가능한 것으로 나타났다.

도 1은 본 발명에 따른 내열성 효소가 삽입된 재조합 벡터(pSG201-Slac) 구축의 모식도를 나타낸 것이다.

도 2는 재조합 벡터 pSG201-Slac이 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 고농도 배양 결과 및 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 재조합 벡터 pSG201-Slac이 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 고농도배양 세포의 파쇄 후 단백질 전기영동 사진 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 올리고당 제조방법에 따른 갈락토올리고당의 합성 후 HPLC 분석 크로마토그램 사진 결과를 나타낸 것이다.

<110> GenoFocus <120> Method for preparing oligosaccharide from sugar using whole cell <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> DNA <213> DNA sequence of 201 promoter <400> 1 agaaaattat tttaaatttc ctcttgaaaa aaacagaatc atcgctataa tgggtaaaaa 60 aggaaaga 68 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer <400> 2 atgtactcat ttccaaatag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer <400> 3 ttagtgcctt aatggcttta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 4 aaaaacggtg atcggatttt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 5 gatctttggg agcagtcctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 6 gcttaaataa aacgaaaggc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 7 aaagagtttg tagaaacgca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 8 gtgaatggac caataataat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 9 tcaaaatggt atgcgttttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer <400> 10 atgtactcat ttccaaatag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer <400> 11 ttagtgcctt aatggcttta 20

Claims

전세포를 이용하여 당으로부터 올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 상기 전세포는 50 내지 80℃에서 안정한 당전이 효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 당은 글루코스, 갈락토스, 맥아당 및 설탕으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고당은 갈락토올리고당, 이소말토올리고당, 프락토올리고당 및 락토슈크로스로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 50 내지 80℃에서 안정한 당전이 효소는 락타아제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 트랜스-글루코시다제, 알파-글루코시다제, 프락토실트랜스퍼라제, 텍스트란슈크라제 및 레반슈크라제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 바실러스, 코리네박테리움, 아스퍼질러스, 및 효모로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 50 내지 80℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 30 내지 60(w/v)%의 농도인 당으로부터 전세포를 이용하여 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 염기서열을 가지는 프로모터와 50 내지 80℃에서 안정한 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 함유하되, 상기 프로모터와 상기 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 벡터.
제10항에 있어서, 상기 50 내지 80℃에서 안정한 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자는 술포로부스, 써머스 속,바실러스 속 및 피로코커스 속으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 유래인 것인 재조합 벡터.
제10항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제12항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제12항 또는 제13항의 재조합 미생물을 배양하여 50 내지 80℃에서 안정한 베타-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 내열성 베타갈락토시다제의 제조방법.