CN117106831A - 一种酶法制备l-岩藻糖的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶法制备L‑岩藻糖的制备方法和应用，所述方法为以岩藻糖基乳糖为底物，经岩藻糖苷酶Eo3066催化反应生成L‑岩藻糖，所述岩藻糖苷酶Eo3066来源于水生细菌Emticicia oligotrophica，GenBank注释号为UniProt ID I2ERT6。本发明采用的大肠表达系统具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的岩藻糖苷酶纯度高、产率高等优点。本发明提供了一种以岩藻糖基乳糖为原料，利用岩藻糖苷酶制备低成本L‑岩藻糖的新方法。

Description

一种酶法制备L-岩藻糖的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和酶工程领域，特别涉一种酶法制备L-岩藻糖的方法，具体为重组大肠杆菌表达载体的构建及转化方法、蛋白表达及纯化方法、酶活性测定和L-岩藻糖制备方法。

背景技术

L-岩藻糖(L-fucose)，又称作6-脱氧-L-半乳糖，分子式为C6H12O5，分子量为164.16，是一种六碳糖，在自然界存在的岩藻糖以L-岩藻糖为主。L-岩藻糖在人体、动植物及微生物体内的多糖中广泛存在，如以硫酸化的寡糖形式存在于人的乳汁中，还存在于海胆和蛙的卵中，以及黄蓍胶、马铃薯、猕猴桃、大豆、翼豆品种、加拿大油菜等的植物多糖以及各种海藻的胞外多糖中。

L-岩藻糖具有多种生物活性。如抗炎作用，将L-岩藻糖适量添加入药物，可起到有效的消炎作用；由于L-岩藻糖在细胞粘附的过程中起到重要的靶向作用，可将药物与L-岩藻糖结合，引导药物靶向药物发挥作用的位置。L-岩藻糖还具有调节血脂、胆固醇的功效，代替蔗糖加入到乳酸饮品、蛋糕、奶酪中，既可以使饮品原有风味，又可以满足人们对营养和健康的需求。L-岩藻糖不能被肠道肠壁细胞吸收，但可被肠道益生菌利用，从而增加肠道内益生菌数量，保持肠道益生菌的平衡，可作为益生元添加到乳酸饮料。在豆制品中加入适量L-岩藻糖，也有调节体内血脂胆固醇、维持肠道内益生菌平衡的作用。此外，L-岩藻糖在口香糖、巧克力、各种糖果、面包、果脯、饼干、果酱和八宝粥等食品中也有应用广泛。

L-岩藻糖可促进纤维母细胞生长从而避免因辐射、紫外线照射而导致的皮肤胶原蛋白缺少、皮肤松弛。L-岩藻糖还可减低皮肤中蛋白水解酶的活性，从而减少对皮肤的损伤。因此，将L-岩藻糖应用于化妆品可以起到皮肤保湿、保护皮肤、促进细胞增生、增加皮肤弹性、减缓皮肤衰老等的作用。

目前L-岩藻糖的合成有三种方法：化学合成法、提取法和生物转化法。化学合成需要还原、酸性水解、差向异构等技术，且成本高昂，从海藻中提取包含L-岩藻糖的寡糖目前主要的方法，存在原料单一、提取成本高的问题^[1]。生物转化法包括利用廉价的维生素C2合成L-岩藻糖或在工程酿酒酵母中生产出L-岩藻糖。

由于L-岩藻糖价格昂贵，目前在医药领域的应用比较广泛，而在食品及其它行业的应用还比较少。因此要使L-岩藻糖在食品级、化妆品领域得到广泛应用，需要发展新的、低成本的L-岩藻糖生产方法。采用酶促合成可以解决成本高昂的问题，最为重要的是如何快速获得大量廉价的岩藻糖。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种生物酶制备L-岩藻糖的方法，以获得低成本、高纯度L-岩藻糖的方法。

本发明要求保护岩藻糖苷酶Eo3066在制备L-岩藻糖中的应用，所述岩藻糖苷酶Eo3066来源于水生细菌Emticicia oligotrophica，GenBank注释号为UniProt ID I2ERT6。

本发明还要求保护与岩藻糖苷酶Eo3066相关的生物材料在制备L-岩藻糖中的应用，所述生物材料为如下任一所示：

A1)编码所述的岩藻糖苷酶Eo3066的核酸分子，

A2)含有所述核酸分子的表达盒，

A3)含有所述核酸分子的重组载体，

A4)含有所述核酸分子的重组菌。

其中，A1)中所述的核酸分子的序列如序列1所示。

其中，A3)中所述的重组载体为将pET30a质粒的Nde I/Xho I位点之间的序列替换为序列1所示序列，得到的重组质粒pET30a-Eo3066。

其中，A4)中所述的重组菌为向所述宿主菌中导入能够表达岩藻糖苷酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述岩藻糖苷酶的重组菌。

所述重组菌为含有所述重组质粒pET30a-Eo3066的大肠杆菌。

所述生物材料还可以为重组细胞，所述重组细胞为向所述宿主细胞中导入能够表达所述岩藻糖苷酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述述岩藻糖苷酶的重组细胞。

本发明提供一种酶法制备L-岩藻糖的方法，以岩藻糖基乳糖为底物，经所述的岩藻糖苷酶催化反应生成L-岩藻糖。

其中，所述岩藻糖苷酶是以粗酶液、粗酶粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的。

其中，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述岩藻糖苷酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。。

其中，所述岩藻糖基乳糖通过化学和合成或者酶法合成制备而成。

其中，所述岩藻糖基乳糖的酶法合成方法为以蔗糖、GDP及pNP-乳糖作为初始底物，在蔗糖合酶、CDP-泰威糖2-差向异构酶、GDP-甘露糖脱水酶、异构还原酶和岩藻糖基转移酶五种酶的催化作用下得到岩藻糖基乳糖。

其中，所述蔗糖合酶(SlSUS)来源于Solanum locopersicum(番茄)，氨基酸序列的GenBank序列号为NP_001234655.2；

所述CDP-泰威糖2-差向异构酶(SeC2E)来源于Salmonella enterica(肠道沙门氏菌)，氨基酸序列的GenBank序列号为DW4091412.1；

所述GDP-甘露糖脱水酶(SeGMD)来源于Salmonella enterica(肠道沙门氏菌)，氨基酸序列的GenBank序列号为ACN45760.1；

所述异构还原酶(SeGER)来源于Salmonella enterica(肠道沙门氏菌)，氨基酸序列的GenBank序列号为WP_001041701.1；

所述岩藻糖基转移酶(Hp13FucT2)来源于Helicbacterpylori(幽门螺杆菌)，氨基酸序列的GenBank序列号为WP_000487428.1。

本发明的有益效果在于：本方法所采用的大肠表达系统具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的岩藻糖苷酶纯度高、产率高等优点。本发明提供了一种以岩藻糖基乳糖为原料，利用岩藻糖苷酶制备低成本L-岩藻糖的新方法。

附图说明

图1为岩藻糖苷酶活性测定，其中，15mL反应液中含8.5μLpH7.4 PBS缓冲液、1.5μLpNP-α-L-fucose(10mM stock solution)和5μL纯化的重组岩藻糖苷酶。以不加重组酶的反应体系为阴性对照。阴性对照(-)的反应体系中不加酶。

图2为岩藻糖苷酶酶促反应产物的检测。其中，在50μL反应体系中，加入5μLpH7.4PBS缓冲液、30μL重组岩藻糖苷酶和5μL(～10μM)纯化的pNP-fucosyllactose，37℃反应16小时。反应产物用HPLC检测。

图3为浓缩岩藻糖苷酶酶促释放岩藻糖。纯化的岩藻糖苷酶浓缩5倍后，在50μL反应体系中于37℃反应16小时。Eo3066岩藻糖苷酶可完全水解pNP-fucosyllactose，释放岩藻糖。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：岩藻糖苷酶Eo3066的基因克隆、异源表达、纯化和酶活测定

1、重组质粒转化到E.coli BL21

本发明从水生细菌Emticicia oligotrophica中挖掘出岩藻糖苷酶(GenBank注释号为UniProt ID I2ERT6)；将岩藻糖苷酶Eo3066的基因序列(如序列1所示)，经合成后替换pET30a质粒的Nde I/Xho I位点之间的序列，其他序列不变得到重组质粒pET30a-Eo3066，将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中，得到E.coli BL21-Eo3066。具体过程如下：

(1)基因合成返回的重组质粒干粉进行离心，加水稀释至1ng/μL；

(2)取1μL稀释后的重组质粒移入100μL感受态细胞中；

(3)静置25min的间隙调好水浴锅温度，迅速放入42℃水浴中热激1min，拿出快速插回冰中，静置2min的破坏以减少E.coli；

(4)取200μL已灭菌的LB液体培养基，加入到热激后的每管感受态细胞中于37℃，800rpm震荡培养50min，使其复苏；

(5)将震荡培养好的菌液均匀加入并涂布到含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基中。并将平板倒置放于37℃恒温培养箱中培养12-16h，直至菌斑长成单菌落合适挑取的状态。

2、重组质粒在大肠杆菌中的异源表达

(1)挑取转入E.coli BL21的单菌落(即含有重组质粒的E.coli BL21-Eo3066)接种至3mL LB液体培养基中，加入50mg/mL的卡那霉素3μL，置于37℃，250rpm的恒温摇床过夜培养；

(2)取1mL菌液接种到400mL新鲜LB培养基中于37℃、250rpm培养至OD₆₀₀为0.5，然后加入IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度为1mM，在20℃、250rpm继续培养3小时。

(3)培养结束后离心(5000g,15min,4℃)收集菌体，将菌体重悬于10mL裂解缓冲液(100mM NaCl,50mM Tris,1％Triton X-100,and 1mM phenyl-methylsulfonyl fluoride,pH 8.0)中，在冰浴中超声裂解20分钟(40on/offcycles with 20μm amplitude for 15s)，然后离心(20000g,20min,4℃)除去细胞碎片，收集细胞裂解液。

细胞裂解液配制：称取Tris 6.06g，氯化钠5.84g溶于800mL超纯水中，加入10mLTriton X-100，搅拌均匀后，盐酸调节pH至8.0，定容至1L，4℃保存。

3、重组载体的镍亲和层析柱纯化

细胞裂解液上样到镍柱(Ni²⁺-nitrilotriacetate agarose亲和层析柱，柱床体积2mL)(Qiagen)，上样后用50mL冲洗缓冲液(50mM Tris-HCl,50mM NaCl,pH 8.0)充分冲洗未吸附蛋白，重组蛋白用洗脱缓冲液(300mM imidazole,50mM Tris-HCl,50mM NaCl,pH 8.0)洗脱，含目标蛋白的洗脱液体积约为4mL，可直接用于后续的酶活分析。

各种试剂配制如下：①冲洗脱缓冲液：称取Tris 6.06g、氯化钠2.92g于800mL超纯水中溶解，用稀HCl调pH至8.0，最后用超纯水定容至1L，至4℃冰箱保存；②洗脱缓冲液液配制：称取Tris 3.03g，氯化钠1.46g，咪唑17.02g溶于400mL超纯水中，用盐酸调节pH至8.0，定容至500mL，室温保存。

4、重组质粒表达产物的酶活分析

纯化后的重组酶岩藻糖苷酶Eo3066以pNP-α-L-fucose为底物时可检测到岩藻糖苷酶活性。

岩藻糖苷酶活性测定：在15L反应液中含8.5μL PBS缓冲液(pH7.4)、1.5μLpNP-α-L-fucose(10mM stock solution)(Sigma公司)和5μL纯化的重组岩藻糖苷酶。以不加重组酶的反应体系为阴性对照(-)。结果如图1所示。结果表明：重组酶Eo3066具有岩藻糖苷酶的活性，可水解pNP-α-L-fucose产生岩藻糖。

实施例2：重组酶纯化后脱盐

实施例1中步骤3得到的纯化后的酶溶液中含有大量的咪唑，所以用PD-10脱盐柱对蛋白酶进行脱盐处理，详细步骤如下：

(1)将一次性脱盐柱PD-10柱内原有溶液流干；

(2)配置pH为8，浓度为10mM的Tris缓冲液并用缓冲液冲洗5倍柱体积的量(此步骤为了防止使用去离子水冲洗蛋白产生沉淀)；

(3)吸取2.5ml经镍亲和层析柱纯化后的混合液加入脱盐柱中使其自由洗脱；

(4)用3ml缓冲液冲洗柱身，根据OD260吸光值收集目的蛋白。

(5)纯化后的岩藻糖苷酶Eo3066的蛋白浓度约为1.0mg/mL。

实施例3：岩藻糖苷酶Eo3066促反应产物的检测

50μL反应体系包括：5μL(～10μM)纯化的pNP-fucosyllactose，5μLpH7.4 PBS缓冲液和30μL(1.0mg/mL)实施例2得到的岩藻糖苷酶Eo3066，在37℃反应16小时。以不加岩藻糖苷酶Eo3066的反应体系作为对照(control)。反应结束后，经反相C18柱(PhenomenexHyperclone 5μm 250×4.6mm)分析反应产物，流速为0.8mL/min，紫外检测器波长为300nm。洗脱条件为20-60％(vol)溶于甲酸氨缓冲液(50mM,pH4.5)的乙腈梯度洗脱6分钟。如图2所示，岩藻糖苷酶Eo3066可水解pNP-fucosyllactose(pNP-岩藻糖基乳糖)释放岩藻糖。

实施例4：岩藻糖苷酶制备L-岩藻糖

为制备L-岩藻糖，将浓度为1.0mg/mL的纯化重组岩藻糖苷酶用centrifugalconcentrators(Vivaspin mini,10kDa MWCO)浓缩5倍，得到浓度为5mg/mL的岩藻糖苷酶。

50μL反应体系包括：5μL(～10μM)纯化的pNP-fucosyllactose，5μLpH7.4 PBS缓冲液和30μL(5mg/mL)重组岩藻糖苷酶，在37℃反应16小时。进行酶促反应，在37℃反应16小时。以不加岩藻糖苷酶Eo3066的反应体系作为对照(control)。结果如图3所示，浓度为5mg/mL的Eo3066岩藻糖苷酶可完全水解反应体系中的pNP-fucosyllactose，释放L-岩藻糖。

实施例5pNP-岩藻糖基乳糖的制备

1、酶的制备

基于不同来源的菌中挖掘出合成GDP-岩藻糖的相关酶(SUS,C2E,GMD,GER,Hp13FucT2)的基因；分解蔗糖的蔗糖合酶(SlSUS)来源于Solanum lycopersicum；可以将核苷酸活化后的葡萄糖差向异构成甘露糖的CDP-泰威糖2-差向异构酶(SeC2E)来源于Salmonella enterica；可以将GDP-甘露糖转化生成GDP-岩藻糖的GDP-甘露糖脱水酶(SeGMD)和异构还原酶(SeGER)也来源Salmonella enterica。从数据库中搜索获得所述蔗糖合酶SlSUS(NP_001234655.2)、CDP-泰威糖2-差向异构酶SeC2E(DW4091412.1)、GDP-甘露糖脱水酶SeGMD(ACN45760.1)、异构还原酶SeGER(WP_001041701.1)和岩藻糖基转移酶Hp13FucT2(WP_000487428.1)基因序列，经合成后分别克隆到pET30a质粒中，分别为，将SlSUS的编码序列为平端连接到pET30a的多克隆位点得到pET30a-SlSUS，将SeC2E的编码序列连接到pET30a的Nde I/Xho I位点之间(替换原位点之间的序列)得到pET30a-SeC2E，将SeGMD的编码序列连接到pET30a的Kpn I/Xho I位点之间得到pET30a-SeGMD，将SeGER的编码序列连接到pET30a的Kpn I/Xho I位点之间得到pET30a-SeGER，将Hp3/4FucT的编码序列接到pET30a的NdeI/XhoI位点之间得到pET30a-Hp3/4FucT。分别将上述四种重组质粒(pET30a-SlSUS、pET30a-SeC2E、pET30a-SeGMD、pET30a-SeGER、pET30a-Hp3/4FucT)转化到大肠杆菌E.coli BL21中。

将重组质粒在大肠杆菌中的异源表达，分离重组大肠杆菌中的蔗糖合酶、CDP-泰威糖2-差向异构酶、GDP-甘露糖脱水酶、异构还原酶和岩藻糖基转移酶，并进一步纯化，得到纯化后的SlSUS、SeC2E、SeGMD、SeGER和Hp13FucT2的蛋白浓度分别为2.0±0.9mg/mL；22±1.5mg/mL；25±1.2mg/mL、38±2.6mg/mL和20±1.6mg/mL，供后续使用。

2.pNP-岩藻糖基乳糖的制备

1)取5μL Tris-HCl(500mM pH＝7.5)、5μL GDP溶液(100mM)、5μL蔗糖溶液(1M)、1μL MgCl₂溶液(100mM)和14μL SlSUS酶溶液(2.0mg/mL)，混合均匀后，于37℃条件下反应12h；

2)接着向上述反应液中加入20μL SeC2E酶溶液(22mg/mL)和4μLNAD⁺溶液(20mM)，混合均匀后，于45℃条件下反应12h；

3)最后向反应体系中加入2μLpNP-乳糖溶液(20mM)、4μLNADPH溶液(20mM)和6μLSeGMD酶溶液(25mg/mL)、4μL SeGER酶溶液(38mg/mL)及15μLHp13FucT2酶溶液(20mg/mL)，混合均匀后，于25℃条件下反应12h。

反应结束后，使用基于UPLC-MS的方法检测，发现生成pNP-岩藻糖基乳糖。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.岩藻糖苷酶Eo3066在制备L-岩藻糖中的应用，所述岩藻糖苷酶Eo3066来源于水生细菌Emticicia oligotrophica，GenBank注释号为UniProt ID I2ERT6。

2.与岩藻糖苷酶Eo3066相关的生物材料在制备L-岩藻糖中的应用，其特征在于，所述生物材料为如下任一所示：

A1)编码权利要求1所述的岩藻糖苷酶Eo3066的核酸分子，

A2)含有所述核酸分子的表达盒，

A3)含有所述核酸分子的重组载体，

A4)含有所述核酸分子的重组菌；

A5)含有所述核酸分子的重组细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，A1)中所述的核酸分子的序列如序列1所示。

4.根据权利要求2所述的应用，A3)中所述的重组载体为将pET30a质粒的Nde I/Xho I位点之间的序列替换为序列1所示序列，得到的重组pET30a-Eo3066。

5.根据权利要求2所述的应用，A4)中所述的重组菌为向所述宿主菌中导入能够表达岩藻糖苷酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述岩藻糖苷酶的重组菌。

6.一种酶法制备L-岩藻糖的方法，其特征在于：以岩藻糖基乳糖为底物，经权利要求1中所述的岩藻糖苷酶催化反应生成L-岩藻糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖苷酶是以粗酶液、粗酶粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述岩藻糖苷酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基乳糖通过化学和合成或者酶法合成制备而成。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基乳糖的酶法合成方法为以蔗糖、GDP及pNP-乳糖作为初始底物，在蔗糖合酶、CDP-泰威糖2-差向异构酶、GDP-甘露糖脱水酶、异构还原酶和岩藻糖基转移酶五种酶的催化作用下得到岩藻糖基乳糖。